( 第 四 版 ) 中 国 医 科 大 学 生 物 化 学 与 分 子 生 物 学 教 研 室 2008 年 04 月
生 物 化 学 实 验 ( 第 四 版 ) 主 编 : 魏 金 荣 副 主 编 : 关 一 夫, 于 爱 鸣 党 员 编 者 ( 按 姓 氏 笔 画 顺 序 ): 毕 强 李 雪 松 刘 素 媛 邢 伟 武 迪 迪 郑 华 川 宗 志 红 宿 文 辉 阎 敬 韩 晓 曦 魏 金 荣 非 党 员 编 者 ( 按 姓 氏 笔 画 顺 序 ): 王 彪 孙 黎 光 安 丽 文 冯 晨 张 天 彪 郝 凤 进 赵 国 杰 袁 莹 中 国 医 科 大 学 生 物 化 学 与 分 子 生 物 学 教 研 室 2008 年 4 月
前 言 近 十 年 来, 科 学 技 术 的 迅 猛 发 展, 使 得 生 物 化 学 与 分 子 生 物 学 的 实 验 技 术 和 方 法 层 出 不 穷 日 新 月 异 虽 然 我 们 对 生 物 化 学 与 分 子 生 物 学 实 验 课 教 学 内 容 陆 续 进 行 过 一 些 调 整 和 改 革, 但 仍 显 得 不 能 适 应 现 代 生 物 科 学 发 展 的 需 要 为 此, 为 了 顺 应 学 科 的 发 展, 全 面 提 高 实 验 教 学 水 平 和 质 量, 使 得 学 生 能 够 学 习 和 掌 握 现 代 生 物 学 技 术, 中 国 医 科 大 学 基 础 医 学 院 生 物 化 学 与 分 子 生 物 学 党 支 部 启 动 了 旨 在 进 行 实 验 课 教 学 改 革 的 党 员 工 程 项 目 在 此 次 新 版 实 验 手 册 的 编 写 过 程 中, 我 们 以 具 有 多 年 实 验 课 教 学 经 验 的 党 员 教 师 为 核 心, 首 先 通 过 大 量 的 文 献 调 研, 提 出 初 步 的 改 革 设 想 ; 由 教 研 室 主 任 关 一 夫 教 授 和 教 研 室 副 主 任 于 爱 鸣 教 授 对 改 革 方 案 提 出 修 改 意 见 ; 经 全 体 参 编 人 员 的 认 真 论 证 和 反 复 研 究, 最 后 确 定 了 改 革 方 案 新 的 改 革 方 案 对 实 验 课 教 学 内 容 进 行 了 整 体 规 划 新 版 的 实 验 手 册 保 留 了 原 有 较 为 先 进 的 部 分 实 验 以 及 具 有 参 考 价 值 的 实 验, 增 添 了 部 分 先 进 的 分 子 生 物 学 实 验 和 技 术 较 新 的 实 验, 如 充 实 和 完 善 了 综 合 性 实 验 1- 抗 胰 蛋 白 酶 的 分 离 纯 化, 增 添 了 免 疫 印 迹 RNA 的 制 备 与 分 析 DNA 酶 解 和 DNA 片 段 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 和 PCR 等 先 进 的 分 子 生 物 学 实 验 和 体 现 生 物 化 学 特 点 的 底 物 浓 度 对 酶 活 性 的 影 响 -Km 值 的 测 定 和 抑 制 剂 对 酶 活 性 的 影 响 的 基 本 实 验 为 了 保 证 实 验 的 可 行 性 和 准 确 性, 我 们 对 某 些 实 验 进 行 了 预 实 验 在 新 版 实 验 手 册 的 编 写 过 程 中, 党 员 教 师 承 担 了 新 内 容 的 编 写 和 修 改 的 繁 重 工 作, 同 时 部 分 党 外 的 青 年 骨 干 教 师 积 极 参 与 该 项 活 动, 承 担 了 部 分 文 字 录 入 工 作 在 此 对 关 一 夫 教 授 于 爱 鸣 教 授 的 大 力 支 持 及 部 分 党 外 教 师 的 大 力 帮 助 表 示 感 谢 本 实 验 手 册 难 免 有 不 妥 之 处, 希 望 广 大 师 生 提 出 宝 贵 意 见 编 者 2008 年 4 月 10 日
目 录 第 一 部 分 常 用 生 物 化 学 实 验 技 术 及 原 理 一 常 用 生 物 材 料 的 处 理 1 二 比 色 分 析 法 和 分 光 光 度 法 4 ( 一 ) 比 色 分 析 法 的 基 本 原 理 4 ( 二 ) 比 色 分 析 的 测 定 方 法 7 ( 三 ) 常 用 分 光 光 度 计 的 使 用 10 三 电 泳 技 术 12 ( 一 ) 基 本 原 理 12 ( 二 ) 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 16 ( 三 ) 等 电 聚 焦 电 泳 22 四 层 析 法 26 ( 一 ) 层 析 技 术 的 发 展 简 史 及 科 学 意 义 26 ( 二 ) 层 析 技 术 的 基 本 原 理 27 ( 三 ) 层 析 法 分 类 28 ( 四 ) 凝 胶 过 滤 层 析 29 ( 五 ) 离 子 交 换 层 析 32 ( 六 ) 亲 和 层 析 35 第 二 部 分 实 验 一 蛋 白 质 的 测 定 38 实 验 一 微 量 凯 氏 (Kjeldahl) 定 氮 法 38 实 验 二 Folin 酚 试 剂 法 (Lowry 法 ) 40 实 验 三 双 缩 脲 法 (Biuret 法 ) 42 实 验 四 考 马 斯 亮 兰 法 (Bradford 法 ) 43 实 验 五 紫 外 吸 收 法 44 实 验 六 BCA 法 45 二 酶 促 反 应 动 力 学 46 实 验 七 酶 的 特 异 性 激 动 剂 及 抑 制 剂 46 实 验 八 ph 对 酶 活 性 的 影 响 47 实 验 九 底 物 浓 度 对 酶 活 性 的 影 响 50 实 验 十 抑 制 剂 对 酶 活 性 的 影 响 52 实 验 十 一 温 度 对 酶 促 反 应 速 度 的 影 响 54 实 验 十 二 酚 标 准 曲 线 的 绘 制 55 实 验 十 三 尿 淀 粉 酶 活 性 测 定 ( 温 氏 法 ) 55 三 生 物 氧 化 57 实 验 十 四 乳 酸 脱 氢 酶 及 辅 酶 Ⅰ 57 实 验 十 五 琥 珀 酸 脱 氢 酶 59
实 验 十 六 细 胞 色 素 氧 化 酶 实 验 59 四 糖 代 谢 60 实 验 十 七 运 动 对 尿 中 乳 酸 含 量 的 影 响 60 实 验 十 八 血 糖 定 量 ( 邻 甲 苯 胺 硼 酸 法 ) 62 实 验 十 九 肝 糖 原 实 验 64 实 验 二 十 尿 糖 定 性 ( 班 氏 法 ) 65 五 脂 类 66 实 验 二 十 一 肝 脂 类 的 提 取 及 薄 层 层 析 66 实 验 二 十 二 血 清 总 胆 固 醇 定 量 67 实 验 二 十 三 尿 中 酮 体 定 性 Lange 法 69 六 蛋 白 代 谢 69 实 验 二 十 四 血 清 蛋 白 的 醋 酸 纤 维 素 膜 电 泳 分 离 及 测 定 69 实 验 二 十 五 血 清 尿 素 氮 定 量 ( 二 乙 酰 一 肟 法 ) 72 实 验 二 十 六 牛 血 清 抗 胰 蛋 白 酶 (α 1 -AT) 的 分 离 及 鉴 定 73 (-) 盐 析 法 74 ( 二 ) 凝 胶 过 滤 法 75 ( 三 ) 纤 维 素 离 子 交 换 层 析 76 ( 四 ) 伴 刀 豆 素 球 蛋 白 琼 脂 糖 亲 和 层 析 77 ( 五 )α 1 -AT 酶 活 力 测 定 78 ( 六 )SDS- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 平 板 电 泳 79 ( 七 ) 总 结 82 实 验 二 十 七 免 疫 印 迹 82 七 核 酸 84 实 验 二 十 八 RNA 的 制 备 与 分 析 84 实 验 二 十 九 从 小 鼠 肝 中 提 取 DNA 87 实 验 三 十 核 酸 的 定 量 测 定 ( 定 磷 法 ) 90 实 验 三 十 一 DNA 的 定 量 测 定 ( 改 良 二 苯 胺 法 ) 92 实 验 三 十 二 DNA 酶 解 和 DNA 片 段 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 94 实 验 三 十 三 PCR 97 八 血 液 生 化 99 实 验 三 十 四 血 清 无 机 磷 定 量 99 附 录 一 缓 冲 液 101 ( 一 ) 一 些 常 用 缓 冲 液 的 化 合 物 的 酸 解 离 常 数 101 ( 二 ) 常 用 缓 冲 液 的 配 制 方 法 102 二 层 析 法 常 用 数 据 表 104 ( 一 ) 葡 聚 糖 凝 胶 的 某 些 技 术 数 据 104 ( 二 ) 琼 脂 糖 凝 胶 的 技 术 数 据 105 ( 三 ) 各 种 凝 胶 所 允 许 最 大 操 作 压 105
三 硫 酸 铵 饱 和 度 常 用 表 106 四 离 心 机 转 子 的 转 速 与 相 对 离 心 力 RCF(g) 间 的 换 算 关 系 108
