新 城 疫 是 家 禽 最 普 遍 的 传 染 病 之 一 它 在 全 球 范 围 内 流 行, 并 可 能 给 家 禽 养 殖 者 带 来 巨 大 的 经 济 损 失 本 病 由 新 城 疫 病 毒 引 起, 可 感 染 超 过 240 余 种 鸟 类, 主 要 通 过 感 染 鸡 只 和 健 康

总 第 18 期 /2014 年 12 月 如 何 克 服 母 源 抗 体 消 失 与 自 身 抗 体 产 生 之 间 存 在 的 免 疫 空 档 期 Roni Yosipovicha,1, Elina Aizenshteina,1, Roy Shadmona, Simcha Krispela,Efrat Shustera, Jacob Pitcovskia,b, 摘 要 在 雏 鸡 出 生 后 的 10 到 14 天 里, 母 源 抗 体 可 对 其 产 生 保 护 随 后, 肉 鸡 的 保 护 力 主 要 来 源 于 主 动 免 疫 接 种 然 而, 在 日 龄 较 小 时, 高 水 平 的 母 源 抗 体 会 对 疫 苗 接 种 诱 导 的 有 效 免 疫 应 答 产 生 干 扰 其 结 果 是, 在 保 护 性 母 体 抗 体 逐 渐 降 低 和 主 动 免 疫 接 种 诱 导 的 自 身 抗 体 上 升 之 间, 存 在 一 个 免 疫 空 档 期 本 研 究 的 主 要 目 的 是, 对 一 种 包 含 被 动 和 主 动 免 疫 接 种 的 免 疫 方 案 进 行 研 究, 以 克 服 该 免 疫 空 档 期, 并 在 肉 鸡 的 成 长 期 内 能 够 持 续 性 的 抵 抗 感 染 性 病 毒 疾 病 新 城 疫 病 毒 (NDV) 是 世 界 范 围 内 家 禽 中 最 普 遍 的 传 染 病 之 一, 本 研 究 中 将 其 作 为 模 式 病 毒 进 行 研 究 对 1 日 龄 雏 鸡 皮 下 注 射 18 个 血 凝 抑 制 (HI) 单 位 的 抗 NDV 免 疫 球 蛋 白 Y, 最 晚 在 17 日 龄 便 可 检 测 到 高 于 4 log2 的 保 护 性 抗 体 滴 度 在 1 日 龄 进 行 被 动 免 疫, 随 后 在 10 日 龄 接 种 减 毒 活 疫 苗, 该 组 合 可 以 在 整 个 生 长 期 内 诱 导 高 水 平 的 保 护 滴 度, 并 一 直 持 续 到 41 日 龄 此 外, 与 仅 免 疫 活 病 毒 疫 苗 的 鸡 群 相 比, 联 合 免 疫 两 种 疫 苗 的 鸡 群 的 HI 抗 体 滴 度 更 均 匀 因 此, 通 过 联 合 进 行 被 动 免 疫 和 主 动 免 疫 的 免 疫 方 案, 可 以 在 肉 鸡 的 整 个 生 长 期 内 提 供 对 NDV 的 充 分 的 免 疫 保 护 1. 简 介 传 染 性 疾 病 是 困 扰 家 禽 养 殖 业 的 一 大 难 题 对 于 病 毒 性 疾 病 来 说, 主 要 是 通 过 免 疫 接 种 来 预 防 在 雏 鸡 出 生 后 的 最 初 几 天 内, 母 源 抗 体 为 其 提 供 保 护 然 而, 鸡 群 母 源 抗 体 的 半 衰 期 相 对 较 短 对 于 一 些 主 要 的 传 染 性 病 毒 来 说, 母 源 抗 体 只 能 在 雏 鸡 出 生 后 的 10-14 天 提 供 充 分 保 护, 随 后 这 些 保 护 性 抗 体 显 著 减 少, 鸡 群 开 始 易 感 通 过 主 动 免 疫 可 以 实 现 对 肉 鸡 的 持 续 保 护 然 而, 高 水 平 的 母 源 抗 体 会 干 扰 1 日 龄 疫 苗 的 免 疫 效 果 在 无 菌 猪 中 已 发 现, 母 源 抗 体 会 干 扰 有 效 免 疫 应 答 的 产 生, 包 括 抑 制 B 和 T 辅 助 细 胞 以 及 抗 原 加 工, 并 且 激 活 抑 制 性 T 细 胞 在 保 护 性 母 源 抗 体 逐 渐 减 少, 自 身 保 护 性 抗 体 尚 未 建 立 之 前 的 这 段 时 期 是 鸡 群 对 病 毒 最 易 感 的 时 期 其 中 一 种 解 决 方 案 是 接 种 毒 力 较 强 的 病 毒 活 疫 苗, 即 使 存 在 母 源 抗 体 也 可 以 诱 导 免 疫 应 答 然 而, 这 种 疫 苗 对 于 接 种 疫 苗 的 鸡 只 会 产 生 负 面 影 响, 如, 接 种 传 染 性 法 氏 囊 病 强 毒 这 类 免 疫 抑 制 病 毒 会 损 害 免 疫 系 统, 或 者 接 种 新 城 疫 病 毒 强 毒 (NDV) 会 造 成 鸡 的 体 重 减 轻

