中 南 大 学 学 报 ( 医 学 版 ) JCentSouthUniv(MedSci) 2008,33(4) 359 胎 兔 成 骨 细 胞 与 复 合 肝 细 胞 生 长 因 子 / 异 种 脱 蛋 白 松 质 骨 的 体 外 培 养 党 洪 胜, 赵 猛, 严 永 祥, 刘 家 国 ( 湖 北 十 堰 市 郧 阳 医 学 院 附 属 太 和 医 院 骨 科, 湖 北 十 堰 442000) [ 摘 要 ] 目 的 : 探 讨 肝 细 胞 生 长 因 子 (HGF) 对 体 外 培 养 的 胎 兔 成 骨 细 胞 在 异 种 脱 蛋 白 松 质 骨 (DPB) 支 架 上 黏 附 行 为 及 增 殖 和 分 化 功 能 的 影 响 方 法 : 成 骨 细 胞 从 胎 兔 中 分 离, 实 验 组 为 HGF/DPB 与 成 骨 细 胞 复 合 培 养, 对 照 组 为 DPB 与 成 骨 细 胞 常 规 培 养 通 过 电 镜 观 察 成 骨 细 胞 在 HGF/DPB 表 面 生 长 与 附 着 状 态, 同 时 检 测 细 胞 增 殖 状 况 和 碱 性 磷 酸 酶 (alkalinephosphatase,alp) 活 性 等, 评 价 成 骨 细 胞 生 长 情 况 和 细 胞 活 性 结 果 : 成 骨 细 胞 在 复 合 肝 细 胞 生 长 因 子 脱 蛋 白 骨 外 表 面 及 孔 隙 内 表 面 均 可 贴 附 生 长, 增 殖 分 化 良 好 HGF/DPB 对 成 骨 细 胞 的 ALP 活 性 有 明 显 的 促 进 作 用, 并 能 促 进 成 骨 细 胞 的 增 殖 结 论 :HGF/DPB 具 有 良 好 的 生 物 相 容 性 和 骨 诱 导 作 用, 可 作 为 骨 组 织 工 程 备 选 的 复 合 支 架 材 料 [ 关 键 词 ] 肝 细 胞 生 长 因 子 ; 成 骨 细 胞 ; 生 物 相 容 性 ; 骨 组 织 工 程 [ 中 图 分 类 号 ] R336 [ 文 献 标 识 码 ] A [ 文 章 编 号 ] 1672 7347(2008)04 0359 06 Biocompatibilityofcombineddeproteinizedbonecoatedwith hepatocytegrowthfactorasscafoldforosteoblastsinvitro infetalrabbits DANGHong sheng,zhaomeng,yanyong xiang,liujia guo (DepartmentofOrthopaedics,TaiheHospital,MedicalSchoolofYunyang,ShiyanHubei442000,China) Abstract: Objective Todeterminethecelularcompatibilityofcombineddeproteinizedbone (DPB)coatedwithhepatocytegrowthfactor(HGF),andtoobservetheadherentefectofosteo blastsinresponsetohgf.methods Osteoblastswereisolatedfrom fetalrabbits.osteoblastswere culturedwithdpbcoatedwithhgfanddeproteinizedboneasexperimentalgroupandcontralgroup, respectively. The proliferation and alkalinephosphatase activity were tested. Their growth was examinedbyinvertedphasecontrastmicroscopeandscanningelectronmicroscope.results Theosteo