Vol. 36 高 等 学 校 化 学 学 报 No. 5 2015 年 5 月 摇 摇 摇 摇 摇 摇 CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES 摇 摇 摇 摇 摇 摇 886 ~ 892 摇 摇 doi: 10. 7503 / cjcu20140965 一 种 新 的 混 合 斑 精 子 分 离 方 法 伍 贤 军 1,2, 赵 摇 兵 2, 缪 摇 璇 2, 钱 摇 程 1, 王 冰 瑜 2, 李 晓 萌 2 1, 杨 百 全 (1. 吉 林 省 公 安 厅 物 证 鉴 定 中 心, 长 春 130051; 2. 东 北 师 范 大 学 生 命 科 学 学 院 分 子 表 观 遗 传 学 教 育 部 重 点 实 验 室, 长 春 130024) 摘 要 摇 制 备 了 精 子 表 面 膜 抗 原 受 精 素 茁 蛋 白 (Fertilin 茁 ) 的 特 异 性 抗 体, 通 过 抗 原 鄄 抗 体 反 应 和 抗 体 固 相 偶 联 技 术, 将 抗 体 连 接 到 琼 脂 糖 球 珠 上, 建 立 了 混 合 斑 精 子 分 离 纯 化 的 新 方 法. 首 先, 通 过 聚 合 酶 链 式 反 应 (PCR) 扩 增 编 码 人 受 精 素 茁 蛋 白 第 341 ~ 373 位 氨 基 酸 的 基 因 序 列, 构 建 PGEX 鄄 4T 鄄 1 / Fertilin 茁 原 核 表 达 质 粒 ; 其 次, 诱 导 表 达 GST 鄄 Fertilin 茁 融 合 蛋 白, 制 备 受 精 素 茁 蛋 白 多 克 隆 抗 体, 免 疫 荧 光 检 测 结 果 表 明, 受 精 素 茁 蛋 白 定 位 于 精 子 的 头 后 部, 并 且 阴 道 上 皮 细 胞 没 有 受 精 素 茁 蛋 白 的 表 达 ; 最 后, 将 受 精 素 茁 抗 体 与 ProteinA 琼 脂 糖 球 珠 连 接 构 建 固 相 抗 体 系 统, 将 精 子 吸 附 于 表 面, 可 从 混 合 斑 ( 精 子 与 阴 道 上 皮 细 胞 混 合 液 ) 中 分 离 纯 化 精 子. 本 文 为 性 犯 罪 案 件 侦 破 提 供 了 新 的 方 法. 关 键 词 摇 混 合 斑 ; 受 精 素 茁 蛋 白 ; 多 克 隆 抗 体 中 图 分 类 号 摇 O657 摇 摇 摇 摇 文 献 标 志 码 摇 A 摇 摇 摇 摇 在 性 犯 罪 案 件 中, 混 合 斑 主 要 是 指 男 性 的 精 液 与 女 性 的 阴 道 分 泌 液 组 成 的 斑 痕, 是 法 医 物 证 检 验 中 常 见 的 检 材 类 型 [1]. 由 于 精 子 细 胞 膜 和 核 膜 蛋 白 质 中 富 含 二 硫 键 [2], 导 致 其 检 测 存 在 纯 化 效 果 差 耗 时 长 及 消 耗 人 力 的 弊 端, 且 精 子 损 失 达 70%, 影 响 了 检 测 成 功 率 [3]. 因 此, 建 立 一 种 新 型 的 混 合 斑 精 子 分 离 方 法 对 于 法 医 物 证 检 验 具 有 重 要 的 意 义. 受 精 素 茁 蛋 白 (Fertilin 茁, 定 位 于 人 类 8 号 染 色 体 上 ) 有 选 择 性 地 表 达 在 人 类 睾 丸 组 织 ( 精 子 ) 中 [4], 在 精 子 发 生 成 熟 获 能 及 精 卵 结 合 和 融 合 过 程 中 发 挥 重 要 作 用. 受 精 素 茁 蛋 白 具 有 前 导 肽 区 金 属 蛋 白 酶 结 构 域 去 整 合 素 结 构 域 富 含 半 胱 氨 酸 结 构 域 表 皮 生 长 因 子 ( EGF) 样 重 复 序 列 跨 膜 结 构 域 和 短 的 胞 质 尾 部 7 个 基 本 结 构 区 [5]. 通 过 对 受 精 素 茁 蛋 白 的 疏 水 性 和 抗 原 决 定 簇 进 行 分 析 [6,7], 选 择 金 属 蛋 白 酶 结 构 域 的 第 341 ~ 373 位 氨 基 酸 残 基 作 为 靶 抗 原 制 备 其 特 异 性 抗 体. 琼 脂 糖 球 珠 ProteinA 能 特 异 性 地 与 抗 体 的 FC 区 结 合, 被 广 泛 应 用 于 生 物 学 研 究 [8,9]. [10] 基 于 抗 原 鄄 抗 体 反 应 和 固 相 分 离 原 理 [11], 本 文 针 对 精 子 表 面 抗 原 受 精 素 茁 蛋 白 胞 外 域 制 备 特 异 性 抗 体, 并 结 合 抗 体 固 相 偶 联 技 术, 建 立 了 新 型 的 混 合 斑 中 精 子 的 分 离 纯 化 方 法. 1 摇 实 验 部 分 1. 1 摇 试 剂 与 仪 器 人 精 子 由 吉 林 省 人 类 精 子 库 提 供 ; 人 阴 道 上 皮 细 胞 由 吉 林 省 公 安 厅 物 证 鉴 定 中 心 提 供 ; 大 肠 杆 菌 DH5 琢 ( 克 隆 宿 主 ) BL21( 表 达 宿 主 ) 及 pgex 鄄 4T 鄄 1 为 本 实 验 室 保 存 的 菌 株 和 质 粒 ; Trizol 试 剂 盒 ( 美 国 Invitrogen 公 司 ); TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver. 3. 0 试 剂 盒, T4 DNA 连 接 酶 及 各 种 限 制 性 内 切 酶 ( 日 本 TaKaRa 公 司 ); 琼 脂 糖 凝 胶 回 收 DNA 试 剂 盒 ( 德 国 Qiagen 公 司 ); 低 分 子 量 蛋 白 Marker( 上 海 生 物 工 程 有 限 公 司 ); 异 丙 基 硫 代 半 乳 糖 苷 ( IPTG, 华 美 生 物 工 程 公 司 ); HRP 标 记 的 羊 抗 兔 IgG( 美 国 Proteintech 公 司 ); 谷 胱 甘 肽 Sepharose 4B( 英 国 GE Healthcare 公 司 ); Tris 鄄 HCl 缓 冲 液 和 弗 氏 佐 剂 ( 北 收 稿 日 期 : 2014 鄄 10 鄄 30. 网 络 出 版 日 期 : 2015 鄄 04 鄄 14. 基 金 项 目 : 国 家 公 安 部 重 点 研 究 计 划 项 目 ( 批 准 号 : 2011ZDYJJNWZ007) 资 助. 联 系 人 简 介 : 杨 百 全, 男, 博 士, 主 任 法 医 师, 主 要 从 事 精 子 分 离 纯 化 及 DNA 检 验 和 纳 米 复 合 磁 性 材 料 的 应 用 研 究. E 鄄 mail: bqyang1971@ 163. com 李 晓 萌, 女, 博 士, 教 授, 主 要 从 事 肿 瘤 信 号 转 导 研 究. E 鄄 mail: lixm441@ nenu. edu. cn