新 城 疫 是 家 禽 最 普 遍 的 传 染 病 之 一 它 在 全 球 范 围 内 流 行, 并 可 能 给 家 禽 养 殖 者 带 来 巨 大 的 经 济 损 失 本 病 由 新 城 疫 病 毒 引 起, 可 感 染 超 过 240 余 种 鸟 类, 主 要 通 过 感 染 鸡 只 和 健 康 鸡 只 之 间 的 直 接 接 触 传 播 NDV 属 于 副 粘 病 毒 科, 是 一 种 有 囊 膜 不 分 节 段 的 负 链 RNA 病 毒 所 有 NDV 被 认 为 属 于 同 一 种 血 清 型, 进 而 可 分 为 两 类 不 同 国 家 的 NDV 疫 苗 接 种 方 案 各 不 相 同, 有 的 国 家 不 进 行 疫 苗 接 种, 而 有 的 国 家 在 鸡 的 生 长 期 内 免 疫 3 到 4 次 疫 苗 进 行 NDV 免 疫 接 种 的 目 的 是 刺 激 中 和 抗 体 的 产 生 根 据 血 凝 抑 制 (HI) 试 验 和 中 和 抗 体 滴 度 与 保 护 力 之 间 的 相 关 性,HI 滴 度 4 log2 被 认 为 具 有 保 护 性 鸡 胚 和 新 生 雏 鸡 通 过 从 蛋 黄 转 移 到 血 清 的 母 源 免 疫 球 蛋 白 Y(IgY 抗 体 ) 获 得 被 动 免 疫 抗 原 特 异 性 IgY 可 以 从 特 异 性 免 疫 某 一 抗 原 的 母 鸡 所 产 的 鸡 蛋 中 大 规 模 提 取 因 此, 关 于 使 用 IgY 进 行 被 动 免 疫 已 被 广 泛 研 究, 并 已 显 示, 其 在 预 防 或 治 疗 感 染 性 疾 病 方 面 存 在 效 果, 尤 其 是 那 些 通 过 肠 道 感 染 的 病 原 在 过 去 的 几 十 年 中, 由 于 大 规 模 的 遗 传 选 择, 肉 鸡 生 长 速 率 有 所 增 加, 其 生 长 期 已 经 降 低 到 35-40 天 疫 苗 接 种 的 目 的 是 持 续 保 护 此 期 间 的 鸡 只 本 研 究 的 主 要 目 的 是 建 立 一 个 能 够 使 较 小 日 龄 鸡 群 持 续 抵 抗 感 染 性 病 毒 疾 病 的 接 种 方 案, 从 而 克 服 母 源 抗 体 下 降 与 主 动 免 疫 接 种 产 生 自 身 抗 体 之 间 存 在 的 时 间 差 2 材 料 与 方 法 2.1 田 间 鸡 群 新 城 疫 抗 体 水 平 的 测 定 在 同 一 商 品 鸡 群 中 提 取 50 只 来 亨 产 蛋 鸡 血 清 (Yavne 孵 化 场 Kvuzat Yavne, 以 色 列 ),50 枚 蛋 内 的 卵 黄 免 疫 球 蛋 白 ( IgY 抗 体 ), 以 及 50 只 雏 鸡 (1 日 龄 ) 的 血 清, 根 据 OIE ( 世 界 动 物 卫 生 组 织 ) 陆 生 动 物 疫 病 诊 断 手 册 2012 版, 通 过 HI 试 验 分 别 测 定 其 抗 NDV 抗 体 水 平 简 言 之, 将 血 清 或 卵 黄 IgY 进 行 2 倍 梯 度 稀 释, 使 用 4 血 凝 单 位 (HAU) 灭 活 新 城 疫 商 品 疫 苗 在 室 温 下 孵 育 30 分 钟 在 每 次 实 验 当 天 制 备 4 单 位 病 毒 加 入 鸡 红 细 胞 ( 使 用 PBS 稀 释 至 1%) 孵 育 30 分 钟 后 进 行 HI 测 定 以 完 全 抑 制 4HAU 抗 原 的 血 清 最 高 稀 释 倍 数 的 log2 作 为 HI 滴 度 每 个 实 验 中 都 包 含 了 阴 性 和 阳 性 对 照 2.2 抗 体 的 生 产 和 纯 化 为 了 获 得 包 含 滴 度 高 而 持 久 的 抗 NDV 抗 体 的 卵 黄, 疫 苗 接 种 程 序 如 下 : 本 实 验 中 所 用 的 5 月 龄 来 亨 蛋 鸡, 在 实 验 之 前, 就 根 据 以 色 列 农 业 卫 生 部 的 推 荐 免 疫 程 序, 从 1 日 龄 到 3 月 龄 进 行 了 免 疫 接 种, 另 外 在 本 实 验 中 还 对 这 些 鸡 只 进 行 了 加 强 免 疫, 每 隔 3 周 进 行 1 次 灭 活 NDV 加 强 免 疫, 共 3 次, 随 后 在 两 个 月 后 进 行 第 4 次 免 疫 每 次 免 疫 后 2 周 收 集 鸡 蛋 分 别 在 第