blastswereatachedtotheoutsideandinsidesurfacesandgrewwel.hgf/dpbcouldstimulatethe alkalinephosphataseactivityoftheosteoblastsandimprovetheproliferationoftheosteoblasts.conclu sion HGF/DPB hasgoodbiocompatibilityandboneinduction.hgf couldimprovetheadherent efectofdpbonosteoblasts,anditcouldbeusedasscafoldmaterialforthebonetisueenginee ring. Keywords: hepatocytegrowthfactor; osteoblast; biocompatibility; bonetisueengi neering [JCentSouthUniv(MedSci),2008,33(4):0359 06] 收 稿 日 期 (Dateofreception) 2007 09 10 作 者 简 介 (Biography) 党 洪 胜 (1972 ), 男, 湖 北 十 堰 人, 副 教 授, 主 要 从 事 骨 关 节 损 伤 修 复 及 组 织 工 程 研 究 通 讯 作 者 (Correspondingauthor) 党 洪 胜,E mail:danghsh@tom.com
360 中 南 大 学 学 报 ( 医 学 版 ),2008,33(4) 细 胞 支 架 的 研 究 是 近 年 来 在 骨 组 织 工 程 学 研 究 领 域 中 的 一 个 重 要 课 题 促 进 种 子 细 胞 在 支 架 上 黏 附 增 殖 及 分 化, 并 保 持 其 功 能, 是 骨 组 织 工 程 技 术 中 的 关 键 环 节 [1 2] 应 用 生 物 活 性 分 子 进 行 支 架 材 料 表 面 修 饰 不 但 可 促 进 细 胞 的 黏 附, 而 且 可 明 显 促 进 细 胞 增 殖, 目 前 已 成 为 研 究 热 点 [3 4] 本 实 验 通 过 复 合 有 肝 细 胞 生 长 因 子 (HGF) 的 异 种 脱 蛋 白 松 质 骨 (DPB) 和 单 纯 异 种 脱 蛋 白 松 质 骨 与 成 骨 细 胞 的 共 同 培 养, 研 究 和 探 讨 复 合 有 生 长 因 子 的 仿 生 骨 材 料 的 生 物 特 性, 为 骨 组 织 工 程 材 料 学 的 研 究 提 供 实 验 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 成 骨 细 胞 的 培 养 无 菌 操 作 下 取 产 前 1 周 新 西 兰 孕 兔 ( 郧 阳 医 学 院 实 验 动 物 中 心 ),3% 戊 巴 比 妥 钠 麻 醉 后 取 出 胎 兔, 处 死 后 取 其 颅 骨 顶 部 组 织, 去 尽 骨 膜 及 其 他 软 组 织, 洗 涤 剪 碎 后, 采 用 二 步 酶 消 化 法 + 差 速 贴 壁 法 (0.1% 的 胶 原 酶 消 化 30min 和 0.25% 胰 酶 消 化 20min) 分 离 纯 化 成 骨 细 胞, 置 于 37,5% CO 2,pH7.2 的 培 养 箱 中 培 养 每 日 倒 置 相 差 显 微 镜 下 观 察 细 胞 生 长 情 况, 每 2~3 天 全 量 更 换 培 养 液 1 次 当 原 代 培 养 的 细 胞 长 满 后, 按 1 2 比 例 传 代 培 养 1.2 成 骨 细 胞 的 鉴 定 在 倒 置 相 差 显 微 镜 下 直 接 观 察 原 代 培 养 细 胞 传 代 培 养 细 胞 的 生 长 情 况 及 形 态 特 点 通 过 细 胞 学 观 察 (Ⅰ 型 胶 原 免 疫 细 胞 化 学 染 色 ) 和 四 唑 盐 法 染 色 进 行 碱 性 磷 酸 酶 染 色 及 茜 素 红 钙 