标题

566 CD5 单 抗 及 188 Re 亲 和 素 二 步 法 预 定 位 对 淋 巴 瘤 Raji 细 胞 的 放 射 免 疫 效 应 研 究 放 射 生 物 学 李 贵 平 郑 文 莉 齐 永 帅 黄 宝 丹 杜 丽 黄 凯 张 辉 摘 要 目 的 探 讨 CD5 单 抗 及 188 Re 亲 和 素 (Avidin) 二 步 法 预 定 位 对 人 淋 巴 瘤 Raji 细 胞 的 放 射 免 疫 效 应 方 法 188 Re 对 CD5 单 抗 及 Avidin 的 标 记 采 用 直 接 标 记 法, 采 用 纸 层 析 法 测 定 标 记 率 及 放 化 纯 度 分 析 188 Re CD5 单 抗 与 Raji 细 胞 的 体 外 结 合 能 力, 并 进 行 体 外 竞 争 结 合 实 验, 采 用 CCK 8 法 测 定 二 步 法 预 定 位 组 188 Re CD5 单 抗 组 188 Re Avidin 组 和 组 对 Raji 细 胞 的 增 殖 抑 制 效 应, 计 算 Raji 细 胞 存 活 率 和 抑 制 率 结 果 188 Re CD5 单 抗 与 Raji 细 胞 的 特 异 性 结 合 率 为 (70 92 ± 1 91)%, 同 时 加 入 188 Re CD5 单 抗 和 过 量 的 CD5 单 抗, 则 细 胞 结 合 率 平 均 为 (7 96 ± 0 87)% 二 步 法 预 定 位 组 188 Re CD5 单 抗 组 188 Re Avidin 组 和 组 对 Raji 细 胞 的 增 殖 均 有 抑 制 作 用, 抑 制 率 与 放 射 性 活 度 呈 正 相 关 (r = 0 907 ~ 0 992,P < 0 05); 在 相 同 放 射 性 活 度 下, 二 步 法 预 定 位 组 在 各 时 间 点 的 抑 制 作 用 均 高 于 188 Re CD5 单 抗 组 188 Re Avidin 组 和 组 ( t = 12 76 ~ 607 98,P < 0 05) 结 论 188 Re CD5 单 抗 可 特 异 性 地 与 Raji 细 胞 结 合,CD5 单 抗 及 188 Re Avidin 二 步 法 预 定 位 对 人 淋 巴 瘤 Raji 细 胞 具 有 明 显 的 抑 制 作 用 关 键 词 预 定 位 ; 亲 和 素 ; 188 Re; CD5 单 抗 ; Raji 细 胞 系 Effect of the two step pretargeting radioimmunotherapy of CD5 monoclonal antibody and 188 Re Avidin on lymphoma Raji cell line Li Guiping, Zheng Wenli, Qi Yongshuai, Huang Baodan, Du Li, Huang Kai, Zhang Hui. Department of Nuclear Medicine, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China Abstract Objective To study the effect of two step pretargeting radioimmunotherapy of CD5 McAb and 188 Re Avidin on lymphoma Raji cell line. Methods The CD5 McAb and Avidin were directly labeled with 188 Re, and the labeling efficiency and radiochemical purity were measured by the paper chromatography. The specific binding test and competition binding test between 188 Re CD5 McAb and Raji cells in vitro were also performed. CCK 8 assay was used to determine the inhibition effect on Raji cell proliferation in the pretargeted group, 188 Re CD5 McAb, 188 Re Avidin and groups, then the cell survival and proliferation inhibition rate were calculated. Results The specific cell binding rate of 188 Re CD5 McAb with Raji cells was (70 92 ± 1 91) %, in the competition group, the binging rate of 188 Re CD5 McAb with Raji cells was only(7 96 ± 0 87)%. The Raji cells proliferation was inhibited in all groups with 188 Re radiolabel, and the inhibition rate was positively