3 次 和 第 4 次 免 疫 后 2 周, 以 及 第 4 次 免 疫 后 4 个 月 采 集 血 液 样 本 所 有 实 验 采 集 的 全 部 血 清 和 鸡 蛋 提 取 的 卵 黄 抗 体 在 -20 条 件 下 保 存, 直 到 进 行 检 测 提 取 IgY 前 将 鸡 蛋 在 4 放 置 10 天 以 上 简 言 之, 将 双 蒸 水 (DDW) 加 入 到 蛋 黄 中 (9:1), 将 混 合 溶 液 在 室 温 下 孵 育 30 分 钟 (RT) 用 10% 乙 酸 将 ph 调 节 至 5.2, 并 将 该 溶 液 在 室 温 孵 育 2.5 小 时 然 后 将 溶 液 通 过 Whatman 滤 纸 过 滤, 直 到 液 体 变 得 透 明 缓 慢 加 入 硫 酸 铵 (40%, Sigma 公 司, 比 利 时 ), 随 后 4 轻 微 混 合 3 小 时 然 后 将 溶 液 15500g 离 心 20 分 钟, 收 集 沉 淀, 称 重 并 使 用 40 % 的 硫 酸 铵 重 悬 (1:1w/v) 每 次 实 验 之 前 将 溶 液 15500g 离 心 20 分 钟 使 用 DDW 将 沉 淀 重 悬, 并 使 用 3.5 kd 试 剂 盒 (Thermo, USA) 在 PBS 中 透 析 过 夜 通 过 HI 试 验 来 测 定 特 异 性 抗 体 的 滴 度 2.3 IgY 使 用 途 径 的 确 定 本 研 究 中 的 所 有 实 验 肉 鸡 均 来 自 商 品 种 鸡, 携 带 高 水 平 的 NDV 抗 体 在 实 验 过 程 中, 将 肉 鸡 饲 养 于 独 立 的 房 间 中, 自 由 采 食 和 饮 水 1 日 龄 肉 鸡 通 过 点 眼 (ED) 肌 注 (IM) 或 皮 下 (SC) 途 径 分 别 给 予 18 个 HI 单 位 的 抗 新 城 疫 IgY 每 组 15 只 鸡 接 种 后 27 天 每 隔 4-6 天 采 集 一 次 血 液 通 过 HI 试 验 检 测 是 否 存 在 特 异 性 抗 NDV 抗 体 2.4 肉 鸡 免 疫 2.4.1 肉 鸡 被 动 免 疫 肉 鸡 在 1 日 龄 或 10 日 龄 皮 下 注 射 200ul 包 含 15 或 18 HI 单 位 的 抗 新 城 疫 IgY 的 PBS 每 组 10 只 鸡 被 动 免 疫 后 1 周 采 集 血 液, 其 后 每 4 天 采 集 一 次 2.4.2 被 动 免 疫 与 灭 活 NDV 疫 苗 联 合 免 疫 肉 鸡 在 1 日 龄 或 10 日 龄 皮 下 注 射 200ul 包 含 18 HI 单 位 的 抗 新 城 疫 IgY 的 PBS, 并 在 10 日 龄 根 据 制 造 商 的 说 明, 肌 注 接 种 灭 活 NDV 疫 苗 每 组 10 只 鸡 免 疫 后 1 周 采 集 血 液, 其 后 每 4 天 采 集 一 次 2.4.3 被 动 免 疫 与 NDV 活 疫 苗 联 合 免 疫 肉 鸡 在 1 日 龄 皮 下 注 射 200ul 包 含 18 HI 单 位 的 抗 新 城 疫 IgY 的 PBS, 并 在 1 日 龄 或 10 日 龄, 根 据 制 造 商 的 说 明, 点 眼 接 种 NDV 活 疫 苗 每 组 15 只 鸡 每 周 采 血 1 次 2.4.4 动 物 伦 理 要 求 所 有 的 动 物 研 究 均 被 以 色 列 动 物 管 理 和 使 用 委 员 会 批 准

2.5 数 据 统 计 分 析 行 分 析 所 有 结 果 采 用 单 因 素 方 差 分 析 (ANOVA) 和 q 检 验 (newman-keuls) 进 行 分 析 用 Graphpad Prism 5 Windows 版 统 计 软 件 进 3. 结 果 3.1 田 间 鸡 群 新 城 疫 抗 体 水 平 的 测 定 在 不 同 阶 段, 通 过 HI 试 验 测 定 50 只 代 表 鸡 只 的 特 异 性 NDV 抗 体 从 产 蛋 鸡 向 卵 黄 再 向 孵 出 的 肉 雏 鸡 转 移 的 比 率 50 只 蛋 鸡 中 有 48 只 的 HI 效 价 在 8-10 之 间 ( 平 均 滴 度 为 9) 卵 黄 中 的 HI 滴 度 均 在 6-12( 平 均 滴 度 为 8.5),1 日 龄 雏 鸡 的 血 清 HI 滴 度 在 5 到 10 之 间 ( 平 均 滴 度 为 7.5) 蛋 鸡 血 清 和 其 所 产 鸡 蛋 中 的 特 异 性 抗 体 水 平 类 似, 但 与 雏 鸡 的 血 清 水 平 差 异 显 著 (P < 0.0001) 在 卵 黄 和 雏 鸡 血 清 中 的 HI 效 价 均 匀 度 要 低 于 其 母 源 产 蛋 鸡 群 的 HI 效 价 均 匀 度 ( 标 准 差 分 别 为 1.1,1.0 和 0.85)( 图 1) 图 1. 