摇 No. 5 摇 伍 贤 军 等 : 一 种 新 的 混 合 斑 精 子 分 离 方 法 887 京 鼎 国 生 物 工 程 有 限 公 司 ); ECL 光 化 学 试 剂 盒 ( 上 海 碧 云 天 生 物 技 术 有 限 公 司 ); 新 西 兰 大 白 兔 ( 吉 林 大 学 预 防 医 学 院 医 动 物 实 验 中 心 ); 其 它 化 学 试 剂 均 为 分 析 纯. TC 鄄 25 / H 型 基 因 扩 增 仪 ( 杭 州 博 日 科 技 有 限 公 司 ); FLUOstar Optima 型 多 功 能 酶 标 仪 ( 德 国 BMG Technology 公 司 ); CEQ8000 型 序 列 测 定 仪 ( 美 国 贝 克 曼 库 尔 特 有 限 公 司 ); CF 鄄 10 型 高 速 离 心 机 ( 韩 国 Daihan 公 司 ); JY92 鄄 IIDN 型 超 声 波 细 胞 粉 碎 仪 ( 宁 波 新 芝 生 物 科 技 股 份 有 限 公 司 ); HZQ 鄄 F 型 细 菌 摇 床 ( 哈 尔 滨 市 东 联 电 子 技 术 开 发 有 限 公 司 ); SZ 鄄 60 型 显 微 镜 ( 日 本 奥 林 巴 斯 公 司 ). 1. 2 摇 人 精 子 总 RNA 的 制 备 及 双 链 cdna 的 合 成 取 500 mg 人 睾 丸 组 织, 加 入 6 ml Trizol, 匀 浆 后 参 照 文 献 [12] 方 法 制 备 总 RNA. 按 TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver. 3. 0 试 剂 盒 操 作 步 骤 合 成 双 链 cdna. 1. 3 摇 PCR 鄄 PMD18 鄄 T / Fertilin 茁 重 组 质 粒 的 构 建 受 精 素 茁 蛋 白 的 基 因 全 长 从 GeneBank 得 到, 基 因 序 列 号 为 AAC51110. 1. 以 cdna 为 模 板, 上 游 引 物 为 5 忆 鄄 GAATTCGAAGCAATTCATTTCAGT ( 含 EcoRI 酶 切 位 点 ); 下 游 引 物 为 5 忆 鄄 CTCGAGATTGT 鄄 GAAGACACTGGGA( 含 XhoI 酶 切 位 点 ), 进 行 聚 合 酶 链 式 反 应 (PCR) 扩 增. 扩 增 得 到 的 片 段 与 pmd18 鄄 T 载 体 连 接, 将 连 接 产 物 转 入 感 受 态 大 肠 杆 菌 DH5 琢 中, 在 含 氨 苄 西 林 ( Amp) 琼 脂 平 板 上 挑 选 克 隆, 以 碱 裂 解 法 小 量 提 取 重 组 质 粒 后, 以 EcoRI 和 XhoI 双 酶 切 鉴 定. 1. 4 摇 原 核 表 达 质 粒 pgex 鄄 4T 鄄 1 / Fertilin 茁 的 构 建 含 有 受 精 素 茁 蛋 白 第 341 ~ 373 位 氨 基 酸 片 段 的 pmd18 鄄 T 质 粒 经 EcoRI 和 XhoI 双 酶 切 后, 利 用 回 收 试 剂 盒 获 得 受 精 素 茁 基 因 该 区 片 段, 同 时 用 相 同 的 酶 处 理 质 粒 pgex 鄄 4T 鄄 1. 将 回 收 的 受 精 素 茁 基 因 第 341 ~ 373 位 氨 基 酸 片 段 和 经 酶 切 的 载 体 pgex 鄄 4T 鄄 1 在 T4 DNA 连 接 酶 作 用 下 于 16 益 连 接 过 夜. 酶 切 鉴 定 重 组 体, 并 通 过 测 序 进 一 步 确 定 重 组 体 的 正 确 性. 1. 5 摇 GST 鄄 Fertilin 茁 融 合 蛋 白 的 诱 导 表 达 和 纯 化 重 组 质 粒 PGEX 鄄 4T 鄄 1 / Fertilin 茁 转 化 大 肠 杆 菌 BL21, 获 得 细 菌 菌 落. 挑 取 单 菌 落 接 入 含 Amp + 的 细 菌 基 本 培 养 基 (LB) 中, 于 37 益 振 摇 培 养 12 h. 将 培 养 物 按 体 积 比 1 颐 50 转 接 于 含 Amp + 的 LB 培 养 基 中, 继 续 在 37 益 摇 床 中 培 养 至 对 数 生 长 中 期. 在 培 养 液 OD 600 = 0 郾 5 ~ 0 郾 6 时, 加 入 终 浓 度 为 0 郾 1 mmol / L 的 异 丙 基 硫 代 半 乳 糖 苷 (IPTG), 以 不 加 入 IPTG 的 作 为 阴 性 对 照, 于 25 益 继 续 培 养 4 ~ 5 h. 离 心 收 集 菌 体, 以 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 (SDS 鄄 PAGE) 鉴 定 GST 鄄 Fertilin 茁 融 合 蛋 白 的 表 达, 并 优 化 表 达 条 件, 进 行 大 量 扩 增 诱 导. 以 5000 r / min 转 速 于 4 益 离 心 5 min, 收 集 菌 体, 用 60 ml 冰 预 冷 的 细 菌 裂 解 液 悬 浮 1 L 菌 液 的 沉 淀 [13]. 