correlated with the radioactivity dose (r = 0 907-0 992, P < 0 05). However, at the same dose, the inhibition effect in the group of two step pretargeting at each time point were all stronger than those of 188 Re CD5 McAb, 188 Re Avidin and alone (t = 12 76-607 98,P < 0 05). But there was no significantly statistical difference in the inhibitory effect between the groups of 188 Re Avidin and ( P > 0 05 ). Conclusions It is confirmed that 188 Re CD5 McAb could be specifically bound to Raji cells, and the two step pretargeting of CD5 McAb and 188 Re Avidin has obvious inhibitory effect on the Raji cell proliferation. Key words Pretargeting technique; Avidin; 188 Re; CD5 McAb; Raji cell line CD5 抗 原 是 一 种 白 细 胞 共 同 抗 原, 广 泛 分 布 DOI:10 3760 / cma. j. issn. 025 5098 2015 08 002 基 金 项 目 : 广 东 省 自 然 科 学 基 金 ( S20130100120); 广 东 省 科 技 计 划 项 目 (2012B031800391) 作 者 单 位 : 510515 广 州, 南 方 医 科 大 学 南 方 医 院 核 医 学 科 ( 李 贵 平 齐 永 帅 黄 宝 丹 杜 丽 黄 凯 张 辉 ); 佛 山 市 第 二 人 民 医 院 超 声 科 ( 郑 文 莉 ) 于 髓 系 和 淋 巴 系 前 体 细 胞 及 淋 巴 结 中 的 成 熟 细 胞 表 面, 在 90% 以 上 的 急 性 髓 细 胞 白 血 病 大 多 数 急 性 淋 巴 细 胞 白 血 病 与 淋 巴 瘤 患 者 中 亦 有 所 表 达, 选 择 抗 CD5 单 抗 可 以 用 于 急 性 髓 细 胞 白 血 病 急 性 淋 巴 细 胞 白 血 病 及 淋 巴 瘤 的 治 疗 [1 3] 近 年 来, 随 着 对 CD5 抗 原 的 结 构 功 能 及 与 疾 病 的 关 系 研 究

567 的 深 入,CD5 抗 原 在 血 液 恶 性 肿 瘤 的 诊 断 与 治 疗 中 的 应 用 越 来 越 受 到 重 视, 对 抗 CD5 抗 体 特 性 的 深 入 研 究 有 望 为 血 液 系 统 恶 性 肿 瘤 提 供 新 的 治 疗 手 段 [ 6] 而 188 Re(E βmax = 2 12 MeV E γ = 155 kev T 1 / 2 = 17 0 h) 是 近 年 出 现 的 一 种 较 理 想 的 放 射 性 核 素,β 射 线 能 量 较 高, 对 肿 瘤 细 胞 有 较 强 的 杀 伤 力, 而 γ 射 线 又 可 用 于 显 像, 便 于 临 床 上 估 算 吸 收 剂 量 和 进 行 药 代 动 力 学 研 究, 可 以 同 时 进 行 显 像 与 治 疗 [7 9] 本 研 究 根 据 国 内 外 研 究 现 状, 选 择 广 谱 表 达 的 CD5 抗 原 作 为 靶 点, 采 用 亲 和 素 生 物 素 系 统 预 定 位 技 术 [10 11], 将 188 Re 标 记 到 CD5 单 抗 及 亲 和 素 上, 建 立 二 步 预 定 位 方 法, 研 究 二 步 法 预 定 位 及 188 Re CD5 单 抗 对 CD5 高 表 达 的 Raji 细 胞 系 的 靶 向 结 合 性 及 抗 肿 瘤 作 用, 并 对 两 者 的 抗 肿 瘤 效 应 进 行 比 较, 探 讨 二 步 法 预 定 位 靶 向 治 疗 淋 巴 瘤 的 可 行 性 材 料 与 方 法 1. 主 要 材 料 及 仪 器 : 抗 人 CD5 单 抗 购 于 生 工 生 物 工 程 ( 上 海 ) 有 限 公 司 ; 亲 和 素 ( Avidin) 生 物 素 活 化 酯 HABA / Avidin 试 剂 CCK 8 试 剂 DMSO 购 于 美 国 Sigma 公 司 ; RPMI 160 培 养 基 胎 牛 血 清 0 25% 胰 蛋 白 酶 青 链 霉 素 双 抗 购 于 美 国 GIBCO 公 司 ; 丙 酮 购 于 广 东 光 华 化 学 厂 有 限 公 司 ; 2 巯 基 乙 醇 购 于 美 国 Amresco 公 司 ( 广 州 市 达 晖 生 物 技 术 有 限 公 司 分 装 ); 氯 化 亚 锡 ( SnCl 2 ) 购 于 广 东 光 华 科 技 股 份 有 限 公 司 ; 葡 庚 糖 酸 钠 及 牛 血 清 白 蛋 白 购 于 上 海 伯 奥 生 物 科 技 有 限 公 司 ;SN 682 型 放 射 免 疫 γ 计 数 器 购 于 上 海 核 福 光 电 仪 器 有 限 公 司 ; 紫 外 分 光 光 度 计 购 于 上 海 光 谱 仪 器 有 限 公 司 ;M5 多 功 能 酶 标 仪 购 于 美 国 Molecular Devices 公 司 2. 