第 一 部 分 常 用 生 物 化 学 实 验 技 术 及 原 理 一 常 用 生 物 材 料 的 处 理 1. 血 液 (Blood Blood) (1) 采 血 因 饮 食 及 其 他 生 理 情 况 常 使 血 液 成 分 发 生 变 动, 所 以 一 般 应 在 早 晨 空 腹 或 禁 食 6 小 时 以 上 安 静 条 件 下 采 血 需 用 血 量 较 少 时, 可 由 耳 垂 或 指 尖 采 毛 细 血 管 血 采 血 前 先 用 手 揉 搓 局 部, 使 血 液 循 环 旺 盛, 再 用 70% 酒 精 进 行 局 部 消 毒, 用 刺 血 针 或 注 射 针 头 穿 刺 ( 深 约 2mm), 擦 去 第 一 滴 血, 在 不 加 压 力 下 任 血 液 自 然 流 出, 然 后 使 血 滴 入 小 试 管 静 脉 采 血 通 常 选 用 肘 窝 的 静 脉, 局 部 用 碘 酒 及 70% 酒 精 消 毒, 扎 止 血 带, 用 严 密 消 毒 的 注 射 器 穿 刺 采 血, 然 后 注 入 适 当 的 容 器 中 1 所 用 注 射 器 针 头 及 盛 血 容 器 都 必 须 是 十 分 清 洁 干 燥 的 2 针 头 与 针 管 需 要 连 接 严 密, 在 采 血 过 程 中 不 应 进 入 小 气 泡, 否 则 易 发 生 凝 血 和 溶 血 3 由 注 射 器 注 出 血 液 时, 必 须 拔 掉 针 头, 沿 器 壁 轻 轻 地 注 到 容 器 中, 不 要 有 气 泡, 避 免 强 力 冲 击 (2) 分 离 血 清 把 新 采 的 血 于 试 管 或 离 心 管 中, 倾 斜 放 置, 任 其 自 然 凝 固, 然 后 移 放 冰 箱 或 室 温 放 置 等 待 析 出 血 清 如 急 用 时, 可 在 已 经 完 全 凝 固 ( 约 需 30~45 分 钟 ) 后, 用 细 的 钝 尖 玻 璃 棒 紧 贴 管 壁 把 凝 块 表 面 周 边 粘 附 管 壁 处 轻 轻 剥 开, 然 后 离 心 2000~3000rpm 约 10 分 钟, 移 取 血 清 放 另 外 小 试 管 中 (3) 抗 凝 全 血 及 血 浆 的 制 备 采 血 后 立 即 注 入 盛 有 适 当 的 抗 凝 剂 的 试 管 中, 轻 振 使 抗 凝 剂 溶 解 并 混 匀, 即 可 得 到 不 凝 的 全 血 把 抗 凝 血 液 离 心 (2000~3000rpm 5~10 分 钟 ), 使 有 形 成 分 下 沉, 上 部 即 为 血 浆 用 乳 头 吸 管 注 意 吸 取 血 浆, 移 放 另 外 试 管 中 备 用 生 化 实 验 中 常 用 的 抗 凝 剂 有 :1 草 酸 盐, 用 量 为 2mg/ml 2 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 (Na 2 EDTA),1mg/ml 3 氟 化 钠,10mg/ml, 它 还 有 抑 制 糖 酵 解 作 用 4 肝 素 ( Heparin),0.05 mg/ml 这 些 抗 凝 剂 使 用 固 体 粉 末, 也 可 以 预 先 配 成 一 定 浓 度 的 溶 液, 按 计 算 量 ( 例 如 5ml 血 液 需 要 10% 草 酸 钾 0.1ml) 加 入 试 管 中, 然 后 放 烘 箱 中 于 80 以 下 烘 干, 便 于 使 用 血 液 加 入 抗 凝 剂 后, 要 及 时 轻 轻 摇 动 使 抗 凝 剂 溶 解 并 混 匀, 不 可 强 力 振 荡, 避 免 溶 血 抗 凝 剂 的 药 量 要 适 当, 过 少 不 足 以 抗 凝, 过 多 则 影 响 实 验 又 根 据 实 验 目 的 不 同 要 对 抗 凝 剂 加 以 选 择, 如 用 草 酸 铵 则 不 适 于 氮 定 量 如 血 糖 定 量 可 用 氟 化 钠 以 防 止 糖 的 分 解, 最 好 与 草 酸 盐 并 用 ( 每 ml 血 用 草 酸 盐 2mg+ 氟 化 钠 3~4mg) 肝 素 抗 凝 效 果 好, 适 用 于 各 种 分 析, 但 价 格 较 贵, 一 般 实 验 中 不 必 使 用 (4) 血 液 样 品 的 保 存
血 液 成 分 容 易 发 生 变 动, 原 则 上 应 尽 快 进 行 分 析 如 必 需 暂 时 保 存 时, 应 放 入 冰 箱 全 血 最 不 稳 定, 可 做 成 除 蛋 白 滤 液 保 存 血 浆 应 及 时 与 血 细 胞 分 开, 血 清 也 应 与 凝 块 分 开, 单 独 保 存 2. 尿 液 (Urine Urine) (1) 采 尿 尿 液 成 分 及 浓 度 生 理 变 动 较 大 按 实 验 目 的 不 同, 可 用 不 同 的 尿 液 许 多 定 性 实 验 可 用 随 时 采 取 的 一 次 尿 样 清 晨 第 一 次 尿 样, 比 较 稳 定, 便 于 比 较, 也 常 采 用 定 量 实 验 常 需 采 用 全 日 尿 样 全 日 尿 亦 即 由 第 一 天 某 时 开 始 到 第 二 天 同 一 时 间 的 24 小 时 尿, 具 体 采 法 如 下 : 在 第 一 天 晨 6 时 排 尿 一 次 弃 去, 以 后 的 排 尿 全 部 收 集 到 加 有 适 当 防 腐 剂 的 容 器 中, 到 翌 晨 6 时, 不 论 有 无 尿 意, 再 主 动 排 尿 一 次 于 容 器 中 采 尿 中 间 不 可 有 异 物 混 入 采 尿 完 了 后, 把 全 部 尿 液 充 分 混 匀, 量 记 总 体 积 及 其 他 必 要 项 目, 然 后 留 取 其 一 部 分 供 实 验 用 (2) 防 腐 为 防 止 采 尿 过 程 中 及 暂 时 保 存 中 尿 液 成 分 发 生 变 化, 需 要 加 适 当 的 防 腐 剂 选 用 不 影 响 实 验 目 的 的 防 腐 剂 常 用 的 有 甲 苯, 全 日 尿 中 加 2~5ml, 它 成 一 薄 层 盖 在 尿 液 表 面 上, 适 用 于 一 般 测 定 另 外 也 常 用 冰 醋 酸 ( 约 10ml) 浓 盐 酸 ( 约 10ml) 等 3. 组 织 许 多 实 验 中 常 用 肝 脏 或 肌 肉, 主 要 因 为 其 量 多 且 含 酶 类 较 全 组 织 材 料 的 处 理 过 程 中, 最 重 要 的 原 则 是 切 实 注 意 勿 使 待 分 析 物 质 发 生 变 化 或 损 失 (1) 动 物 的 处 理 一 般 常 用 兔 鼠 蛙 等, 可 用 打 击 头 部 使 急 速 死 亡, 鼠 亦 常 用 脱 颈 椎 方 法 致 死, 必 要 时 立 即 断 头 放 血 然 后 迅 速 采 出 所 需 组 织, 放 到 冰 冷 条 件 下, 除 去 其 他 组 织, 洗 去 血 液, 用 滤 纸 吸 干, 称 重 供 用 (2) 匀 浆 的 制 备 进 行 组 织 或 细 胞 内 酶 活 性 的 测 定 或 某 些 成 分 的 定 量 时 多 使 用 组 织 匀 浆 制 备 匀 浆 一 般 常 用 乳 钵 把 组 织 剪 碎, 放 乳 钵 中, 必 要 时 加 少 量 玻 璃 砂, 研 磨, 加 入 一 定 量 液 体 以 做 成 一 定 稀 释 倍 数 的 匀 浆 ( 如 10% 匀 浆, 即 指 匀 浆 中 含 组 织 湿 重 10%) 但 研 磨 中 一 次 加 入 较 多 液 体, 不 便 于 细 研, 可 先 加 少 量, 研 细 后, 最 后 加 入 全 量 研 匀 制 备 匀 浆 并 提 取 组 织 成 分 常 用 的 溶 液 有 生 理 盐 水 缓 冲 液 等 分 析 某 些 细 胞 成 分 时, 使 用 0.15M 的 KCl 或 0.25M 蔗 糖 液 等 有 时 为 使 蛋 白 沉 淀 并 提 取 某 些 成 分, 用 5~10% 三 氯 醋 酸 等 在 分 析 酶 活 性 或 某 些 易 变 物 质 ( 如 ATP 等 ) 或 分 离 细 胞 内 各 组 分 进 行 研 究 时, 特 别 要 注 意 保 持 冰 冷 条 件, 迅 速 处 理 制 备 匀 浆 时, 一 方 面 采 取 冷 却 手 段, 防 止 变 化 ; 另 外 也 可 改 进 方 法 加 速 操 作 为 此, 可 采 用 匀 浆 器 (Homogenizer), 使 用 电 动 匀 浆 器 不 仅 加 快 了 研 磨 速 度, 也 提 高 了 匀 浆 的 均 匀 程 度 4. 沉 淀 的 分 离 (1) 过 滤 一 般 生 化 定 量 实 验 中, 常 用 优 质 滤 纸 和 小 漏 斗 进 行 过 滤 例 如 滤 除 血 清 蛋 白 质 的 沉 淀, 用 其 上 清 液 进 行 各 种 分 析 先 把 适 当 大 小 的 圆 形 滤 纸 进 行 对 折 两 次, 使 所 成 圆 锥 体
与 漏 斗 内 壁 全 面 接 触 如 与 漏 斗 角 度 不 适 合 要 调 整 滤 纸 的 圆 锥 角 度, 使 之 与 漏 斗 相 适 应 角 度 合 适 滤 纸 全 面 紧 贴 漏 斗 壁, 中 间 无 气 泡, 使 过 滤 速 度 较 快 向 滤 纸 上 倾 注 液 体, 要 沿 玻 棒 加 于 中 央, 加 液 不 可 过 多, 液 面 应 距 滤 纸 上 缘 2mm 以 上 (2) 离 心 及 离 心 机 离 心 法 是 利 用 离 心 力 将 不 同 质 量 的 物 质 进 行 分 离 离 心 力 与 转 速 ( 每 分 钟 转 数 ) 的 平 方 物 质 质 量 及 旋 转 半 径 成 正 比 电 动 离 心 机 转 速 快 分 离 效 果 高, 可 以 迅 速 地 使 溶 液 中 悬 浮 物 沉 积 下 来, 得 出 上 清 液 及 沉 淀, 供 进 一 步 分 析 液 体 黏 稠 或 过 少, 难 以 过 滤 或 不 适 于 需 时 较 长 的 过 滤 者, 皆 可 离 心 再 有 需 要 反 复 沉 淀 和 洗 涤 以 及 需 要 收 集 量 少 的 沉 淀 进 行 分 析 者, 更 需 要 离 心 此 外 离 心 法 也 用 于 某 些 液 体 的 分 离 离 心 使 用 离 心 机 (Centrifuge) 使 用 离 心 机 时 特 别 要 注 意 对 称 位 置 上 离 心 力 的 平 衡 其 次 注 意 防 止 离 心 过 程 中 离 心 管 的 破 裂 及 保 证 离 心 效 果, 虽 然 转 速 愈 快 时 间 愈 长 则 离 心 作 用 愈 大, 但 这 也 增 加 仪 器 负 担 和 打 坏 离 心 管 的 危 险 一 般 实 验, 常 用 转 速 为 每 分 钟 5000 转 ( 每 分 钟 转 数 round per minute, 常 用 符 号 rpm 表 示 ) 以 下, 大 多 数 情 况 下, 约 2000rpm 5~10 分 钟 即 可 达 到 目 的 某 些 实 验, 按 规 定 的 转 速 及 时 间 作 用, 转 速 不 可 过 高, 时 间 不 可 拖 长 一 般 电 动 离 心 机 的 使 用 方 法 及 注 意 事 项 如 下 : 使 用 方 法 1) 检 查 离 心 管 套 管 : 如 有 玻 璃 碎 片 等 异 物, 必 须 彻 底 清 除 管 底 放 好 适 当 的 棉 花 或 胶 垫 2) 平 衡 对 称 位 置 的 重 量 : 用 称 离 心 管 用 的 天 平, 平 衡 对 称 位 置 上 的 套 管 离 心 管 与 内 容 物 的 总 重 一 侧 放 检 品 管, 向 另 侧 离 心 管 加 水, 达 到 平 衡 为 止 3) 套 管 等 放 入 离 心 机 的 对 称 位 置 后, 离 心 管 不 得 过 高, 否 则 必 须 重 新 处 理 最 后 