国 际 神 经 病 学 神 经 外 科 学 杂 志 年 第 卷 第 期 在 匹 罗 卡 品 致 痫 大 鼠 海 马 苔 藓 纤 维 出 芽 中 的 作 用 论 著 唐 薇 婷 曾 畅 李 国 良 冯 莉 陈 锶 肖 波 中 南 大 学 湘 雅 医 院 神 经 内 科 湖 南 省 长 沙 市 中 南 大 学 湘 雅 医 院 健 康 管 理 中 心 湖 南 省 长 沙 市 摘 要 目 的 观 察 传 统 型 瞬 时 受 体 电 位 通 道 ()* 蛋 白 在 匹 罗 卡 品 致 痫 大 鼠 海 马 中 的 表 达 变 化 探 讨 其 在 海 马 苔 藓 纤 维 出 芽 中 的 作 用 方 法 只 +, 大 鼠 随 机 分 为 - 和 - 采 用 氯 化 锂 匹 罗 卡 品 腹 腔 注 射 法 建 立 颞 叶 癫 痫 模 型 腹 腔 注 射 等 量 无 菌 生 理 盐 水 按 癫 痫 持 续 状 态 + 后../.. 和. 分 为 / 个 亚 组 每 亚 组 只 大 鼠 以 上 各 亚 组 及 再 分 为 个 小 组 分 别 进 行 011 %"$ 检 测 ()* 及 突 触 重 建 标 志 蛋 白 + $! 在 海 马 中 的 表 达 和! 染 色 观 察 海 马 苔 藓 纤 维 出 芽 并 评 分 结 果 ()* 蛋 白 表 达 量 在 + 后. 达 高 峰 其 他 时 间 点 均 显 著 高 于 + $! 蛋 白 表 达 量 在 + 后. /.. 和. 显 著 增 加. / /.... 达 峰 值 大 鼠 齿 状 回 内 分 子 层 在 + 后. 出 现! 颗 粒 并 呈 进 行 性 增 加 结 论 ()* 可 能 参 与 了 苔 藓 纤 维 出 芽 这 一 过 程 关 键 词 传 统 型 瞬 时 受 体 电 位 通 道 匹 罗 卡 品 颞 叶 癫 痫 苔 藓 纤 维 出 芽 大 鼠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海 马 苔 藓 纤 维 出 芽 $3!%1$4!2 ;:+ 及 其 所 导 致 的 突 触 重 建 是 颞 叶 癫 痫 特 征 性 的 病 理 改 变 有 不 少 研 究 发 现 钙 离 子 通 道 与 ;:+ 密 切 相 关 瞬 时 受 体 电 位 通 道!111$$1!" 1" () 1" 是 位 于 细 胞 膜 或 胞 内 细 胞 器 膜 上 的 一 类 重 要 的 非 选 择 性 阳 离 子 通 道 可 直 接 介 导 钙 离 子 内 流 也 可 以 膜 去 极 化 方 式 激 活 其 他 钙 基 金 项 目 中 央 高 校 基 本 科 研 业 务 费 专 项 资 金 资 助 中 南 大 学 收 稿 日 期 修 回 日 期 作 者 简 介 唐 薇 婷 女 博 士 医 师 主 要 从 事 癫 痫 的 研 究 通 讯 作 者 肖 波 男 教 授 博 士 博 士 生 导 师 主 要 从 事 癫 痫 研 究!"#!$%$&'$$$
D$4 "$31!$ "14$"$2. 14$421 离 子 通 道 已 知 传 统 型 () 通 道 $!"() ()* 与 钙 离 子 通 道 密 切 相 关 但 其 是 否 参 与 ;:+ 尚 不 清 楚 本 研 究 拟 动 态 监 测 ()* 蛋 白 在 匹 罗 卡 品 致 痫 大 鼠 海 马 中 的 变 化 结 合 突 触 重 建 标 志 蛋 白 + $! 检 测 和! 