结 节 染 色 等 方 法 对 培 养 的 细 胞 进 行 观 察 鉴 定 1.3 异 种 脱 蛋 白 骨 支 架 材 料 的 制 作 和 检 测 采 用 过 氧 化 氢 乙 醚 法 制 作 支 架 材 料 脱 蛋 白 骨 用 新 鲜 成 年 杂 交 犬 胫 骨 上 端 股 骨 下 端 松 质 骨, 剔 除 骨 表 面 软 组 织 并 将 其 切 割 成 3mm 4mm 10mm 的 骨 条, 用 生 理 盐 水 洗 净, 置 超 声 振 荡 仪 中 清 洗 将 骨 条 浸 泡 在 盛 有 20% 过 氧 化 氢 的 可 密 闭 玻 璃 容 器 中 进 行 脱 蛋 白 处 理 后, 用 生 理 盐 水 洗 涤 数 遍, 晾 干 后 置 入 加 有 250mL 乙 醚 的 Soxleht 容 器 中 循 环 脱 脂 处 理, 制 得 的 DPB, 对 DPB 进 行 超 声 振 荡 清 洗 后, 烘 干 材 料 中 液 体, 将 其 置 于 超 低 温 冰 箱 内 -50 预 冻 过 夜 之 后, 再 置 冻 干 机 内 除 去 残 余 水 分 装 在 塑 料 袋 中 用 环 氧 乙 烷 密 闭 消 毒 24h, 置 -20 冰 箱 备 用 1.4 DPB 形 态 结 构 的 观 察 通 过 光 镜 倒 置 相 差 显 微 镜 及 扫 描 电 镜 (AMRAR21000B 型 ) 对 DPB 进 行 观 察, 观 察 其 表 面 形 态 结 构, 材 料 外 表 面 孔 隙 内 表 面 结 构, 孔 径 大 小 孔 隙 率 和 孔 间 交 通 情 况, 并 用 LabwrksTM 图 像 分 析 系 统 对 其 孔 径 大 小 和 孔 隙 率 进 行 测 定 1.5 X 射 线 衍 射 分 析 采 用 D/MAX 1200 型 X 射 线 衍 射 分 析 仪 测 试 DPB 无 机 成 分 的 组 成 和 晶 体 结 构 1.6 HGF/DPB 的 制 备 取 1 支 HGF50μg/ 支 ( 美 国 R&D 公 司 ) 溶 于 2.5mL 无 菌 蒸 馏 水 中 并 摇 匀, 加 入 DPB,MM 1 型 微 型 振 荡 器 振 荡, 置 于 1mL 离 心 管 中, 真 空 抽 负 压,ChristALPHA1 4 型 冻 干 机 冻 干, 置 于 双 层 聚 乙 烯 薄 膜 内, 环 氧 乙 烷 熏 蒸 消 毒,4 冰 箱 保 存 备 用 1.7 细 胞 与 支 架 的 体 外 复 合 培 养 及 生 长 情 况 观 察 取 2 块 一 次 性 无 菌 96 孔 板, 选 用 生 长 状 态 良 好 的 第 3 代 成 骨 细 胞 消 化 离 心, 用 含 完 全 培 养 液 配 制 成 浓 度 为 3 10 5 /ml 的 细 胞 悬 液, 每 孔 加 入 细 胞 悬 液 2mL 实 验 分 HGF/DPB 组 和 DPB 对 照 组 然 后 将 培 养 板 放 入 置 于 37,5% CO 2, ph 7.2 的 培 养 箱 中 培 养 2 d 换 液 1 次 (1) MTT 法 测 定 细 胞 增 殖 : 于 培 养 的 2,4,6,8dHGF/ DPB 组 DPB 对 照 组 分 别 取 3 块 支 架 材 料 采 用 MTT 法 测 定 细 胞 增 殖 向 培 养 板 孔 内 加 入 MTT 100μL 继 续 培 养 4h, 小 心 吸 出 上 清 液, 加 二 甲 基 亚 砜 1mL, 轻 轻 震 荡 10min, 待 结 晶 溶 解 后 吸 出 150μL 加 入 96 孔 板 内, 选 择 波 长 490nm 酶 标 仪 测 定 吸 光 OD 值 (2) 相 差 显 微 镜 观 察 : 细 胞 接 种 后, 每 日 在 倒 置 相 差 显 微 镜 下 观 察 HGF/DPB 组 DPB 材 料 边 缘 外 表 面 及 孔 内 表 面 成 骨 细 胞 与 材 料 的 贴 附 情 况 以 及 细 胞 的 外 形 数 量 等 (3) 扫 描 电 镜 