盖 上 离 心 机 盖 4) 先 将 调 速 旋 钮 转 到 零 位, 然 后 再 正 确 连 接 电 源 ( 注 意 电 压 严 防 接 错 ) 逐 步 转 动 旋 钮, 渐 渐 加 快 转 速, 待 机 钮 指 示 或 转 速 指 示 器 的 标 示 达 到 所 需 转 速 为 止 记 时 间 5) 到 规 定 时 间 时, 逐 渐 地 转 回 旋 钮 到 零 位, 拔 下 电 源 插 销, 等 待 转 动 自 然 停 止, 决 不 可 用 手 强 制 地 使 之 突 然 停 转 然 后 开 盖, 取 出 离 心 管 注 意 事 项 1) 离 心 机 需 放 在 牢 固 平 稳 的 台 面 上, 保 持 水 平 位 置 2) 使 用 离 心 机, 关 键 问 题 是 对 称 位 置 上 的 离 心 力 相 等, 不 仅 对 称 的 要 总 重 相 等, 而 且 重 心 所 在 位 置 也 应 该 对 称, 只 有 这 样 才 能 保 证 仪 器 高 速 正 常 运 行 和 得 到 好 的 离 心 效 果 ; 否 则 在 高 度 旋 转 中 会 产 生 离 心 力 的 很 大 差 别, 发 生 震 动, 影 响 沉 降 效 能, 并 且 容 易 使 离 心 管 破 碎, 甚 至 会 损 伤 仪 器 所 以 保 持 对 称 位 的 平 衡 是 必 须 严 格 遵 守 的 操 作 规 程 所 用 离 心 管 应 当 是 重 量 和 形 状 相 同 的 管 壁 厚 薄 不 规 整 质 量 不 好 的 玻 璃 离 心 管, 在 3000rpm 以 上 时 很 容 易 发 生 打 管 现 象 一 般 使 用 较 低 转 速 时 可 两 侧 都 放 待 离 心 液 体, 为 对 称 位 平 衡 向 较 轻 侧 离 心 管 与 套 管 之 间 加 水 但 使 用 转 速 较 高 时, 应 当 取 前 述 向 另 侧 离 心 管 中 加 水 的 方 法 向 离 心 管 与 套 间 加 水 虽 然 两 侧 可 以 等 重, 但 旋 转 后 两 者 重 心 所 在 位 置 不 同, 即 旋 转 半 径 不 同, 高 速 旋 转 时 仍 会 产 生 离 心 力 的 不 同 等 重 并 不 一 定 离 心 力 相 等, 平 衡 的 原 则 是 要 求 对 称 位 离 心
力 相 等 3) 起 动 及 停 车 过 程 都 必 须 是 逐 渐 地, 起 动 过 快 时 可 有 多 余 电 流 变 为 热 能, 有 烧 线 包 危 险, 震 动 也 大, 易 洒 出 液 体 或 打 破 离 心 管 强 制 突 然 停 转, 不 仅 会 有 沉 淀 振 起, 也 会 损 害 仪 器 4) 起 动 时 或 离 心 过 程 中 出 现 异 常 声 响 时, 要 及 时 停 车 进 行 检 查 处 理 5) 注 意 切 勿 使 液 体 流 溅 于 离 心 机 内 侵 蚀 机 体, 机 腔 内 应 干 燥 清 洁, 离 心 管 内 装 液 体 不 可 过 满, 避 免 溅 出 使 用 后 对 离 心 管 套 管 也 要 进 行 检 查 处 理, 套 管 内 应 保 持 清 洁 干 燥, 不 得 留 有 液 体 或 碎 破 片 等 二 比 色 分 析 法 和 分 光 光 度 法 我 们 知 道 许 多 物 质 都 是 具 有 颜 色 的, 当 含 有 这 些 物 质 的 溶 液 浓 度 改 变 时, 溶 液 颜 色 的 深 浅 度 也 就 随 着 改 变 溶 液 越 浓 颜 色 越 深, 溶 液 越 稀 颜 色 越 浅 因 此 可 以 利 用 比 较 颜 色 深 浅 的 方 法 来 确 定 溶 液 中 有 色 物 质 的 含 量, 这 种 方 法 就 称 为 比 色 分 析 法 此 法 可 用 光 电 比 色 计 进 行 测 定, 由 滤 光 板 来 获 得 近 似 的 单 色 光, 滤 光 板 的 波 长 范 围 宽 达 30~50nm 根 据 物 质 对 光 的 吸 收 特 性 和 吸 收 强 度, 对 物 质 进 行 定 性 和 定 量 的 分 析 方 法, 称 为 分 光 光 度 法 (spectrophotometry) 用 紫 外 光 源 测 定 无 色 物 质 的 方 法, 称 为 紫 外 分 光 光 度 法 ; 用 可 见 光 光 源 测 定 有 色 物 质 的 方 法, 称 为 可 见 光 光 度 法 可 用 分 光 度 计 进 行 测 定, 以 棱 镜 或 光 栅 为 分 光 器, 并 用 夹 缝 分 出 很 窄 的 一 条 单 波 长 的 光 这 种 单 色 光 的 波 长 范 围 一 般 都 在 5nm 左 右, 因 而 其 测 定 的 灵 敏 度, 选 择 性 和 准 确 度 都 比 光 电 比 色 法 高 分 光 度 法 和 比 色 分 析 法 都 是 光 吸 收 方 法, 两 者 的 的 主 要 区 别 是 所 用 的 一 起 的 构 造 和 分 析 的 灵 敏 度 准 确 度 以 及 范 围 所 不 同 ( 一 ) 比 色 分 析 法 的 基 本 原 理 1. 单 色 光 与 互 补 色 光 是 一 种 电 磁 波 波 长 范 围 在 400~760nm 的 光 是 人 的 视 觉 所 能 觉 察 的, 故 称 为 可 见 光 波 长 小 于 400nm 的 光 为 紫 外 光 ; 大 于 760nm 的 光 为 红 外 光 我 们 日 常 所 见 到 的 白 光 是 由 不 同 波 长 (400~700nm) 的 电 磁 波 按 一 定 比 例 组 成 的 混 合 光 当 一 束 白 光 经 棱 镜 分 光 后 为 红 橙 黄 绿 青 蓝 紫 七 种 色 光, 这 种 现 象 称 为 色 散 只 具 有 一 种 波 长, 不 能 再 行 分 解 的 色 光 称 作 单 色 光 所 以 白 光 是 由 各 种 不 同 波 长 的 单 色 光, 按 一 定 比 率 混 合 而 成 的 复 合 光 各 种 颜 色 可 见 光 的 近 似 波 长 列 于 表 1 把 两 种 适 当 颜 色 的 光 按 一 定 的 强 度 比 率 混 合, 可 以 成 为 白 光, 这 两 种 色 光 称 为 互 补 色, 如 图 1 所 示, 图 中 处 于 直 线 关 系 的 两 种 色 光 为 互 补 色, 如 黄 光 和 蓝 光 可 混 合 成 白 光 表 1 可 见 光 的 波 长 颜 色 紫 色 蓝 色 青 蓝 青 青 绿 绿 黄 橙 红
波 长 /nm 400~ 450~ 480~ 490~ 500~ 560~ 580~ 600~ 650~ 450 480 490 500 560 580 600 650 760 2. 溶 液 的 颜 色 与 光 的 选 择 性 吸 收 (1) 物 质 对 光 的 选 择 性 吸 收 物 质 的 颜 色, 主 要 取 决 于 它 对 各 种 色 光 的 吸 收 透 过 反 射 的 程 度 由 于 物 质 的 本 性 和 形 态 不 同, 对 光 的 吸 收 透 过 反 射 的 程 度 也 就 不 同, 物 质 因 而 呈 现 不 同 的 颜 色 对 透 明 物 质 而 言, 例 如 溶 液, 物 质 的 颜 色 主 要 取 决 于 该 物 质 对 光 的 吸 收 程 度 有 色 溶 液 对 光 的 吸 收 具 有 选 择 性, 溶 液 中 有 色 质 点 选 择 性 的 吸 收 某 种 颜 色 的 光, 使 该 溶 液 呈 现 该 被 吸 收 光 的 互 补 色 例 如, 白 光 照 射 时, 蓝 色 的 双 缩 脲 试 剂 溶 液 主 要 吸 收 其 中 的 黄 色 光, 而 白 光 中 的 其 他 色 光 都 能 透 过 在 这 些 透 过 光 中, 除 蓝 色 以 外 的 色 光 都 能 两 两 互 补 成 白 色, 所 以 双 缩 脲 溶 液 就 呈 现 为 蓝 色, 即 黄 色 的 互 补 色 由 此 可 见, 有 色 溶 液 的 颜 色 是 被 吸 收 光 颜 色 的 补 色 吸 收 越 多, 则 补 色 的 颜 色 越 深 比 较 溶 液 颜 色 的 深 度, 实 质 上 就 是 比 较 溶 液 对 它 所 吸 收 光 的 吸 收 程 度 (2) 光 吸 收 曲 线 物 质 对 不 同 波 长 光 的 选 择 性 吸 收, 可 以 用 光 吸 收 曲 线 来 描 述 通 常 测 定 同 一 物 质 吸 收 不 同 波 长 光 线 的 吸 光 度 值, 以 波 长 为 横 坐 标, 吸 光 度 为 纵 坐 标 作 图, 所 得 的 曲 线 为 光 吸 收 曲 线, 或 吸 收 光 谱 核 黄 素 的 吸 收 光 谱 如 图 2 所 示, 由 图 可 见, 核 黄 素 对 不 同 波 长 光 线 吸 收 程 度 不 同, 在 可 见 光 中, 选 择 性 地 对 450nm 吸 收 最 多, 称 为 最 大 吸 收 另 外 在 紫 外 部 分 还 有 两 个 吸 收 峰, 分 别 在 260nm 和 370nm 处 各 种 物 质 的 结 构 性 质 不 同, 对 不 同 波 长 的 光 的 吸 收 程 度 也 不 同, 各 有 其 特 异 的 吸 收 曲 线, 这 使 它 可 以 作 为 物 质 定 性 鉴 定 的 基 础, 例 如, 可 测 定 两 处 波 长 的 吸 光 度 值, 用 其 比 值 来 确 认 是 否 是 某 物 质 对 于 同 一 物 质 来 说, 不 同 浓 度 的 溶 液 的 光 吸 收 曲 线 形 状 相 似, 最 大 吸 收 波 长 不 变, 而 且 在 一 定 波 长 处, 吸 光 度 随 溶 液 的 浓 度 的 增 加 而 增 加, 这 个 特 性 可 以 作 为 物 质 定 量 分 析 的 基 础 3. 朗 伯 - 比 尔 定 律 光 密 度 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 当 一 束 平 行 单 色 光 通 过 溶 液 后, 光 被 溶 液 吸 收 的 程 度 与 溶 液 的 浓 度 以 及 液 层 的 厚 度 有 关 浓 度 越 大, 液 层 越 厚, 则 吸 收 光 约 多, 这 就 是 溶 液 对 光 的 吸 收 规 律, 即 朗 伯 - 比 尔 橙 图 2 黄 红 图 1 白 绿 光 紫 互 补 色 示 意 图 青 蓝 3 0 0 4 0 0 5 0 0 波 长 (n m ) 核 黄 素 的 吸 收 光 谱 青 蓝