染 色 探 讨 其 在 ;:+ 中 的 可 能 作 用 * + 材 料 与 方 法 * * + 材 料 +, 雄 性 大 鼠 只 周 龄 体 重 / 2 由 中 南 大 学 湘 雅 医 学 院 试 验 动 物 部 提 供 氯 化 锂 盐 酸 匹 罗 卡 品 山 羊 抗 兔 2 二 抗 兔 抗 山 羊 2 二 抗 9+ +,+! +!2 公 司 山 羊 ()* 多 克 隆 一 抗 + *4 公 司 兔 + $! 多 克 隆 一 抗 *1!$ 公 司 蛋 白 浓 度 检 测 试 剂 盒 <)= 公 司 考 马 斯 亮 蓝 / >+9 公 司 内 参! 蛋 白 上 海 硕 盟 阿 拉 伯 树 胶 上 海 国 药 集 团 化 学 试 剂 有 限 公 司 日 本 光 电 / 型 脑 电 图 机 垂 直 板 电 泳 仪 和 凝 胶 成 像 系 统 9!$(. *, + 方 法 实 验 动 物 分 组 及 造 模 +, 雄 性 大 鼠 只 随 机 分 为 - 与 - 按 癫 痫 持 续 状 态 + 后.. /.. 和. 分 为 / 个 亚 组 每 亚 组 只 大 鼠 以 上 各 亚 组 及 再 分 为 个 小 组 分 别 进 行 01 1 %"$ 方 法 检 测 ()* 蛋 白 及 突 触 素 + $! 在 海 马 中 的 表 达! 染 色 观 察 海 马 ;:+ 并 评 分 大 鼠 腹 腔 注 射 氯 化 锂 =!*" 7?82 约 / 2?82 后 予 匹 罗 卡 品 )!"$ 2?82 腹 腔 注 射 注 射 匹 罗 卡 品 后 观 察 大 鼠 的 行 为 变 化 痫 性 发 作 程 度 按 (!1 标 准 进 行 分 级 达 到 (!1 级 并 进 入 癫 痫 持 续 状 态 的 大 鼠 为 致 痫 成 功 组 若 无 发 作 或 发 作 未 达 (!1 级 的 大 鼠 继 续 注 射 匹 罗 卡 品 2?82? 次 可 重 复 次 其 间 达 级 以 上 的 动 物 也 归 为 致 痫 成 功 组 次 后 仍 未 达 到 标 准 的 为 致 痫 不 成 功 组 + 持 续 /! 以 上 者 予 @ 水 合 氯 醛 "?82 腹 腔 注 射 终 止 发 作 致 痫 不 成 功 组 和 死 亡 大 鼠 予 以 剔 除 并 在 后 续 的 实 验 中 补 足 大 鼠 予 腹 腔 注 射 生 理 盐 水 / 2?82 并 于 注 射 后 观 察 其 行 为 学 变 化 脑 电 图 记 录 急 性 期. 静 止 期. 慢 性 期. 大 鼠 和 大 鼠 分 别 进 行 脑 电 图 描 记 记 录 方 法 为 大 鼠 麻 醉 后 用 橡 皮 套 套 住 大 鼠 的 四 肢 固 定 于 木 板 上 再 用 细 麻 绳 套 住 大 鼠 门 齿 以 固 定 头 部 参 考 导 联 描 记 一 根 电 极 插 入 大 鼠 颞 部 头 皮 下 另 一 根 电 极 插 入 对 侧 乳 突 皮 下 在 日 本 光 电 / 型 脑 电 图 机 上 描 记 脑 电 活 动 海 马 组 织 蛋 白 的 提 取 及 011 9"$ 检 测 ()* 蛋 白 水 平 将 各 时 间 点 动 物 用 @ 水 合 氯 醛 / "?82 腹 腔 注 射 麻 醉 迅 速 断 头 取 脑 完 整 分 离 出 海 马 用 组 织 裂 解 液 提 取 海 马 组 织 全 细 胞 蛋 白 使 用 9* 法 测 定 总 蛋 白 浓 度 A 水 浴 箱 内! 使 蛋 白 变 性 用 +,+ ) 电 泳 分 离 蛋 白 用 免 疫 印 迹 操 作 转 膜 再 封 闭 然 后 将 膜 裁 剪 成 目 标 条 带 和 内 参 相 应 条 带 并 分 别 置 于 封 闭 液 稀 释 好 的 一 抗 中 山 羊 ()* 多 克 隆 抗 体 稀 释 浓 度 为 / + $! 