某 蛋 鸡 群 其 卵 黄 及 其 后 代 1 日 龄 雏 鸡 的 新 城 疫 HI 抗 体 滴 度 (log2) 个 体 的 滴 度 以 三 角 形 表 示 每 一 组 中 的 线 代 表 平 均 水 平 母 源 鸡 群 & 卵 黄 抗 体 HI 滴 度 与 1 日 龄 雏 鸡 血 清 HI 滴 度 比 较, 差 异 显 著, *** P <0.0001

3.2 蛋 鸡 接 种 后 的 抗 体 产 生 情 况 为 制 备 从 卵 黄 中 提 取 的 用 于 被 动 免 疫 试 验 的 IgY, 对 发 育 成 熟 的 产 蛋 鸡 进 行 了 四 次 灭 活 NDV 疫 苗 免 疫 从 第 2 次 接 种 后 两 周 开 始, 一 直 到 第 4 次 接 种 后 两 个 月, 卵 黄 中 的 抗 NDV IgY 的 HI 滴 度 为 12 卵 黄 中 特 异 性 抗 体 的 效 价 与 母 鸡 的 血 清 抗 体 水 平 类 似 3.3 被 动 免 疫 最 佳 途 径 的 确 定 为 了 确 定 1 日 龄 肉 鸡 最 佳 被 动 免 疫 途 径, 将 18 个 HI 单 位 的 抗 NDV 纯 化 免 疫 球 蛋 白 通 过 点 眼 肌 注 或 皮 下 途 径 进 行 接 种 免 疫 后 的 27 天 内, 每 隔 4-6 天 采 集 血 液 样 本 通 过 HI 试 验 测 定 肉 鸡 血 清 中 的 特 异 性 抗 NDV 抗 体 滴 度 ( 图 2) 1 日 龄 肉 鸡 皮 下 途 径 进 行 被 动 免 疫 后, 可 以 在 长 达 13-17 天 内 诱 导 至 少 为 4( 该 抗 体 水 平 被 认 为 可 以 起 到 保 护 作 用 ) 的 HI 抗 体 滴 度, 而 且 相 对 比 较 均 匀, 其 特 征 是 每 只 鸡 的 HI 效 价 分 布 相 对 集 中, 离 散 度 较 小 在 接 种 后 27 天, 与 未 接 种 组 和 肌 注 接 种 组 相 比 ( 两 组 的 HI 抗 体 滴 度 仅 在 8-13 日 龄 4), 皮 下 注 射 组 的 NDV 抗 体 水 平 显 著 较 高 (P <0.01), 且 离 散 度 较 小 ( 图 2) 点 眼 接 种 的 结 果 类 似 于 未 接 种 组 ( 数 据 未 显 示 ). 因 此, 我 们 将 皮 下 注 射 确 定 为 最 佳 的 被 动 免 疫 接 种 途 径, 并 在 随 后 的 实 验 中 使 用 图 2. 1 日 龄 肉 鸡 皮 下 (SC) 或 肌 注 (IM) 途 径 进 行 被 动 免 疫 后 血 清 内 的 NDV 病 毒 HI 中 和 抗 体 滴 度 随 时 间 产 生 的 变 化 NV- 未 免 疫 肉 鸡

3.4 为 肉 鸡 提 供 抵 抗 NDV 的 长 期 保 护, 被 动 免 疫 所 需 抗 体 剂 量 的 测 定 肉 鸡 在 1 日 龄 或 10 日 龄 皮 下 注 射 15 或 18 HI 单 位 的 抗 新 城 疫 抗 体 通 过 HI 试 验 测 定 被 动 免 疫 后 血 清 NDV 抗 体 提 供 的 保 护 水 平, 结 果 总 结 在 表 1 中 所 有 未 免 疫 肉 鸡 在 15 日 龄 时 均 易 感 在 1 日 龄 时 使 用 抗 NDV 抗 体 进 行 被 动 免 疫 可 以 延 长 肉 鸡 血 清 中 保 护 性 抗 体 存 在 的 时 间 每 只 鸡 注 射 15 个 HI 单 位 的 抗 体 后,HI 效 价 > 4 的 时 间 为 8-15 日 龄, 而 每 只 鸡 注 射 18 个 HI 单 位 的 抗 体 可 将 这 一 期 限 延 长 至 15-19 天 在 10 日 龄 时 每 只 鸡 接 种 18 HI 单 位 的 抗 体 的 保 护 期 (HI 滴 度 >4 的 持 续 时 间 可 达 22-26 日 龄 ) 要 比 1 日 龄 注 射 相 同 剂 量 的 抗 体 保 护 期 要 长 相 比 于 接 种 15 个 HI 单 位 抗 体 的 鸡 只, 接 种 18 个 HI 单 位 抗 体 的 鸡 只 的 HI 抗 体 滴 度 大 于 4 的 时 期 要 相 对 更 长, 并 在 所 有 