细 胞 培 养 :B 细 胞 淋 巴 瘤 Raji 细 胞 系 由 南 方 医 科 大 学 南 方 医 院 血 液 科 提 供 采 用 悬 浮 细 胞 培 养 法 培 养, 用 含 10% 胎 牛 血 清 的 RPMI 160 培 养 基 培 养, 在 37 5% CO 2 和 95% 相 对 湿 度 的 孵 箱 内 孵 育, 每 2 天 传 代 1 次 在 细 胞 对 数 生 长 期 进 行 实 验 3. CD5 单 抗 的 生 物 素 化 及 活 性 测 定 : 将 CD5 单 抗 与 生 物 素 活 化 酯 的 摩 尔 比 为 1 30 ~ 1 50 取 样, 生 物 素 活 化 酯 / 二 甲 基 亚 砜 ( DMSO) 溶 液 滴 加 至 CD5 单 抗 的 碳 酸 氢 钠 溶 液 中, 室 温 振 荡 反 应 1 h, 取 一 定 量 生 物 素 化 CD5 抗 体 反 应 液 于 PD 10 柱 中, 离 心 纯 化, 离 心 半 径 10 cm,2 000 r / min, 离 心 5 min; 采 用 ELISA 法 鉴 定 生 物 素 化 活 性 ; 采 用 HABA / Avidin 试 剂 进 行 CD5 单 抗 生 物 素 化 程 度 测 定. CD5 单 抗 及 Avidin 的 188 Re 标 记 方 法 和 鉴 定 : 按 文 献 [5] 方 法,CD5 单 抗 及 Avidin 的 还 原 采 用 2 ME 法, 188 Re 的 还 原 采 用 氯 化 亚 锡 法, 分 别 将 上 述 两 种 还 原 溶 液 混 合 均 匀, 室 温 反 应 2 h 纸 层 析 法 测 定 其 标 记 率, 固 定 相 为 新 华 1 号 滤 纸, 展 开 剂 为 混 合 物 溶 液 ( 氨 水 乙 醇 水 = 1 2 5) 和 生 理 盐 水 5 188 Re CD5 单 抗 与 Raji 细 胞 的 体 外 结 合 实 验 及 竞 争 结 合 抑 制 实 验 : 待 细 胞 增 殖 至 对 数 生 长 期, 以 RPMI 160 培 养 基 重 悬, 制 成 细 胞 数 分 别 为 0. 5 10 5 1 10 5 2 10 5 3 10 5 和 5 10 5 的 细 胞 悬 液 将 不 同 浓 度 的 细 胞 分 别 加 入 离 心 管, 每 个 浓 度 3 管, 各 管 再 加 入 20 μl(7 10 Bq) 标 记 物 在 37 细 胞 培 养 箱 中 温 育 1 h, 分 别 测 各 管 总 放 射 性 计 数 ( T ); 离 心 5 min, 离 心 半 径 10 cm, 2 000 r / min, 后 去 上 清 液, 用 PBS (0 01 mol / L, ph 7 ) 洗 涤 2 次, 再 测 量 结 合 在 细 胞 上 的 放 射 性 计 数 (B) 并 计 算 其 结 合 率 同 时 做 竞 争 结 合 实 验, 在 各 管 细 胞 中 先 加 入 50 μg 未 标 记 的 CD5 单 抗, 然 后 再 加 入 20 μl 的 标 记 物, 余 步 骤 同 前, 测 量 结 合 在 细 胞 上 的 放 射 性 计 数 (B) 并 计 算 其 结 合 率 6. 体 外 培 养 Raji 细 胞 增 殖 抑 制 试 验 : 体 外 培 养 Raji 细 胞 的 增 殖 抑 制 效 应 采 用 CCK 8 测 定 法 进 行 评 估, 设 置 个 实 验 组 : 二 步 法 预 定 位 组 188 Re Avidin 组 188 Re CD5 单 抗 组 和 组 将 Raji 细 胞 浓 度 调 整 为 10 / 孔, 接 种 于 96 孔 板, 37 培 养 箱 孵 育 1 h 后, 各 组 分 别 相 应 加 入 1 85 10 7 10 18 5 10 37 10 和 55 5 10 Bq 5 种 剂 量 的 放 射 性 药 物, 每 个 剂 量 设 3 个 复 孔, 以 未 加 药 ( 只 有 细 胞 和 培 养 液 ) 为 对 照 组, 并 设 空 白 调 零 组 ( 只 加 药 和 培 养 液, 没 有 细 胞 ), 于 细 胞 孵 育 一 定 时 间 后 取 出 96 孔 板, 再 加 入 10 μl CCK 8 继 续 孵 育 1 ~ 2 h 后, 用 酶 标 仪 检 测 50 nm 波 长 吸 光 度 计 算 Raji 细 胞 存 活 率 和 抑 制 率 7. 统 计 学 处 理 : 数 据 用 `x ± s 表 示 采 用 SPSS 13 0 统 计 软 件 分 析 采 用 单 因 素 方 差 分 析 和 独 立 样 本 t 检 验 分 析 数 据 ; 相 关 性 检 验 采 用 Pearson 积 差 相 关 P < 0 05 为 差 异 有 统 计 学 意 义 结 1. CD5 单 抗 的 生 物 素 化 程 度 及 活 性 的 测 定 : ELISA 法 测 定 生 物 素 化 CD5 单 抗 ( 鼠 源 性 ) 的 免 疫 果

