案 例 报 告 乙 酰 苯 肼 溶 血 性 贫 血 小 鼠 证 候 属 性 演 变, 及 不 同 治 疗 方 药 疗 效 比 较 一 归 纳 问 题 在 仔 细 阅 读 三 份 案 例 之 后, 我 将 三 份 案 例 的 材 料 与 方 法, 结 果 和 分 析, 讨 论 及 思 考 四 部 分 进 行 横 向 比 较, 最 后 发 现 了 一 些 问 题 1 材 料 与 方 法 1.1 实 验 动 物 分 组 与 处 理 (1) 实 验 动 物 的 随 机 分 配 方 法 不 当 可 能 造 成 误 差 三 份 案 例 均 将 超 过 四 十 只 的 体 重 超 过 18g, 个 体 区 别 不 超 过 4g 的 雄 性 小 鼠 ( 案 例 一 二 使 用 ICR 小 鼠, 案 例 三 使 用 昆 明 鼠, 两 种 均 为 封 闭 群 小 鼠 ) 进 行 试 验, 并 随 机 分 成 四 组 结 合 案 例 一 中 关 于 小 鼠 初 始 体 重 不 均 一 造 成 的 后 续 试 验 结 果 的 误 差 可 以 将 小 鼠 称 量 后 由 计 算 机 统 计 软 件 进 行 随 机 分 组, 减 小 组 间 区 别 (2) 正 常 组 应 进 行 等 给 药 量 水 灌 胃 可 能 对 结 果 造 成 误 差 案 例 一 中 并 未 给 正 常 组 小 鼠 进 行 灌 胃, 案 例 二 三 中 则 给 与 自 来 水 0.5ml/ 只 灌 胃 根 据 一 只 成 鼠 其 食 量 4 8 克 / 天 ; 饮 水 量 4 7 毫 升 / 天 小 鼠 胃 容 量 [1] 小 (1 1.5 毫 升 ), 功 能 差 可 知 0.5ml 的 自 来 水 灌 胃 是 相 当 必 要 的, 约 占 小 鼠 进 水 量 1/8 以 下 小 鼠 饲 养 使 用 自 来 水 作 为 饮 用 水, 若 使 用 蒸 馏 水 则 可 能 造 成 电 解 质 平 衡 异 常 灌 胃 会 造 成 小 鼠 精 神 紧 张 与 胃 部 充 盈, 也 有 可 能 会 因 为 操 作 不 当 造 成 消 化 道 损 伤 等 因 素 造 成 小 鼠 的 进 食 习 惯 改 变, 导 致 体 型 爪 色 等 改 变 最 终 影 响 实 验 结 果 将 正 常 组 小 鼠 进 行 同 样 频 率, 剂 量 的 灌 胃 可 以 修 正 误 差 1.1 处 方 制 备 与 用 量 (1) 乙 酰 苯 肼 的 制 备 案 例 二 中 2%(20mg/ml) 乙 酰 苯 肼 溶 液 的 制 备 产 生 了 错 误, 导 致 实 验 产 生 了 不 可 预 计 的 误 差 实 验 前 应 事 先 计 算 药 剂 需 要 量 并 记 录, 称 量 后 进 行 核 对, 规 避 以 上 失 误 (2) 方 剂 的 制 备 三 则 案 例 中 四 物 汤 的 配 比 不 一 三 则 案 例 中 均 将 生 药 常 规 水 煎 后 浓 缩, 案 例 一 中 饮 片 未 进 行 浸 泡 临 床 应 用 中 常 将 饮 片 水 浸 大 于 30min 后 水 煎, 有 利 于 药 物 的 萃 取, 因 此 实 验 用 药 剂 应 贴 合 临 床 实 际, 先 浸 后 煎 此 外, 每 日 每 次 用 药 前 可 将 药 液 加 热 至 常 温 并 充 分 混 匀, 使 药 物 均 一 2 结 果 与 分 析 2.1 各 组 小 鼠 存 活 情 况 案 例 一 中 共 46 只 小 鼠, 死 亡 3 只 小 鼠 ; 案 例 二 中 共 49 只 小 鼠, 死 亡 13 只 小 鼠 ; 案 例 三 中 共 40 只 小 鼠, 无 死 亡 根 据 案 例 情 况 进 行 分 析, 案 例 二 中 由 于 第 一 次 乙 酰 苯 肼 溶 液 进 行 溶 血 性 贫 