微生物学实验讲义

微 生 物 学 实 验 讲 义 生 物 实 验 教 学 中 心 主 编 : 高 平 2009-06-01

目 录 实 验 一 常 用 培 养 基 的 制 备 灭 菌 与 消 毒 实 验 二 土 壤 中 微 生 物 分 离 纯 化 培 养 实 验 三 菌 种 保 藏 实 验 四 细 菌 形 态 观 察 及 单 染 色 实 验 五 放 线 菌 及 霉 菌 形 态 观 察 实 验 六 革 兰 氏 染 色 及 芽 孢 染 色 实 验 七 酵 母 菌 的 形 态 观 察 及 死 活 细 胞 的 鉴 定 实 验 八 微 生 物 直 接 计 数 法 及 测 微 技 术 实 验 九 大 肠 杆 菌 生 长 曲 线 的 测 定 实 验 十 水 中 细 菌 总 数 的 测 定 实 验 十 一 细 菌 细 胞 的 生 化 反 应 实 验 实 验 十 二 噬 菌 体 的 分 离 纯 化 及 效 价 测 定

实 验 一 常 用 培 养 基 的 制 备 灭 菌 与 消 毒 了 解 培 养 基 的 配 制 原 理 ; 掌 握 配 制 培 养 基 的 一 般 方 法 和 步 骤 ; 了 解 常 见 灭 菌 清 毒 基 本 原 理 及 方 法 ; 掌 握 干 热 天 菌 高 压 蒸 汽 灭 菌 及 过 滤 除 菌 的 操 作 方 法 培 养 基 是 人 工 按 一 定 比 例 配 制 的 供 微 生 物 生 长 繁 殖 和 合 成 代 谢 产 物 所 需 要 的 营 养 物 质 的 混 合 物 培 养 基 的 原 材 料 可 分 为 碳 源 氮 源 无 机 盐 生 长 因 素 和 水 根 据 微 生 物 的 种 类 和 实 验 目 的 不 同, 培 养 基 也 有 不 同 的 种 类 和 配 制 方 法 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 是 一 种 应 用 最 广 泛 和 最 普 通 的 细 菌 基 础 培 养 基, 有 时 又 称 为 普 通 培 养 基 由 于 这 种 培 养 基 中 含 有 一 般 细 胞 生 长 繁 殖 所 需 要 的 最 基 本 的 营 养 物 质, 所 以 可 供 微 生 物 生 长 繁 殖 之 用 干 热 天 菌 高 压 蒸 汽 灭 菌 方 法 主 要 是 通 过 升 温 使 蛋 白 质 变 性 从 而 达 到 杀 死 微 生 物 的 效 果 1. 器 材 试 管 三 角 瓶 烧 杯 量 筒 玻 璃 棒 培 养 基 分 装 器 天 平 牛 角 匙 高 压 蒸 汽 灭 菌 锅 ph 度 纸 棉 花 牛 皮 纸 记 号 笔 麻 绳 纱 布 吸 管 培 养 皿 电 烘 箱 注 射 器 微 孔 滤 膜 过 滤 器 镊 子 等 2. 试 剂 牛 肉 膏 蛋 白 胨 NaCl 琼 脂 1. 称 量 溶 化 调 ph 过 滤 分 装 加 塞 包 扎 灭 菌 无 菌 检 查 2. 干 热 灭 菌 : 装 入 待 灭 菌 物 品 升 温 恒 温 降 温 开 箱 取 物 3. 高 压 蒸 汽 灭 菌 : 加 水 装 物 品 加 盖 加 热 排 冷 空 气 加 压 恒 压 降 压 回 零 排 汽 取 物 无 菌 检 查 4. 过 滤 除 菌 : 组 装 灭 菌 连 接 压 滤 无 菌 检 查 清 洗 灭 菌 1. 要 严 格 按 配 方 配 制 2. 调 ph 不 要 过 头 3. 干 热 灭 菌 要 注 意 物 品 不 要 堆 放 过 紧, 注 意 温 度 的 时 间 控 制,70ºC 以 下 放 物 取 物 4. 高 压 灭 菌 要 注 意 物 品 不 要 过 多, 加 热 后 排 除 冷 空 气, 到 时 降 压 回 零 取 物 5. 过 滤 除 菌 要 注 意 各 部 件 灭 菌, 压 滤 时, 压 力 要 适 当, 不 可 太 猛 太 快, 滤 膜 要 注 意 清 洗 保 存 1. 培 养 基 配 好 后, 为 什 么 必 须 立 即 灭 菌? 如 何 检 查 灭 菌 后 的 培 养 基 是 无 菌 的? 2. 在 配 制 培 养 基 的 操 作 过 程 中 应 注 意 些 什 么 问 题? 为 什 么? 3. 培 养 微 生 物 的 培 养 基 应 具 备 哪 些 条 件? 为 什 么? 4. 培 养 基 的 配 制 原 则 是 什 么?