568 活 性 平 均 为 (90 57 ± 8 13) % ; 采 用 HABA / Avidin 试 剂 测 定, 平 均 每 个 CD5 单 抗 分 子 可 结 合 0 个 生 物 素 分 子 2. 188 Re 标 记 CD5 单 抗 及 Avidin 的 标 记 率 测 定 : 经 多 次 标 记 实 验 得 出, 在 最 佳 标 记 条 件 下, 188 Re CD5 单 抗 标 记 率 平 均 为 (82 52 ± 2 92)%, 188 Re Avidin 标 记 率 平 均 为 (80 83 ± 3 8)%, 经 PD 10 柱 纯 化 后, 二 者 放 化 纯 度 均 > 90%, 二 者 放 射 性 比 活 度 平 均 为 (2 06 ± 0 07)TBq / mmol 3. 188 Re CD5 单 抗 与 Raji 细 胞 的 体 外 结 合 实 验 和 竞 争 结 合 抑 制 实 验 : 188 Re CD5 单 抗 与 Raji 细 胞 的 总 结 合 率 平 均 为 (78 88 ± 1 62)%, 表 明 CD5 单 抗 经 188 Re 标 记 后 仍 保 持 着 较 好 的 免 疫 活 性 在 竞 争 结 合 抑 制 实 验 中, 同 时 加 入 标 记 物 和 过 量 的 CD5 单 抗, 细 胞 结 合 率 平 均 仅 为 (7 96 ± 0 87)%, 而 未 加 入 过 量 的 CD5 单 抗, 其 细 胞 结 合 率 平 均 为 (70 92 ± 1 91)%, 表 明 标 记 的 CD5 单 抗 与 Raji 细 胞 的 结 合 可 被 未 标 记 的 CD5 单 抗 竞 争 性 抑 制, 提 示 标 记 CD5 单 抗 与 Raji 细 胞 的 结 合 具 有 特 异 性 ( 表 1). 188 Re 标 记 物 不 同 处 理 组 对 体 外 培 养 的 Raji 细 胞 增 殖 抑 制 作 用 : 采 用 CCK 8 测 定 Raji 细 胞 增 殖 抑 制 实 验 结 果 如 表 2 所 示 二 步 法 预 定 位 组 188 Re CD5 单 抗 组 188 Re Avidin 组 和 组 对 Raji 细 胞 的 增 殖 均 有 抑 制 作 用, 其 抑 制 率 与 放 射 性 活 度 呈 正 相 关 关 系 ( r = 0 907 0 992 0 968 0 976, P < 0 05); 在 相 同 的 放 射 性 活 度 下, 二 步 法 预 定 位 组 抑 制 作 用 均 强 于 188 Re CD5 组 188 188 Re Avidin 组 和 ReO - 组 ( t = 12 76 ~ 607 98,P < 0 05); 而 188 Re Avidin 组 和 组 的 抑 制 作 用 差 异 无 统 计 学 意 义 (P > 0 05) 讨 血 液 系 统 恶 性 肿 瘤, 包 括 急 性 白 血 病 慢 性 白 血 病 恶 性 淋 巴 瘤 等, 是 严 重 威 胁 人 类 健 康 和 生 命 的 疾 病, 而 传 统 的 放 化 疗 并 不 能 彻 底 治 愈 血 液 系 统 恶 性 肿 瘤 以 及 延 长 患 者 的 生 存 时 间 和 降 低 其 死 亡 率 [12] 而 基 于 单 克 隆 抗 体 的 放 射 免 疫 靶 向 治 疗 则 具 有 靶 向 性 强 特 异 性 高 和 不 良 反 应 小 等 特 点, 将 显 著 提 高 对 血 液 系 统 恶 性 肿 瘤 的 治 愈 率, 极 大 地 改 善 患 者 的 生 活 质 量 [3,6] 目 前 已 经 用 于 临 床 的 有 放 射 性 标 记 抗 CD20 单 抗 [13], 还 有 许 多 正 在 进 行 Ⅰ [1] 期 Ⅱ 期 临 床 试 验 Pagel 等 比 较 了 抗 CD20 单 抗 和 抗 CD5 单 抗 在 小 鼠 B 系 淋 巴 瘤 的 放 射 免 疫 治 疗 中 的 疗 效, 同 量 放 射 性 标 记 的 抗 CD5 单 抗 在 肿 瘤 组 织 中 的 吸 收 量 是 抗 CD20 单 抗 的 1 2 ~ 1 倍, 肿 瘤 组 织 和 正 常 组 织 的 吸 收 比 较, 抗 CD5 单 抗 为 1 5 1( 血 液 ) ~ 20 1( 小 肠 ), 抗 CD20 单 抗 为 0 1 ( 血 液 ) ~ 9 8 1( 小 肠 ) CD5 抗 原 在 白 细 胞 表 面 广 泛 表 达, 而 在 其 他 实 体 组 织 细 胞 上 不 表 达, 具 有 良 好 的 靶 向 性 188 Re 具 有 良 好 的 核 物 理 与 生 物 学 行 为, 研 究 表 明, 高 铼 酸 盐 在 各 脏 器 吸 收 较 少 并 很 快 地 通 过 尿 排 泄, 在 人 体 内 的 生 物 半 衰 期 < 10 h, 不 会 对 人 体 造 成 严 重 的 辐 射 损 伤, 有 可 能 在 肿 瘤 的 治 疗 方 面 起 到 很 好 的 作 用 [9] 本 研 究 将 具 有 广 谱 抗 肿 瘤 特 性 的 CD5 单 抗 作 为 放 射 性 核 素 的 靶 向 载 体, 选 用 诊 治 兼 用 的 放 射 性 核 素 188 Re 对 其 进 行 标 记, 制 备 具 有 特 异 性 靶 向 作 用 的 放 射 免 疫 药 物, 为 进 一 步 提 高 放 射 免 疫 治 疗 药 物 的 疗 效, 又 将 亲 和 素 生 物 素 系 统 的 预 定 位 技 术 应 