观 察 : 分 别 于 培 养 第 3,15 天 将 生 物 材 料 取 出, 用 PBS 清 洗 后,2% 冷 戊 二 醛 固 定, 系 列 丙 酮 中 脱 水, 乙 酸 异 戊 二 酯 置 换, 临 界 点 干 燥, 表 面 喷 金, 扫 描 电 镜 观 察 成 骨 细 胞 在 HGF/DPB, DPB 材 料 上 的 生 长 情 况 (4) 检 测 碱 性 磷 酸 酶 活 性 : 两 组 接 种 细 胞 后 第 2,4,6 及 8 天 终 止 培 养, 吸 出 培 养 液, 用 缓 冲 液 冲 洗 2 次, 每 孔 加 入 0.5mL 的 0.1% Triton 100,4 过 夜 用 吸 管 反 复 吹 打, 制 成 细 胞 裂 解 液, 采 用 考 马 斯 蓝 微 板 法 测 定 细 胞 总 蛋 白 含 量 用 碱 性 磷 酸 酶 试 剂 盒 测 定 各 组 成 骨 细 胞 碱 性 磷 酸 酶 活 性, 分 析 材 料 对 成 骨 细 胞 碱 性 磷 酸 酶 活 性 的 影 响 碱 性 磷 酸 酶 活 性 以 每 毫 克 细 胞 蛋 白 中 所 含 的 碱 性 磷 酸 酶 活 性 单 位 计 算
胎 兔 成 骨 细 胞 与 复 合 肝 细 胞 生 长 因 子 / 异 种 脱 蛋 白 松 质 骨 的 体 外 培 养 党 洪 胜, 等 361 1.8 统 计 学 处 理 采 用 统 计 软 件 SPSS11.5 进 行 分 析, 实 验 数 据 以 (x±s) 表 示, 各 实 验 组 与 对 照 组 的 检 测 结 果 比 较 采 用 方 差 分 析, 以 P<0.05 为 差 异 有 统 计 学 意 义 2 结 果 2.1 成 骨 细 胞 镜 下 观 察 接 种 后 12h 部 分 成 骨 细 胞 开 始 贴 壁, 逐 渐 伸 出 伪 足 呈 多 种 形 态 细 胞, 培 养 至 7d 左 右 细 胞 相 互 交 织 并 通 过 突 起 呈 聚 集 生 长 10d 左 右 细 胞 聚 集 成 团 生 长 明 显, 细 胞 突 起 相 互 网 络 呈 拱 形 连 接 ( 图 1A) 经 Ⅰ 型 胶 原 免 疫 细 胞 化 学 染 色 阳 性 的 成 骨 细 胞 胞 浆 内 分 布 着 棕 黄 色 颗 粒 ( 图 1B); 四 唑 盐 法 染 色 成 骨 细 胞 表 现 为 胞 浆 及 细 胞 膜 中 有 深 蓝 色 或 蓝 色 细 小 颗 粒 沉 淀, 细 胞 核 红 色 ( 图 1C) 茜 素 红 染 色 可 见 诱 导 后 有 部 分 细 胞 聚 集 一 起 呈 集 落 状 生 长, 形 成 橘 红 色 的 钙 化 结 节 ( 图 1D) 图 1 成 骨 细 胞 A: 贴 壁 10d( 40);B:Ⅰ 型 胶 原 染 色 ( 40);C: 碱 性 磷 酸 酶 ( 40);D: 茜 素 红 染 色 出 现 钙 化 灶 ( 40) Fig.1Osteoblasts.A:10dgrowthofosteoblastsinvitro( 40);B:ImmunohistochemistrydyeingofcolagenⅠ inosteoblasts ( 40);C:ALPstainingofosteoblasts( 40);D:Alizarinredstainingshowingacalciumnodule( 40). 2.2 脱 蛋 白 骨 DPB 外 观 呈 灰 白 色,3mm 4mm 10mm 长 条 状, 无 异 味, 表 面 可 见 不 规 则 多 孔 结 构, 镜 下 可 见 材 料 呈 三 维 立 体 多 孔 网 状 结 构, 含 大 量 孔 隙, 孔 隙 间 有 广 泛 的 交 通 DPB 孔 径 为 200~500μm, 孔 隙 率 49.63% ±3.20%( 图 2) 2.3 X 射 线 衍 射 分 析 DPB 特 征 峰 与 羟 基 磷 灰 石 的 衍 射 数 据 能 较 好 符 合, 材 料 中 主 要 的 晶 相 成 分 是 羟 基 磷 