2) 用 70% 的 酒 精 对 采 血 管 顶 端 和 管 盖 进 行 清 理 消 毒 后, 取 出 上 层 血 浆 ( 约 3ml), 分 至 5-6 个 标 记 好 的 冻 存 管 中, 每 管 500ul( 每 管 分 装 的 体 积 可 视 具 体 情 况 而 定 ); 3) 取 出 中

样 本 前 处 理 规 范 ( 人 ) 采 集 好 的 样 本 应 尽 快 在 采 集 处 或 者 转 移 至 处 理 中 心 进 行 前 期 处 理 不 同 类 型 不 同 研 究 目 的 的 样 本 前 处 理 的 方 法 不 同, 处 理 人 员 应 严 格 按 照 标 准 操 作 规 程 进 行 1. 血 液 样 本 血 液 样 本 采 集 完 毕, 需 要 尽 快 对 样 本 进 行 前 期 处 理 样 本 处 理 前 的 冷 藏 最 好 不 超 过 4h, 以 尽 量 降 低 凝 血 反 应 的 影 响 不 能 在 采 集 地 点 立 刻 进 行 前 期 处 理 的 样 本 也 应 低 温 冷 藏 尽 快 转 移 至 处 理 中 心 处 理 采 集 的 全 血 经 过 分 离 后 成 为 血 清 血 浆 和 血 沉 棕 黄 层 等 血 液 成 份 进 行 样 本 储 存 或 继 续 进 行 提 取 DNA 蛋 白 质 等 样 本 制 备 1.1 全 血 1.1.1 采 集 的 血 液 样 本 如 不 进 行 成 分 的 分 离, 直 接 用 于 全 血 的 储 存, 也 需 要 稍 作 前 期 处 理 抗 凝 的 血 液 应 被 快 速 地 冷 冻 上 如 果 需 要 完 整 的 血 细 胞, 则 需 要 使 用 二 甲 基 亚 砜 (DMSO) 以 确 保 在 冷 冻 时 细 胞 是 存 活 的 1.1.2 血 液 按 要 求 分 装 到 统 一 规 格 的 无 菌 冻 存 管 中, 加 入 DMSO 混 合 均 匀 后 将 冻 存 管 放 入 冷 冻 冰 箱 中 在 至 少 4 小 时 候 后, 才 能 转 移 到 -80 或 更 低 温 条 件 下 储 存 1.2 血 浆 血 沉 棕 黄 层 和 红 细 胞 1.2.1 用 途 用 EDTA 管 和 ACD 管 采 集 的 血 液, 经 离 心 后 可 以 分 为 三 层 : 上 层 的 血 浆, 中 层 的 血 沉 棕 黄 层, 下 层 的 红 细 胞 血 浆 可 以 用 于 生 物 鉴 定,DNA 提 取, 蛋 白 质 组 学 分 析 和 生 物 标 志 物 发 现 等 研 究 血 沉 棕 黄 层 是 一 层 很 薄 的 灰 白 色 的 白 细 胞 和 血 小 板 层, 可 以 用 于 DNA 的 提 取 和 细 胞 系 的 产 生 1.2.2 处 理 方 法 1)4 下 离 心 真 空 采 血 管 ( 大 约 5ml), 使 血 浆 从 血 细 胞 中 分 离 ; 1

2) 用 70% 的 酒 精 对 采 血 管 顶 端 和 管 盖 进 行 清 理 消 毒 后, 取 出 上 层 血 浆 ( 约 3ml), 分 至 5-6 个 标 记 好 的 冻 存 管 中, 每 管 500ul( 每 管 分 装 的 体 积 可 视 具 体 情 况 而 定 ); 3) 取 出 中 层 的 血 沉 棕 黄 层 ( 约 200ul), 平 均 分 至 2 个 标 记 好 的 冻 存 管 中 ; 4) 将 下 层 红 细 胞 转 移 至 标 记 好 的 冻 存 管 中 ; 5) 将 上 述 冻 存 管 放 入 液 氮 中 快 速 冷 冻, 对 于 白 细 胞 层 最 好 使 用 程 序 降 温 法 进 行 冷 冻 ; 6) 冷 冻 好 的 样 本 储 存 在 -80 或 液 氮 环 境 中 1.3 血 清 血 凝 块 采 集 到 没 有 抗 凝 血 剂 离 心 管 中 的 血 