随 后 的 实 验 中 被 使 用 3.5 被 动 免 疫 和 主 动 免 疫 联 合 免 疫 3.5.1 被 动 免 疫 和 灭 活 NDV 疫 苗 联 合 免 疫 我 们 对 被 动 和 主 动 免 疫 联 用 时 的 抗 新 城 疫 病 毒 抗 体 水 平 随 时 间 变 化 的 效 果 进 行 了 检 测 肉 鸡 在 1 日 龄 或 10 日 龄 皮 下 注 射 18 HI 单 位 的 抗 新 城 疫 IgY, 并 在 10 日 龄 肌 注 接 种 灭 活 NDV 疫 苗 在 1 日 龄 进 行 被 动 免 疫 后, HI 滴 度 在 17 天 后 降 低 到 4 以 下 在 被 动 免 疫 后 第 10 天 加 强 免 疫 灭 活 NDV 疫 苗 并 没 有 延 长 保 护 期 仅 在 10 日 龄 免 疫 灭 活 病 毒 疫 苗 的 鸡 只 的 HI 滴 度 在 整 个 实 验 期 间 均 小 于 4, 与 没 有 接 种 疫 苗 的 阴 性 对 照 鸡 只 情 况 类 似 ( 图 3A) 未 接 种 疫 苗 的 鸡 只 的 HI 效 价 代 表 了 所 有 实 验 中 的 雏 鸡 的 母 源 抗 体 水 平 在 10 日 龄 进 行 被 动 免 疫 可 以 诱 导 高 滴 度 的 HI(>4), 并 可 持 续 至 22 日 龄 与 仅 进 行 被 动 免 疫 相 比, 在 10 日 龄 进 行 联 合 疫 苗 免 疫 的 鸡 只 的 HI 效 价 > 4 的 时 间 并 没 有 延 长 ( 图 3B) 尽 管 在 10 日 龄 单 独 进 行 被 动 免 疫 或 与 灭 活 疫 苗 联 合 接 种 可 以 诱 导 具 有 保 护 性 的 抗 体 滴 度 (> 4), 并 可 持 续 至 22 日 龄, 但 并 没 有 获 得 预 期 的 保 护 被 动 免 疫 与 主 动 免 疫 ( 灭 活 NDV 疫 苗 ) 联 合 免 疫 并 没 有 延 长 高 水 平 NDV 中 和 抗 体 的 持 续 时 间 3.5.2 被 动 免 疫 和 NDV 活 疫 苗 联 合 免 疫 为 了 检 测 被 动 免 疫 和 NDV 活 疫 苗 联 合 免 疫 的 效 果, 肉 鸡 在 1 日 龄 皮 下 注 射 18 HI 单 位 的 抗 新 城 疫 IgY, 并 在 1 日 龄 或 10 日 龄 点 眼 接 种 NDV 活 疫 苗 我 们 在 这 两 个 独 立 的 实 验 组 中 观 察 到 了 类 似 的 结 果

表 1 肉 鸡 血 清 中 NDV HI log2 抗 体 滴 度 ( 平 均 值 ± 不 同 时 间 段 各 组 SD 值 ) 日 龄 ( 天 ) 1 日 龄 /15 HI a 1 日 龄 /18 HI b 10 日 龄 /18 HI c NV d 8 4.8(±0.6) 6.7(±0.5) NT NT 15 2.5(±0.8) 4.4(±0.5)*** 5.4(±0.5)*** 1.8(±0.9) 19 1.9(±0.7) 3.4(±0.5)*** 4.8(±0.4)** 1.7(±0.7) 22 1.7(±0.7) 3.5(±0.5)** 4.2(±0.6)** 2(±0.8) 26 1.2(±0.4) 2.9(±0.3)*** 2.5(±0.8)*** <1 31 <1 <1 2.2(±0.6)*** <1 33 <1 1(±0.5) 1.7(±0.5)*** <1 39 <1 1(±0) 1.7(±0.5) 1.1(±0.4) a 1 日 龄 /15 HI 1 日 龄 肉 鸡 免 疫 15 个 HI 单 位 的 抗 NDV IgY 抗 体 b 1 日 龄 /18 HI 1 日 龄 肉 鸡 免 疫 18 个 HI 单 位 的 抗 NDV IgY 抗 体. c 10 日 龄 /18 HI 10 日 龄 肉 鸡 免 疫 18 个 HI 单 位 的 抗 NDV IgY 抗 体. d NV- 未 免 疫 肉 鸡 所 有 免 疫 均 以 皮 下 接 种 途 径 接 种 NT- 未 检 测 *** 免 疫 组 与 未 免 疫 组 之 间 的 HI 滴 度 存 在 显 著 性 差 异,P<0.0001

18HI/1 日 龄 18HI/1 日 龄 + 灭 活 NDV 疫 苗 /10 日 龄 灭 活 NDV 疫 苗 /10 日 龄 未 免 疫 18HI/10 日 龄 18HI+ 灭 活 NDV 疫 苗 /10 日 龄