灰 石, 无 机 物 存 在 形 式 未 改 变 2.4 倒 置 相 差 显 微 镜 下 观 察 成 骨 细 胞 与 HGF/DPB,DPB 材 料 体 外 复 合 培 养 第 1 天 可 见 培 养 板 上 的 材 料 边 缘 仅 有 少 量 细 胞 贴 附, 培 养 板 底 部 有 散 在 单 个 或 多 个 细 胞 群, 细 胞 呈 梭 形 扁 圆 形 及 多 角 形 外 观, 随 着 培 养 时 间 的 延 长, 附 着 的 细 胞 增 多, 材 料 外 表 面 及 孔 内 表 面 成 骨 细 胞 数 量 有 明 显 增 加, 分 布 欠 均, 细 胞 开 始 分 化 增 殖, 细 胞 形 态 多 为 梭 形 及 三 角 形, 以 HGF/DPB 材 料 上 附 着 较 多 ( 图 3,4) 2.5 扫 描 电 镜 观 察 成 骨 细 胞 与 材 料 复 合 培 养 3d 时,2 组 材 料 表 面 细 胞 为 单 层 结 构, 形 态 多 样, 有 数 个 突 起, 附 着 于 材 料 表 面 并 深 入 孔 隙 内, 形 成 一 种 锚 状 结 构, 与 材 料 牢 固 结 合, 并 在 材 料 表 面 伸 展 随 着 时 间 延 长, 细 胞 数 量 明 显 增 多, 以 HGF/DPB 为 甚, 并 有 钙 盐 结 晶 沉 积, 最 终 形 成 骨 结 节 细 胞 被 包 埋 在 基 质 中 ( 图 5~7)
３６２ 中南大学学报 医学版 ２ ８ ３ ３ ４ ２ ６ 细 胞 增 殖 测 定 经 ＭＴＴ法 检 测 ＨＧＦ 学 意 义 Ｐ ５ 表 １ ＤＰＢ组 细 胞 增 殖 能 力 较 ＤＰＢ组 对 照 组 组 明 显 增 ２ ７ 碱 性 磷 酸 酶 活 性 测 定 ＨＧＦ ＤＰＢ组 的 强 在 第 ２天 到 第 ８天 增 殖 比 较 差 异 具 有 统 计 ＡＬＰ活 性 明 显 高 于 ＤＰＢ组 表 ２ 图 ２ 扫描电镜下 ＤＰＢ多孔结构 Ａ ２ 倍 Ｂ １ 倍 Ｆｉ ２Ａｐｐ ｎ ｆｄｐｂｂｙ ｎｎｉ ｎｇ ｌ ｎｍｉ ｐ Ａ Ｓ ＥＭ ２ Ｂ Ｓ ＥＭ １ 图 ３ 倒置相差显微镜下 ＤＰＢ与细胞复合 ２ 图 ４ 倒置相差显微镜下 ＨＧＦ ＤＰＢ与细胞复合 ２ Ｆｉ ３Ｏ ｎｄｄｐｂｈ ｂ ｎ ｕ ｄ ｕ ｄ Ｉ ｎ Ｆｉ ４Ｏ ｎｄｈｇｆ ＤＰＢｈ ｂ ｎ Ｉ ｎ ｄｍｉ ｄｍｉ ｐ ２ 图 ５ 成骨细胞与 ＤＰＢ复合培养第 ３天 扫描电镜 １ ｐ ２ 图 ６ 成骨细胞与 ＨＧＦ ＤＰＢ复合培养 第 ３天 扫描电镜 ５ Ｆｉ ５Ｏ ｎｄｄｐｂ ｈ ｂ ｎ Ｆｉ ６Ｏ ｎｄｈｇｆ ＤＰＢ ｈ 图 ７ 成骨细胞与 ＨＧＦ ＤＰＢ复合培养 第１ ５天 细胞逐渐被包埋在基质 中 扫描电镜 ６ ｕ ｄ ｕ ｄ ｆ ３ ｄ ｙ ７Ａｆ ｕ ｄｆ １ ５ｄ ｙ ｂ ｎ ｕ ｄｆ ３ｄ ｙ ＳＥＭ Ｆｉ ＳＥＭ １ ５ ｉ ｍｂ ｄｄｉ ｎｇ ｉ ｎ ｘ ｌ ｌ ｍ ｉ ｘ ＳＥＭ ６
胎 兔 成 骨 细 胞 与 复 合 肝 细 胞 生 长 因 子 / 异 种 脱 蛋 白 松 质 骨 的 体 外 培 养 党 洪 胜, 等 363 表 1 MTT 法 检 测 HGF/DPB 对 成 骨 细 胞 增 殖 的 影 响 (n=3,x±s) Tab.1 EfectofHGF/DPBonproliferationoftheosteoblastsbyMTT(n=3,x±s) 组 别 成 骨 细 胞 生 长 增 殖 OD 值 2d 4d 6d 8d DPB 组 0.46±0.01 0.59±0.05 0.66±0.04 0.59±0.07 HGF/DPB 组 0.64±0.02 0.74±0.02 0.80±0.10 0.72±0.08 与 DPB 组 比 较, P<0.01 表 2 不 同 时 间 各 组 碱 性 磷 酸 酶 活 性 测 定 (n=3,x±s) Tab.2 ActivitiesofALPindeferenttimeof2groups(n=3,x±s) 组 别 