多 克 隆 抗 体 稀 释 浓 度 为 摇 床 轻 摇 孵 育! 后 A 孵 育 过 夜 9+ 洗 B! 然 后 再 放 在 另 一 塑 料 袋 中 加 入 封 闭 液 稀 释 的 二 抗 稀 释 浓 度 室 温 下 摇 床 轻 摇 9+ 洗 B! 滴 加,9 液 避 光 显 色 将 胶 片 进 行 扫 描 用 凝 胶 图 像 处 理 系 统 分 析 目 标 带 的 净 光 密 度 值 内 参 为! 分 子 量 <, 灌 注 取 材 及! 染 色 观 察 海 马 苔 藓 纤 维 出 芽 于 各 时 间 点 常 规 用 @ 水 合 氯 醛 / "?82 麻 醉 实 验 动 物 经 左 心 室 灌 注 生 理 盐 水 / " 再 用 含 @ 硫 化 钠 的 ";)9 C 灌 注! 续 用 A @ 多 聚 甲 醛 灌 注 /! 量 约 / " 断 头 取 脑 置 A @ 多 聚 甲 醛 固 定 过 夜 后 常 规 脱 水 行 冰 冻 切 片 自 中 脑 向 额 叶 行 冠 状 连 续 切 片 收 集 有 海 马 的 脑 片 贴 片 室 温 晾 干 在 暗 室 中 入 显 影 液 中 显 色!! 显 影 液 配 方 / @ 阿 拉 伯 树 胶 " 柠 檬 酸 盐 缓 冲 液 " / @ 对 苯 二 酚 溶 液 " @ 硝 酸 银 溶 液 / " 流 水 冲 洗 /! 终 止 反 应 常 规 脱 水 透 明 树 胶 封 片 各 时 间 点 每 只 大 鼠 随 机 选 取 张 切 片 大 鼠 选 取 相 近 断 面 的 切 片 在 生 物 光 学 显 微 镜 倍 物 镜 下 观 察 海 马 * 区 和 齿 状 回 颗 粒 细 胞 上 区! 颗 粒 并 评 分 采 用 / 分 半 定 量 评 分 标 准 如 下 分 未 见! 颗 粒 分 偶 见! 颗 粒! 颗 粒 不 连 续 分 布 分 较 多! 颗 粒 不 连 续 分 布 分! 颗 粒 近 连 续 分 布 分! 颗 粒 连 续 分 布 / 分! 颗 粒 形 成 致 密
国 际 神 经 病 学 神 经 外 科 学 杂 志 年 第 卷 第 期 的 层 状 带 * - + 统 计 学 处 理 实 验 数 据 均 用 均 数 标 准 差 0, 表 示 成 组 设 计 多 样 本 均 数 用 单 因 素 方 差 分 析 E 实 验 组 与 间 比 较 用 两 样 本 检 验 检 验 水 准 - / 统 计 分 析 和 图 表 绘 制 分 别 用 +)++ 统 计 软 件 和 ;!$$3E3!1#1" 进 行, + 结 果, * + 行 为 学 变 化 及 脑 电 图 表 现 用 氯 化 锂 腹 腔 注 射 后 大 鼠 行 为 活 动 无 变 化 在 匹 罗 卡 品 注 射 /! 后 大 鼠 开 始 呈 现 外 周 胆 碱 能 反 应 开 始 发 作 尚 不 频 繁 随 着 时 间 延 长 发 作 频 率 增 高 用 于 致 痫 的 大 鼠 共 只 其 中 / 只 大 鼠 达 到 (!1 级 并 进 入 + 进 入 + 状 态 后 有 只 因 抽 搐 致 死 其 余 大 鼠 在 后 进 入 静 止 期 静 止 期 大 部 分 大 鼠 行 为 正 常 少 数 抽 搐 严 重 的 大 鼠 进 入 静 止 期 后 活 动 迟 钝 不 能 主 动 进 食 进 水 数 天 后 衰 竭 死 亡 共 计 只 存 活 的 大 鼠 于 /. 后 出 现 自 发 发 作 呈 强 直 阵 挛 性 发 作 持 续 时 间 短 暂 约 半 分 钟 至! 发 作 次 数 从. 