用 于 单 抗 的 放 免 治 疗 中, 利 用 亲 和 素 生 物 素 高 度 特 异 性 结 合 能 力 及 信 号 放 大 作 用, 以 及 188 Re 优 良 的 核 素 性 质 可 把 药 物 的 不 良 反 应 降 低 到 最 低 水 平, 而 且 论 表 1 188 Re CD5 单 抗 与 不 同 细 胞 数 Raji 细 胞 的 体 外 竞 争 结 合 率 比 较 (%, x ± s) 组 别 样 本 数 0 5 10 5 1 10 5 2 10 5 3 10 5 5 10 5 未 加 CD5 单 抗 组 3 70 05 ± 0 58 69 18 ± 1 1 71 06 ± 2 69 71 93 ± 1 6 70 13 ± 2 26 加 过 量 CD5 单 抗 组 3 6 30 ± 0 90 a 8 15 ± 1 05 a 6 51 ± 1 02 a 6 52 ± 0 6 a 7 5 ± 1 75 a 注 : a 与 未 加 CD5 单 抗 组 比 较,t = 112 9 52 57 32 23 55 1 82 93,P < 0 05 表 2 188 Re 标 记 物 不 同 处 理 组 在 不 同 放 射 性 活 度 下 对 体 外 培 养 Raji 细 胞 的 抑 制 率 (%, x ± s) 组 别 样 本 数 18 5 kbq 7 kbq 185 kbq 370 kbq 555 kbq 二 步 法 预 定 位 组 3 28 90 ± 0 07 30 76 ± 0 09 35 65 ± 0 11 9 3 ± 0 13 78 07 ± 0 1 188 Re CD5 单 抗 组 3 13 9 ± 0 07 a 16 56 ± 0 17 b 22 01 ± 0 09 c 28 9 ± 0 15 d 33 0 ± 0 15 e 188 Re Avidin 组 3 8 ± 0 12 a 8 51 ± 0 10 b 16 7 ± 0 12 c 18 77 ± 0 10 d 2 78 ± 0 11 e 组 3 3 88 ± 0 10 a 9 76 ± 0 1 b 15 08 ± 0 1 c 18 29 ± 0 12 d 19 86 ± 0 08 e 注 : 与 同 一 活 度 二 步 法 预 定 位 组 比 较, a t = 23 0 257 3 37 22,P < 0 05; b t = 12 76 282 16 215 36,P < 0 05; c t = 165 6 20 37 207 28,P < 0 05; d t = 185 65 331 55 309 21,P < 0 05; e t = 37 82 518 11 607 98,P < 0 05

569 基 于 CD5 单 抗 的 靶 向 放 射 免 疫 药 物 的 研 究 国 内 外 报 道 较 少 [15 16] 预 定 位 的 概 念 是 针 对 放 射 性 核 素 标 记 抗 体 类 药 物 而 言 的, 其 原 理 是 将 抗 肿 瘤 抗 体 与 放 射 性 核 素 分 开 给 药, 延 长 抗 体 在 肿 瘤 细 胞 上 的 滞 留 时 间, 使 肿 瘤 结 合 与 未 结 合 抗 体 之 比 达 最 大 值 [11 12,15], 预 定 位 技 术 的 优 点 是 增 加 了 放 射 性 药 物 在 肿 瘤 组 织 的 浓 聚, 提 高 了 药 物 的 有 效 性 并 减 少 了 不 良 反 应 与 传 统 的 放 射 性 核 素 标 记 单 抗 相 比, 预 定 位 技 术 显 示 了 更 好 的 治 疗 效 果, 显 著 地 提 高 了 肿 瘤 组 织 中 的 放 射 性 剂 量 [15] 为 此, 本 研 究 选 择 CD5 高 表 达 的 Raji 细 胞 系, 利 用 体 外 细 胞 培 养 技 术 检 测 188 Re CD5 单 抗 的 靶 向 结 合 性 及 二 步 法 预 定 位 体 外 抗 肿 瘤 作 用 188 Re CD5 单 抗 与 Raji 细 胞 的 体 外 竞 争 结 合 实 验 表 明 :CD5 单 抗 经 188 Re 标 记 后 仍 保 持 着 较 好 的 免 疫 结 合 活 性, 且 可 被 未 标 记 的 CD5 单 抗 竞 争 性 抑 制, 表 明 188 Re 标 记 的 CD5 单 抗 可 特 异 性 地 结 合 Raji 细 胞, 即 对 淋 巴 瘤 Raji 细 胞 具 有 靶 向 性 目 前, 研 究 抗 肿 瘤 药 物 对 体 外 培 养 的 肿 瘤 细 胞 抑 制 作 用 的 常 用 方 法 是 MTT 法 其 原 理 为 活 细 胞 线 粒 体 中 的 琥 珀 脱 氢 酶 能 使 黄 色 可 溶 的 MTT 还 原 为 难 溶 性 的 蓝 紫 色 的 甲 臜 ( formazam) 结 晶, 而 死 细 胞 没 有 此 功 能 这 种 结 晶 物 能 溶 解 于 二 甲 亚 砜 (DMSO) 中, 并 能 用 酶 联 免 疫 检 测 仪 测 定 溶 液 在 90 nm 处 的 吸 光 度, 这 个 吸 光 度 值 在 一 定 范 围 内 和 细 胞 数 量 成 正 比 而 本 实 验 采 用 的 CCK 8 试 剂 盒, 是 一 种 基 于 WST 8 的 广 泛 应 用 于 细 胞 增 殖 和 细 胞 毒 性 的 快 速 高 灵 敏 度 检 测 试 剂 盒 WST 8 是 一 种 类 似 于 MTT 