实 验 二 土 壤 中 微 生 物 分 离 纯 化 培 养 掌 握 倒 平 板 的 方 法 和 几 种 常 用 的 分 离 纯 化 微 生 物 的 基 本 操 作 技 术 ; 了 解 不 同 的 微 生 物 菌 落 在 斜 面 上 半 固 体 培 养 基 和 液 体 培 养 基 中 的 生 长 特 征 ; 进 一 步 熟 练 和 掌 握 微 生 物 无 菌 操 作 技 术 ; 掌 握 微 生 物 培 养 方 法 从 混 杂 的 微 生 物 群 体 中 获 得 只 含 有 某 一 种 或 某 一 株 微 生 物 的 过 程 称 为 微 生 物 的 分 离 与 纯 化 常 用 的 分 离 纯 化 方 法 : 单 细 胞 挑 取 法, 稀 释 涂 布 平 板 法, 稀 释 混 合 平 板 法, 平 板 划 线 法 稀 释 涂 布 平 板 法 步 骤 : 倒 平 板 - 制 备 土 壤 污 水 稀 释 液 - 涂 布 - 培 养 - 挑 菌 落 ; 平 板 划 线 法 步 骤 : 倒 平 板 - 标 记 培 养 基 名 称 - 划 线 1. 器 材 盛 9m1 无 菌 水 的 试 管 盛 90m1 无 菌 水 并 带 有 玻 璃 珠 的 三 角 烧 瓶 无 菌 玻 璃 涂 棒 无 菌 吸 管 接 种 环 酒 精 灯 无 菌 培 养 皿 显 微 镜 血 细 胞 计 数 板 等 2. 试 剂 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基, 高 氏 1 号 培 养 基, 查 氏 培 养 基 1. 土 壤 稀 释 液 的 制 备 2. 微 生 物 分 离 纯 化 : 稀 释 涂 平 板 法, 平 皿 划 线 分 离 法, 微 生 物 培 养 技 术 1. 掌 握 含 菌 培 养 基 的 配 制, 严 格 控 制 温 度 2. 平 板 划 线 应 防 止 染 菌, 同 时 应 注 意 划 线 深 度 及 密 度 1. 如 何 确 定 平 板 上 某 单 个 菌 落 是 否 为 纯 培 养? 请 写 出 实 验 的 主 要 步 骤 2. 如 果 要 分 离 得 到 极 端 嗜 盐 细 菌, 在 什 么 地 方 取 样 品 为 宜? 并 说 明 理 由 实 验 三 菌 种 保 藏 1. 学 习 并 掌 握 菌 种 保 藏 的 基 本 原 理 2. 掌 握 常 用 的 几 种 不 同 的 菌 种 保 藏 方 法 微 生 物 个 体 微 小 代 谢 旺 盛 生 长 繁 殖 快, 如 果 保 存 不 妥 容 易 发 生 变 异 和 杂 菌 污 染, 甚 至 导 致 细 胞 死 亡 等 现 象 因 此, 保 存 好 菌 种 是 非 常 必 要 和 重 要 的

常 用 的 菌 种 保 藏 方 法 包 括 传 代 培 养 法 载 体 法 悬 液 法 冷 冻 法 和 真 空 干 燥 法 1. 材 料 大 肠 杆 菌 青 霉 菌 放 线 菌 2. 试 剂 液 体 石 蜡 甘 油 五 氧 化 二 磷 95% 乙 醇 10% 盐 酸 无 水 氯 化 钙 食 盐 干 冰 3. 器 材 无 菌 吸 管 无 菌 滴 管 无 菌 培 养 皿 ; 安 额 管 冻 干 管 40 目 与 100 目 筛 子 油 纸 滤 纸 条 (0.5X1.2cm) 干 燥 器 真 泵 器 真 空 泵 真 空 压 力 表 喷 灯 L 形 五 通 管 冰 箱 低 温 冰 箱 ( 30 ) 超 低 温 冰 箱 和 液 氮 罐 等 1. 斜 面 保 藏 法 2. 液 体 石 蜡 法 3. 穿 刺 保 藏 法 4. 砂 土 管 保 藏 法 5. 冷 冻 真 空 干 燥 保 存 法 1. 清 楚 各 种 保 藏 方 法 的 优 缺 点, 针 对 不 同 要 求 选 择 适 宜 的 保 藏 方 法 2. 熔 封 安 瓶 时 防 止 封 闭 不 严 3. 液 氮 冻 存 操 作 应 防 止 冻 伤 根 据 你 自 己 的 实 验 谈 谈 1--2 种 菌 种 保 藏 方 法 的 利 弊? 实 验 四 细 菌 形 态 观 察 及 单 染 色 1. 了 解 简 单 染 色 法 的 原 理, 并 掌 握 其 操 作 方 法 2. 