图 3 新 城 疫 IgY 抗 体 与 灭 活 NDV 疫 苗 联 合 免 疫 后 的 NDV HI 抗 体 滴 度 (log2) (A)1 日 龄 肉 鸡 皮 下 接 种 18 HI 单 位 的 抗 NDV IgY 抗 体, 和 / 或 10 日 龄 肌 注 接 种 灭 活 NDV 疫 苗 后 的 NDV 血 清 中 和 抗 体 HI log2 滴 度 NV- 未 免 疫 肉 鸡 (B) 肉 鸡 在 10 日 龄 皮 下 接 种 18 HI 单 位 的 抗 NDV IgY 抗 体, 和 / 或 10 日 龄 肌 注 接 种 灭 活 NDV 疫 苗 后 的 NDV 血 清 中 和 抗 体 HI log2 滴 度 NV- 未 免 疫 肉 鸡,**,*** 代 表 处 理 组 与 NV 组 之 间 存 在 显 著 差 异,P 值 分 别 为 P < 0.001 和 0.0001 在 1 日 龄 联 合 进 行 被 动 免 疫 接 种 和 NDV 活 疫 苗 接 种 时,HI 滴 度 在 整 个 期 间 都 很 低 ( 从 第 12 天 开 始 <4), 与 在 1 日 龄 单 独 进 行 被 动 免 疫 或 活 疫 苗 免 疫 接 种 的 结 果 类 似 ( 图 4A) 与 1 日 龄 单 独 进 行 被 动 免 疫 相 比, 在 1 日 龄 和 10 日 龄 联 合 免 疫 NDV 活 疫 苗 接 种 并 没 有 使 HI 滴 度 有 所 增 加, 两 组 的 HI 滴 度 在 12 日 龄 以 后 均 <4( 图 4B) 在 1 日 龄 进 行 被 动 免 疫, 并 在 10 日 龄 联 合 免 疫 NDV 活 疫 苗 时,HI 效 价 在 整 个 试 验 期 间 均 大 于 4, 而 且 在 12 日 龄 至 20 日 龄 之 间 有 所 增 长 ( 图 4C) 与 单 独 进 行 被 动 免 疫 相 比, 这 种 组 合 不 仅 诱 导 了 更 高 的 HI 效 价 水 平, 而 且 与 10 日 龄 单 独 免 疫 NDV 活 疫 苗 组 ( 在 14 日 龄 以 后, 组 内 的 HI 抗 体 差 异 为 6-7 个 滴 度 ) 相 比, 抗 体 水 平 更 均 匀 一 致, 表 现 为 离 散 度 减 小 ( 在 整 个 实 验 期 间, 组 内 的 HI 抗 体 差 异 3-4 个 滴 度 ) 在 10 日 龄 和 14 日 龄, 离 散 度 的 减 少 也 是 显 著 的 ( 分 别 为 P< 0.0001 和 0.01 )( 图 5)

图 4 肉 鸡 血 清 中 的 抗 新 城 疫 病 毒 抗 体 的 HI log2 滴 度 (A)1 日 龄 肉 鸡 皮 下 接 种 18 HI 单 位 的 抗 NDV IgY 抗 体, 和 / 或 1 日 龄 点 眼 接 种 NDV 减 毒 活 疫 苗 (B)1 日 龄 肉 鸡 皮 下 接 种 18 HI 单 位 的 抗 NDV IgY 抗 体, 和 / 或 1 日 龄 及 10 日 龄 点 眼 接 种 NDV 减 毒 活 疫 苗 (C)1 日 龄 肉 鸡 皮 下 接 种 18 HI 单 位 的 抗 NDV IgY 抗 体, 和 / 或 10 日 龄 点 眼 接 种 NDV 减 毒 活 疫 苗 *,**, *** 表 示 各 组 与 单 独 被 动 免 疫 组 相 比 差 异 显 著, 其 P 值 分 别 为 P <0.01, 0.001 和 0.0001 图 5 肉 鸡 血 清 中 抗 新 城 疫 病 毒 抗 体 HI log2 滴 度 随 着 时 间 的 推 移 的 变 化 情 况 (A) 肉 鸡 在 1 日 龄 皮 下 免 疫 18 HI 单 位 的 抗 NDV IgY (B) 肉 鸡 在 10 日 龄 点 眼 免 疫 NDV 减 毒 活 疫 苗 (C) 肉 鸡 在 1 日 龄 皮 下 免 疫 18 HI 单 位 的 抗 NDV IgY, 并 在 10 日 龄 点 眼 免 疫 NDV 减 毒 活 疫 苗 单 个 鸡 只 的 滴 度 以 三 角 形 表 示 横 线 表 示 每 一 天 的 HI 平 均 效 价