定 律 其 数 学 表 示 式 的 表 述 如 下 : 如 图 3 所 示, 假 定 一 束 平 行 单 色 光 通 过 溶 液, 设 入 射 光 的 强 度 为 I 0, 溶 液 的 浓 度 为 C, 液 层 的 厚 度 为 L, 透 射 光 强 度 为 I, 则 lg(i 0 /I)=KCL 式 中 lg(i 0 /I) 的 意 义 是 : 当 I=I 0 时,lg(I 0 /I)=0, 表 示 溶 液 完 全 不 吸 收 光 线 ; 当 I<<I 0 时,lg(I 0 /I) 值 很 大, 表 示 溶 液 对 光 线 吸 收 较 多 ; 当 I 0 时,lg(I 0 /I) 值 无 穷 大, 表 示 光 线 几 乎 被 溶 液 完 全 吸 收, 即 溶 液 不 透 光 T=I/I 0 =10 - KCL 所 以,lg(I 0 /I) 表 示 光 线 透 过 溶 液 时 被 吸 收 的 程 度, 一 般 用 吸 光 度 A(Absorbance) 或 消 光 度 E(Extinction) 来 表 示, 习 惯 上 又 称 为 光 密 度 OD 或 D(Optical density) 因 此, 上 式 又 可 写 为 : A=KCL 或 D=KCL 该 式 的 物 理 意 义 是 : 在 一 定 温 度 下, 一 束 平 行 的 单 色 光 通 过 均 匀 的 非 散 射 溶 液 时, 溶 液 对 光 的 吸 收 程 度 与 溶 液 的 浓 度 及 液 层 厚 度 的 乘 积 成 正 比 式 中 K 为 吸 光 系 数, 在 数 值 上 等 于 C 和 L 均 为 1 时 溶 液 在 特 定 波 长 下 所 具 有 的 吸 光 度 在 一 定 温 度 下, 对 于 同 一 物 质 和 一 定 波 长 的 入 射 光 而 言, 它 是 一 个 常 数 当 C 以 mol L -1 为 单 位 时, 吸 光 系 数 称 为 摩 尔 吸 光 系 数, 用 ε 表 示, 其 单 位 是 L mol -1 cm -1 ; 当 C 以 质 量 体 积 浓 度 (g ml -1 ) 表 示 时, 吸 光 系 数 称 为 百 分 吸 光 系 数, 用 E 1% 1cm 表 示, 单 位 是 ml g -1 cm-1 ε 值 越 大, 表 示 有 色 物 质 对 该 波 长 光 的 吸 收 能 力 越 强, 有 色 物 质 的 颜 色 越 深, 测 定 的 灵 敏 度 也 就 越 高 一 般 ε 值 在 10 3 以 上 即 可 进 行 比 色 分 析 比 色 法 中 常 把 I/I 0 称 为 透 光 率, 用 T 表 示, 透 光 率 和 吸 光 度 的 关 系 如 下 : A=lg(I 0 /I)=lg(1/T)=-lgT 需 要 指 出 的 是, 朗 伯 - 比 尔 定 律 不 仅 适 用 于 可 见 光, 也 适 用 于 红 外 光 和 紫 外 光 ; 不 仅 适 用 于 均 匀 非 散 射 的 液 体, 也 适 用 于 固 体 和 气 体 因 此, 它 是 各 类 吸 光 光 度 法 定 量 的 依 据, 用 途 很 广 I 0 图 3 L C 溶 液 的 光 吸 收 示 意 图 I ( 二 ) 比 色 分 析 的 测 定 方 法 1. 待 测 溶 液 浓 度 的 计 算 方 法 利 用 光 电 比 色 计 或 是 分 光 光 度 计 可 以 测 出 溶 液 的 吸 光 度, 依 据 朗 伯 - 比 尔 定 律, 通 过
测 得 的 溶 液 吸 光 度, 求 出 待 测 溶 液 浓 度 的 常 用 计 算 方 法 有 如 下 几 种 (1) 标 准 曲 线 法 计 算 待 测 溶 液 的 浓 度 先 配 制 一 系 列 浓 度 由 小 到 大 的 标 准 溶 液, 分 别 测 定 标 准 溶 液 的 吸 光 度 在 标 准 溶 液 一 定 浓 度 的 范 围 内, 溶 液 的 浓 度 与 其 吸 光 度 之 间 呈 直 线 关 系 以 各 管 吸 光 度 为 纵 坐 标, 各 管 的 浓 度 为 横 坐 标 作 图, 得 到 一 条 通 过 原 点 的 直 线, 叫 做 标 准 曲 线 在 制 作 标 准 曲 线 时, 至 少 用 五 种 浓 度 递 增 的 标 准 溶 液, 测 出 的 数 据 至 少 要 有 三 个 落 在 直 线 上, 制 作 的 标 准 曲 线 方 可 使 用 标 准 曲 线 可 在 固 定 仪 器 和 方 法 的 条 件 下 多 次 使 用, 适 合 于 经 常 性 工 作 但 若 仪 器 不 同 或 测 定 方 法 及 条 件 改 变, 测 得 的 标 准 曲 线 不 同 因 此 在 更 换 任 何 测 定 条 件 时 都 需 重 新 绘 制 标 准 曲 线 测 定 待 测 溶 液 时, 操 作 条 件 应 与 测 定 标 准 溶 液 时 相 同 测 出 吸 光 度 后, 从 标 准 曲 线 上 直 接 查 出 待 测 溶 液 的 浓 度 如 图 4 所 示 浓 度 (2) 标 准 管 法 计 算 待 测 溶 液 的 同 样 条 件 下, 同 时 测 得 标 准 液 和 待 测 液 的 吸 光 度, 通 过 比 较 标 准 和 待 测 溶 液 的 吸 光 度, 推 出 待 测 溶 液 浓 度 的 方 法 推 导 过 程 如 下 : 根 据 朗 伯 - 比 尔 定 律 可 知 标 准 溶 液 :As=KsCsLs 待 测 溶 液 :Au=KuCuLu 两 种 溶 液 的 液 层 厚 度 相 同, 所 以 Lu=Ls; 而 且 是 同 一 物 质 的 两 种 不 同 浓 度, 测 定 时 所 用 单 色 光 相 同, 测 定 温 度 也 相 同, 所 以 Ku=Ks 两 式 相 比 得 到 :Au/As=Cu/Cs, 即 Cu=Cs Au/As 上 式 中 Au,As 可 由 光 电 比 色 计 或 分 光 光 度 计 测 出,Cs 为 已 知, 则 待 测 溶 液 的 浓 度 Cu 即 可 以 求 出 (3) 标 准 系 数 法 计 算 待 测 溶 液 的 浓 度 此 法 比 上 述 两 法 简 便, 将 多 次 测 定 标 准 溶 液 的 吸 光 度 计 算 出 平 均 值, 按 下 式 求 出 标 准 系 数 : 标 准 系 数 = 标 准 液 浓 度 / 标 准 液 平 均 吸 光 度 将 用 同 样 方 法 测 出 待 测 溶 液 的 吸 光 度 带 入 下 式 得 到 待 测 液 浓 度 : 待 测 液 浓 度 = 待 测 溶 液 吸 光 度 标 准 系 数 (4) 消 光 系 数 法 计 算 待 测 溶 液 的 浓 度 计 算 公 式 为 : 图 4 标 准 曲 线 ( 浓 度 - 吸 光 度 曲 线 ) C=D/ 在 同 样 条 件 下 测 得 待 测 溶 液 的 吸 光 度, 可 用 上 式 计 算 出 其 浓 度 此 公 式 常 用 于 紫 外 吸 收 法, 如 对 蛋 白 质 溶 液 浓 度 的 测 定, 不 需 显 色, 方 法 简 便 由 于 蛋 白 质 在 波 长 280nm 处 有 最 大 吸 收 峰, 利 用 已 知 蛋 白 质 在 波 长 280nm 处 的 克 分 子 消 光
系 数, 再 读 取 待 测 液 蛋 白 质 的 吸 光 度, 即 可 算 出 蛋 白 质 的 浓 度 2. 比 色 分 析 条 件 的 选 择 (1) 波 长 的 选 择 波 长 的 选 择 对 比 色 分 析 的 灵 敏 度, 准 确 度 有 很 大 的 影 响 选 择 波 长 的 原 则 是 : 吸 收 最 大, 干 扰 最 小 因 为 吸 光 度 越 大, 测 定 灵 敏 度 越 高, 准 确 度 也 容 易 提 高 ; 干 扰 越 小, 选 择 性 越 好, 测 定 准 确 度 越 高 如 图 5 所 示, 有 A 和 B 两 种 物 质 存 在,A 物 质 最 大 吸 收 波 长 在 a 处, 但 在 同 样 波 长 下 B 物 质 也 有 吸 收, 对 测 定 有 干 扰, 因 此 选 用 b 处 波 长 比 较 合 适, 此 时 灵 敏 度 虽 有 所 降 低, 但 清 除 了 B 物 质 的 干 扰, 提 高 了 准 确 度 (2) 吸 光 度 的 选 择 溶 液 的 吸 光 度 太 大 或 太 小, 都 会 影 响 测 量 的 准 确 度 在 光 电 比 色 计 或 分 光 光 度 计 的 读 数 盘 上 附 有 相 互 对 应 的 两 种 标 尺 : 一 种 是 等 距 离 标 尺, 为 透 光 率 T, 单 位 为 %, 范 围 是 0 100; 另 一 种 是 不 等 距 离 标 尺, 为 吸 光 度 A, 范 围 是 0 如 图 6 所 示, 在 吸 光 度 较 小 的 一 端,A 值 的 读 数 只 能 准 确 至 1~2 位 有 效 数 字 ; 在 吸 光 度 较 大 的 一 端, 由 于 刻 度 密 集, 读 数 也 只 能 精 确 至 1~2 位 有 效 数 字 ; 而 在 标 尺 中 部, 读 数 可 精 确 至 图 5 物 质 A 和 B 的 吸 收 曲 线 2~3 位 有 效 数 字 因 此, 吸 光 度 在 检 流 计 标 尺 中 部 读 数, 测 定 精 度 较 高, 即 测 量 时 要 求 A 值 范 围 在 0.05~1.0 根 据 A=KCL 关 系 式 可 以 看 出, 调 节 溶 液 浓 度 或 改 变 比 色 杯 厚 度, 都 可 以 改 变 吸 光 度 一 般 采 用 改 变 溶 液 浓 度 的 方 法, 控 制 吸 光 度 在 0.05~1.0 的 范 围 内 (3) 显 色 条 件 与 参 比 溶 液 图 6 吸 光 度 和 透 光 率 的 关 系 待 测 的 无 色 的 溶 液, 往 往 需 要 通 过 显 色 反 应, 生 成 有 色 产 物, 再 进 行 比 色 分 析 首 先, 应 该 选 择 合 适 的 显 色 剂, 使 显 色 反 应 灵 敏 度 高, 选 择 性 好, 产 物 化 学 性 质 稳 定 ; 其 次, 必 须 控 制 显 色 条 件, 包 括 显 色 剂 的 用 量, 溶 液 的 ph 值, 温 度, 反 应 时 间, 杂 质 的 干 扰, 因 为 这 些 因 素 的 变 化 可 以 引 起 能 够 引 起 颜 色 深 度 的 变 化, 从 而 影 响 比 色 测 定 的 准 确 度 此 外, 比 色 分 析 中, 需 要 利 用 空 白 溶 液 调 节 仪 器 的 透 光 率 为 100%, 此 时 的 吸 光 度 为 零 所 谓 空 白 溶 液 是 指, 仅 仅 不 含 待 测 物 质, 而 其 他 溶 剂, 反 应 试 剂, 显 色 条 件, 比 色 条 件 与 被 测 溶 液 完 全 相 同 的 溶 液 利 用 空 白 溶 液, 可 以 消 除 显 色 反 应 中 其 他 有 色 物 质 的 干 扰, 以 及 溶 剂 和 比 色 杯 对 入 射 光 的 影 响 3. 比 色 计 或 分 光 光 度 计 的 工 作 原 理 比 色 计 或 分 光 光 度 计 一 般 包 括 五 大 部 件 ( 图 7)