液 室 温 下 会 在 30 分 钟 内 自 动 分 成 两 相, 固 相 含 有 纤 维 蛋 白 和 细 胞, 液 相 则 含 有 血 清 1.3.1 室 温 下 离 心 真 空 采 血 管 ; 1.3.2 将 上 清 液 转 移 至 5 个 标 记 好 的 冻 存 管 中 ; 1.3.3 将 下 层 血 凝 块 用 无 菌 光 滑 玻 璃 棒 轻 轻 混 匀, 然 后 用 药 匙 小 心 分 装 至 2 个 标 记 好 的 冻 存 管 中 ; 1.3.4 将 冻 存 管 放 入 液 氮 杜 瓦 瓶 或 干 冰 中 快 速 冷 冻 ; 1.3.5 储 存 在 -80 或 液 氮 环 境 中 1.4 滤 纸 血 斑 要 将 采 集 的 血 液 处 理 成 血 斑 时, 需 要 用 到 滤 纸 使 用 EDTA/ACD 管 采 集 的 血 液 来 制 造 血 斑 拿 滤 纸 时 一 定 要 戴 手 套, 且 只 能 捏 拿 滤 纸 的 最 上 角, 标 记 好 不 要 让 滤 纸 接 触 到 任 何 不 干 净 的 表 面 1.4.1 在 开 始 前, 反 转 真 空 采 血 管 使 得 里 面 的 抗 凝 血 充 分 混 合 ; 1.4.2 打 开 管 盖 前, 先 用 70% 的 酒 精 擦 拭 采 血 管 的 顶 部 ; 1.4.3 使 用 微 量 移 液 管 吸 取 一 定 量 的 血 液, 滴 到 滤 纸 圈 中, 制 得 滤 纸 血 斑 ; 2

1.4.4 将 滤 纸 放 置 在 II 级 生 物 安 全 柜 内, 自 动 晾 干 ; 1.4.5 将 滤 纸 放 在 一 个 纸 质 信 封 ( 严 禁 塑 料 ) 里,-20 储 存 1.5 注 意 事 项 1.5.1 制 备 血 浆 时, 应 尽 快 的 离 心 血 液 1.5.2 制 备 血 清 时, 血 液 应 该 在 采 集 后 1 小 时 内 处 理 好 超 过 了 这 个 时 间, 细 胞 活 性 会 迅 速 下 降, 导 致 细 胞 结 构 脆 弱, 蛋 白 质 和 核 酸 降 解 1.5.3 用 于 蛋 白 质 组 学 研 究 的 血 液 标 本, 应 在 室 温 下 尽 快 的 处 理 好, 因 为 低 温 会 激 活 血 小 板, 并 释 放 肽 段 到 体 外 样 本 中 2. 组 织 样 本 采 集 好 的 组 织 样 本 需 要 尽 快 进 行 前 期 处 理, 最 好 在 30min 内 完 成 超 过 了 时 限 的 组 织, 依 然 应 该 进 行 处 理, 但 需 记 录 下 这 个 延 迟 的 信 息 组 织 主 要 被 处 理 成 3 类 样 本 进 行 储 存 : 新 鲜 冰 冻 组 织 样 本,OCT 包 埋 冰 冻 组 织 样 本 和 石 蜡 包 埋 组 织 样 本 2.1 新 鲜 冰 冻 组 织 2.1.1 对 于 从 非 高 危 险 性 病 人 身 上 取 得 或 被 认 定 为 不 具 有 高 危 险 性 的 组 织, 优 先 处 理 储 存 为 新 鲜 冰 冻 组 织 样 本 为 获 取 新 鲜 冰 冻 组 织 样 本, 不 能 使 用 福 尔 马 林 处 理 样 本 2.1.2 用 于 快 速 冷 冻 的 组 织 标 本, 切 割 成 大 小 0.5 0.5 0.5cm 左 右 的 小 块 较 小 的 组 织 碎 片 也 应 该 被 快 速 冷 冻, 并 储 存 进 组 织 库 中 2.1.3 样 本 量 足 够 的 情 况 下, 正 常 组 织 和 癌 旁 组 织 各 处 理 成 3 份, 肿 瘤 组 织 处 理 成 4 份, 分 别 装 于 标 记 好 的 冻 存 管 中 其 中 一 份 肿 瘤 组 织 用 于 质 量 控 制, 其 余 低 温 保 存 2.1.4 切 割 成 大 小 合 适 的 组 织 样 本 应 尽 快 进 行 快 速 冷 冻, 冷 冻 的 时 间 不 宜 过 长, 一 般 控 制 在 1 分 钟, 具 体 时 间 根 据 组 织 块 的 大 小 而 定 快 速 冷 冻 时 可 以 选 择 直 接 3