ALP 活 性 (U/mg 蛋 白 ) 检 测 结 果 2d 4d 6d 8d DPB 组 11.57±0.68 12.87±0.24 13.44±0.46 13.89±0.66 HGF/DPB 组 12.79±0.32 14.84±0.89 15.70±0.60 16.67±0.71 与 DPB 组 比 较, P<0.05, P<0.01 3 讨 论 组 织 工 程 的 三 要 素 是 种 子 细 胞 支 架 材 料 和 生 长 调 节 因 子, 其 中 支 架 材 料 起 中 心 作 用, 种 子 细 胞 复 合 支 架 材 料 的 体 外 培 养 是 实 现 生 物 组 织 工 程 的 必 要 条 件 目 前 对 构 建 组 织 工 程 骨 的 支 架 材 料 以 及 种 子 细 胞 在 多 种 支 架 材 料 上 的 培 养 已 有 较 多 报 道 种 子 细 胞 的 体 外 分 离 培 养 技 术 已 成 熟, 但 各 种 细 胞 与 支 架 材 料 单 独 使 用 时 的 成 骨 能 力 是 有 限 的, 目 前 的 研 究 越 来 越 倾 向 于 应 用 生 物 活 性 分 子 进 行 支 架 材 料 表 面 修 饰, 多 种 生 物 活 性 分 子, 如 肽 生 长 因 子 等 已 经 被 应 用 到 支 架 材 料 表 面 修 饰 当 中 当 前 骨 组 织 工 程 研 究 中 所 用 的 支 架 材 料 有 2 类 :(1) 生 物 衍 生 材 料, 如 冻 干 脱 钙 骨 脱 蛋 白 骨 和 胶 原 等 ;(2) 人 工 合 成 材 料, 如 聚 乳 酸 聚 乙 醇 酸 等 人 工 合 成 材 料 往 往 存 在 力 学 强 度 差 降 解 物 引 起 较 明 显 炎 症 或 降 解 速 度 慢 等 缺 陷 而 天 然 材 料 如 生 物 衍 生 骨 在 经 过 理 化 方 法 处 理 后, 去 除 了 具 有 阻 滞 作 用 的 脂 质 和 杂 质 蛋 白, 降 低 了 材 料 的 抗 原 性, 能 很 好 地 保 持 原 骨 组 织 的 形 态 结 构, 其 理 化 特 性 可 很 好 满 足 构 建 组 织 工 程 骨 的 要 求 而 得 到 高 度 重 视 [5 6] 本 实 验 中 采 用 松 质 骨 作 原 料 通 过 过 氧 化 氢 乙 醚 法 制 备 出 DPB 支 架 材 料, 镜 下 可 见 材 料 呈 三 维 立 体 多 孔 网 状 结 构, 含 大 量 孔 隙, 孔 隙 间 有 广 泛 的 交 通 X 射 线 衍 射 分 析 DPB 特 征 峰 与 羟 基 磷 灰 石 的 衍 射 数 据 能 较 好 符 合, 材 料 中 主 要 的 晶 相 成 分 是 羟 基 磷 灰 石, 无 机 物 存 在 形 式 未 改 变 这 种 类 似 于 骨 小 梁 结 构 的 载 体 有 利 于 种 子 细 胞 的 黏 附 和 生 长, 并 为 细 胞 外 基 质 的 分 泌 提 供 了 宽 大 的 表 面 积 和 内 部 空 间, 具 有 良 好 的 组 织 亲 和 性 和 结 合 力 对 支 架 材 料 表 面 进 行 修 饰 可 明 显 提 高 细 胞 的 [7] 黏 附 作 用,Yang 等 将 骨 细 胞 刺 激 因 子 1/ 多 营 养 蛋 白 PTN 复 合 在 拟 生 态 支 架 上 与 BMCs 联 合 培 养, 结 果 表 明 骨 修 复 时 细 胞 基 质 的 相 互 作 用 中 [8] PTN 可 促 进 新 骨 的 形 成 Zambonin 等 将 HGF 复 合 到 羟 基 磷 灰 石 上 与 成 骨 细 胞 体 外 联 合 培 养, 结 果 显 示 HGF 能 显 著 促 进 成 骨 细 胞 增 殖 和 增 加 胶 原 的 合 成, 从 而 为 将 来 在 人 工 假 体 表 面 进 行 复 合 HGF 的 羟 基 磷 灰 石 涂 层 提 供 依 据 在 实 验 中, 笔 者 采 用 HGF 对 DPB 支 架 