光 源 单 色 光 器 狭 缝 吸 收 杯 检 测 器 系 统 图 7 分 光 光 度 计 的 基 本 结 构 示 意 图 (1) 光 源 在 光 电 比 色 计 和 可 见 光 分 光 光 度 计 中, 采 用 6~12V 的 钨 灯, 其 最 适 宜 的 波 长 范 围 是 360~1000nm, 为 使 光 的 强 度 稳 定, 须 用 稳 压 装 置 来 稳 定 电 压 紫 外 分 光 光 度 计 中, 采 用 氢 弧 灯, 适 宜 波 长 范 围 是 200~320nm (2) 波 长 控 制 器 在 光 电 比 色 计 中 采 用 滤 光 片 作 为 波 长 控 制 器 滤 光 片 是 有 色 玻 璃 片, 其 作 用 是 从 光 源 发 出 的 连 续 光 谱 中 分 出 实 验 所 需 的 某 一 特 定 波 长 范 围 的 光, 即 获 得 适 当 波 长 的 近 似 单 色 光 选 择 滤 光 片 的 原 则 是 滤 光 片 最 易 透 过 的 光, 也 就 是 溶 液 最 易 吸 收 的 光 即 滤 光 片 的 颜 色 与 溶 液 的 颜 色 应 互 为 补 色, 这 是 因 为 有 色 溶 液 对 它 的 互 补 色 光 有 最 大 的 吸 收 分 光 光 度 计 采 用 单 色 器 来 控 制 波 长 它 可 以 把 连 续 波 长 的 光 分 解, 从 中 得 出 任 一 所 需 波 长 的 更 纯 的 单 色 光 单 色 器 包 含 有 狭 缝 调 节 透 镜 系 统 以 及 色 散 元 件 紫 外 分 光 光 度 计 中, 光 学 系 统 中 的 透 镜 棱 镜 由 石 英 制 成, 对 紫 外 光 吸 收 很 少 (3) 吸 收 池 吸 收 池 供 比 色 时 盛 溶 液 用, 它 是 用 无 色 透 明 厚 度 均 匀 的 玻 璃 制 成 的 其 透 光 的 两 面 严 格 平 行 同 一 系 列 的 测 定 中, 所 用 的 比 色 皿 必 须 配 套, 即 同 一 配 套 比 色 皿 盛 有 同 一 溶 液 在 同 一 波 长 时 测 得 的 透 光 率 误 差 不 得 越 过 0.5% 实 验 时 可 根 据 溶 液 的 浓 度 不 同 选 择 0.5 1.0 2.0 3.0cm 不 同 规 格 的 比 色 皿 比 色 皿 要 保 持 清 洁, 透 光 面 要 注 意 保 护, 不 得 用 手 直 接 接 触 或 用 粗 糙 的 滤 纸 擦 拭, 以 免 划 伤 表 面, 影 响 吸 收 程 度 若 外 壁 有 液 珠, 应 用 滤 纸 吸 干 后 再 用 擦 镜 纸 擦 净 紫 外 分 光 光 度 计 的 比 色 皿 为 石 英 比 色 皿, 以 减 少 对 紫 外 光 的 吸 收 (4) 光 电 转 换 器 它 是 将 光 能 转 换 成 电 信 号 的 器 件, 常 用 的 有 光 电 池 和 光 电 管 光 电 池, 常 用 硒 光 电 池, 适 用 于 380~750nm 波 长 范 围 当 光 线 照 射 到 光 电 池 时, 电 子 从 半 导 体 表 面 逸 出 由 于 硒 的 半 导 体 特 性 而 在 电 路 中 产 生 光 电 流 将 光 电 池 与 一 个 灵 敏 检 流 计 相 联, 在 照 射 光 强 度 不 太 大 且 外 电 路 电 阴 很 小 时, 光 电 流 大 小 与 照 射 光 的 强 度 成 正 比 因 此 可 根 据 光 电 流 的 大 小 测 量 透 过 溶 液 的 光 强 度 硒 光 电 池 的 优 点 是 光 电 流 较 大, 可 不 必 经 过 放 大 而 直 接 用 灵 敏 检 流 计 测 量 有 时 当 光 电 池 受 强 光 照 射 或 连 续 使 用 时 间 太 长 时, 容 易 产 生 疲 劳, 这 时 需 使 其 在 暗 的 状 态 下 暂 作 恢 复, 方 可 继 续 使 用 光 电 管, 由 封 装 在 真 空 透 明 管 中 的 一 个 半 圆 柱 型 阴 极 和 一 个 丝 状 阳 极 组 成 阴 极 凹 面 有 光 电 发 射 材 料 层, 被 光 照 射 可 发 电 子 当 两 极 间 加 有 电 压 时, 发 射 出 来 的 电 子 就 流
向 阳 极 产 生 光 电 流 发 射 出 的 电 子 数 目 与 射 在 该 表 面 上 光 束 的 强 度 成 正 比 光 电 管 产 生 的 电 流 较 弱, 经 放 大 器 放 大 后 可 由 微 安 电 表 直 接 指 示 出 吸 光 度 或 透 光 率 (5) 检 流 计 用 光 电 池 作 光 电 转 换 器 的 比 色 测 量 仪 器 中, 检 流 计 一 般 采 用 悬 镜 式 光 电 反 射 检 流 计, 其 灵 敏 度 较 高 检 流 计 有 吸 光 度 A 和 百 分 透 光 率 T(%) 两 种 刻 度 标 尺, 可 直 接 读 数 标 尺 上 透 光 率 T 是 等 分 的 而 吸 光 度 A 的 刻 度 是 不 均 匀 的 透 光 率 T 可 用 小 数 或 百 分 率 表 示 对 于 用 光 电 管 作 光 电 转 换 器 的 仪 器, 由 于 加 了 放 大 器, 可 方 便 地 连 接 微 安 电 表 记 录 仪, 数 字 显 示 器 等 指 示 器, 也 可 以 调 节 电 桥 平 衡 的 方 式 读 数 取 数 据 ( 三 ) 常 用 分 光 光 度 计 的 使 用 目 前 实 验 室 常 用 的 分 光 光 度 计 主 要 是 721 型 722 型 和 751 型 分 光 光 度 计 721 和 722 型 为 可 见 光 分 光 光 度 计, 波 长 范 围 在 360~800nm 这 两 型 的 工 作 原 理 基 本 结 果 部 件 性 能 操 作 程 序 等 均 大 致 相 同 其 主 要 区 别 有 两 点 : 一 是 721 型 的 光 学 系 统 中 是 通 过 一 个 色 散 棱 镜 而 获 得 单 色 光, 而 722 型 的 色 散 元 件 是 一 个 光 栅 ; 二 是 721 型 的 读 数 是 根 据 指 针 在 刻 度 表 上 的 位 置 而 得 到 的, 在 一 定 程 度 上 存 在 读 数 误 差, 而 722 型 的 读 数 盘 是 直 接 显 示, 所 以 其 结 果 读 数 更 方 便 更 准 确 751 型 的 波 长 范 围 在 200~1000nm, 可 测 定 各 种 物 质 在 紫 外 可 见 光 及 近 红 外 区 的 吸 收 光 谱 下 面 主 要 介 绍 722S 型 和 751 型 分 光 光 度 计 的 操 作 程 序 及 注 意 事 项 1.72 722S 2S 型 分 光 光 度 计 的 一 般 操 作 程 序 (1) 开 机 预 热 15 分 钟 以 上 (2) 转 动 波 长 选 择 钮, 选 用 所 需 的 波 长 (3) 将 装 有 空 白 标 准 样 品 的 比 色 杯 放 入 比 色 杯 架, 使 空 白 管 对 准 光 路 (4) 打 开 样 品 室 暗 箱 盖 ( 光 门 自 动 关 闭 ), 按 0%ADJ 键, 即 能 自 动 进 行 机 械 零 点 的 调 整, 数 码 显 示 为 0.000 (5) 盖 好 比 色 杯 暗 箱 盖 ( 光 门 自 动 开 启 ), 按 100%ADJ 键, 即 能 自 动 进 行 空 白 零 点 的 调 整, 数 码 显 示 为 100.0( 一 次 如 有 误 差 可 再 按 一 次 ) (6) 按 MODE 键 选 择 吸 光 度 测 定 模 式 (ABS 灯 亮 ), 数 码 显 示 自 动 转 换 为 吸 光 度 值 0.000 度 (7) 拉 动 比 色 杯 架 的 拉 杆, 使 测 定 杯 进 入 光 路, 从 数 码 显 示 上 即 可 读 出 样 品 的 吸 光 (8) 比 色 完 毕 后, 关 上 电 源 形 状, 取 出 比 色 杯, 将 比 色 杯 暗 箱 盖 好, 清 洗 比 色 杯 并 晾 干 2.751 型 分 光 光 度 计 的 一 般 操 作 程 序 (1) 在 电 源 电 压 与 仪 器 要 求 相 符 时, 接 通 电 源 (2) 选 择 相 应 波 长 的 光 源 灯, 钨 丝 灯 波 长 范 围 是 320~1000nm, 氢 弧 灯 波 长 范 围 是 320nm 以 下 拨 动 电 源 灯 座 把 手, 将 选 用 的 光 源 灯 置 入 光 路 中 根 据 需 要 可 以 在 光 路 中 插 入 滤 光 板, 以 减 少 杂 散 光, 一 般 情 况 下 无 此 必 要