学 习 并 掌 握 微 生 物 涂 片 染 色 的 基 本 技 术 和 无 菌 操 作 技 术 3. 巩 固 显 微 镜 ( 油 镜 ) 的 使 用 方 法 4. 初 步 认 识 细 菌 的 形 态 特 征 细 菌 个 体 微 小, 且 较 透 明, 必 须 借 助 染 色 法 使 菌 体 着 色, 与 背 景 形 成 鲜 明 的 对 比, 以 便 在 显 微 镜 下 进 行 观 察 根 据 实 验 目 的 不 同, 可 分 为 简 单 染 色 法 鉴 别 染 色 法 和 特 殊 染 色 法 等 简 单 染 色 法 是 最 基 本 的 染 色 方 法, 是 利 用 单 一 染 料 对 细 菌 进 行 染 色 此 法 操 作 简 便, 适 用 于 菌 体 一 般 形 状 和 细 菌 排 列 的 观 察 常 用 碱 性 染 料 进 行 简 单 染 色 1. 材 料 大 肠 杆 菌, 枯 草 芽 孢 杆 菌

2. 试 剂 吕 氏 碱 性 美 蓝 染 液 ( 或 草 酸 铵 结 晶 紫 染 液 ) 齐 氏 石 炭 酸 复 红 染 液 3. 器 材 显 微 镜 酒 精 灯 载 玻 片 接 种 环 双 层 瓶 ( 内 装 香 柏 油 和 二 甲 苯 ) 等 简 单 染 色 法 : 涂 片 干 燥 固 定 染 色 水 洗 干 燥 镜 检 1. 涂 片 时, 生 理 盐 水 及 取 菌 不 宜 过 多, 涂 片 应 尽 可 能 均 匀, 2. 水 洗 步 骤 水 流 不 宜 过 大, 过 急, 以 免 涂 片 薄 膜 脱 落 1. 你 认 为 制 备 细 菌 染 色 标 本 时, 尤 其 应 该 注 意 哪 些 环 币? 2. 为 什 么 要 求 制 片 完 全 干 燥 后 才 能 用 油 镜 观 察? 3. 如 果 你 的 涂 片 未 经 热 固 定, 将 会 出 现 什 么 问 题? 如 果 加 热 温 度 过 高 时 间 太 长, 又 会 怎 样 呢? 实 验 五 放 线 菌 及 霉 菌 形 态 观 察 1. 了 解 放 线 菌 霉 菌 形 态 观 察 的 原 理 2. 学 习 并 掌 握 观 察 放 线 菌 霉 菌 形 态 的 操 作 方 法 3. 初 步 了 解 放 线 菌 霉 菌 的 形 态 特 征 放 线 菌 是 指 能 形 成 分 枝 丝 状 体 或 菌 丝 体 的 一 类 革 兰 氏 阳 性 细 菌 常 见 放 线 菌 大 多 能 形 成 菌 丝 体, 紧 贴 培 养 基 表 面 或 深 入 培 养 基 内 生 长 的 叫 基 内 菌 丝 ( 简 称 基 丝 ), 基 丝 生 长 到 一 定 阶 段 还 能 向 空 气 中 生 长 出 气 生 菌 丝 ( 简 称 气 丝 ), 并 进 一 步 分 化 产 生 孢 子 丝 及 孢 子 有 的 放 线 菌 只 产 生 基 丝 而 无 气 丝 在 显 微 镜 下 直 接 观 察 时, 气 丝 在 上 层 基 丝 在 下 层, 气 丝 色 暗, 基 丝 较 透 明 孢 子 丝 依 种 类 的 不 同, 有 直 波 曲 各 种 螺 旋 形 或 轮 生 霉 菌 可 产 生 复 合 分 枝 的 菌 丝 体, 分 基 内 菌 丝 和 气 生 菌 丝, 气 生 菌 丝 生 长 到 一 定 阶 段 分 化 产 生 繁 殖 菌 丝, 由 繁 殖 菌 丝 产 生 孢 子 霉 菌 菌 丝 体 ( 尤 其 是 繁 殖 菌 丝 ) 及 孢 子 的 形 态 特 征 是 识 别 不 同 种 类 霉 菌 的 重 要 依 据 霉 菌 菌 丝 和 孢 子 的 宽 度 通 常 比 细 菌 和 放 线 菌 粗 得 多, 常 是 细 菌 菌 体 宽 度 的 几 倍 至 几 十 倍, 因 此, 用 低 倍 显 微 镜 即 可 观 察 人 们 设 计 了 各 种 培 养 和 观 察 方 法, 这 些 方 法 的 主 要 目 的 是 为 了 尽 可 能 保 持 放 线 菌 自 然 生 长 状 态 下 的 形 态 特 征 本 实 验 采 用 插 片 法 插 片 法 : 将 放 线 菌 接 种 在 琼 脂 平 板 上, 插 上 灭 菌 盖 玻 片 后 培 养, 使 放 线 菌 菌 丝 沿 着 培 养 基 表 面 与 盖 玻 片 的 交 接 处 生 长 而 附 着 在 盖 玻 上 观 察 时, 轻 轻 取 出 盖 玻 片, 置 于 载 玻 片 上 直 接 镜 检 这 种 方 法 可 观 察 到 放 线 菌 自 然 生 长 状 态 下 的 特 征, 而 且 便 于 观 察 不 同 生 长 期 的 形 态