4. 讨 论 雏 鸡 主 要 是 在 早 期 比 较 易 感, 因 为 它 们 的 免 疫 系 统 在 10-14 日 龄 才 能 发 育 完 全 在 此 期 间, 对 于 刚 刚 孵 出 的 雏 鸡 的 保 护 主 要 来 自 母 源 抗 体 为 了 使 子 代 鸡 群 获 得 针 对 主 要 致 病 病 毒 ( 新 城 疫, 流 感, 传 染 性 法 氏 囊 病 病 毒, 禽 传 染 性 支 气 管 炎 病 毒 ) 的 有 效 保 护, 父 母 代 鸡 群 往 往 需 要 进 行 繁 多 的 免 疫 接 种, 以 诱 导 产 生 高 水 平 的 抗 体, 并 通 过 鸡 蛋 转 移 至 胚 胎 然 而, 绝 大 多 数 情 况 下 母 源 抗 体 在 10-14 日 龄 时 会 下 降 到 保 护 水 平 以 下 (NDV 抗 体 效 价 的 半 衰 期 为 6.3 天 ) 父 母 代 鸡 群 以 及 随 后 的 子 代 鸡 群 的 抗 体 水 平 可 能 是 差 异 大 的, 其 结 果 是, 雏 鸡 的 保 护 水 平 差 异 很 大, 有 可 能 完 全 保 护, 也 有 可 能 保 护 效 果 很 差 未 受 保 护 的 鸡 可 能 会 被 感 染, 并 将 病 毒 传 播 给 其 他 鸡 只, 在 某 些 疾 病 条 件 下 可 能 会 造 成 全 群 的 扑 杀, 如 NDV 和 流 感 为 了 在 母 源 抗 体 下 降 到 保 护 水 平 以 下 时 能 够 持 续 保 护 雏 鸡, 在 雏 鸡 日 龄 较 小 时 要 进 行 主 动 免 疫 各 个 国 家 的 疫 苗 接 种 计 划 各 不 相 同, 这 取 决 于 生 物 安 全 和 地 方 疾 病 流 行 情 况 蛋 内 接 种 或 1 日 龄 免 疫 后, 在 10 日 龄 使 用 活 疫 苗 进 行 加 强 免 疫 是 某 些 病 毒 疫 苗 的 的 常 规 免 疫 策 略 然 而, 这 样 的 疫 苗 接 种 方 法 只 是 部 分 有 效, 而 且 在 许 多 情 况 下 保 护 不 足, 原 因 如 下 :(ⅰ) 母 源 抗 体 会 干 扰 免 疫 应 答 的 激 活 ; (ii) 出 孵 后 的 雏 鸡 免 疫 系 统 尚 不 完 全 成 熟 ;(iii) 接 种 存 在 部 分 毒 力 的 活 病 毒 会 引 起 免 疫 抑 制 ;(ⅳ) 免 疫 应 答 水 平 与 基 因 存 在 密 切 关 系, 尤 其 是 在 日 龄 较 小 时 结 果 是, 在 1 日 龄 进 行 免 疫 接 种 诱 导 的 鸡 群 的 保 护 性 抗 体 水 平 高 度 可 变 ( 在 本 研 究 中 的 图 1, 以 及 与 Leandro 的 研 究 相 一 致 ) 此 外, 在 母 源 抗 体 下 降 到 保 护 水 平 以 下, 疫 苗 诱 导 的 自 身 抗 体 出 现 之 前 的 这 段 时 期 内, 鸡 群 可 能 会 感 染 传 染 性 疾 病 这 一 时 期 可 以 通 过 接 种 高 滴 度 的 相 关 致 病 病 毒 的 被 动 免 疫 抗 体 来 消 除 肉 鸡 在 1 日 龄 时 使 用 特 异 性 抗 体 进 行 被 动 免 疫 具 有 以 下 优 点 :(ⅰ) 可 以 产 生 直 接 保 护, 没 有 滞 后 期 ;(ⅱ) 在 现 有 母 源 抗 体 基 础 上 添 加 IgY, 有 助 于 提 高 鸡 群 抗 体 水 平 的 均 匀 性 ; (ⅲ) 它 不 需 要 使 敏 感 的 1 日 龄 雏 鸡 接 触 活 病 毒 ; (iv) 可 通 过 高 滴 度 的 IgY 抗 体 延 长 其 保 护 期 ; (ⅴ) 因 为 IgY 是 从 超 免 母 鸡 中 纯 化 得 到 的, 它 是 抗 病 毒 的 高 亲 和 性 抗 体 ; (ⅵ ) 可 以 通 过 接 种 特 定 抗 体 的 混 合 物 来 同 时 提 供 针 对 多 种 病 原 体 的 保 护 蛋 黄 IgY 是 一 种 来 源 方 便 的 抗 体 鸡 舍 价 格 低 廉, 鸡 蛋 的 采 集 对 鸡 群 没 有 伤 害,IgY 的 分 离 快 速, 简 单 许 多 研 究 已 经 检 测 了 使 用 卵 黄 抗 体 来 控 制 动 物 疾 病 的 方 法 卵 黄 抗 体 的 产 量 依 赖 于 产 蛋 鸡 的 抗 体 滴 度, 其 与 鸡 蛋 中 特 异 性 IgY 的 浓 度 及 提 取 效 率 密 切 相 关 刚 孵 化 的 雏 鸡 的 NDV 疫 苗 接 种 计 划 主 要 依 赖 于 母 源 抗 体 和 主 动 免 疫 接 种 母 源 抗 体 和 疫 苗 接 种 后 的 自 身 抗 体 存 在 重 叠 对 于 实 现 持 续 的 保 护 至 关 重 要 问 题 在 于, 母 源 抗 体 消 退 和 疫 苗 接 种 后 自 身 抗 体 的 上 升 之 间 存 在 免 疫 空 窗 期 在 此 期 间, 鸡 群 对 于 病 原 体 高 度 敏 感, 并 可 威 胁 雏 鸡 和 整 个 鸡 群 的 安 全 本 研 究 的 目 的 是 建 立 一 个 预 防 接 种 方 法, 通 过 将 被 动 和 主 动 免 疫 接 种 相 结 合, 可 以 在 整 个 生 长 期 内 ( 最 长 40 天 ) 保 护 鸡 群 中 的 所 有 肉 鸡