用 超 声 波 裂 解 细 菌, 再 以 9600 r / min 的 转 速 于 4 益 离 心 15 min, 取 上 层 清 液, 过 Glutathione 鄄 Sepharose 4B 柱, 先 以 等 体 积 的 洗 脱 缓 冲 液 洗 1( 含 20 mmol / L 谷 胱 甘 肽 和 50 mmol / L Tris 鄄 HCl 缓 冲 液, ph = 8 郾 0) 洗 脱, 收 集 洗 脱 液, 再 以 等 体 积 的 洗 脱 缓 冲 液 2(100 mmol / L 谷 胱 甘 肽 ) 洗 涤 2 次, 收 集 洗 脱 液, 用 SDS 鄄 PAGE 鉴 定 纯 化 产 物 [14]. 1. 6 摇 兔 抗 受 精 素 茁 蛋 白 抗 血 清 的 制 备 以 纯 化 的 GST 鄄 Fertilin 茁 融 合 蛋 白 免 疫 雄 性 新 西 兰 大 白 兔, 初 次 免 疫 使 用 500 滋 g 融 合 蛋 白, 与 等 体 积 的 完 全 弗 氏 佐 剂 充 分 混 匀 乳 化 后, 背 部 皮 下 多 点 注 射. 免 疫 前 取 耳 静 脉 血 分 离 血 清, 作 为 免 疫 前 的 血 清 对 照. 于 14 d 后 进 行 第 1 次 加 强 免 疫, 将 500 滋 g 纯 化 的 GST 鄄 Fertilin 茁 融 合 蛋 白 与 不 完 全 弗 氏 佐 剂 等 体 积 混 匀, 前 后 四 脚 掌 肌 肉 注 射. 之 后 每 隔 14 d 加 强 免 疫 1 次, 共 加 强 免 疫 4 次. 采 取 颈 动 脉 放 血, 收 集 血 清 [15]. 1. 7 摇 间 接 ELISA 法 测 定 受 精 素 茁 蛋 白 抗 血 清 效 价 末 次 免 疫 后 7 d 取 耳 血, 采 用 间 接 ELISA 法 测 定 未 处 理 血 清 及 用 谷 胱 甘 肽 巯 基 转 移 酶 (GST) 蛋 白 预 清 除 其 中 GST 抗 体 的 血 清 的 效 价. 将 经 亲 和 层 析 柱 纯 化 的 GST 和 GST 鄄 Fertilin 茁 分 别 包 板 ( 每 孔 0 郾 5 滋 g, 溶 于 100 滋 L 0 郾 015 mol / L 碳 酸 盐 缓 冲 液, ph = 9 郾 6), 于 4 益 静 置 12 h. 将 100 g / L 的 脱 脂 奶 粉 孵 育 1 h, 加 入 不 同 稀 释 度 的 待 测 血 清, 于 37 益 反 应 1 h, 洗 涤 后 加 入 HRP 标 记 的 羊 抗 兔 域 级 抗 体 (Jackson Immunoresearch Laboratories, 体 积 比 为 1 颐 15000). 于 37 益 反 应 1 h, 洗 涤 后 显 色 10 min, 用 2 mol / L H 2 SO 4 终 止 反 应 后 测 定 490 nm 处 的 光 吸 收 值 [16].
888 高 等 学 校 化 学 学 报 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 Vol. 36 摇 1. 8 摇 ProteinA 纯 化 受 精 素 茁 蛋 白 抗 血 清 将 ProteinA sepharose CL 鄄 4B 填 料 缓 慢 装 柱, 平 衡 柱 子 后 加 入 经 过 稀 释 的 抗 血 清, 控 制 流 速 保 证 抗 血 清 与 填 料 的 结 合, 即 亲 和 层 析 使 抗 体 结 合 在 柱 子 上, 洗 涤 2 次 后 用 ph = 2 郾 7 的 缓 冲 溶 液 洗 脱 抗 体, 用 1 郾 5 ml EP 管 收 集 洗 脱 液 并 测 定 280 nm 处 的 光 密 度, 直 到 洗 脱 液 中 不 含 有 抗 体 为 止. 将 含 抗 体 的 收 集 管 混 合 [17], 洗 脱 后 的 抗 体 与 抗 血 清 用 SDS 鄄 PAGE 和 考 马 斯 亮 蓝 染 色 鉴 定. 1. 9 摇 免 疫 印 迹 法 检 测 受 精 素 茁 蛋 白 抗 体 的 特 异 性 将 小 鼠 睾 丸 组 织 剪 碎, 加 适 量 组 织 细 胞 裂 解 液 ( RIPA) [0 郾 1% ( 质 量 分 数 ) 十 二 烷 基 磺 酸 钠 +150 mmol / L 氯 化 钠 +100 mmol / L Tris 鄄 HCl( ph = 7 郾 4) +1% ( 质 量 分 数 ) 聚 乙 二 醇 辛 基 苯 基 醚 +1% ( 质 量 分 数 ) 脱 氧 胆 酸 钠 +1 mmol / L 苯 甲 基 磺 酰 氟 ], 充 分 研 磨 后 离 心 收 集 上 层 清 液. 取 等 量 的 上 层 清 液 进 行 SDS 鄄 PAGE 电 泳 分 离, 电 转 移 至 聚 偏 二 氟 乙 烯 膜 (PVDF) 上. 将 PVDF 膜 用 5% ( 质 量 分 数 ) 脱 脂 奶 粉 孵 育 1 h; 与 自 制 的 玉 级 抗 体 于 室 温 下 反 应 1 h, 用 磷 酸 缓 冲 盐 溶 液 (PBS) 洗 涤 3 次 ; 再 与 HRP 标 记 的 羊 抗 兔 域 级 抗 体 于 室 温 下 反 应 1 h, 以 PBS 洗 涤 3 次, 用 ECL 光 化 学 试 剂 盒 (Amersham Phamacia) 检 测 信 号, X 光 片 曝 光 显 影 [18]. 1. 10 摇 免 疫 荧 光 法 检 测 受 精 素 茁 蛋 白 在 精 子 中 的 定 位 将 人 精 子 均 匀 涂 于 十 二 孔 板 ( 约 10 5 Cells / 孔 ) 并 置 于 孵 箱 中 干 燥, 用 4% ( 质 量 分 数 ) 多 聚 甲 醛 于 室 温 固 定 2 h, 用 PBS 洗 涤 3 次 [19], 滴 加 PBS( 对 照 组 ) 或 兔 抗 受 精 素 茁 蛋 白 抗 体, 室 温 下 孵 育 2 h, 用 PBS 洗 涤 3 次, 滴 加 异 硫 氰 酸 荧 光 素 标 记 的 羊 抗 兔 IgG, 室 温 下 避 光 孵 育 1 h, 用 PBS 洗 涤 3 次 ; 用 4 忆,6 鄄 二 脒 基 鄄 2 鄄 苯 基 吲 哚 (DAPI) 于 室 温 下 孵 育 1 min, 用 PBS 洗 涤 3 次 ; 用 荧 光 显 微 镜 观 察 并 拍 照. 1. 