数 次 至 数 天 次 不 等 慢 性 期 内 大 鼠 无 死 亡 致 痫 不 成 功 和 死 亡 大 鼠 予 以 剔 除 并 在 后 续 的 实 验 中 补 足 大 鼠 + 后. 急 性 期 均 异 常 表 现 为 节 律 增 多 及 单 个 多 个 棘 波 或 阵 发 连 续 棘 波 群 发 放 + 后. 静 止 期 正 常 + 后. 慢 性 期 则 可 记 录 到 散 发 尖 波 棘 波 或 棘 慢 波 未 出 现 诱 发 发 作 及 自 发 发 作 用 同 样 方 法 记 录 亦 未 见 癫 痫 样 放 电 波,., + 蛋 白 表 达 变 化 011 9"$ 结 果 显 示 ()* 蛋 白 表 达 量 在 + 后. 达 高 峰 其 他 时 间 点 均 显 著 高 于 对 照 见 表 图,.- + /%!!$ 蛋 白 表 达 变 化 011 9"$ 结 果 显 示 + $! 蛋 白 表 达 量 在 + 后. /.. 和. 较 显 著 增 加 / 或. 达 峰 值 见 表 图 表 *+ 与 不 同 时 间 点 蛋 白 平 均 0 值 +0, 蛋 白.. /... ()* / / / 注 与 相 比 表,+ 与 不 同 时 间 点 /%!!$ 蛋 白 平 均 0 值 +0, 蛋 白.. /... + $! / / / / 注 和 为 与 相 比 分 别 为 / 图 *+()* 蛋 白 在 及 不 同 时 间 点 的 表 达,.1 + 染 色 大 鼠 未 见 苔 藓 纤 维 穿 越 齿 状 回 颗 粒 细 胞 层 到 齿 状 回 内 分 子 层 见 图 匹 罗 卡 品 致 痫 大 鼠 + 后. 内 分 子 层 出 现 点 状! 颗 粒 + 后 /. 起! 颗 粒 进 行 性 增 加 直 到 本 研 究 结 束 + 后. 见 图 至 图 具 体 评 分 见 表 "! #$ 图, + + $! 蛋 白 在 及 不 同 时 间 点 的 表 达 表 -+ 与 各 时 间 点 齿 状 回 内 层 子 层 染 色 评 分 评 分 分 值 例 数.. /... / / /
D$4 "$31!$ "14$"$2. 14$421 图 - +! 染 色 大 鼠 海 马 B 图 1 +! 染 色 + 后 /. 大 鼠 海 马 B 图 +! 染 色 + 后. 大 鼠 海 马 B 图 +! 染 色 + 后. 大 鼠 海 马 B - + 讨 论 氯 化 锂 匹 罗 卡 品 致 痫 大 鼠 模 型 在 行 为 及 病 理 改 变 上 与 人 类 颞 叶 癫 痫 非 常 类 似 近 年 来 一 直 被 视 为 理 想 的 颞 叶 癫 痫 模 型 而 广 泛 应 用 于 颞 叶 癫 痫 发 病 机 制 和 抗 癫 痫 药 物 的 研 究 约 @ @ 的 颞 叶 癫 痫 患 者 伴 有 海 马 硬 化 包 括 神 经 细 胞 脱 失 胶 质 增 生 和 海 马 苔 藓 纤 维 出 芽 ;:+ 及 其 所 导 致 的 突 触 重 建 目 前 占 主 导 地 位 的 假 说 是 ;:+ 引 起 的 突 触 重 建 导 致 海 马 内 回 返 兴 奋 性 环 路 的 形 成 促 使 海 马 兴 奋 性 增 高 使 癫 痫 易 感 性 进 一 步 增 强 从 而 导 致 癫 痫 的 反 复 发 作 和 长 期 维 持 形 成 难 治 性 颞 叶 癫 痫! 染 色 法 是 利 用 苔 藓 纤 维 比 周 围 神 经 纤 维 网 有 较 高 的 含 锌 量 这 一 特 性 对 苔 藓 纤 维 进 行 特 异 性 染 色! 染 色 颗 粒 实 质 是 苔 藓 纤 维 突 触 末 端! 颗 粒 增 多 即 提 示 突 触 发 生 增 加 本 研 究 中! 