(3) 检 查 仪 器 各 种 开 关 和 旋 钮 处 于 关 闭 位 置 时, 打 开 电 源 开 关, 预 热 20 分 钟 左 右 (4) 选 择 适 当 的 比 色 杯, 测 定 波 长 在 350nm 以 上 用 玻 璃 比 色 杯 ; 若 在 350nm 以 下, 用 石 英 比 色 杯 比 色 杯 盛 入 溶 液 后, 放 在 比 色 杯 架 上, 然 后 再 放 入 暗 箱 内, 盖 好 盖 板 此 时 盛 空 白 溶 液 的 比 色 杯 恰 好 处 于 光 路 中 (5) 选 择 适 当 的 光 电 管, 测 定 波 长 范 围 在 200~650nm 内, 用 紫 敏 光 电 管, 应 将 手 柄 推 入 ; 若 在 650~1000nm 范 围 内, 用 红 敏 光 电 管, 应 将 手 柄 拉 出 (6) 将 选 择 开 关 扳 到 校 正 处, 转 动 选 择 波 长 的 旋 钮, 使 波 长 刻 度 对 准 所 需 的 波 长 (7) 调 节 暗 电 流 旋 钮, 使 电 表 指 针 对 准 0 位 置 为 了 得 到 较 高 准 确 度, 每 测 定 一 次 都 应 校 正 暗 电 流 一 次 (8) 调 节 灵 敏 度 旋 钮, 在 正 常 情 况 下, 从 左 面 停 止 位 置 顺 时 针 方 向 旋 转 3~5 圈 (9) 转 动 读 数 电 位 器 旋 钮, 使 刻 度 盘 处 于 透 光 率 100% 位 置 打 开 选 择 开 关 到 1, 拉 开 暗 电 流 闸 门, 使 单 色 光 进 入 光 电 管 (10) 调 节 狭 缝 旋 钮, 使 电 表 指 针 处 于 0 位 置 附 近, 而 后 用 灵 敏 度 旋 钮 细 调, 使 指 针 准 确 的 指 在 0 位 (11) 轻 轻 拉 动 比 色 杯 架 拉 杆, 使 第 一 待 测 溶 液 处 于 光 路 中, 这 时 电 表 指 针 偏 离 0 位 再 转 动 读 数 电 位 器 旋 钮, 重 新 使 电 表 指 针 对 准 0 位, 刻 度 盘 上 的 读 数 即 为 该 待 测 溶 液 的 吸 光 度 接 着 拉 动 拉 杆 使 第 二 第 三 个 比 色 杯 对 准 光 路, 按 相 同 方 法 读 取 吸 光 度 值 (12) 完 成 一 次 测 量 后, 立 即 关 上 暗 电 流 闸 门, 以 保 护 光 电 管 (13) 在 读 数 时, 若 选 择 开 关 处 于 1 的 位 置, 吸 光 度 范 围 从 0, 透 光 率 从 0 100% 当 透 光 率 小 于 10%, 可 选 用 0.1 的 选 择 开 关, 使 获 得 较 精 确 的 数 值, 此 时 读 出 的 透 光 率 数 值 要 除 以 10, 而 相 应 的 吸 光 度 数 值 应 加 上 1.0 (14) 测 定 完 毕, 将 每 个 开 关 旋 钮 操 作 手 柄 等 复 原 或 关 闭 取 出 比 色 杯 洗 净, 自 然 干 燥 3. 操 作 分 光 光 度 计 的 注 意 事 项 (1) 分 光 光 度 计 为 贵 重 的 精 密 仪 器, 要 做 好 防 震 防 潮 防 光 和 防 腐 蚀 的 保 护 工 作 防 震 : 仪 器 应 放 在 固 定 的 平 稳 台 上, 不 要 随 意 搬 动, 使 用 时 要 轻 转 旋 钮, 不 可 用 力 过 猛 损 坏 机 件 ; 防 潮 : 光 电 池 受 潮 后, 灵 敏 度 下 降, 甚 至 失 效, 所 以 光 电 池 附 近 应 放 置 硅 胶, 仪 器 应 放 在 干 燥 的 地 方 ; 防 光 : 光 电 池 平 时 不 应 受 光 照 射, 使 用 时 应 防 止 强 光 照 射, 防 止 长 时 间 连 续 照 射 ; 防 腐 蚀 : 使 用 时 应 防 止 酸 碱 等 物 质 侵 入 机 件 内 部, 盛 装 待 测 液 时, 可 达 到 比 色 杯 高 度 的 3/4 左 右, 不 宜 过 多, 防 止 溶 液 流 出 杯 外, 移 动 比 色 杯 拉 杆 时 要 轻 轻 的 拉 动, 以 防 溶 液 溅 出, 腐 蚀 机 件 (2) 不 可 用 手, 滤 纸 和 毛 刷 等 物 摩 擦 比 色 杯 的 光 滑 面, 用 手 可 拿 比 色 杯 的 磨 面 比 色 杯 用 完 后 立 即 用 蒸 馏 水 洗 净, 干 燥 每 台 分 光 光 度 计 有 四 个 比 色 杯 专 用, 不 可 与 其 他 分 光 光 度 计 的 比 色 杯 互 换 三 电 泳 技 术
带 电 质 点 在 电 场 中 向 与 自 身 电 荷 相 反 的 电 极 移 动 的 现 象 称 为 电 泳 (electrophoresis) 蛋 白 质 分 子 为 两 性 电 解 质, 在 不 同 ph 溶 液 中 带 不 同 电 荷, 在 直 流 电 场 中 能 够 泳 动, 这 就 是 蛋 白 质 的 电 泳 现 象 1809 年 俄 国 物 理 学 家 Reǔss(PeЙce) 首 次 发 现 了 电 泳 现 象 他 将 两 根 玻 璃 管 插 入 粘 土 中, 容 器 灌 满 水, 管 底 放 一 层 砂 粒, 然 后 在 玻 璃 管 中 分 别 插 入 一 根 电 极, 并 与 银 - 锌 伏 打 电 池 相 连 当 电 路 接 通 后, 带 负 电 荷 的 粘 土 颗 粒 向 正 极 移 动, 通 过 砂 粒 层 进 入 水 中, 致 使 正 极 管 中 水 逐 渐 混 浊, 负 极 管 中 的 水 仍 是 澄 清 的, 但 体 积 增 加 了 后 来 有 关 电 泳 现 象 的 一 些 数 学 和 物 理 问 题 先 后 得 到 阐 明 1892~1897 年,Picton 和 Linder 首 次 证 明 血 红 蛋 白 等 胶 体 颗 粒 具 有 两 性 解 离 性 质 (amphoteric nature) 接 着,Field 和 Teague 用 琼 脂 作 为 支 持 介 质, 进 行 了 白 喉 毒 素 和 白 喉 抗 毒 素 的 电 泳 研 究 1937 年, 瑞 典 化 学 家 Tiselius 创 造 了 Tiselius 电 泳 仪, 并 建 立 了 研 究 蛋 白 质 的 移 动 界 面 电 泳 方 法, 并 利 用 该 方 法 首 次 成 功 地 将 血 清 蛋 白 质 分 成 几 个 组 分 ( 清 蛋 白 及 α β γ 球 蛋 白 ), 并 因 此 而 于 1948 年 获 得 诺 贝 尔 奖 如 今 各 种 类 型 的 电 泳 技 术, 发 展 十 分 迅 速, 已 广 泛 用 于 生 物 化 学 分 子 生 物 学 医 学 药 学 食 品 农 业 卫 生 及 环 保 等 学 科 中, 成 为 物 质 研 究 种 类 鉴 定 分 离 纯 化 及 纯 度 分 析 等 方 面 极 其 有 效 的 研 究 方 法 电 泳 方 法 很 多, 按 电 泳 的 各 种 原 理 和 性 质 可 将 电 泳 分 为 如 下 三 大 类 : 1. 自 由 电 泳 (free electrophoresis moving boundary electrophoresis) 指 以 溶 液 为 介 质 进 行 的 没 有 固 体 支 持 介 质 的 电 泳, 也 称 移 动 界 面 电 泳 (moving boundary electrophoresis) 2. 区 带 电 泳 (zone electrophoresis) 是 指 有 固 体 支 持 介 质 的 电 泳, 即 在 电 场 作 用 下, 在 某 一 固 体 支 持 介 质 上, 将 一 种 混 合 物 分 离 成 若 干 条 区 带 的 电 泳 过 程 按 支 持 介 质 的 不 同 或 形 状 电 压 及 用 途 的 不 同 还 可 再 被 分 为 五 类 ( 表 2) 区 带 电 泳 由 于 设 备 简 单 样 品 用 量 少 和 耗 时 少 等 优 点 而 成 为 用 途 最 广 泛 的 蛋 白 质 电 泳 分 离 方 法 3. 稳 态 电 泳 (steady state electrophoresis) 也 称 置 换 ( 排 代 ) 电 泳 (displacement electrophoresis), 该 电 泳 特 点 是, 分 子 颗 粒 的 迁 移 在 一 定 的 时 间 内 即 可 达 到 稳 态, 达 到 稳 态 后, 带 的 宽 度 不 随 时 间 而 改 变, 优 点 是 分 辨 率 高, 包 括 等 电 聚 焦 和 等 电 泳 速 电 泳 ( 一 ) 基 本 原 理 在 两 个 平 行 电 极 上 加 一 定 的 电 压 (V), 就 会 在 两 电 极 中 间 产 生 电 场 强 度 (E),L 是 电 极 间 距 离 E=V/L 1 在 溶 液 中, 电 场 对 带 电 分 子 的 作 用 力 (F), 等 于 所 带 净 电 荷 与 电 场 强 度 的 乘 积 : F=QE 2 表 2 区 带 电 泳 的 种 类 分 类 依 据 类 型 支 持 介 质 纸 电 泳 (paper electrophoresis, PE)
醋 酸 纤 维 素 电 泳 (cellulose acetate electrophoresis, CAE) 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 (agar gel electrophoresis, AGE) 淀 粉 凝 胶 电 泳 ( starch gel electrophoresis, SGE) 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 (polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) 薄 层 电 泳 (thin layer electrophoresis,tle) 支 持 介 质 形 状 平 板 电 泳 ( block electrophoresis, BE) 柱 电 泳 (column electrophoresis, CE) 电 压 分 离 区 带 形 状 低 压 电 泳 ( low voltage electrophoresis, LVE) 高 压 电 泳 ( high voltage electrophoresis, HVE) 盘 状 电 泳 ( disk electrophoresis, DE) 火 箭 电 泳 (rocket electrophoresis, RE) 分 析 电 泳 (analytical electrophoresis, AE) 用 途 制 备 电 泳 (preparative electrophoresis, PE) 定 量 免 疫 电 泳 (quantitative immunoelectrophoresis, QIE) 上 式 中 Q 是 带 电 分 子 的 净 电 荷,E 是 电 场 强 度 这 个 作 用 力 使 得 带 电 分 子 向 其 电 荷 相 反 的 电 极 方 向 移 动 如 果 是 在 真 空 里, 带 电 质 点 的 移 动 会 很 快, 最 后 撞 到 电 极 上 但 是 在 溶 液 中 的 移 动, 分 子 会 受 到 介 质 粘 滞 力 的 阻 碍 粘 滞 力 (F ) 的 大 小 与 分 子 大 小 形 状 电 泳 介 质 孔 径 大 小 以 及 缓 冲 液 粘 度 等 有 关, 并 与 带 电 分 子 的 移 动 速 度 成 正 比, 对 于 球 状 分 子,F 的 大 小 服 从 Stokes 定 律, 即 : F =6πrηv 3 式 中 F 是 对 球 形 分 子 的 阻 力,r 是 球 形 分 子 的 半 径,η 是 溶 液 粘 度,υ 是 电 泳 速 度 当 带 电 分 子 匀 速 移 动 时 :F=F, QE=6πrηv 4 因 此 电 泳 速 度 v=eq/6πrη 5 电 泳 迁 移 率 M(mobility) 是 指 在 单 位 电 场 强 度 时 带 电 分 子 的 迁 移 速 度 : M=v/E=Q/6πrη 6 这 就 是 迁 移 率 公 式, 由 上 式 可 以 看 出, 迁 移 率 与 带 电 分 子 所 带 净 电 荷 成 正 比, 与 分 子 的 大 小 和 缓 冲 液 的 粘 度 成 反 比 为 便 于 对 各 种 分 子 进 行 比 较, 带 电 质 点 在 电 场 中 的 移 动 速 度 常 用 迁 移 率 M 来 表 示, 在 一 定 的 条 件 下, 对 于 一 定 的 分 子,M 是 一 定 的 因 此 它 是 描 述 物 质 在 电 泳 中 行 为 的 特