1. 材 料 黑 曲 霉 青 霉 和 根 霉, 细 黄 链 霉 菌 或 青 色 链 霉 菌, 灭 菌 的 高 氏 I 号 琼 脂 和 灭 菌 的 查 氏 培 养 基 2. 实 验 器 材 经 灭 菌 的 : 平 皿 玻 璃 纸 无 菌 吸 管 盖 玻 片 玻 璃 涂 棒, 以 及 载 玻 片 接 种 环 接 种 铲 镊 子 显 微 镜 等 倒 平 板 接 种 插 片 培 养 镜 检 1. 倒 平 板 要 厚 一 些, 接 种 时 划 线 要 密 2. 插 片 时 要 有 一 定 角 度 并 与 划 线 垂 直 3. 观 察 时, 宜 用 略 暗 光 线 ; 先 用 低 倍 镜 找 到 适 当 视 野, 更 换 高 倍 镜 观 察 4. 如 果 用 0.1% 美 蓝 对 培 养 后 的 盖 玻 片 进 行 染 色 后 观 察, 效 果 会 更 好 1. 镜 检 时, 你 如 何 区 分 放 线 菌 的 基 内 菌 丝 和 气 生 菌 丝? 2. 你 认 为 霉 菌 和 放 线 菌 菌 丝 的 主 要 区 别 是 什 么? 实 验 六 革 兰 氏 染 色 及 芽 孢 染 色 1. 了 解 革 兰 氏 染 色 法 和 芽 孢 染 色 法 的 原 理, 并 掌 握 其 操 作 方 法 2. 了 解 革 兰 氏 染 色 法 在 细 菌 分 类 鉴 定 中 的 重 要 性 3. 学 习 并 掌 握 微 生 物 涂 片 染 色 的 基 本 技 术 和 无 菌 操 作 技 术 4. 学 习 显 微 镜 ( 油 镜 ) 的 使 用 方 法 5. 初 步 认 识 细 菌 的 形 态 特 征 革 兰 氏 染 色 法 的 基 本 步 骤 是 : 先 用 初 染 剂 结 晶 紫 进 行 染 色, 再 用 碘 液 媒 染, 然 后 用 乙 醇 ( 或 丙 酮 ) 脱 色, 最 后 用 复 染 剂 ( 如 番 红 ) 复 染 经 此 方 法 染 色 后, 细 胞 保 留 初 染 剂 蓝 紫 色 的 细 菌 为 革 兰 氏 阳 性 菌 ; 如 果 细 胞 中 初 染 剂 被 脱 色 剂 洗 脱 而 使 细 菌 染 上 复 染 剂 的 颜 色 ( 红 色 ), 该 菌 属 于 革 兰 氏 阴 性 菌 革 兰 氏 染 色 反 应 是 细 菌 重 要 的 鉴 别 特 征, 为 保 证 染 色 结 果 的 正 确 性, 采 用 规 范 的 染 色 方 法 是 十 分 必 要 的 芽 孢 染 色 法 的 基 本 原 理, 用 着 色 力 强 的 染 色 剂 孔 雀 绿 或 石 炭 酸 复 红, 在 加 热 条 件 下 染 色, 使 染 料 不 仅 进 入 菌 体 也 可 进 入 芽 孢 内, 进 入 菌 体 的 染 料 经 水 洗 后 被 脱 色, 而 芽 孢 一 经 着 色 难 以 被 水 洗 脱, 当 用 对 比 度 大 的 复 染 剂 染 色 后, 芽 孢 仍 保 留 初 染 剂 的 颜 色, 而 菌 体 和 芽 孢 囊 被 染 成 复 染 剂 的 颜 色, 使 芽 孢 和 菌 体 更 易 于 区 分

1. 材 料 : 枯 草 芽 孢 杆 菌 12~18h 营 养 琼 脂 斜 面 培 养 物, 大 肠 杆 菌 约 24h 营 养 琼 脂 斜 面 培 养 物 2. 试 剂 革 兰 氏 染 色 液 ( 结 晶 紫 液 碘 液 95% 乙 醇 番 红 液 ) 5% 孔 雀 绿 水 溶 液 3. 实 验 器 材 小 试 管 滴 管 烧 杯 试 管 架 滤 纸 木 夹 子 载 玻 片 盖 玻 片 凹 载 玻 片 无 菌 水 显 微 镜 等 接 种 环 双 层 瓶 ( 内 装 香 柏 油 和 二 甲 苯 ) 擦 镜 纸 生 理 盐 水 等 1. 革 兰 氏 染 色 法 制 片 初 染 媒 染 脱 色 复 染 镜 检 2.Schaefer-Fulton 氏 染 色 法 制 片 染 色 水 洗 复 染 水 洗 镜 检 1. 