染 色 揭 示 异 常 出 芽 的 苔 藓 纤 维 在 齿 状 回 内 分 子 层 的 生 长 具 有 时 间 依 赖 性 随 + 后 时 间 延 长 其 程 度 进 行 性 增 加 至 本 研 究 终 点. 达 高 峰 ;:+ 的 变 化 趋 势 提 示 突 触 重 建 对 促 进 颞 叶 癫 痫 的 发 生 发 展 有 重 要 意 义 突 触 蛋 白 + $! 是 一 种 相 对 分 子 质 量 为 的 钙 结 合 蛋 白 在 神 经 元 胞 体 合 成 后 主 要 转 运 至 轴 突 终 末 特 异 性 地 分 布 于 突 触 前 囊 泡 膜 上 是 突 触 终 末 特 异 性 标 志 物 它 既 是 突 触 发 生 的 标 志 又 能 反 映 突 触 的 传 递 效 能 *$4"1 认 为 在 癫 痫 形 成 过 程 中 神 经 元 突 触 重 建 需 持 久 的 基 因 表 达 及 一 定 的 物 质 基 础 + $! 直 接 参 与 了 神 经 元 间 信 息 的 传 递 对 突 触 传 递 效 能 的 变 化 有 显 著 影 响 与 突 触 可 塑 性 密 切 相 关 / C! 等 发 现 点 燃 癫 痫 模 型 大 鼠 反 复 抽 搐 后 随 着 囊 泡 合 成 增 加 + $! 表 达 增 多 以 满 足 突 触 活 动 增 强 对 突 触 囊 泡 的 需 要 本 研 究 结 果 显 示 与 相 比 大 鼠 在 + 后 /. 海 马 + $! 蛋 白 的 表 达 显 著 上 升 + 后. 达 到 最 高 峰 直 至 本 研 究 终 点. 仍 然 明 显 高 于 正 常 与 本 研 究 中! 颗 粒 增 多 基 本 一 致 表 明 伴 随 苔 藓 纤 维 出 芽 有 新 的 突 触 联 系 形 成 有 不 少 研 究 发 现 钙 通 道 与 ;:+ 密 切 相 关 例 如 = 型 钙 通 道 参 与 9,: 诱 导 出 芽 的 作 用 钙 通 道 阻 断 剂 尼 卡 地 平 可 阻 滞 匹 罗 卡 品 致 痫 诱 导 的 ;:+ () 通 道 主 要 介 导 钙 离 子 钠 离 子 和 镁 离 子 流 的 跨 膜 转 运 最 早 发 现 于 果 蝇 的 视 觉 系 统 迄 今 在 哺 乳 动 物 已 发 现 种 亚 型 分 属 于 个 亚 家 族 ()* () (); () ()) ();= 和 ( ) () 通 道 表 达 广 泛 调 节 机 制 各 异 参 与 痛 温
国 际 神 经 病 学 神 经 外 科 学 杂 志 年 第 卷 第 期 觉 机 械 感 觉 视 觉 味 觉 维 持 细 胞 内 外 的 离 子 稳 态 和 细 胞 生 长 调 控 等 众 多 生 命 活 动 由 于 它 们 可 能 与 各 种 人 类 疾 病 相 关 引 起 了 越 来 越 多 国 内 外 学 者 的 关 注 ()* 在 哺 乳 动 物 的 脑 组 织 中 有 较 高 的 表 达 依 据 氨 基 酸 序 列 的 同 源 性 及 功 能 的 相 似 度 哺 乳 动 物 ()* 家 族 可 分 为 个 亚 家 族 ( )* ()* ()*?? 以 及 ()*?