征 参 数 两 种 类 似 的 物 质 在 具 体 电 泳 时 能 否 分 开, 视 二 者 迁 移 率 的 差 别 迁 移 率 相 近 则 不 易 分 开 ; 迁 移 率 差 别 大, 则 单 位 时 间 内 的 分 离 距 离 也 大 在 电 泳 过 程 中, 带 电 质 点 的 移 动 速 度 v 为 单 位 时 间 t( 通 常 以 秒 计 ) 内 移 动 的 距 离 d ( 以 厘 米 计 ), 即 v=d/t; 同 时, 电 场 强 度 E 为 单 位 距 离 l( 以 厘 米 计 ) 内 的 电 位 差 v( 以 伏 特 计 ), 即 E=v/l, 以 此 代 入 迁 移 率 公 式 6, 则 : M=v/E=dl/vt 可 见, 带 电 质 点 在 电 泳 时 的 移 动 距 离 不 仅 与 该 物 质 迁 移 率 有 关, 还 与 实 验 时 的 条 件 如 电 压 电 泳 时 间 及 电 场 距 离 密 切 相 关, 因 此, 除 了 带 电 质 点 本 身 的 结 构 性 质, 即 质 点 所 带 净 电 荷 的 量 质 点 的 大 小 和 质 点 的 形 状 外, 还 有 许 多 外 界 因 素 可 以 影 响 物 质 电 泳 的 移 动 速 度 与 移 动 距 离 主 要 影 响 因 素 有 以 下 几 方 面 : 1. 电 场 强 度 (electric field intensity) 电 场 强 度 (v/l) 是 每 厘 米 的 电 位 降, 也 称 电 位 梯 度 电 场 强 度 对 泳 动 速 度 起 着 决 定 性 的 作 用, 这 是 因 为 推 动 带 电 质 点 运 动 的 电 场 力 取 决 于 电 场 强 度 电 场 强 度 越 大, 电 泳 速 度 越 快 但 增 大 电 场 强 度 会 引 起 通 过 介 质 的 电 流 强 度 增 大, 而 造 成 电 泳 过 程 产 生 的 热 量 增 大 电 流 在 介 质 中 所 做 的 功 (W) 为 : W=I 2 Rt 上 式 中 :I 为 电 流 强 度,R 为 电 阻,t 为 电 泳 时 间 电 流 所 作 的 功 绝 大 部 分 都 转 换 为 热, 因 而 引 起 介 质 温 度 升 高, 这 会 造 成 很 多 影 响 : 1 样 品 和 缓 冲 离 子 扩 散 速 度 增 加, 引 起 样 品 分 离 带 的 加 宽 ;2 产 生 对 流, 引 起 待 分 离 物 的 混 合 ;3 如 果 样 品 对 热 敏 感, 会 引 起 蛋 白 变 性 ;4 引 起 介 质 粘 度 降 低 电 阻 下 降 等 等 电 泳 中 产 生 的 热 通 常 是 由 中 心 向 外 周 散 发 的, 所 以 介 质 中 心 温 度 一 般 要 高 于 外 周, 尤 其 是 管 状 电 泳, 由 此 引 起 中 央 部 分 介 质 相 对 于 外 周 部 分 粘 度 下 降, 摩 擦 系 数 减 小, 电 泳 迁 移 速 度 增 大, 由 于 中 央 部 分 的 电 泳 速 度 比 边 缘 快, 所 以 电 泳 分 离 带 通 常 呈 弓 型 降 低 电 流 强 度, 可 以 减 小 生 热, 但 会 延 长 电 泳 时 间, 引 起 待 分 离 生 物 大 分 子 扩 散 的 增 加 而 影 响 分 离 效 果 所 以 电 泳 实 验 中 要 选 择 适 当 的 电 场 强 度, 同 时 可 以 适 当 冷 却 降 低 温 度 以 获 得 较 好 的 分 离 效 果 2. 影 响 带 电 质 点 电 荷 量 的 外 界 因 素 带 电 质 点 所 带 净 电 荷 的 量 是 决 定 其 电 泳 速 度 的 另 一 因 素, 它 除 和 质 点 本 身 的 结 构 性 质 有 关 外, 还 受 质 点 周 围 介 质 的 影 响, 其 中 最 重 要 的 是 介 质 的 ph 和 离 子 强 度 : (1) 介 质 的 ph 值 缓 冲 液 的 ph 值 会 影 响 待 分 离 生 物 大 分 子 的 解 离 程 度, 从 而 对 其 带 电 性 质 产 生 影 响, 溶 液 ph 值 距 离 其 等 电 点 愈 远, 其 所 带 净 电 荷 量 就 越 大, 电 泳 的 速 度 也 就 越 大, 尤 其 对 于 蛋 白 质 等 两 性 分 子, 缓 冲 液 ph 还 会 影 响 到 其 电 泳 方 向, 当 缓 冲 液 ph 大 于 蛋 白 质 分 子 的 等 电 点, 蛋 白 质 分 子 带 负 电 荷, 其 电 泳 的 方 向 是 指 向 正 极 因 此, 当 分 离 某 一 为 了 蛋 白 质 混 合 物 时, 应 选 择 一 个 合 适 的 ph, 使 各 种 蛋 白 质 所 带 电 荷 差 异 较 大, 以 利 于 分 离 为 保 持 电 泳 过 程 中 待 分 离 生 物 大 分 子 的 电 荷 以 及 缓 冲 液 ph 值 的 稳 定 性, 必 须 采 用 缓 冲 液 (2) 缓 冲 液 的 离 子 强 度 带 电 质 点 的 电 荷 量 不 仅 受 溶 液 ph 的 影 响, 也 受 到 溶 液 中 各 种 离 子 的 浓 度 和 电 荷 数 ( 即 离 子 的 价 数 ) 的 影 响, 这 种 影 响 通 常 用 离 子 强 度 表 示 离 子 强 度 代 表 所 有 类 型 的 7
离 子 所 产 生 的 静 电 力, 也 就 是 全 部 的 离 子 效 应, 它 取 决 于 离 子 电 荷 的 总 数, 而 与 溶 液 中 盐 类 的 性 质 无 关 为 保 持 电 泳 过 程 中 缓 冲 液 ph 值 的 稳 定 性, 通 常 要 保 持 一 定 的 离 子 强 度, 一 般 在 0.02-0.2, 离 子 强 度 过 低, 则 缓 冲 能 力 差, 但 如 果 离 子 强 度 过 高, 会 在 待 分 离 分 子 周 围 形 成 较 强 的 带 相 反 电 荷 的 离 子 扩 散 层, 由 于 离 子 扩 散 层 与 待 分 离 分 子 的 移 动 方 向 相 反, 它 们 之 间 产 生 了 静 电 引 力, 因 而 引 起 电 泳 速 度 降 低 另 外 缓 冲 液 的 粘 度 也 会 对 电 泳 速 度 产 生 影 响 溶 液 的 离 子 强 度 可 按 下 式 计 算 : 设 溶 液 中 各 种 离 子 的 浓 度 为 C 1 C 2, 离 子 的 价 数 的 Z 1 Z 2, 则 : 离 子 强 度 I=1/2(C 1 Z 12 +C 2 Z 22 + +C n Z n2 ) 或 I=1/2 C i Z i 2 3. 电 泳 支 持 物 对 迁 移 率 的 影 响 区 带 电 泳 虽 然 使 用 了 比 较 惰 性 的 材 料 作 为 支 持 物, 但 它 的 结 构 性 质 仍 对 迁 移 率 有 很 大 影 响, 主 要 表 现 在 下 列 三 个 方 面 : (1) 吸 附 作 用 (adsorption): 象 吸 附 层 析 一 样, 有 的 支 持 物 对 样 品 有 滞 留 作 用, 因 而 造 成 脱 尾 现 象, 不 能 形 成 一 条 很 清 晰 的 带, 因 而 降 低 分 辨 力 吸 附 作 用 还 能 降 低 总 的 迁 移 率 纸 的 吸 附 作 用 最 大, 但 是 如 果 使 用 醋 酸 纤 维 膜, 则 可 消 除 这 种 现 象 (2) 电 渗 作 用 (electroendosmosis): 在 电 场 中, 液 体 对 于 固 体 支 持 介 质 的 相 对 移 动, 称 为 电 渗 现 象 由 于 支 持 介 质 表 面 可 能 会 存 在 一 些 带 电 基 团, 如 滤 纸 表 面 通 常 有 一 些 羧 基, 琼 脂 可 能 会 含 有 一 些 硫 酸 基, 而 玻 璃 表 面 通 常 有 Si-OH 基 团 等 等 这 些 基 团 电 离 后 会 使 支 持 介 质 表 面 带 电, 吸 附 一 些 带 相 反 电 荷 的 离 子, 在 电 场 的 作 用 下 向 电 极 方 向 移 动, 形 成 介 质 表 面 溶 液 的 流 动, 这 种 现 象 就 是 电 渗 在 ph 值 高 于 3 时, 玻 璃 表 面 带 负 电, 吸 附 溶 液 中 的 正 电 离 子, 引 起 玻 璃 表 面 附 近 溶 液 层 带 正 电, 在 电 场 的 作 用 下, 向 负 极 迁 移, 带 动 电 极 液 产 生 向 负 极 的 电 渗 流 如 果 电 渗 方 向 与 待 分 离 分 子 电 泳 方 向 相 同, 则 加 快 电 泳 速 度 ; 如 果 相 反, 则 降 低 电 泳 速 度 (3) 分 子 筛 作 用 (molecular sieve effect): 这 是 凝 胶 电 泳 的 一 个 特 性 凝 胶 的 分 子 筛 性 质 有 助 于 大 小 上 有 所 不 同 的 大 的 离 子 化 合 物 的 分 离 琼 脂 淀 粉 和 