被 动 免 疫 所 用 抗 体 是 从 超 免 蛋 鸡 所 产 蛋 中 有 效 提 取 出 来 的 本 研 究 中 使 用 HI 滴 度 作 为 NDV 中 和 抗 体 与 保 护 水 平 之 间 的 相 关 指 数 我 们 并 没 有 使 用 强 毒 NDV 进 行 攻 毒 实 验, 来 验 证 HI 抗 体 滴 度 在 4 以 上 的 保 护 水 平 然 而, 文 献 中 已 经 报 道 了 HI 效 价 与 攻 毒 实 验 的 保 护 水 平 之 间 存 在 直 接 联 系 在 本 研 究 中, 根 据 OIE 的 建 议, 我 们 将 HI 抗 体 滴 度 4 认 为 是 可 以 提 供 针 对 NDV 毒 株 的 保 护, 尽 管 最 近 的 一 些 研 究 已 经 显 示,HI 滴 度 3 就 可 以 产 生 保 护 我 们 对 进 行 被 动 免 疫 的 最 佳 接 种 途 径 和 IgY 的 量 进 行 了 测 定 皮 下 注 射 可 以 产 生 最 高 和 最 均 一 的 HI 滴 度 ( 图 2), 因 此 在 所 有 随 后 的 实 验 中 使 用 1 日 龄 免 疫 18 个 HI 的 IgY 的 保 护 期 比 免 疫 15 个 HI 的 IgY 的 保 护 期 要 长 ( 表 1) 用 18 个 HI 单 位 的 抗 NDV IgY 进 行 被 动 免 疫 可 以 将 保 护 期 延 长 到 至 少 17 日 龄 尽 管 这 一 延 长 仍 然 不 能 在 整 个 生 长 期 内 提 供 保 护, 但 可 以 避 免 母 源 抗 体 在 8-10 日 龄 时 下 降 到 保 护 水 平 以 下 这 样 我 们 就 将 主 动 免 疫 日 龄 延 长 到 免 疫 系 统 发 育 成 熟 的 日 龄, 并 且 可 以 在 被 动 免 疫 的 IgY 仍 然 提 供 保 护 的 情 况 下 产 生 自 身 免 疫 应 答 为 了 获 得 整 个 生 长 期 的 保 护, 我 们 对 被 动 免 疫 和 灭 活 疫 苗 或 减 毒 活 病 毒 的 联 合 免 疫 效 果 进 行 了 检 测 单 独 或 联 合 使 用 NDV 灭 活 疫 苗 进 行 免 疫, 与 单 独 通 过 被 动 免 疫 诱 导 的 保 护 时 间 相 比 并 没 有 延 长 ( 图 3) 在 1 日 龄 进 行 被 动 免 疫, 联 合 进 行 一 次 (1 日 龄 ) 或 两 次 (10 日 龄 ) 活 疫 苗 免 疫, 并 不 能 提 供 保 护, 这 可 能 是 由 于 雏 鸡 中 的 母 源 抗 体 处 在 较 高 水 平, 这 可 能 会 干 扰 活 疫 苗 的 复 制, 减 少 免 疫 力 的 产 生 ( 分 别 为 图 4A 和 B) 然 而, 在 1 日 龄 进 行 被 动 免 疫, 并 在 10 日 龄 联 合 进 行 一 次 活 疫 苗 免 疫, 在 整 个 生 长 期 内 诱 导 的 HI 滴 度 均 > 4, 最 高 可 延 长 至 41 天 ( 图 4C), 离 散 度 也 有 所 减 少 ( 图 5) 只 有 该 种 免 疫 组 合 实 现 了 疫 苗 滴 度 的 均 一 性, 这 意 味 着 所 有 的 雏 鸡 均 可 以 在 整 个 期 间 获 得 保 护, 包 括 母 源 抗 体 消 退 和 疫 苗 接 种 后 自 身 抗 体 的 上 升 之 间 的 免 疫 敏 感 期 在 此 期 间, 联 合 免 疫 产 生 的 保 护 性 抗 体 水 平 显 著 高 于 使 用 活 疫 苗 单 独 免 疫 的 抗 体 水 平 ( 图 5B 和 C) 本 研 究 中 实 验 是 在 靶 动 物 - 肉 鸡 中 进 行 的, 可 以 使 结 论 更 加 切 合 实 际 通 过 将 被 动 免 疫 和 减 毒 活 疫 苗 主 动 免 疫 相 结 合 的 免 疫 方 案, 可 以 在 整 个 生 长 期 内 ( 约 41 日 龄 ) 提 供 针 对 NDV 的 充 分 保 护 在 本 实 验 中 建 立 的 针 对 NDV 的 免 疫 方 法, 可 能 也 适 用 于 其 它 禽 类 病 毒 病 原 体, 如 传 染 性 法 氏 囊 病 病 毒 和 呼 肠 孤 病 毒