冷 冻, 或 将 组 织 封 装 在 容 器 中, 再 整 个 放 入 冷 冻 剂 ( 例 如 预 冷 的 异 戊 烷 ) 中 储 存 不 建 议 使 用 液 氮 作 为 直 接 冷 冻 的 冷 冻 剂, 因 为 其 会 造 成 白 化 等 危 险 的 事 故 2.1.5 快 速 冷 冻 时 如 果 不 采 用 直 接 冷 冻, 还 有 如 下 方 法 可 以 选 择 : 1) 将 组 织 定 位 在 一 片 软 木 和 一 张 同 样 大 小 的 曾 经 浸 没 于 生 理 盐 水 中 的 Whatman 纸 上, 再 放 入 冷 冻 剂 中 冷 冻 ; 2) 将 标 本 包 埋 进 塑 料 冻 存 模 具 中 的 冷 凝 剂 中, 并 整 个 浸 没 在 预 冷 的 异 戊 烷 中 进 行 冷 冻 ; 3) 使 用 冻 存 麦 管 系 统, 将 组 织 封 装 进 冻 存 麦 管 中 此 方 法 需 要 热 封 每 个 端 口, 并 将 其 放 置 于 冷 冻 剂 中 2.1.6 冷 冻 剂 异 戊 烷 的 预 冷 : 将 冷 冻 剂 预 冷 到 不 透 明 的 液 滴 开 始 出 现, 并 且 溶 液 也 开 始 变 得 朦 胧 时 为 止 此 时, 异 戊 烷 会 处 于 其 冰 点 (-160 ), 这 也 是 组 织 的 最 佳 冰 点 异 戊 烷 预 冷 的 选 择 方 案 如 下 : 1) 液 氮 : 在 液 氮 中 悬 挂 一 瓶 异 戊 烷, 进 行 预 冷 ; 2) 干 冰 : 将 干 冰 加 入 异 戊 烷 中, 直 到 形 成 粘 稠 状 液 体 ; 或 者 在 干 冰 中 悬 挂 一 瓶 异 戊 烷, 进 行 预 冷 2.1.7 在 冷 冻 完 成 前 不 要 将 组 织 从 异 戊 烷 中 取 出, 但 要 确 保 标 本 没 有 爆 裂 2.1.8 采 集 好 的 样 本 冰 冻 成 为 组 织 样 本 的 过 程 应 尽 可 能 使 用 少 的 时 间, 间 隔 一 般 不 超 过 30 分 钟 2.1.9 冰 冻 结 束 后 得 到 的 新 鲜 冰 冻 组 织 样 本 应 立 刻 用 干 冰 转 移 到 -80 冰 箱 或 液 氮 罐 等 设 备 中 2.2OCT 冰 冻 组 织 切 片 OCT 冷 冻 组 织 切 片 的 制 备 只 能 由 经 过 训 练 的 技 术 人 员 进 行 操 作 2.2.1 采 集 好 的 组 织 样 本 其 中 一 块 组 织 可 用 于 进 行 OCT 包 埋 冰 冻, 制 作 成 冰 冻 组 织 切 片 4

2.2.2 组 织 样 本 的 要 求 和 新 鲜 冰 冻 组 织 的 一 致, 注 意 控 制 处 理 的 时 间 2.2.3 在 冰 冻 前 将 组 织 加 入 至 OCT 冰 冻 切 片 包 埋 剂 中 进 行 包 埋, 包 埋 的 过 程 应 去 除 产 生 的 气 泡 2.2.4 包 埋 完 成 的 组 织 尽 快 进 行 快 速 冷 冻 2.2.5 冷 冻 完 成 的 组 织 取 出 放 到 切 片 机 的 过 程 应 使 用 干 冰 2.2.6 根 据 需 要 确 定 切 片 厚 度, 标 准 切 片 厚 度 为 4μm, 用 于 核 酸 提 取 的 切 片 可 以 在 10-20μm, 应 保 证 切 片 厚 度 的 持 续 稳 定 2.2.7 切 完 的 组 织 切 片 应 快 速 装 片, 重 新 冰 冻 和 低 温 储 存 2.2.8OCT 冷 冻 组 织 切 片 用 苏 木 紫 和 曙 红 (H&E) 染 