的 化 合 物, 在 电 子 耦 合 试 剂 1 Methoxy PMS 存 在 的 情 况 下, 可 以 被 还 原 生 成 橙 黄 色 水 溶 性 的 甲 臜 细 胞 增 殖 越 多 越 快, 则 颜 色 越 深 ; 细 胞 毒 性 越 大, 则 颜 色 越 浅 对 于 同 样 的 细 胞, 颜 色 的 深 浅 和 细 胞 数 目 呈 线 性 关 系 本 试 剂 盒 与 传 统 的 MTT 法 相 比 具 有 明 显 的 优 势 :1CCK 8 法 是 一 种 灵 敏 度 高 操 作 简 便 使 用 安 全 的 细 胞 增 殖 与 毒 性 检 测 方 法 ;2CCK 8 法 对 细 胞 无 毒, 可 以 多 次 测 定 选 取 最 佳 测 定 时 间, 与 MTT 方 法 相 比 线 性 范 围 更 宽, 灵 敏 度 更 高 ;3CCK 8 溶 液 不 需 配 制, 可 以 直 接 加 入 到 细 胞 样 品 中, 即 开 即 用, 比 MTT 更 加 稳 定, 实 验 结 果 重 复 性 好 ;MTT 实 验 生 成 的 formazam 不 是 水 溶 性 的, 需 要 使 用 DMSO 等 有 机 溶 剂 溶 解 ; 而 本 方 法 产 生 的 formazam 是 水 溶 性 的, 不 仅 省 去 了 溶 解 步 骤, 更 因 此 减 少 了 该 操 作 步 骤 带 来 的 误 差 基 于 上 述 原 因, 本 实 验 中 采 用 CCK 8 法 研 究 种 188 Re 标 记 物 对 体 外 培 养 的 Raji 细 胞 的 抑 制 作 用, 结 果 表 明 二 步 法 预 定 位 组 188 Re CD5 单 抗 组 188 Re Avidin 组 和 组 对 Raji 细 胞 的 增 殖 均 有 不 同 程 度 的 抑 制 作 用, 其 抑 制 率 与 放 射 性 活 度 呈 正 相 关 关 系 ; 在 放 射 性 活 度 相 等 的 情 况 下, 二 步 法 预 定 位 组 在 各 时 间 点 抑 制 作 用 均 明 显 高 于 188 Re CD5 单 抗 组 188 Re Avidin 组 和 组 ; 而 188 Re Avidin 组 和 组 相 比, 抑 制 作 用 差 异 无 统 计 学 意 义 实 验 结 果 表 明, 二 步 法 预 定 位 可 以 增 强 放 射 性 核 素 对 Raji 细 胞 的 杀 伤 与 抑 制 作 用 其 原 因 可 能 与 CD5 单 抗 的 特 异 性 结 合 作 用 预 定 位 方 式 充 分 保 留 了 生 物 素 化 CD5 单 抗 的 免 疫 结 合 活 性 以 及 放 射 性 核 素 标 记 的 亲 和 素 可 在 肿 瘤 细 胞 内 尽 可 能 多 的 集 聚, 从 而 提 高 了 杀 伤 Raji 细 胞 的 放 射 效 应 [17] 因 此,CD5 单 抗 介 导 的 188 Re Avidin 的 二 步 法 预 定 位 对 Raji 细 胞 的 杀 伤 作 用 应 高 于 188 Re CD5 单 抗, 本 实 验 结 果 也 证 实 了 这 一 点 而 188 Re Avidin 和 因 均 不 能 与 Raji 细 胞 发 生 特 异 性 结 合, 当 吸 去 药 物 时, 其 杀 伤 作 用 也 随 之 停 止, 因 而 抑 癌 作 用 较 弱 总 之, 本 研 究 结 果 证 实 二 步 法 预 定 位 对 体 外 培 养 肿 瘤 细 胞 增 殖 的 抑 制 效 应 方 面 取 得 了 初 步 的 成 功, 但 考 虑 到 体 外 细 胞 试 验 与 荷 瘤 动 物 模 型 不 完 全 相 同, 仍 需 在 荷 瘤 小 鼠 动 物 模 型 中 实 施 二 步 法 预 定 位 放 免 治 疗 的 研 究, 以 验 证 二 步 法 预 定 位 体 内 抗 肿 瘤 作 用 的 有 效 性 参 考 文 献 [ 1 ] Ratei R, Sperling C, Karawajew L, et al. Immunophenotype and clinical characteristics of CD5 negative and CD5 positive childhood acute lymphoblastic leukemia [ J ]. 1998, 77(3): 107 11. Ann Hematol, [ 2 ] 郑 文 莉, 李 贵 平. 亲 和 素 生 物 素 系 统 预 定 位 放 免 治 疗 白 血 病 的 研 究 [J]. 放 射 免 疫 学 杂 志, 2013, 26(): 28 32. [ 3 ] 汪 兵, 李 贵 平. 放 射 性 核 素 标 记 单 克 隆 抗 体 靶 向 治 疗 血 液 系 统 恶 性 肿 瘤 [J]. 放 射 免 疫 学 杂 志, 2011, 2(2): 1 17. [ ] 李 贵 平, 汪 兵, 黄 宝 丹, 等. CD5 单 抗 介 导 的 淋 巴 瘤 荷 瘤 裸 鼠 三 步 法 预 定 位 放 免 显 像 [ J]. 中 山 大 学 学 报 ( 医 学 科 学 版 ), 201, 35(1):127 131. [ 5 ] 郑 文 莉, 李 贵 平, 黄 宝 丹, 等. 188 Re 直 接 法 标 记 CD5 单 抗 及 其 体 内 生 物 分 布 研 究 [ J]. 中 华 临 床 医 师 杂 志 ( 电 子 版 ), 2013, 7(18):135 138. [ 6 ] Pagel JM, Matthews DC, Kenoyer A, et al. Pretargeted radioimmunotherapy using anti CD5 monoclonal antibodies to deliver radiation to murine hematolymphoid tissues and human myeloid leukemia[ J]. Cancer Res, 2009, 69(1): 185 192. ( 下 转 第 57 页 )