涂 片 时, 生 理 盐 水 及 取 菌 不 宜 过 多, 涂 片 应 尽 可 能 均 匀, 2. 乙 醇 脱 色 是 革 兰 氏 染 色 操 作 的 关 键 环 节, 严 格 掌 握 脱 色 时 间 1. 你 认 为 要 得 到 正 确 的 改 良 的 革 兰 氏 染 色 结 果 必 须 注 意 哪 些 操 作? 关 键 在 哪 一 步? 为 什 么? 2. 现 有 一 株 细 菌 宽 度 明 显 大 于 大 肠 杆 菌 的 粗 壮 杆 菌, 请 你 鉴 定 其 革 兰 氏 染 色 反 应 你 怎 样 运 用 大 肠 杆 菌 和 金 黄 色 葡 萄 球 菌 为 对 照 菌 株 进 行 涂 片 染 色, 以 证 明 你 的 染 色 结 果 正 确 性 3. 你 的 染 色 结 果 是 否 正 确? 如 果 不 正 确, 请 说 明 原 因 4. 若 涂 片 中 观 察 到 的 只 是 大 量 游 离 芽 孢, 很 少 看 到 芽 孢 囊 及 营 养 细 胞, 你 认 为 这 是 什 么 原 因? 5. 说 明 芽 孢 染 色 法 的 原 理 用 简 单 染 色 法 能 否 观 察 到 细 菌 的 芽 孢? 实 验 七 酵 母 菌 的 形 态 观 察 及 死 活 细 胞 的 鉴 定 1. 观 察 酵 母 菌 的 形 态 特 征 出 芽 生 殖 方 式, 并 掌 握 酵 母 菌 与 细 菌 形 态 特 征 的 区 别 2. 学 习 鉴 别 死 活 细 胞 的 实 验 方 法 酵 母 菌 是 单 细 胞 的 真 核 微 生 物, 菌 体 比 细 菌 大 而 且 不 运 动 酵 母 菌 的 繁 殖 方 式 分 为 无 性 繁 殖 和 有 性 繁 殖 两 种, 以 无 性 繁 殖 为 主 芽 殖 是 酵 母 菌 普 遍 的 无 性 繁 殖 方 式, 少 数 为 裂 殖 ; 有 性 繁 殖 是 产 生 子 囊 和 子 囊 孢 子 本 实 验 是 通 过 美 蓝 染 液 水 浸 片 和 水 一 碘 液 水 浸 片 来 观 察 酵 母 的 形 态 和 芽 殖 方 式 美 蓝 是 一 种 无 毒 性 的 染 料, 它 的 氧 化 型 呈 蓝 色, 还 原 型 无 色 用 美 蓝 对 酵 母 活 细 胞 染 色 时, 由 于 细 胞 的 新 陈 代 谢 作 用, 细 胞 内 具 有 较 强 的 还 原 能 力, 能 使 美 蓝 由 蓝 色 的 氧 化 型 变 为 无 色 的 还 原 型, 而 对 代 谢 作 用 微 弱 或 死 细 胞, 无 此 还 原 能

力 或 还 原 能 力 极 弱, 而 被 美 蓝 染 成 蓝 色 或 淡 蓝 色 因 此, 不 仅 用 此 法 可 观 察 酵 母 细 胞 形 态, 也 可 用 来 鉴 别 酵 母 菌 的 死 细 胞 和 活 细 胞 1. 材 料 酿 酒 酵 母 (Saccharomyces cerevisiae) 或 卡 尔 酵 母 (Saccharomyces calsbergensis) 培 养 2 天 左 右 的 麦 芽 汁 ( 或 豆 芽 汁 ) 液 体 培 养 物 2. 试 剂 0.05% 和 O.1% 吕 氏 碱 性 美 蓝 染 色 液 革 兰 氏 染 色 用 的 碘 液 3. 器 材 显 微 镜 载 玻 片 盖 玻 片 接 种 环 洒 精 灯 等 1. 美 蓝 浸 片 观 察 酵 母 培 养 制 片 染 色 镜 检 30 分 钟 后 再 镜 检 2. 水 - 碘 浸 片 观 察 1. 染 液 不 宜 过 多 或 过 少, 否 则, 在 盖 上 盖 玻 片 时, 菌 液 溢 出 或 出 现 大 量 气 泡 2. 用 镊 子 取 一 块 盖 玻 片, 先 将 一 侧 与 菌 液 接 触, 然 后 慢 慢 将 盖 玻 片 放 下, 使 其 盖 在 菌 液 上, 盖 玻 片 不 宜 平 着 放 下, 避 免 气 泡 产 生 1. 吕 氏 碱 性 美 蓝 染 液 浓 度 和 作 用 时 间 的 不 同, 对 酵 母 菌 死 细 胞 数 量 有 何 影 响? 试 分 析 其 原 因 2. 在 显 微 镜 下, 酵 母 菌 有 哪 些 突 出 的 特 征 区 别 于 一 般 细 菌? 实 验 八 微 生 物 直 接 计 数 法 及 测 微 技 术 1. 