色 2.2.9 染 色 不 固 定 的 冷 冻 切 片 时, 切 片 可 能 较 容 易 从 板 上 脱 离, 可 使 用 黏 性 板 来 克 服 该 不 足, 减 弱 曙 红 染 色, 加 强 核 染 2.3 石 蜡 包 埋 组 织 切 片 石 蜡 包 埋 组 织 切 片 的 制 备 只 能 由 经 过 训 练 的 技 术 人 员 进 行 操 作 2.3.1 选 择 合 适 大 小 的 组 织 块 制 作 石 蜡 包 埋 组 织 样 本, 组 织 块 不 宜 过 大, 一 般 不 超 过 1.5 1.0 0.5cm 2.3.2 事 先 准 备 好 中 性 含 有 磷 酸 缓 冲 液 的 10% 福 尔 马 林 作 为 固 定 样 本 的 试 剂, 固 定 样 本 应 该 在 室 温 中 进 行, 固 定 试 剂 的 量 应 该 远 大 于 样 本, 使 样 本 能 浸 没 其 中 并 充 分 渗 透 2.3.3 从 组 织 采 集 到 固 定 的 时 间 不 宜 太 长, 一 般 控 制 在 4 小 时 以 内, 固 定 的 时 间 在 24-48 小 时 为 宜 2.3.4 固 定 完 的 组 织 在 进 行 石 蜡 包 埋 前 要 进 行 脱 水, 根 据 标 准 化 的 流 程 采 用 低 熔 点 的 石 蜡 对 组 织 进 行 包 埋 2.3.5 包 埋 好 的 组 织 样 本 根 据 需 要 确 定 切 片 厚 度, 标 准 切 片 厚 度 为 4μm, 用 于 核 酸 提 取 的 切 片 可 以 在 10-20μm, 保 证 切 片 厚 度 的 持 续 稳 定 5

2.3.6 切 片 应 该 烘 干, 一 般 55 环 境 下 烘 干 1 小 时 2.3.7 石 蜡 包 埋 组 织 切 片 用 苏 木 紫 和 曙 红 (H&E) 染 色 2.3.8 未 染 色 的 切 片 为 了 保 证 其 稳 定 性 应 在 真 空 封 闭 和 低 温 条 件 下 储 存 2.3.9 注 意 事 项 1) 由 于 福 尔 马 林 的 化 学 危 害 性, 福 尔 马 林 固 定 的 替 代 方 法 对 于 长 期 储 存 的 效 果 很 多 时 候 都 是 未 知 的, 因 此 应 该 凭 经 验 来 操 作 2) 酒 精 固 定 可 以 替 代 福 尔 马 林 固 定 采 用 酒 精 固 定 时, 组 织 需 要 放 进 70% 的 酒 精 ( 用 焦 碳 酸 二 乙 酯 DEPC 水 稀 释 ) 中 至 少 4 小 时 3) 应 避 免 使 用 包 含 苦 味 酸 的 布 安 氏 液 等 固 定 媒 介, 因 为 这 类 化 合 物 会 对 随 后 的 提 取 的 核 酸 的 PCR 分 析 产 生 干 扰 4) 所 有 的 试 剂 都 应 该 是 去 除 了 DNA 酶 和 RNA 酶 的 2.4RNAlater 2.4.1 当 干 冰 或 液 氮 还 没 有 准 备 好, 将 采 集 的 组 织 放 进 RNAlater 中,RNAlater 能 够 保 护 新 鲜 标 本 中 的 RNA 2.4.2 控 制 用 于 RNAlater 处 理 的 组 织 样 本 厚 度 不 超 过 0.5cm, 然 后 将 该 组 织 浸 泡 于 5-10 倍 体 积 的 RNAlater 中 ( 例 如,0.5g 的 组 织, 需 要 2.5-5ml 的 RNAlater) 2.4.3 用 RNAlater 处 理 过 的 组 织 和 细 胞 标 本, 能 够 在 4 下 储 存 一 个 月,25 下 储 存 一 周, 或 者 在 -20 下 无 限 期 的 储 存 2.5 组 织 芯 片 制 备 组 织 芯 片 制 作 流 程 包 括 : 阵 列 设 计 入 选 样 本 病 理 复 诊 与 标 记 取 芯 ( 供 体 蜡 块 ) 点 阵 ( 受 体 腊 块 切 片 制 成 组 织 芯 片 ), 具 体 参 照 标 准 操 作 流 程 进 行 2.5.1 检 测 芯 片 主 要 用 于 检 测 标 志 蛋 白 表 达 状 况 和 水 平, 可 以 使 用 具 有 明 确 临 床 病 理 学 资 料 6