57 [13] Shirai K, Mizui T, Suzuki Y, et al. X irradiation changes dendritic spine morphology and density through reduction of cytoskeletal proteins in mature neurons[ J]. Radiat Res, 2013, 179(6):630 636. [1] Yang M, Song MS, Kim SH, et al. Cytotoxicity of gamma ray in rat immature hippocampal neurons[ J]. J Vet Sci, 2011,12(3): 203 207. [15] Shirai K, Mizui T, Suzuki Y, et al. Differential effects of X irradiation on immature and mature hippocampal neurons in vitro [ J]. Neurosci Lett, 2006,399(1 2):57 60. [16] 王 国 卿, 封 丽 芳, 夏 作 理. 星 形 胶 质 细 胞 的 生 物 学 功 能 与 神 经 元 修 复 [J]. 中 国 临 床 康 复,2005,9(1):16 18. [17] Fiala JC, Spacek J, Harris KM. Dendritic spine pathology: cause or consequence of neurological disorders? [ J]. Brain Res Brain Res Rev, 2002,39(1):29 5. [18] Kojima N, Shirao T. Synaptic dysfunction and disruption of postsynaptic drebrin actin complex: a study of neurological disorders accompanied by cognitive deficits[ J]. Neurosci Res, 2007,58(1):1 5. [19] Benedito AB, Lehtinen M, Massol R, et al. The transcription factor NFAT3 mediates neuronal survival [ J]. J Biol Chem, 2005,280():2818 2825. [20] Graef IA, Wang F, Charron F, et al. Neurotrophins and netrins require calcineurin / NFAT singaling to stimulate outgrowth of embryonic axons[ J]. Cell,2003,113(5):657 670. [21] Abdul HM, Sama MA, Furman JL, et al. Cognitive decline in Alzheimer s disease is associated with selective changes in calcineurin / NFAT signaling [ J]. J Neurosci, 2009,29 ( 1 ): 12957 12969. [22] Schwartz N, Schohl A, Ruthazer ES. Neural activity regulates synaptic properties and dendritic structure in vivo through calcineurin / NFAT signaling [ J ]. Neuron, 2009, 62 ( 5 ): 655 669. [23] Nguyen T, Di Giovanni S. NFAT signaling in neural development and axon growth [ J ]. Int J Dev Neurosci, 2008, 26 ( 2 ): 11 15. [2] Quadrato G, Benevento M, Alber S, et al. Nuclear factor of activated T cells ( NFATc ) is required for BDNF dependent survival of adult born neurons and spatial memory formation in the hippocampus[ J]. Proc Natl Acad Sci