了 解 血 球 计 数 板 计 数 原 理, 并 掌 握 计 数 方 法 2. 掌 握 用 测 微 尺 测 定 微 生 物 大 小 的 方 法 显 微 镜 直 接 计 数 法 是 将 一 定 稀 释 的 菌 体 或 孢 子 悬 液 注 入 血 球 计 数 板 的 计 数 室 中, 于 显 微 镜 下 直 接 计 数 的 一 种 简 便 快 速 直 观 的 方 法 因 为 计 数 板 是 一 块 特 别 的 载 玻 片 其 上 由 四 条 槽 构 成 三 个 平 台 ; 中 间 较 宽 的 平 台 又 被 一 短 横 槽 隔 成 两 半, 每 一 边 的 平 台 上 各 刻 有 一 个 方 格 网, 每 个 方 格 网 共 分 为 九 个 大 方 格, 一 种 是 一 个 大 方 格 分 成 25 个 中 方 格, 而 每 个 中 方 格 又 分 成 16 个 小 方 格 ( 见 图 2 3 44); 另 一 种 是 一 个 大 方 格 分 成 16 个 中 方 格, 每 个 中 方 格 又 分 成 25 个 小 方 格, 无 论 哪 种 每 个 大 方 格 中 的 小 方 格 都 是 400 个 每 一 个 大 方 格 边 长 为 0.1mm, 所 以 计 数 室 的 容 积 为 0.1mm3 计 数 时, 通 常 只 用 5 个 中 格 内 的 菌 体 ( 孢 子 ) 数 即 可 然 后 求 出 每 个 中 方 格 的 平 均 值, 再 乘 上 25 或 16, 得 出 一 个 大 方 格 中 的 总 茵 数, 再 换 算 成 lml 菌 液 中 的 总 菌 数 若 设 5 个 中 方 格 中 总 菌 数 为 N, 菌 液 稀 释 倍 数 为 M, 如 果 是 25 个 中 方 格 计 数 板, 则 计 算 方 法 为 : lml 菌 液 中 的 总 菌 数 = 平 均 每 个 中 格 中 菌 的 个 数 25 10 4 M=50000N M( 个 )

微 生 物 细 胞 的 大 小 是 微 生 物 基 本 的 形 态 特 征, 也 是 分 类 鉴 定 的 依 据 之 一 微 生 物 大 小 的 测 定, 需 要 在 显 微 镜 下, 借 助 于 特 殊 的 测 量 工 具 测 微 尺, 包 括 目 镜 测 微 尺 和 镜 台 测 微 尺 镜 台 测 微 尺 是 中 央 部 分 刻 有 精 确 等 分 线 的 载 玻 片, 一 般 是 将 1mm 等 分 为 100 格, 每 格 长 0.01mm( 即 10pm) 镜 台 测 微 尺 并 不 直 接 用 来 测 量 细 胞 的 大 小, 而 是 用 于 校 正 目 镜 测 微 尺 每 格 的 相 对 长 度 1. 材 料 酿 酒 酵 母 藤 黄 微 球 菌 和 大 肠 杆 菌 的 染 色 标 本 片 酿 酒 酵 母 24h 马 铃 薯 斜 面 培 养 物 2. 实 验 器 材 细 胞 计 数 板 显 微 镜 盖 玻 片 无 菌 毛 细 滴 管 目 镜 测 微 尺 镜 台 测 微 尺 载 玻 片 盖 玻 片 显 微 镜 等 1. 微 生 物 直 接 计 数 法 菌 悬 液 制 备 镜 检 计 数 室 加 样 品 显 微 镜 计 数 清 洗 血 细 胞 计 数 板 2. 微 生 物 测 微 技 术 装 目 镜 测 微 尺 校 正 菌 体 大 小 测 定 1. 防 止 加 样 空 气 泡 产 生 2. 调 节 显 微 镜 光 线 的 强 弱 适 当 1. 根 据 你 的 体 会, 说 明 用 血 细 胞 计 数 板 计 数 的 误 差 主 要 来 自 哪 些 方 面? 应 如 何 尽 量 减 少 误 差 力 求 准 确? 2. 某 单 位 要 求 知 道 一 种 干 酵 母 粉 中 的 活 菌 存 活 率, 请 设 计 1~2 种 可 行 的 检 测 方 法 3. 为 什 么 更 换 不 同 放 大 倍 数 的 目 镜 或 物 镜 时, 必 须 用 镜 台 测 微 尺 重 新 对 目 镜 测 微 尺 进 行 校 正? 实 验 九 大 肠 杆 菌 生 长 曲 线 的 测 定 1. 了 解 大 肠 杆 菌 的 生 长 曲 线 特 征 和 繁 殖 规 律, 并 学 会 绘 制 生 长 曲 线 2. 