但 随 访 时 间 短 或 无 患 者 生 存 期 的 组 织 样 本 制 备 2.5.2 分 型 芯 片 在 用 于 检 测 标 志 蛋 白 表 达 状 况 和 水 平 的 基 础 上, 能 够 用 于 临 床 分 子 分 型 研 究 和 评 价 所 用 的 组 织 要 求 有 系 统 的 临 床 随 访 资 料 3. 尿 液 样 本 3.1 尿 标 本 要 新 鲜, 留 取 后 立 即 进 行 相 应 的 处 理 放 置 4h 以 上 尿 中 成 分 可 发 生 变 化, 如 红 细 胞 白 细 胞 溶 解 等 在 冷 冻 前, 室 内 温 度 应 维 持 在 最 低 的 状 态 3.2 根 据 标 本 分 析 或 储 存 所 需 的 量, 将 采 集 到 的 样 本 分 装 至 标 记 好 的 2ml 冻 存 管 3.3 某 些 特 殊 样 本 应 根 据 样 本 将 要 用 于 的 研 究 目 的 加 入 适 当 防 腐 剂 3.4 有 些 尿 液 样 本 含 有 细 胞 碎 片 等 杂 质, 应 对 此 类 样 本 进 行 离 心 分 离 4. 粪 便 样 本 采 集 的 每 个 样 本 应 单 独 放 在 一 个 容 器, 样 本 容 器 最 好 统 一 规 格 采 集 好 后 立 即 密 封, 根 据 样 本 的 性 状 及 要 求 不 同, 作 暂 时 的 冷 藏 冷 冻 或 立 即 进 行 处 理 样 品 经 包 装 密 封 后, 必 须 尽 快 送 至 实 验 室 处 理 因 此 在 样 本 运 输 计 划 中, 要 根 据 样 本 的 储 存 要 求, 妥 善 安 排 运 送 计 划 4.1 样 本 采 集 至 样 本 处 理 的 时 间 间 隔 最 好 小 于 30min 4.2 暂 不 处 理 的 样 本 应 放 于 4 密 封 暂 存 4.3 可 每 按 管 1-2g 的 样 本 量 分 装 至 冻 存 管, 立 即 密 封,-80 保 存 5. 唾 液 样 本 5.1 使 用 蛋 白 酶 抑 制 剂 处 理 样 本 ; 5.2 将 样 本 进 行 离 心, 分 离 唾 液 上 清 和 可 能 存 在 的 颗 粒 物 质 ; 5.3 分 别 收 集 上 清 和 颗 粒 物, 按 标 准 分 装 至 标 记 好 的 冻 存 管 中 7

6. 精 液 样 本 6.1 采 集 完 精 液 后, 应 于 35-37 水 浴 箱 中 ( 无 条 件 时 则 室 温 放 置 20-45min) 待 其 液 化 6.2 液 化 后 的 精 液 需 要 向 标 本 中 加 入 蛋 白 酶 抑 制 剂, 以 避 免 精 液 标 本 被 蛋 白 酶 水 解 掉 如 用 于 病 毒 分 离 培 养, 应 在 4h 内 完 成 6.3 液 化 后 的 精 液 转 移 至 15ml 离 心 管 中, 加 入 相 应 的 试 剂, 离 心 处 理 后 可 以 分 离 得 到 精 子 细 胞 非 精 子 细 胞 精 浆 将 这 些 成 分 按 规 程 分 别 进 行 分 装 6.4 处 理 好 的 精 子 细 胞 样 本 和 非 精 子 细 胞 样 本 可 以 用 于 进 一 步 的 处 理, 也 可 以 储 存 在 -80 的 环 境 下 6.5 精 浆 样 本 可 以 用 于 病 毒 的 分 离 培 养 等 进 一 步 处 理, 也 可 以 储 存 在 -80 的 环 境 下 7. 