USA,2012,109(23): E199 1508. ( 收 稿 日 期 :2015 03 06) ( 上 接 第 569 页 ) [ 7 ] Iznaga Escobar N, Ramirez IL, Izquierdo JC, et al. 188 Re labeled anti epidermal growth factor receptor humanized monoclonal antibody h R3: labeling conditions, in vitro and in vivo stability[ J]. Methods Find Exp Clin Pharmacol, 2003, 25 (9): 703 711. [ 8 ] Luo TY, Cheng PC, Chiang PF, et al. 188 Re HYNIC trastuzumab enhances the effect of apoptosis induced by trastuzumab in HER2 overexpressing breast cancer cells[ J]. Ann Nucl Med, 2015, 29(1):52 62. [ 9 ] Pillai MR, Dash A, Knapp FF Jr. Rhenium 188: availability from the 188 W / 188 Re generator and status of current applications [ J]. Curr Radiopharm, 2012, 5(3): 228 23. [10] Lütje S, Rijpkema M, Goldenberg DM, et al. Pretargeted dual modality immuno SPECT and near infrared fluorescence imaging for image guided surgery of prostate cancer [ J]. Cancer Res, 201, 7(21):6216 6223. [11] Goldenberg DM, Chang CH, Rossi EA, et al. Pretargeted molecular imaging and radioimmunotherapy [ J]. Theranostics, 2012, 2(5):523 50. [12] Green DJ, Pagel JM, Pantelias A, et al. Pretargeted radioimmunotherapy for B cell lymphomas[ J]. Clin Cancer Res, 2007, 13(18 Pt 2): 5598s 5603s. [13] Witzig TE, Wiseman GA, Maurer MJ, et al. A phase I trial of immunostimulatory CpG 7909 oligodeoxynucleotide and yttrium 90 ibritumomab tiuxetan radioimmunotherapy for relapsed B cell non Hodgkin lymphoma[ J]. Am J Hematol, 2013, 88(7):589 593. [1] Pagel JM, Hedin N, Subbiah K, et al. Comparison of anti CD20 and anti CD5 antibodies for conventional and pretargeted radioimmunotherapy of B cell lymphomas[ J]. Blood, 2003, 101 (6):230 238. [15] Paganelli G, Magnani P, Zito F, et al. Three step monoclonal antibody tumor targeting in carcinoembryonic antigen positive patients[ J]. Cancer Res, 1991, 51(21): 5960 5966. [16] Schulz AS, Glatting G, Hoenig M, et al. Radioimmunotherapy based conditioning for hematopoietic cell transplantation in children with malignant and nonmalignant diseases[ J]. Blood, 2011,117(17): 62 650. [17] Chen Y, Kornblit B, Hamlin DK, et al. Durable donor engraftment after radioimmunotherapy using alpha emitter astatine 211 labeled anti CD5 antibody for conditioning in allogeneic hematopoietic cell transplantation[ J]. Blood, 2012, 119(5): 1130 1138. ( 收 稿 日 期 :2015 01 0))