血 造 模 时 用 量 失 误, 第 二 次 用 药 量 增 大 等 原 因 造 成 小 鼠 死 亡 率 达 26.53%, 对 实 验 的 科 学 性 产 生 巨 大 影 响 应 严 格 按 照 实 验 设 计 操 作 配 置 药 品, 防 止 此 类 失 误 采 用 预 实 验 的 方 法 规 避 失 误 2.2 证 候 表 现 三 组 案 例 均 使 用 了 相 同 的 小 鼠 诊 法 与 辨 证 方 法 (1) 小 鼠 整 笼 外 观 案 例 一 二 对 小 鼠 整 笼 外 观 进 行 摄 影, 案 例 三 进 行 文 字 描 述 由 于 案 例 中 未 第 1 页 ( 共 5 页 )
对 摄 影 提 供 设 备 型 号, 设 置 参 数 等 信 息, 使 摄 影 照 片 作 为 实 验 结 果 造 成 重 复 性 上 的 误 差, 提 供 的 信 息 不 够 全 面 客 观 文 字 描 述 使 结 果 更 易 读, 但 是 无 法 避 免 个 人 主 观 判 断 造 成 的 误 差 可 考 虑 在 今 后 的 实 验 中 将 标 注 清 晰 的 照 片 配 合 文 字 描 述 (2) 爪 尾 外 观 案 例 一 三 对 小 鼠 爪 尾 进 行 摄 影 及 文 字 描 述, 案 例 二 进 行 了 四 诊 指 标 观 察, 并 进 行 列 表, 无 照 片 可 考 虑 将 二 者 结 合 2.3 证 候 及 其 演 变 三 组 案 例 均 使 用 了 相 同 的 病 理 材 料 骨 髓 涂 片 及 血 涂 片 的 制 备 血 红 蛋 白 及 血 清 总 抗 氧 化 能 力 的 测 定 肾 脏 总 RNA 的 提 前 及 RTPCR 的 有 关 材 料 与 方 法 气 盛 衰 度 三 组 案 例 均 进 行 旷 场 试 验, 案 例 三 增 加 了 5d 的 旷 场 试 验 ; 案 例 二 三 增 加 了 抓 力 测 试 1d 与 8d 的 测 试 结 果 在 数 据 方 面 有 巨 大 差 异, 而 5d 的 测 试 结 果 则 增 添 了 更 多 数 据,1d-5d 与 5d-8d 的 上 升 斜 率 的 不 同 具 体 提 示 了 小 鼠 产 生 的 变 化 根 据 案 例 内 容, 旷 场 试 验 的 旷 场 设 置, 小 鼠 的 个 数, 小 鼠 的 抓 取 等 会 对 实 验 结 果 造 成 误 差 血 盛 衰 度 三 组 案 例 均 进 行 爪 r 尾 r 值 的 测 定 可 考 虑 在 1d 尾 尖 取 血 测 试 血 红 蛋 白, 与 后 续 试 验 内 容 提 供 佐 证 阴 盛 衰 度 三 组 案 例 均 进 行 小 鼠 体 重 测 试 应 与 阳 盛 衰 度 结 合 进 行 综 合 分 析 阳 盛 衰 度 三 组 案 例 均 进 行 小 鼠 腋 温 测 试 应 与 阴 盛 衰 度 结 合 进 行 综 合 分 析 2.4 同 病 异 证 并 不 能 有 效 地 说 明 情 况, 此 外 案 例 三 缺 乏 该 项 血 象 与 骨 髓 象 涂 片 涂 片 的 质 量 直 接 关 系 观 测 结 果 可 采 取 同 一 人 员 操 作, 增 加 样 本 涂 片 进 行 筛 选 来 提 高 效 率 2.5 肝 脾 外 观 可 在 盛 放 肝 脾 标 本 的 玻 璃 培 养 皿 下 垫 方 比 例 尺 及 比 色 尺 2.6 肝 脏 脾 脏 小 肠 病 理 (HE 染 色 ) 染 色 的 深 浅, 样 本 的 位 置, 切 片 的 薄 厚 影 响 观 测 结 果 可 采 取 同 一 人 员 操 作, 增 加 样 本 染 色 进 行 筛 选 来 提 高 效 率 3 问 题 总 结 (1) 实 验 设 计 上 应 尽 量 保 证 客 观, 实 验 操 作 上 应 避 免 误 差 (2) 案 例 一 否 认 四 物 汤 对 乙 酰 苯 肼 溶 血 性 贫 血 小 鼠 有 治 疗 作 用, 而 案 例 二 三 则 支 持 其 有 效 案 例 一 中 使 用 方 剂 饮 片 总 量 小 于 案 例 三, 故 其 对 乙 酰 苯 肼 溶 血 性 贫 血 小 鼠 的 治 疗 效 用 与 用 药 饮 片 的 总 量 浓 煎 有 无 关 系 不 明 确 二 研 究 背 景 四 物 汤 为 补 血 和 血 调 经 化 瘀 之 良 方 其 中 当 归 可 行 血 补 血, 川 芎 行 血, 白 芍 熟 地 滋 阴 养 血,4 种 药 物 配 合 应 用 补 而 不 滞, 平 调 阴 阳 四 物 汤 组 方 配 比 有 参 考 太 平 惠 民 和 剂 局 方, 并 参 照 卫 生 部 药 品 标 准 中 药 成 方 制 剂 中 四 物 合 剂 的 配 方 等 数 种, 不 同 比 例 对 四 物 汤 的 疗 效 产 生 了 不 同 偏 重 有 关 四 物 汤 补 血 作 用 配 伍 机 理 的 研 究 报 道 较 少, 而 且 也 不 够 全 面, 与 中 医 理 论 有 一 定 的 差 距 近 年 来, 许 多 专 家 应 用 乙 酰 苯 肼 联 合 环 磷 酰 胺 等 对 小 鼠 进 行 血 虚 造 模, 对 第 2 页 ( 共 5 页 )
四 物 汤 做 了 大 量 的 实 验 研 究 现 代 研 究 已 从 外 周 血 骨 髓 等 多 方 面 对 四 物 汤 补 血 功 能 进 行 了 探 讨, 显 示 四 物 汤 通 过 多 成 分 多 环 节 改 善 血 虚 患 者 的 造 血 功 能 ; 调 节 血 清 和 骨 髓 蛋 白 质 的 表 达 等 1 论 据 与 论 证 1.1 四 物 汤 对 乙 酰 苯 肼 溶 血 性 贫 血 小 鼠 确 有 疗 效 李 媛 等 分 别 观 察 了 四 物 汤 传 统 饮 片 汤 剂 与 配 方 颗 粒 汤 剂 对 急 性 大 量 失 血 引 起 的 失 血 性 模 型 及 联 合 注 射 乙 酰 苯 肼 和 环 磷 酰 胺 起 的 化 学 损 伤 性 血 虚 证 小 鼠 模 型 灌 胃 处 理 后 外 周 血 细 胞 的 变 化, 发 现 四 物 汤 配 方 颗 粒 汤 剂 与 传 统 饮 片 汤 剂 不 同 剂 量 组 均 有 不 同 程 度 升 高 外 周 血 细 胞 的 作 用 聂 金 娜 等 采 用 乙 酰 苯 肼 和 环 磷 酰 胺 复 制 血 虚 小 鼠 模 型, 观 察 八 珍 汤 四 物 汤 四 君 子 汤 对 血 虚 小 鼠 外 周 血 象, 发 现 3 种 汤 剂 对 血 虚 小 鼠 的 外 周 血 象 均 有 改 善 作 用 通 过 以 上 研 究 发 现, 四 物 汤 等 中 医 传 统 治 疗 血 虚 的 方 剂 有 很 好 的 疗 效 [2] 谭 洪 玲 等 采 用 60Coγ2 射 线 照 射 环 磷 酰 胺 腹 腔 注 射 和 综 合 放 血 法 制 作 血 虚 证 动 物 模 型, 检 测 对 小 鼠 骨 髓 细 胞 周 期 的 影 响, 同 时 观 察 四 物 汤 给 药 后 对 其 影 响, 结 果 发 现, 四 物 汤 有 促 进 射 线 损 伤 致 血 虚 证 小 鼠 骨 髓 细 胞 G 0/1 期 进 入 S 期 的 作 用 [2] 1.2 治 疗 乙 酰 苯 肼 溶 血 性 贫 血 小 鼠 的 四 物 汤 配 伍 四 物 汤 是 传 统 医 学 补 血 调 血 的 代 表 方 剂, 由 当 归 熟 地 川 芎 白 芍 4 味 中 药 组 成 临 床 上 用 于 治 疗 各 种 血 虚 证 患 者 有 关 四 物 汤 补 血 作 用 配 伍 机 理 的 研 究 报 道 较 少, 而 且 也 不 够 全 