脑 脊 液 7.1 采 集 完 脑 脊 液 样 本 后, 须 将 其 转 移 到 含 有 EDTA 和 氟 化 钠 混 合 液 的 西 林 瓶 中 7.2 如 果 脑 脊 液 样 本 中 含 有 红 细 胞 或 颗 粒 物, 则 建 议 在 冷 冻 前 对 脑 脊 液 进 行 离 心 7.3 处 理 好 的 脑 脊 液 样 本 应 该 冷 冻 并 储 存 在 -80 或 液 氮 环 境 下 因 为 脑 脊 液 一 旦 离 开 人 体 就 会 迅 速 的 溶 解, 因 此 一 定 要 以 最 快 的 速 度 冷 冻 脑 脊 液 标 本 8. 气 管 上 皮 细 胞 衬 液 (ELF) 采 集 到 的 细 胞 上 皮 衬 液 即 回 收 到 的 灌 洗 液 在 实 验 室, 测 量 回 收 的 灌 洗 液 总 量, 并 通 过 离 心 使 得 细 菌 和 蛋 白 质 分 离 将 分 离 得 到 的 细 菌 置 于 标 记 好 的 冻 存 管 进 行 储 存 或 者 进 行 细 菌 培 养 9. 骨 髓 样 本 如 果 骨 髓 标 本 含 有 红 细 胞, 在 冷 冻 前 应 先 将 其 离 心 去 除 骨 髓 标 本 采 集 好 后 应 尽 快 冷 冻 上, 并 储 存 在 -80 环 境 下 8

10. 宫 颈 细 胞 样 本 采 集 好 的 宫 颈 细 胞 样 本 可 以 用 于 制 作 宫 颈 巴 氏 涂 片 或 者 进 行 细 胞 系 的 培 养 10.1 涂 片 将 刮 板 的 两 面 ( 或 宫 颈 刷 ) 仔 细 的 涂 在 玻 片 上 如 果 是 保 护 液 中 重 悬 的 样 本, 离 心 将 标 本 中 的 血 液 黏 液 和 炎 细 胞 与 上 皮 细 胞 分 离, 处 理 后 留 取 一 定 的 储 存 液 及 管 底 的 细 胞 团 将 其 混 匀 后 放 入 甩 片 机 制 成 直 径 为 2cm 的 薄 层 细 胞 涂 片 10.2 迅 速 的 固 定 好 所 有 玻 片 可 以 使 用 喷 雾 固 定 剂, 喷 雾 器 的 使 用 需 严 格 按 照 标 准 操 作 规 程 进 行 或 者 将 玻 片 浸 没 于 95% 的 乙 醇 中 15~20 分 钟 如 果 玻 片 没 有 迅 速 的 固 定 好, 则 细 胞 将 会 干 枯 并 变 得 畸 形 影 响 样 本 的 质 量 10.3 标 记 制 作 完 巴 氏 玻 片 之 后 仔 细 的 在 每 个 玻 片 的 边 缘 进 行 标 记 11. 人 皮 肤 成 纤 维 细 胞 养 采 集 到 的 人 皮 肤 样 本 是 组 织 块, 应 尽 快 带 回 实 验 室 或 者 处 理 中 心 进 行 细 胞 培 11.1 处 理 方 法 11.1.1 用 PBS 溶 液 充 分 洗 去 组 织 块 上 的 血 迹, 适 当 剪 掉 结 蒂 组 织 并 把 剩 下 表 皮 剪 成 4~8 块 更 小 的 组 织 块, 充 分 洗 涤 ; 11.1.2 将 组 织 块 剪 碎 后, 分 别 用 含 无 血 清 DMEM/F12 和 Ⅳ 胶 原 酶 的 消 化 液 胰 酶 消 化 液 对 组 织 块 进 行 消 化 ; 11.1.3 终 止 消 化 后 加 入 完 全 培 养 基 对 得 到 的 细 胞 进 行 原 代 培 养 ; 11.1.4 原 代 细 胞 培 养 到 70-80% 汇 合 时 对 细 胞 进 行 传 代 培 养 ; 11.1.5 终 止 细 胞 的 培 养, 用 胰 酶 对 培 养 的 细 胞 进 行 消 化 ; 9