11 摇 免 疫 荧 光 法 检 测 受 精 素 茁 蛋 白 抗 体 对 精 子 及 阴 道 上 皮 细 胞 的 特 异 性 识 别 将 人 精 子 ( 约 10 5 Cells) 与 人 阴 道 上 皮 细 胞 (10 2 Cells) 混 合, 均 匀 涂 于 十 二 孔 板 并 置 于 孵 箱 中 干 燥, 经 固 定 及 抗 体 孵 育, 用 荧 光 显 微 镜 观 察 并 拍 照. 1. 12 摇 受 精 素 茁 蛋 白 抗 体 鄄 ProteinA 琼 脂 糖 球 珠 系 统 对 精 子 纯 化 能 力 检 测 Fertilin 茁 抗 体 与 琼 脂 糖 球 珠 ProteinA 于 室 温 下 结 合 2 h, 用 PBS 洗 涤 3 次, 制 得 受 精 素 茁 固 相 抗 体 系 统. 将 等 量 的 4% ( 质 量 分 数 ) 多 聚 甲 醛 固 定 过 的 精 子 ( 约 10 4 Cells) 分 别 与 ProteinA 和 受 精 素 茁 蛋 白 抗 体 鄄 ProteinA 于 室 温 下 结 合 3 h, 用 显 微 镜 观 察 并 拍 照. 2 摇 结 果 与 讨 论 2. 1 摇 精 子 表 面 特 异 性 抗 原 受 精 素 茁 原 核 表 达 质 粒 的 构 建 从 人 睾 丸 组 织 提 取 总 RNA 后, 逆 转 录 合 成 双 链 cdna, 以 合 成 的 双 链 cdna 为 模 板, 通 过 引 物 设 计 在 序 列 的 两 端 引 入 EcoRI (5 忆 端 ) 和 XhoI (3 忆 端 ) 酶 切 位 点, 应 用 PCR 反 应 扩 增 出 受 精 素 茁 蛋 白 第 341 ~ 373 位 氨 基 酸 的 DNA 序 列, 长 度 为 99bp, 结 果 见 图 1. 将 该 片 段 克 隆 至 pgex 鄄 4T 鄄 1 原 核 表 达 载 体, 进 行 DNA 序 列 测 定, 结 果 如 图 2 所 示, 测 序 峰 形 清 晰, 与 数 据 库 来 源 序 列 相 同, 且 受 精 素 茁 片 段 大 小 正 确. Fig. 1 摇 PCR amplifying of 341 373aa from Fertilin 茁 Lane 1: DNA marker; lane 2: DNA band of 341 373aa from Fertilin 茁. Fig. 2 摇 Fertilin 茁 recombinant plasmid sequencing result DNA nucleotide sequence: GAATTCGAAGCAATTCATTTCAGTGGTGTGAAGATCTTTAGTAACTGCAGCTTCGAAGACTTTGCACATTT 鄄 TATTTCAAAGCAGAAGTCCCAGTGTCTTCACAATCTCGAG.
摇 No. 5 摇 伍 贤 军 等 : 一 种 新 的 混 合 斑 精 子 分 离 方 法 889 2. 2 摇 融 合 蛋 白 GST 鄄 Fertilin 茁 的 诱 导 表 达 和 纯 化 为 了 验 证 重 组 质 粒 pgex 鄄 4T 鄄 1 / Fertilin 茁 能 否 成 功 表 达 融 合 蛋 白 及 确 定 诱 导 剂 异 丙 基 鄄 茁 鄄 D 鄄 硫 代 半 乳 糖 苷 (IPTG) 的 适 宜 浓 度, 用 重 组 质 粒 转 化 大 肠 杆 菌 BL21, 经 LB 培 养 后 使 用 不 同 浓 度 的 IPTG 诱 导, 收 集 菌 体, 用 SDS 鄄 PAGE 分 析 GST 鄄 Fertilin 茁 融 合 蛋 白 的 表 达. 由 图 3 可 见, 经 IPTG 诱 导 后 可 高 效 表 达 表 观 分 子 量 为 30000 的 融 合 蛋 白, 与 预 期 分 子 量 相 符. 其 中, 0 郾 1 mmol / L IPTG 诱 导 融 合 蛋 白 表 达 量 最 高, 0 郾 5 mmol / L IPTG 诱 导 融 合 蛋 白 表 达 量 较 少, 而 未 经 IPTG 诱 导 的 无 明 显 融 合 蛋 白 表 达, 表 明 诱 导 剂 IPTG 的 适 宜 浓 度 为 0 郾 1 mmol / L. Fig. 3 摇 SDS 鄄 PAGE analysis of GST 鄄 Fertilin 茁 fusion gene expression product in E. coli Lane 1: Protein marker; lane 2: lysate of bacteria GST / BL21 before IPTG induction; lane 3: lysate of bacteria GST / BL21 after 0 郾 1 mmol / L IPTG in 鄄 duction; lane 4: lysate of bacteria GST / BL21 after 0 郾 5 mmol / L IPTG induc 鄄 tion; lane 5: lysate of bacteria Fertilin 茁 / BL21 before IPTG induction; lane 6: lysate of bacteria Fertilin 茁 / BL21 after 0 郾 1 mmol / L IPTG induction; lane 7: lysate of bacteria Fertilin 茁 / BL21 after 0 郾 5 mmol / L IPTG