面, 与 中 医 理 论 有 一 定 的 差 距 参 考 太 平 惠 民 和 剂 局 方, 并 参 照 卫 生 部 药 品 标 准 中 药 成 方 制 剂 中 四 物 合 剂 的 配 方, 本 实 验 四 物 汤 中 各 味 药 采 用 等 份 用 量 通 过 各 实 验 指 标 的 排 序 结 果, 结 合 聚 类 分 析, 我 们 得 到 的 结 论 是 : 对 此 血 虚 动 物 模 型 的 补 血 作 用 四 物 汤 全 方 最 好, 拆 方 所 得 的 各 种 配 伍 组 合 均 不 及 四 物 汤 全 方 [3] 1.3 浓 度 不 同 的 四 物 汤 对 乙 酰 苯 肼 溶 血 性 贫 血 小 鼠 的 不 同 疗 效 四 物 汤 的 临 床 用 量 各 家 记 载 有 所 不 同, 本 实 验 的 四 物 汤 中 剂 量 定 为 6.25g/kg, 相 当 于 小 鼠 的 临 床 等 效 量, 低 高 量 据 此 依 次 递 减 递 增 1 倍 在 实 验 的 结 果 中 可 以 看 出, 各 个 给 药 组 红 细 胞 白 细 胞 等 指 标 均 有 不 同 程 度 的 升 高, 但 四 物 汤 组 整 体 优 于 滋 阴 养 血 丸 组, 其 中 以 高 剂 量 组 最 优, 中 低 剂 量 组 依 次 递 减 [4] 1.4 四 物 汤 治 疗 乙 酰 苯 肼 溶 血 性 贫 血 大 鼠 兼 有 保 肝 作 用 现 代 研 究 已 从 外 周 血 骨 髓 等 多 方 面 对 四 物 汤 补 血 功 能 进 行 了 探 讨, 显 示 四 物 汤 通 过 多 成 分 多 环 节 改 善 血 虚 患 者 的 造 血 功 能 ; 调 节 血 清 和 骨 髓 蛋 白 质 的 表 达 等 实 验 观 察 到 四 物 汤 治 疗 后, 动 物 一 般 情 况 明 显 好 转, 外 周 血 红 细 胞 数 血 红 蛋 白 量 明 显 回 升, 网 织 红 细 胞 计 数 明 显 升 高, 骨 髓 造 血 加 快 为 四 物 汤 临 床 施 治 溶 血 性 贫 血 提 供 了 实 验 依 据 实 验 还 发 现, 该 药 对 肝 脾 肿 大 的 恢 复 作 用 较 明 显, 从 另 一 个 侧 面 反 映 出 四 物 汤 补 肝 血 护 肝 的 重 要 作 用 与 正 常 组 比 较, 贫 血 组 大 鼠 体 重 明 显 减 轻 ; 肝 脏 脾 脏 湿 重 明 显 升 高 正 常 大 鼠 肝 脏 外 观 柔 嫩, 颜 色 鲜 红 ; 贫 血 组 大 鼠 肝 脾 外 观 明 显 肿 大 颜 色 暗 黑 四 物 汤 治 疗 组 大 鼠 体 重 有 明 显 的 恢 复, 肝 脾 较 小, 色 泽 暗 红 [5] 2 结 论 与 假 说 2.1 结 论 四 物 汤 对 乙 酰 苯 肼 溶 血 性 贫 血 小 鼠 确 有 疗 效, 且 等 浓 度 条 件 下 胜 于 其 他 组 方 文 献 显 示 等 比 例 饮 片 全 方 四 物 汤 疗 效 胜 于 四 物 汤 组 方 药 对, 倍 浓 度 药 液 疗 效 胜 于 半 浓 度 药 液 四 物 汤 对 乙 酰 苯 肼 溶 血 性 贫 血 大 鼠 有 明 确 治 疗 效 果 兼 具 保 肝 功 第 3 页 ( 共 5 页 )