11.1.6 加 入 完 全 培 养 基, 充 分 吹 散 细 胞 后 离 心, 留 取 细 胞 11.2 储 存 分 离 得 到 的 细 胞, 在 控 制 的 冰 冻 速 率 下 冻 存, 大 约 每 分 钟 1 直 到 -80, 再 转 移 至 适 当 的 储 存 设 备 中 12. 脐 带 12.1 人 脐 带 间 充 质 干 细 胞 (UCMSC) 脐 带 由 三 部 分 组 成 : 羊 膜 被 覆 上 皮 脐 血 管 和 位 于 两 者 之 间 被 称 为 华 通 氏 胶 的 粘 液 结 缔 组 织 华 通 氏 胶 中 存 在 着 一 种 成 纤 维 样 细 胞, 被 称 为 人 脐 带 间 充 质 干 细 胞, 该 细 胞 具 有 自 我 更 新 增 值 和 多 向 分 化 潜 能 与 其 他 干 细 胞 相 比, 人 脐 带 间 充 质 干 细 胞 有 明 显 优 势 : 成 本 较 低, 来 源 丰 富, 不 会 给 捐 赠 者 造 成 新 的 创 伤 和 痛 苦 ; 是 一 种 较 为 原 始 的 干 细 胞, 可 塑 性 强, 扩 增 能 力 强, 无 致 瘤 活 性 和 低 免 疫 原 性 ; 与 骨 髓 充 质 间 干 细 胞 比, 不 会 随 着 传 代 次 数 增 加 和 机 体 年 龄 增 长 导 致 增 值 能 力 和 分 化 能 力 降 低 12.2 处 理 方 法 12.2.1 酶 消 化 法 1) 将 采 集 好 的 样 本 用 含 青 链 霉 素 PBS 液 冲 洗 剔 除 血 管 筋 膜 后, 分 离 出 华 通 氏 胶, 然 后 逐 步 剪 碎, 并 用 含 青 链 霉 素 PBS 洗 涤 4 遍, 剪 碎 成 小 块 ; 2) 用 胶 原 酶 Ⅳ 对 组 织 块 进 行 消 化 ; 3) 消 化 后, 可 见 胶 状 粘 稠 产 物, 加 入 3 倍 体 积 的 PBS 稀 释 后, 用 无 菌 滤 网 过 滤, 收 集 过 滤 后 的 液 体, 离 心 去 上 清, 用 相 应 的 细 胞 培 养 基 混 匀 细 胞 沉 淀, 转 至 10cm 培 养 皿 中 进 行 培 养 ; 4) 细 胞 培 养 至 80% 融 合 时, 胰 酶 消 化, 进 行 细 胞 的 传 代 培 养 ; 5) 细 胞 汇 合 度 为 80% 左 右 终 止 细 胞 培 养, 收 集 细 胞 进 行 冻 存 12.2.2 组 织 块 贴 壁 法 10

1) 将 采 集 好 的 样 本 用 含 青 链 霉 素 PBS 液 冲 洗 剔 除 血 管 筋 膜 后, 分 离 出 华 通 氏 胶, 然 后 逐 步 剪 碎, 并 用 含 青 链 霉 素 PBS 洗 涤 4 遍, 剪 碎 成 小 块 ; 2) 用 少 量 培 养 基 将 其 湿 润, 将 组 织 块 均 匀 接 种 于 合 适 培 养 皿 内, 放 置 于 培 养 箱 内 进 行 原 代 培 养 ; 3) 细 胞 培 养 至 80% 融 合 时 进 行 传 代 培 养 ; 4) 培 养 好 的 细 胞 进 行 分 离 冻 存 13. 注 意 事 项 13.1 安 全 使 用 冷 冻 剂 和 试 剂 使 用 干 冰 液 氮 等 冷 冻 剂 和 二 甲 基 亚 砜 (DMSO) 福 尔 马 林 异 戊 烷 等 试 剂 时 是 危 险 的, 在 用 干 冰 或 液 氮 进 行 样 本 的 处 理 时 应 注 意 安 全 13.2 安 全 使 用 仪 器 在 用 到 离 心 机 切 片 机 等 仪 器 的 时 候 要 严 格 按 照 标 准 操 作 规 程 进 行 操 作, 如 仪 器 对 使 用 人 员 有 特 别 要 求, 只 有 符 合 要 求 的 人 员 可 以 使 用, 其 他 人 员 禁 止 使 用 14. 处 理 信 息 的 记 录 样 本 前 处 理 的 所 有 信 息 包 括 所 处 理 的 组 织 类 型 日 期 处 理 人 员 处 理 延 迟 信 息 非 标 准 的 操 作 步 骤 等 都 应 在 样 本 处 理 记 录 表 上 记 录 15. 相 关 文 件 和 记 录 样 本 处 理 记 录 表 11