induction. Fig. 4 摇 SDS 鄄 PAGE analysis of purified GST and GST 鄄 Fertilin 茁 fusion protein Lane 1: Protein marker; lane 2: purified GST; lane 3: purified GST 鄄 Fertilin 茁. GST / BL21 和 GST 鄄 Fertilin 茁 / BL21 细 菌 沉 淀 经 超 声 裂 解 获 得 可 溶 性 蛋 白, 经 Glutathione 鄄 Sepharose 鄄 4B 层 析 法 纯 化 后 进 行 SDS 鄄 PAGE 分 析, 结 果 如 图 4 所 示, 纯 化 得 到 高 纯 度 分 子 量 为 26000 的 GST 蛋 白 和 分 子 量 为 30000 的 GST 鄄 Fertilin 茁 融 合 蛋 白, 其 中 GST 鄄 Fertilin 茁 融 合 蛋 白 有 轻 微 降 解. 2. 3 摇 间 接 ELISA 法 测 定 受 精 素 茁 蛋 白 抗 血 清 效 价 以 GST 鄄 Fertilin 茁 融 合 蛋 白 免 疫 前 的 新 西 兰 大 白 兔 血 清 作 为 对 照, 取 末 次 加 强 免 疫 后 第 7 d 的 血 清, 将 其 分 为 未 处 理 血 清 及 用 GST 蛋 白 预 清 除 其 中 的 GST 抗 体 的 血 清 两 部 分. 将 血 清 分 别 稀 释 至 1 伊 10 3, 1 伊 10 4, 1 伊 10 5 及 1 伊 10 6 倍, 采 用 间 接 ELISA 法 测 定 抗 体 的 效 价. 由 图 5 可 见, 2 种 血 清 中 抗 体 的 滴 度 无 明 显 差 异, 免 疫 前 的 兔 血 清 中 未 测 出 抗 融 合 蛋 白 GST 鄄 Fertilin 茁 的 抗 体, 末 次 免 疫 后 血 清 中 受 精 素 茁 蛋 白 抗 体 的 滴 度 高 达 1 伊 10 6 以 上. Fig. 5 摇 Titer of Fertilin 茁 immune serum detected by ELISA assay Fig. 6 摇 SDS 鄄 PAGE analysis of ProteinA purified Fertilin 茁 antibody Lane 1: Protein molecular weight marker; lane 2: unpurified Fertilin 茁 antiserum; lane 3: proteina purified Fertilin 茁 antibody.
890 高 等 学 校 化 学 学 报 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 Vol. 36 摇 2. 4 摇 ProteinA 纯 化 受 精 素 茁 蛋 白 抗 血 清 为 了 提 高 所 制 备 抗 体 的 纯 度, 利 用 ProteinA 纯 化 抗 血 清. 结 果 见 图 6. 与 抗 血 清 相 比, ProteinA 纯 化 后 的 抗 体 具 有 清 晰 的 轻 重 链, 且 无 其 它 明 显 条 带, 表 明 抗 体 纯 化 效 果 明 显. 2. 5 摇 兔 抗 GST 鄄 Fertilin 茁 血 清 特 异 性 的 Western blot 鉴 定 图 7 为 利 用 多 克 隆 抗 体 受 精 素 茁 蛋 白 对 小 鼠 睾 丸 组 织 样 进 行 Western blot 检 验 的 结 果. 可 见, 在 小 鼠 睾 丸 组 织 样 中 检 测 到 1 条 特 异 的 蛋 白 条 带 (85000), 而 作 为 阴 性 对 照 的 蛋 白 样 并 未 检 测 到 相 关 条 带, 说 明 受 精 素 茁 蛋 白 抗 体 具 有 良 好 的 特 异 性. Fig. 7 摇 Western blot analysis of Fertilin 茁 in mouse testis 2. 6 摇 免 疫 荧 光 法 检 测 精 子 表 面 膜 抗 原 受 精 素 茁 蛋 Lane 1: Negative control protein sample; 白 在 精 子 中 的 定 位 lane 2. lysate of mouse testis. 图 8 为 多 克 隆 抗 体 (PBS 为 对 照 ) 标 示 的 受 精 素 茁 蛋 白 在 人 精 子 中 定 位 的 情 况. 在 荧 光 显 微 镜 下 观 察 到 受 精 素 茁 蛋 白 定 位 于 精 子 的 头 后 部 [20]. Fig. 8 摇 Immunofluorescence analysis of expression of Fertilin 茁 in sperm Fertilin 茁 was stained with Fertilin 茁 antibody(red); nuclei were stained with DAPI(blue). (A), (E) DIPA; (B) PBS; (C), (G) DIPA with Fertilin 茁 merge; (D), (H) PBS / Fertilin 茁 with sperm merge; (F) Fertilin 茁. 2. 7 摇 免 疫 荧 光 法 检 测 受 精 素 茁 蛋 白 抗 体 对 精 子 及 阴 道 上 皮 细 胞 的 特 异 性 识 别 在 性 犯 罪 案 件 中 精 子 主 要 存 在 于 混 合 斑 中, 所 以 精 子 与 阴 道 上 皮 细 胞 的 分 离 至 关 重 要. 为 了 进 一 步 证 明 受 精 素 茁 蛋 白 抗 体 对 阴 道 上 皮 细 胞 无 交 叉 免 疫 反 应, 取 人 精 子 与 人 阴 道 上 皮 细 胞 混 合, 用 受 精 素 茁 蛋 白 抗 体 做 免 疫 荧 光 分 析. 