能, 小 鼠 是 否 有 同 样 的 效 果 不 得 而 知 2.2 假 说 等 比 例 配 比 的 四 物 汤 在 倍 浓 度, 等 浓 度, 半 浓 度 条 件 下 对 乙 酰 苯 肼 溶 血 性 贫 血 小 鼠 疗 效 依 次 减 弱, 切 均 具 有 保 肝 护 肝 功 能 三 实 验 设 计 1 材 料 1.1 实 验 动 物 ICR 小 鼠 46 只, 雄 性,1-1.5 月 龄, 体 重 23-26g, 常 规 饲 养 随 机 分 为 四 组 : 1.2 实 验 动 物 的 处 理 (1) 模 型 组 :10 只 小 鼠, 分 别 在 1d 皮 下 注 射 2% 乙 酰 苯 肼 溶 液 0.075ml/10g 与 4d 皮 下 注 射 2% 乙 酰 苯 肼 溶 液 0.05ml/10g, 共 两 次 1d-7d 每 日 一 次 灌 胃 自 来 水 0.5ml/ 只 (2) 倍 浓 度 组 :12 只 小 鼠, 造 模 同 模 型 组,1d-7d 每 日 一 次 灌 胃 倍 浓 度 四 (3) 原 浓 度 组 :12 只 小 鼠, 造 模 同 模 型 组,1d-7d 每 日 一 次 灌 胃 原 浓 度 四 (4) 半 浓 度 组 :12 只 小 鼠, 造 模 同 模 型 组,1d-7d 每 日 一 次 灌 胃 半 浓 度 四 自 造 模 之 日 起, 各 组 动 物 添 加 等 量 水 及 饲 料 : 水 500ml/ 只, 饲 料 200g/ 只 1.3 处 方 与 用 量 四 物 汤 : 由 当 归 地 黄 川 芎 白 芍 各 等 份 50g, 交 由 相 关 部 门 进 行 鉴 定 中 药 制 备 : 按 中 华 人 民 共 和 国 药 典 附 录 中 方 法 制 成 四 物 汤 水 煎 液, 浓 缩 至 每 毫 升 含 原 生 药 2g, 分 装 后 存 冰 箱 保 存 备 用 实 验 时 以 该 浓 度 为 倍 浓 度, 稀 释 一 倍 为 原 浓 度, 原 浓 度 稀 释 一 倍 为 半 浓 度 灌 胃 前 药 液 应 加 热 混 匀 2 方 法 2.1 分 别 于 造 模 前 对 所 有 小 鼠 经 行 尾 尖 采 血 分 别 于 造 模 1d 5d 8d 对 所 有 小 鼠 进 行 四 诊 和 辩 证, 共 三 次 第 八 天 四 诊 辩 证 后 处 死, 取 材, 指 标 鉴 定 2.2 小 鼠 诊 法 与 辩 证 方 法 见 有 关 专 著, 略 2.3 病 理 有 关 材 料 及 方 法 参 见 有 关 实 验 指 导 手 册, 略 2.4 骨 髓 涂 片 及 血 涂 片 制 作 的 有 关 材 料 和 方 法 参 见 有 关 实 验 指 导 手 册, 略 2.5 血 红 蛋 白 和 血 清 总 抗 氧 化 能 力 检 测 的 有 关 材 料 和 方 法 参 见 有 关 实 验 试 剂 盒 及 实 验 指 导 手 册, 略 2.6 肾 脏 总 RNA 的 提 取 和 RTPCR 的 有 关 材 料 和 方 法 参 见 有 关 实 验 指 导 手 册, 略 四 参 考 文 献 [1] 苗 明 三. 实 验 动 物 和 动 物 实 验 技 术 [M]. 实 验 动 物 和 动 物 实 验 技 术,1997,8(1): 90-94. [2] 朱 化 珍, 陈 德 兴. 中 药 及 其 复 方 对 血 虚 模 型 小 鼠 补 血 作 用 的 实 验 研 究 进 展. 世 界 科 学 技 术 ( 中 医 药 现 代 化 ) [J],2012,14(2):1485-1487. [3] 袁 久 荣, 卢 兖 伟, 容 蓉 等. 计 算 机 辅 助 分 析 四 物 汤 补 血 作 用 配 伍 机 理 的 研 究. 中 国 实 验 方 剂 学 杂 志 [J],2000,6(1):36-38. [4] 孙 峻. 滋 阴 养 血 丸 和 四 物 汤 对 血 虚 小 鼠 补 血 作 用 研 究. 长 春 中 医 学 院 学 第 4 页 ( 共 5 页 )
报,2005,21(4):38-39 [5] 龚 文 君, 沃 兴 德. 四 物 汤 对 乙 酰 苯 肼 致 溶 血 性 贫 血 模 型 大 鼠 的 治 疗 作 用. 浙 江 中 医 杂 志 [J],2009,44(9):640-641 第 5 页 ( 共 5 页 )