材 料 进 行 修 饰,HGF 是 一 种 多 功 能 因 子, 对 多 种 组 织 器 官 发 挥 作 用 HGF 在 体 内 外 均 可 调 节 成 骨 细 胞 的 增 殖 和 分 化, 调 节 骨 的 新 生 和 吸 收 [9 10] HGF 能 诱 导 血 管 生 成, 其 刺 激 新 生 血 管 生 成 活 性 比 VEGF 及 碱 性 成 纤 维 细 胞 生 长 因 子 更 为 强 大 [11 12], 是 目 前 发 现 的 最 强 效 的 促 血 管 生 成 因 子 HGF 能 诱 导 上 皮 细 胞 及 内 皮 细 胞 产 生 极 性 并 刺 激 产 生 三 维 管 状 结 构 的 形 成 HGF 这 种 促 进 形 成 新 生 管 状 结 构 的 功 能 也 对 骨 Haversian 系 统 的 产 生 具 有 重 要 意 义 [13] 通 过 从 胎 兔 颅 骨 分 离 培 养 的 成 骨 细 胞 与 HGF/DPB 及 DPB 材 料 在 体 外 复 合 培 养, 发 现 成 骨 细 胞 在 HGF/DPB 表 面 附 着 良 好, 随 着 换 液 和 培 养 时 间 的 延 长, 成 骨 细 胞 在 其 上 伸 展 繁 殖, 分 泌 胶 原 纤 维 与 钙 盐 结 晶 等 细 胞 外 基 质, 同 时 可 以 附 着 于 材 料 的 孔 隙 周 边 或 深 入 材 料 孔 隙 内 生 长,
364 中 南 大 学 学 报 ( 医 学 版 ),2008,33(4) 最 终 细 胞 被 包 埋 在 基 质 中 细 胞 增 殖 测 定 和 ALP 活 性 测 定 显 示,HGF/DPB 组 的 ALP 活 性 明 显 高 于 DPB 组 说 明 材 料 所 复 合 的 HGF 可 明 显 增 强 细 胞 内 ALP 活 性, 增 加 骨 钙 素 的 合 成 量, 同 时 HGF/DPB 组 较 DPB 组 能 明 显 促 进 细 胞 的 增 殖, 表 明 HGF/DPB 兼 备 细 胞 支 架 和 细 胞 诱 导 作 用 基 于 此 可 为 以 后 研 究 血 管 化 人 工 骨 提 供 基 础 本 实 验 采 用 HGF 修 饰 DPB 支 架 材 料 与 成 骨 细 胞 在 体 外 进 行 复 合 培 养, 经 观 察 检 测 证 实, HGF/DPB 能 促 进 成 骨 细 胞 在 支 架 材 料 增 殖 和 增 强 成 骨 能 力, 从 而 为 进 一 步 观 察 成 骨 细 胞 与 内 皮 细 胞 联 合 在 支 架 材 料 上 培 养 的 再 血 管 化 和 成 骨 活 性 提 供 了 实 验 资 料 参 考 文 献 : [1] HasenbeinM E,AndersenT T,BiziosR.Micropaterned surfacesmodifiedwithselectpeptidespromoteexclusiveinter actions with osteoblasts[j]. Biomaterials, 2002, 23 (19):3937 3942. [2] GarcíaA J,ReyesC D.Bio adhesivesurfacestopromote osteoblastdiferentiation and bone formation[j]. J Dent Res,2005,84(5):407 413. [3] ZhangL,Hum M,WangM,etal.Evaluationofmodifying colagenmatrixwithrgd peptidethroughperiodateoxidation [J].JBiomedMaterRes,2005,73(4):468 475. [4] ShinH,TemenofJS,BowdenG C,etal.Osteogenicdif ferentiationofratbonemarow stromalcelsculturedonarg Gly