由 图 9 可 见, 受 精 素 茁 蛋 白 抗 体 特 异 性 染 色 于 精 子 的 头 后 部, 而 阴 道 上 皮 细 胞 不 能 被 识 别, 表 明 受 精 素 茁 蛋 白 抗 体 可 以 用 于 混 合 斑 中 精 子 的 纯 化, 无 交 叉 免 疫 反 应. Fig. 9 摇 Immunofluorescence analysis of expression of Fertilin 茁 in sperm and vaginal epithelial cells Fertilin 茁 was stained with Fertilin 茁 antibody( red); nuclei were stained with DAPI( blue). ( A) DIPA; ( B) Fertilin 茁 ; ( C) DIPA with Fertilin 茁 merge; (D) fertilin 茁 with sperm and vaginal epithelial cells merge(sperm, yellow arrow; vaginal epithelial cells, green arrow). 2. 8 摇 受 精 素 茁 蛋 白 抗 体 鄄 ProteinA 琼 脂 糖 球 珠 系 统 对 精 子 纯 化 能 力 的 检 测 在 案 件 侦 破 过 程 中, 收 集 到 的 样 本 是 包 含 了 精 子 阴 道 上 皮 细 胞 及 细 胞 碎 片 等 的 混 合 物, 并 且 精 子 含 量 很 低. 为 了 模 拟 实 际 案 例, 用 受 精 素 茁 蛋 白 抗 体 鄄 ProteinA 琼 脂 糖 球 珠 系 统 检 测 受 精 素 茁 蛋 白 抗 体 鄄 ProteinA 及 ProteinA 分 别 与 稀 释 至 低 浓 度 的 精 子 的 结 合 能 力, 检 测 结 果 见 图 10. 可 见 受 精 素 茁 蛋 白
摇 No. 5 摇 伍 贤 军 等 : 一 种 新 的 混 合 斑 精 子 分 离 方 法 891 抗 体 鄄 ProteinA 能 够 捕 获 到 精 子, 而 对 照 的 ProteinA 不 具 备 捕 获 精 子 的 能 力, 表 明 受 精 素 茁 蛋 白 抗 体 鄄 ProteinA 琼 脂 糖 球 珠 系 统 具 备 纯 化 精 子 的 能 力. Fig. 10 摇 Images of ProteinA 鄄 Fertilin 茁 antibody to capture sperm (A) ProteinA unable to capture sperm; (B) (D) proteina 鄄 Fertilin 茁 antibody to capture sperm(sperm, solid arrow; ProteinA, hollow arrow). 目 前, 国 际 上 混 合 斑 中 精 子 的 分 离 方 法 主 要 是 两 步 消 化 法, 其 原 理 是 利 用 精 子 表 面 蛋 白 和 上 皮 细 胞 抗 蛋 白 酶 K 消 化 的 能 力 差 异 来 消 化 除 去 上 皮 细 胞, 留 下 精 子, 由 于 采 用 间 接 的 方 式 获 得 精 子, 纯 化 效 果 较 差 ; 本 文 方 法 利 用 固 相 抗 体 特 异 性 结 合 精 子, 可 以 从 混 合 物 中 准 确 地 捕 捉 到 精 子, 去 除 其 它 细 胞 的 干 扰, 具 有 直 接 高 效 及 特 异 等 特 点. 3 摇 结 摇 摇 论 采 用 PCR 扩 增 法 构 建 了 PGEX 鄄 4T 鄄 1 / Fertilin 茁 原 核 表 达 质 粒, 诱 导 表 达 并 纯 化 GST 鄄 Fertilin 茁 融 合 蛋 白, 利 用 该 融 合 蛋 白 制 备 的 多 克 隆 抗 体 效 价 经 ELISA 法 检 测 为 1 颐 1 伊 10 6 以 上, 经 Western blot 检 测 具 有 良 好 的 特 异 性. 通 过 免 疫 荧 光 实 验 分 析, 受 精 素 茁 蛋 白 抗 体 特 异 性 结 合 于 精 子 头 后 部, 且 不 与 阴 道 上 皮 细 胞 存 在 交 叉 免 疫 反 应. 将 受 精 素 茁 蛋 白 抗 体 与 ProteinA / G 连 接, 并 将 其 用 于 精 子 纯 化, 通 过 抗 原 抗 体 特 异 性 结 合, 在 显 微 镜 下 可 以 观 察 到 受 精 素 茁 蛋 白 抗 体 鄄 ProteinA / G 具 有 捕 获 精 子 的 能 力, 可 用 于 精 子 纯 化. 综 上 所 述, 制 备 了 受 精 素 茁 蛋 白 抗 体, 并 运 用 抗 原 抗 体 反 应 和 抗 体 固 相 偶 联 技 术 实 现 了 精 子 的 分 离 纯 化, 建 立 了 混 合 斑 精 子 分 离 纯 化 的 新 型 方 法. 参 摇 考 摇 文 摇 献 [ 1 ] 摇 Yuan Z. C., Jing H. N., Lai Y., Wang H. J., Chen H. Y., Chin. J. Forensic Med., 2010, 25(1), 10 12( 袁 自 闯, 金 洪 年, 赖 跃, 王 慧 君, 陈 红 英. 中 国 法 医 学 杂 志, 2010, 25(1), 10 12) [ 2 ] 摇 Ren W. Y., Zhang H., Xue D. Z., Journal of Liaoning Police Academy, 2010, 12(1), 86 89( 任 文 彦, 张 慧, 薛 大 忠. 辽 宁 警 专 学 报, 2010, 12(1), 86 89) [ 3 ] 摇 Zhang J., Li Y. F., National Journal of Andrology, 2004, 10(1), 52 54( 张 军, 李 彦 锋. 