/ 其 中 ()* 仅 表 达 于 大 鼠 和 小 鼠 在 人 类 属 伪 基 因 ()* 主 要 参 与 细 胞 膜 受 体 激 活 磷 脂 酶 * )=* 后 所 介 导 的 钙 离 子 进 入 蛋 白 偶 联 受 体 )*( 及 受 体 酪 氨 酸 激 酶 < 分 别 通 过 激 活 磷 脂 酶 * 和 激 活 ()* 通 道 9,: 与 受 体 酪 氨 酸 激 酶 9 89 结 合 后 可 激 活 磷 脂 酶 * 继 而 激 活 ()* 通 道 有 研 究 指 出 ()* 通 道 介 导 了 9,: 引 起 的 小 脑 颗 粒 细 胞 轴 突 导 向 的 作 用 提 示 ()* 可 能 参 与 了 神 经 元 发 育 和 可 塑 性 的 过 程 ;$1" 等 报 道 9,: 通 过 激 活 )=*?) ( 来 开 放 ()* 通 道 从 而 起 到 对 神 经 元 的 保 护 作 用 ()* 在 脑 组 织 中 表 达 最 多 大 量 研 究 表 明 ()* ( 及 蛋 白 表 达 于 大 鼠 海 马 同 时 还 表 达 于 人 脑 海 马 组 织 而 且 ()* 大 量 表 达 于 海 马 神 经 元 兴 奋 性 突 触 尤 其 是 突 触 后 ()* 通 道 可 通 过 磷 脂 酶 * )=* 依 赖 机 制 由 蛋 白 耦 联 受 体 )*( 和 受 体 酪 氨 酸 激 酶 < 激 活 活 化 后 可 能 通 过 *;< *(9 通 路 发 挥 促 树 突 生 长 的 作 用 本 研 究 发 现 大 鼠 ()* 在 + 后. 表 达 显 著 性 上 调 呈 进 行 性 上 升. 时 升 至 最 高 峰 ()* 表 达 显 著 上 调 与! 颗 粒 及 + $! 表 达 增 多 在 时 间 上 相 关 提 示 ()* 在 癫 痫 的 病 理 情 况 下 表 达 上 调 可 能 参 与 苔 藓 纤 维 异 常 出 芽 但 其 具 体 机 制 尚 不 明 了 尚 有 待 于 进 一 步 研 究 通 过 本 实 验 发 现 ()* 可 能 参 与 了 苔 藓 纤 维 出 芽 这 为 阐 明 癫 痫 发 病 机 制 开 发 抗 癫 痫 新 药 提 供 新 的 思 路 和 理 论 依 据 参 考 文 献 *", (41"=0 +4%!2*1()!$ 1"3!"(114$! (!1(D;$.!3!!$ $31!41!!%1"1!"!4 "!$ ;$$+1!41"1$11$2*"! 14$!$" C$"1=! D= *1 44 =$4! 1 "*$ 17411$31$ "1!41! 1 $$"$2!". %1!$"131 14$" / / *$4"1,*$!1!"1$21!1"4" "1!$! 1 "!%!1 3141!"1!4!"1! +4" + / C ( 9$1 1"!2,!$!!$ $31!4 $11!!$3 $!. ).4!2 1 41. "1 1$31"!!4!"$1!1$.1"! 1! 41..4"# 14$" C!9 911 ;!1, 1 "!!.11.1 21$311! $! $%1! $ "1#!.4"%! 4D *1"9!$" / <$ (. ;< :46!5 + 1 "9!.1!1. 14$$!3$!.4111#!%"111!4!! 1.1124 D14$! / 812!! ; 48!=1* 1"%"$81!!%!$3!%1$4!2. $2!!1.13!!3$"$5!2!"$!1 1!41!! 41!1 14$!11 / =! D! * *4!< 1 "1!"$"1$3()* 1"! 124!. 1$3112$5 $1%%!.1!1. 14$$!3$41 / +$! 0+ 981)+$1!2$". $1!215 9, :!.41. 14$ 4!"174!1()* 1"34!$ 14$! / / / $4 D,4 0= $4 <* 1 "*!!"$"1$3()* 1"! 13$!$ $31#!$ 14114 $!11!= :12+D 1(= 1 "()* 1"$$1.1.!!2$5! 1*;<*(9 5D*1"+!