Aspmodifiedhydrogelswithoutdexamethasoneandbeta glycerolphosphate[j]. Biomaterials, 2005,26(17): 3645 3654. [5] MendesSC,TibbeJM,VeenhofM,etal.Bonetisue engineeredimplantsusinghumanbonemarow stromalcels: efectofcultureconditionsanddonorage[j].tisueeng, 2002,8(6):911 920. [6] OrbanJM,MaraK G,HolingerJO.Compositionoptions fortisue engineered bone[j]. Tisue Eng, 2002,8 (4):529 539. [7] YangX,TareR S,PartridgeK A,etal.Inductionofhu manosteoprogenitorchemotaxis,proliferation,diferentiation, and bone formation by osteoblast stimulating factor 1/ pleiotrophin: osteoconductive biomimetic scafoldsfortisue engineering[j].jboneminerres,2003,18(1):47 57. [8] ZamboninG,CamerinoC,GrecoG,etal.Hydroxyapatite coatedwithheaptocytegrowthfactor(hgf) stimulateshu manosteoblastsinvitro[j].jbonejointsurgbr,2000, 82(3):457 460. [9] ParikhSN.Genetherapy:principlesandclinicalapplica tionsinorthopedics[j]. Orthopedics, 2004, 27(3): 294 303. [10] Bostrom M P, Saleh K J, Einhorn T A. Osteoinductive growthfactorsin preclinicalfractureand long bone defects models[j]. Orthop Clin North Am, 1999, 30(4): 647 658. [11] TaniyamaY,MorishitaR,AokiM,etal.Therapeutican giogenesisinducedbyhumanhepatocytegrowthfactorgenein ratandrabbithindlimbischemiamodels:preclinicalstudyfor treatmentofperipheralarterialdisease[j].genetherapy, 2001,8(3):181 189. [12] MorishitaR,SakakiM,YamamotoK,etal.Impairmentof colateralformationinlipoprotein(a)transgenicmice:thera peuticangiogenesisinducedbyhumanhepatocytegrowthfactor gene[j].circulation,2002,105(12):1491 1496. [13] BusolinoF,DiRenzoM F,ZicheM,etal.Hepatocyte growthfactorisapotentangiogenicfactorwhich stimulates endothelialcelmotility and growth[j]. J CelBiol, 1992,119(3):629 641. ( 本 文 编 辑 彭 敏 宁 )