中 华 男 科 学, 2004, 10(1), 52 54) [ 4 ] 摇 Li L. L., Ma H. D., Livestock and Poultry Industry, 2006, 4(2), 35 37( 李 林 林, 马 恒 东. 育 种 繁 殖, 2006, 4(2), 35 37) [ 5 ] 摇 Alberto C., Mol. Biol. Evol., 2003, 20(1), 21 29 [ 6 ] 摇 Wang G. T., Tian G. S., Zhang G. Q., Fu X. X., Wang Y. Q., National Medical Journal of China, 1994, 74(6), 355 357( 王 国 棠, 田 庚 善, 张 国 庆, 傅 希 贤, 王 玉 勤. 中 华 医 学 杂 志, 1994, 74(6), 355 357) [ 7 ] 摇 Li J. T., Yin X. P., Liu J. S., Hu Y. H., Progress in Veterinary Medicine, 2008, 29(3), 10 13( 李 江 涛, 殷 相 平, 柳 纪 省, 胡 永 浩. 动 物 医 学 进 展, 2008, 29(3), 10 13) [ 8 ] 摇 Wu J., Liu S., Shen X. Y., Yang N. Y., Liu Y., Tsuji I., Yamamura T., Li J., Li X. M., Chem. Res. Chinese Universities, 2013, 29(5), 911 916 [ 9 ] 摇 Wu J., Wei W., Yang N. Y., Shen X. Y., Tsuji I., Yamamura T., Li J., Li X. M., Chem. Res. Chinese Universities, 2013, 29 (3), 512 518 [10] 摇 Tao Y. X., Shanghai Journal of Immunology, 1999, 19(2), 65 68( 陶 义 训. 上 海 免 疫 学 杂 志, 1999, 19(2), 65 68) [11] 摇 Xu H., Zhang G. L., Zhang F. B., Chemical Industry and Engineering, 2003, 20(1), 28 32( 徐 辉, 张 国 亮, 张 凤 宝. 化 学 工 业 与 工 程, 2003, 20(1), 28 32) [12] 摇 Dong L. Y., Li Q. F., Qu X. G., Li Y. X., Li X. F., Xu H. T., Xie Z., Hereditas, 2009, 31(5), 495 499( 董 丽 艳, 李 齐 发, 屈 旭 光, 李 隐 侠, 李 新 福, 徐 洪 涛, 谢 庄. 遗 传, 2009, 31(5), 495 499) [13] 摇 Wu C. Y., Lou J. T., Jiang T. W., Qian Z., Zhou Y., Chen Y., Gu M. L., Deng A. M., Zhong R. Q., Acad. J. Sec. Mil. Med. Univ., 2006, 27(12), 1281 1285( 吴 传 勇, 娄 加 陶, 蒋 廷 旺, 钱 琤, 周 晔, 陈 燕, 谷 明 莉, 邓 安 梅, 仲 人 前. 第 二 军 医 大 学 学 报,
892 高 等 学 校 化 学 学 报 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 Vol. 36 摇 2006, 27(12), 1281 1285) [14] 摇 Chen X. W., Liu X. G., Liang J. Y., Liang N. C., Chin. J. Biochem. Mol. Biol., 2004, 20(2), 176 182( 陈 小 文, 刘 新 光, 梁 景 耀, 梁 念 慈. 中 国 生 物 化 学 与 分 子 生 物 学 报, 2004, 20(2), 176 182) [15] 摇 Xin X. H., Wu Y. M., Huang G., Chin. J. Cell Mol. Immunol., 2004, 20(6), 764( 刑 小 红, 吴 元 明, 黄 高. 细 胞 与 分 子 免 疫 学 杂 志, 2004, 20(6), 764) [16] 摇 Yang R., Xie Z. P., Long R. X., Bai H. Z., Tan Z. G., Wang Y., Wu Z. X., Zhang Y., J. Med. Res., 2010, 39(1), 24 26 ( 杨 蓉, 谢 忠 平, 龙 润 乡, 白 惠 珠, 谭 振 国, 王 燕, 吴 忠 香, 张 勇. 医 学 研 究 杂 志, 2010, 39(1), 24 26) [17] 摇 Wu D. Y., Fu H. S., Song Z. M., Guide of China Medicine, 2012, 10(2), 77 80( 武 德, 付 海 申, 宋 振 民. 中 国 医 药 指 南, 2012, 10(2), 77 80) [18] 摇 Yang X. H., Xu H. S., China Prac. Med. May, 2010, 5(13), 25 26( 杨 晓 红, 许 海 生. 中 国 实 用 医 药, 2010, 5(13), 25 26) [19] 摇 Song L., Feng Y. C., Zhu H. B., Zhang M. L., Journal of Xinxiang Medical College, 1991, 8(3), 166 168( 宋 力, 冯 元 春, 朱 洪 波, 张 敏 六. 