复 习 光 电 比 浊 法 测 量 细 菌 数 量 的 方 法 将 一 定 量 的 细 菌 转 入 新 鲜 液 体 培 养 基 中, 在 适 宜 的 条 件 下 培 养 细 胞 要 经 历 延 迟 期 对 数 期 稳 定 期 和 衰 亡 期 四 个 阶 段 以 培 养 时 间 为 横 坐 标, 以 细 菌 数 目 的 对 数 或 生 长 速 率 为 纵 坐 标 作 图 所 绘 制 的 曲 线 称 为 该 细 菌 的 生 长 曲 线 不 同 的 细 菌 在 相 同 的 培 养 条 件 下 其 生 长 曲 线 不 同, 同 样 的 细 菌 在 不 同 的 培 养 条 件 下 所 绘 制

的 生 长 曲 线 也 不 相 同 1. 材 料 与 试 剂 大 肠 杆 菌 LB 液 体 培 养 基 70ml 分 装 2 支 大 试 管 (5ml/ 支 ) 剩 余 60ml 装 入 250ml 的 三 角 瓶 2. 器 材 722 型 分 光 光 度 计 恒 温 振 荡 摇 床 无 菌 试 管 无 菌 吸 管 等 编 号 接 种 培 养 比 浊 测 定 1. 测 定 OD 值 时, 要 求 从 低 浓 度 到 高 浓 度 测 定 2. 严 格 控 制 培 养 时 间 1. 根 据 实 验 数 据 画 出 生 长 曲 线, 并 说 明 大 肠 杆 菌 生 长 特 征 2. 如 果 用 活 菌 计 数 法 制 作 生 长 曲 线, 你 认 为 会 有 什 么 不 同? 两 者 各 有 什 么 缺 点 7. 3. 次 生 礼 谢 产 物 的 大 量 积 累 在 哪 个 时 期? 根 据 细 菌 生 长 繁 殖 的 规 律, 采 用 哪 些 措 施 可 使 次 生 代 谢 产 物 积 累 更 多? 实 验 十 水 中 细 菌 总 数 的 测 定 1. 学 习 水 样 的 采 取 方 法 和 水 样 细 菌 总 数 测 定 的 方 法 2. 了 解 水 源 水 的 平 板 菌 落 计 数 的 原 理 本 实 验 应 用 平 板 计 数 技 术 测 定 水 中 细 菌 总 数 由 于 水 中 细 菌 种 类 繁 多, 它 们 对 营 养 和 其 他 生 长 条 件 的 要 求 差 别 很 大, 不 可 能 找 到 一 种 培 养 基 在 一 种 条 件 下, 使 水 中 所 有 的 细 菌 均 能 生 长 繁 殖, 因 此, 以 一 定 的 培 养 基 平 板 上 生 长 出 来 的 菌 落, 计 算 出 来 的 水 中 细 菌 总 数 仅 是 一 种 近 似 值 目 前 一 般 是 采 用 普 通 牛 肉 膏 蛋 白 胨 琼 脂 培 养 基 1. 试 剂 牛 肉 膏 蛋 白 胨 琼 脂 培 养 基, 灭 菌 水 2. 器 材 灭 菌 三 角 瓶, 灭 菌 的 带 玻 璃 塞 瓶, 灭 菌 培 养 皿, 灭 菌 吸 管, 灭 菌 试 管 等 1. 水 样 的 采 取 2. 细 菌 总 数 测 定 3. 菌 落 计 数 方 法

1. 注 意 全 过 程 防 止 染 菌 从 自 来 水 的 细 菌 总 数 结 果 来 看, 是 否 合 乎 饮 用 水 的 标 准? 实 验 十 一 细 菌 细 胞 的 生 化 反 应 实 验 了 解 并 掌 握 细 菌 鉴 定 中 常 用 生 理 生 化 反 应 的 原 理 和 方 法 各 种 细 菌 由 于 具 有 不 同 的 酶 系 统, 致 使 它 们 能 利 用 不 同 的 底 物, 或 虽 然 可 以 利 用 相 同 的 底 物, 却 产 生 不 同 的 代 谢 产 物, 因 此 可 以 利 用 各 种 生 理 生 化 反 应 来 鉴 别 细 菌 糖 发 酵 是 最 常 用 的 生 化 反 应, 存 在 于 大 多 数 细 菌 中 不 同 的 细 菌 在 糖 的 分 解 能 力 上 存 在 很 大 的 差 异 有 些 细 菌 能 分 解 某 种 糖 并 产 生 酸 性 物 质 ( 如 乳 酸 丙 酸 醋 酸 等 ) 和 气 体 ( 如 二 氧 化 碳 氢 甲 烷 等 ), 而 有 些 细 菌 只 产 生 酸 不 产 生 气 体 例 如 大 肠 杆 菌 分 解 乳 糖 和 葡 萄 糖 产 酸 并 产 气, 普 通 变 形 杆 菌 分 解 葡 萄 糖 产 酸 产 气, 但 不 能 分 解 乳 糖 酸 的 产 生 可 利 用 指 示 剂 来 判 断 在 培 养 基 中 加 入 溴 甲 酚 紫 (ph5.2 为 黄 色,pH6.8 为 紫 色 ), 当 发 酵 产 酸 时, 使 培 养 基 由 紫 色 变 为 黄 色 气 体 的 产 生 可 由 发 酵 试 管 中 倒 置 的 德 汉 氏 小 管 中 有 无 气 泡 的 出 现 来 验 证. 1. 材 料 大 肠 杆 菌 普 通 变 性 杆 菌 产 气 杆 菌 糖 发 酵 培 养 基 蛋 白 胨 水 培 养 基 葡 萄 糖 蛋 白 胨 水 培 养 基 2. 试 剂 甲 基 红 试 剂 40%KOH 5%a 一 萘 酚 乙 醚 吲 哚 试 剂 3. 实 验 器 材 德 汉 氏 小 管 试 管 接 种 环 恒 温 培 养 箱 培 养 基 配 制 编 号 试 管 接 种 培 养 观 察 结 果 1. 要 严 格 按 照 培 养 基 配 方 配 制 培 养 基 2. 观 察 结 果 时 要 注 意 滴 加 药 量 及 反 应 时 间 1. 哪 些 生 理 生 化 试 验 可 用 于 区 别 大 肠 杆 菌 和 产 生 肠 杆 菌? 结 果 如 何? 2. 做 糖 发 酵 试 验 时 应 注 意 哪 些 问 题?

3. 甲 基 红 试 验 和 伏 一 普 试 验 的 最 终 产 物 如 何? 为 什 么 会 出 现 不 同 的 最 终 产 物? 实 验 十 二 噬 菌 体 的 分 离 纯 化 及 效 价 测 定 1. 学 习 分 离 纯 化 噬 菌 体 的 原 理 和 方 法 2. 观 察 噬 菌 斑 的 形 态 和 大 小 3. 掌 握 噬 菌 体 效 价 测 定 的 基 本 方 法 噬 菌 体 是 细 菌 的 专 性 寄 生 物, 自 然 界 中 凡 是 有 细 菌 存 在 的 地 方, 均 可 以 发 现 其 特 异 性 的 噬 菌 体, 噬 菌 体 侵 入 细 菌 细 胞 后, 利 用 宿 主 细 胞 的 酶 系 统 进 行 复 制 和 增 殖, 最 终 导 致 细 菌 细 胞 裂 解, 噬 菌 体 从 细 胞 中 释 放 出 来, 可 以 进 一 步 侵 染 细 菌 细 胞 在 液 体 培 养 基 中, 噬 菌 体 可 以 使 浑 浊 的 菌 悬 液 变 为 澄 清 在 长 有 宿 主 细 菌 的 固 体 培 养 基 平 板 上, 噬 菌 体 可 以 裂 解 细 菌 形 成 透 明 的 空 斑, 即 噬 菌 斑, 一 个 噬 菌 体 产 生 一 个 噬 菌 斑, 因 此 可 以 利 用 这 个 性 质 对 噬 菌 体 进 行 分 离 和 效 价 的 测 定 噬 菌 体 的 效 价 是 指 噬 菌 体 的 浓 度, 即 一 毫 升 培 养 液 中 所 含 有 的 噬 菌 体 数 量 噬 菌 体 效 价 的 测 定 方 法 多 采 用 双 层 琼 脂 平 板 法 先 在 培 养 皿 中 倒 入 底 层 固 体 培 养 基, 凝 固 后 再 倒 入 含 有 宿 主 细 菌 和 一 定 稀 释 度 噬 菌 体 的 半 固 体 培 养 基 培 养 一 段 时 间 后, 计 算 噬 菌 斑 的 数 量 1. 材 料 大 肠 杆 菌 牛 肉 膏 蛋 白 胨 固 体 培 养 基 牛 肉 膏 蛋 白 胨 半 固 体 培 养 基 ( 含 有 琼 脂 0.5%, 试 管 分 装, 每 管 3~5m1) 三 倍 浓 缩 的 牛 肉 膏 蛋 白 胨 液 体 培 养 基 2. 器 材 培 养 皿 无 菌 吸 管 三 角 瓶 抽 滤 瓶 蔡 氏 细 菌 滤 器 真 空 泵 阴 沟 污 水 噬 菌 体 分 离 噬 菌 体 纯 化 效 价 测 定 1. 噬 菌 体 时 要 注 意 细 菌 滤 器 的 型 号 2. 纯 化 噬 菌 体 时 要 注 意 形 态 大 小 3. 效 价 测 定 时 要 注 意 双 层 琼 脂 平 板 法 的 使 用 技 巧 1. 在 固 体 培 养 基 平 板 上 为 什 么 能 形 成 噬 茵 斑? 2. 从 固 体 培 养 基 平 板 上 得 到 的 噬 菌 斑 数 目, 如 何 计 算 噬 菌 体 的 效 价?