新 乡 医 学 院 学 报, 1991, 8(3), 166 168) [20] 摇 Chatot C. L., Ziomek C. K., Bavister B. D., J. Reprod. Fertil., 1989, 86(2), 679 688 覮 New Method for Sperm Separation from Mixed Stain Samples WU Xianjun 1,2, ZHAO Bing 2, MIAO Xuan 2, QIAN Cheng 1, WANG Bingyu 2, LI Xiaomeng 2*, YANG Baiquan 1* (1. Forensic Science Institute of Jilin Province, Changchun 130051, China; 2. Key Laboratory of Molecular Epigenetics, Ministry of Education, School of Life Science, Northeast Normal University, Changchun 130024, China) Abstract 摇 In sex crimes cases, mixed stain samples(a mixture of sperm and vaginal epithelial cells) are com 鄄 mon and important biological evidence. Identification of sperm sources is the key of cases detected. The lack of effective technique of sperm separation from mixed stain samples is the bottleneck of sperm test. In the pre 鄄 sent study, the group chose sperm surface antigen, Fertilin 茁, as antigen to prepare specific antibodies, and further coupled the antibody to a solid phase of agarose beads, in order to establish a new sperm separation system. First, antigen Fertilin 茁 recombinant plasmid was constructed. A cdna for Fertilin 茁 341 373aa was amplified by polymerase chain reaction(pcr), and was cloned into a prokaryotic expression plasmid, pgex 鄄 4T 鄄 1 vector. Second, GST 鄄 Fertilin 茁 (341 373aa) fusion protein was induced and purified. Against this an 鄄 tigen, the Fertilin 茁 antibodies were obtained from serum of rabbit immunized. ELISA and Western blot analy 鄄 sis demonstrated the specificity of the antibody against Fertilin 茁 antigen. Then, the specific recognition of the antibody to sperm was identified by the immunofluorescence assay, in which Fertilin 茁 protein in the sperm head can detected by the antibody, whereas in the vaginal epithelial cells showed negative detection. Finally, the sperm detection system using the solid phase of Fertilin 茁 antibody was established, in which the Fertilin 茁 antibody was coupled to ProteinA / G agarose beads and was able to separate sperm from the mixture. In con 鄄 clusion, the Fertilin 茁 antibody was successfully prepared, which was able to bind to the rear of the sperm head. Furthermore, the Fertilin 茁 solid phase antibody system was generated, which could bind to the sperm surface, so as to isolate the sperms from the mixed stain samples. This sperm separation method from mixed stain samples provided a new detection for sexual offenses. Keywords 摇 Mixed stain sample; Fertilin 茁 ; Polyclonal antibody (Ed. : P, H, W, K) 覮 Supported by the Project of Ministry of Public Security, China(No. 2011ZDYJJNWZ007).