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 的 分 子 筛 原 理 是, 随 着 凝 胶 中 交 联 度 的 增 加, 孔 径 减 少, 大 分 子 移 动 的 阻 力 逐 渐 增 加 若 使 用 Sephadex 型 的 凝 胶, 情 况 则 正 好 相 反, 它 的 特 性 是 对 小 分 子 迁 移 的 阻 碍 作 用 要 比 大 分 子 来 得 大 ( 二 ) 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 (polyacrylamide gel) 是 一 种 人 工 合 成 的 凝 胶 自 1959 年 -1964 年 间, 人 们 利 用 这 种 凝 胶 作 电 泳 支 持 物 分 离 人 血 清 蛋 白 成 功 后, 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 法 (polyacrylamide gel electrophoresis) 为 分 离 蛋 白 质 核 酸 这 些 生 物 大 分 子 化 合 物 提 供 了 极 为 有 力 的 手 段 以 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 为 支 持 物 的 电 泳 具 有 如 下 优 点 : (1) 在 一 定 浓 度 时, 凝 胶 透 明, 有 弹 性, 机 械 性 能 好 (2) 化 学 性 能 稳 定, 与 被 分 离 物 不 起 化 学 反 应, 在 很 多 溶 剂 中 不 溶 (3) 对 ph 和 温 度 变 化 较 稳 定
(4) 几 乎 无 吸 附 和 电 渗 作 用, 只 要 Acr 纯 度 高, 操 作 条 件 一 致, 则 样 品 分 离 重 复 性 好 (5) 样 品 不 易 扩 散, 且 用 量 少 (6) 凝 胶 孔 径 可 调 节, 根 据 被 分 离 物 的 分 子 量 选 择 合 适 的 浓 度, 通 过 改 变 单 体 及 交 联 剂 的 浓 度 调 节 凝 胶 的 孔 径 (7) 分 辨 率 高, 尤 其 在 不 连 续 凝 胶 电 泳 中, 集 浓 缩 分 子 筛 和 电 荷 效 应 为 一 体 因 而 较 醋 酸 纤 维 薄 膜 电 泳 琼 脂 糖 电 泳 等 有 更 高 的 分 辨 率 由 于 具 有 这 些 优 点, 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 目 前 已 广 泛 应 用 于 医 学 和 生 物 学 等 各 学 科 领 域 根 据 凝 胶 装 置 形 式, 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 可 分 为 圆 盘 凝 胶 电 泳 和 平 板 电 泳 两 种 圆 盘 电 泳 是 在 直 立 的 玻 璃 管 内 进 行 ; 平 板 电 泳 是 在 两 块 玻 璃 板 间, 将 丙 烯 酰 胺 聚 合 成 方 形 的 薄 板 1. 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 的 制 备 原 理 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 由 单 体 丙 烯 酰 胺 ( 简 称 Acr) 和 甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 ( 简 称 Bis) 通 过 化 学 或 光 催 化 聚 合 而 成, 形 成 三 维 网 状 高 聚 物 单 体 及 聚 合 物 的 化 学 结 构 式 见 图 8 聚 合 过 程 由 自 由 基 催 化 完 成 催 化 聚 合 的 常 用 方 法 有 两 种 : 化 学 聚 合 法 和 光 聚 合 法 化 学 聚 合 以 过 硫 酸 铵 ((NH 4 ) 2 S 2 O 8 ) 为 催 化 剂 在 水 溶 液 中, 过 硫 酸 铵 可 形 成 自 由 基 SO 4-, 后 者 与 丙 烯 酰 胺 单 体 接 触, 将 其 双 键 打 开, 活 化 形 成 自 由 基 丙 烯 酰 胺 这 个 活 化 了 的 自 由 基 丙 烯 酰 胺 再 以 同 样 的 方 式 连 续 与 其 他 丙 烯 酰 胺 分 子 和 甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 分 子 反 应 就 能 聚 合 并 形 成 凝 胶 丙 烯 酰 胺 还 可 用 核 黄 素 催 化 聚 合, 这 是 个 光 激 发 的 催 化 反 应 核 黄 素 在 光 照 下 分 解, 其 黄 素 部 分 被 还 原 成 无 色 型 ; 但 在 有 痕 量 氧 存 在 的 条 件 下, 无 色 型 又 被 氧 化 成 具 有 自 由 基 的 黄 素 这 些 自 由 基 黄 素 与 过 硫 酸 铵 产 生 的 自 由 基 起 同 样 的 作 用, 也 能 使 丙 烯 酰 胺 和 甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 聚 合 形 成 凝 胶 为 加 速 聚 合, 在 制 备 凝 胶 时 还 需 加 用 一 种 脂 肪 族 叔 胺,N,N,N,N - 四 甲 基 乙 二 胺 ( 简 称 TEMED) 作 为 加 速 剂, 其 作 用 原 理 是 因 为 它 在 溶 液 中 也 能 以 自 由 基 形 式 存 在, 可 加 快 过 硫 酸 铵 产 生 自 由 基 结 构 式 为 : H 3 C H 3 C N CH 2 CH 2 N CH 3 CH 3
O H 2 C CH C, Acr O O HC NH 2 + H 2 C CH C NH CH 2 NH C CH2 N,N'-, Bis H 2 C CH 2 NH C O CH [CH 2 CH] CH 2 CH [CH 2 CH] CH 2 x C O C O C O NH 2 CH CH 2 NH 2 x C O H 2 C CH [CH 2 CH] CH 2 CH [CH 2 CH] CH 2 x C O C O C O NH CH 2 NH 2 NH 2, PAG x S 2 O 8 2-2SO 4 - SO 4 - + H 2 C CH H2C CH CONH 2 CONH 2 n CONH 2 CONH 2 CONH 2 H 2 C CH H 2 C CH H 2 C CH 图 8 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 单 体 及 聚 合 物 的 化 学 结 构 式 在 制 备 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 时 应 注 意 : (1)Acr 和 Bis 都 是 神 经 毒 化 合 物, 操 作 时 要 特 别 当 心 (2)TEMED 只 有 当 它 处 于 自 由 碱 基 状 态 下 才 能 发 挥 其 加 速 剂 的 效 能, 所 以 催 化 系 统 需 要 在 碱 性 条 件 下 进 行, 低 ph 时, 常 会 延 迟 聚 合 作 用 (3) 分 子 氧 能 阻 止 链 的 延 长, 妨 碍 聚 合 作 用, 操 作 时 应 尽 量 避 免 溶 液 中 过 量 氧 的 存
在 通 常 采 用 的 办 法 是 1 聚 合 前 将 溶 液 抽 气 ;2 聚 合 时, 将 胶 面 封 以 水 层 以 避 免 直 接 与 空 气 接 触 2. 凝 胶 孔 径 的 选 择 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 具 有 三 维 网 状 结 构, 网 状 的 孔 径 主 要 由 两 个 因 素 决 定 : (1) 凝 胶 总 浓 度, 通 常 用 T% 表 示, 即 100 毫 升 凝 胶 溶 液 中 所 含 Acr 和 Bis 的 总 克 数 (2) 交 联 度, 通 常 用 C% 表 示, 即 交 联 剂 Bis 占 单 体 与 交 联 剂 总 量 的 百 分 数 T=a+b/m 100% C=b/(a+b) 100% 式 中 :a= 凝 胶 溶 液 中 所 含 Acr 克 数 b= 凝 胶 溶 液 中 所 含 Bis 克 数 m= 凝 胶 溶 液 中 缓 冲 液 体 积 的 毫 升 数 J.C.Fawcett 等 人 曾 测 定 了 总 浓 度 为 6.5-20% 的 丙 烯 酰 胺 凝 胶 液 在 六 种 不 同 比 例 的 双 丙 烯 酰 胺 (Bis) 存 在 时 聚 合 后 的 孔 径 大 小, 其 结 果 整 理 如 下 表 : 表 3 双 丙 烯 酰 胺 浓 度 对 平 均 孔 径 的 影 响 丙 烯 酰 胺 总 浓 度 R0.5(Å)( 半 径 ) (%) 1% 5% 15% 25% (Acr+Bis) (Bis 的 浓 度 ) 6.5 24 19 28-8.0 23 16 24 36 10.0 19 14 20 30 12.0 17 9 - - 15.0 14 7 - - 从 表 中 可 以 看 出 : 1 凝 胶 孔 径 大 小 在 很 大 程 度 上 取 决 于 丙 烯 酰 胺 (Acr) 和 双 丙 烯 酰 胺 (Bis) 二 者 的 总 浓 度 T T 值 越 大, 孔 径 相 应 变 小 2 值 得 注 意 的 是, 当 T 值 不 变 时 Bis 浓 度 在 5% 时 孔 径 最 小, 高 于 或 低 于 5% 时 孔 径 却 相 应 变 大 这 就 可 能 有 这 样 的 现 象 出 现 : 当 Bis 浓 度 在 5% 以 上 或 以 下 时, 尽 管 T 值 大, 但 却 比 T 值 小 而 Bis 浓 度 为 5% 时 的 孔 径 要 大 因 此, 一 般 不 用 改 变 Bis 浓 度 的 办 法 来 控 制 凝 胶 孔 度 ( 通 常 将 它 固 定 在 丙 烯 酰 胺 总 浓 度 T 的 5%), 而 是 通 过 改 变 T 值 来 控 制 孔 径 大 小 凝 胶 孔 径 在 凝 胶 电 泳 中 是 一 个 重 要 的 参 数 要 想 得 到 好 的 分 离 结 果, 选 择 一 定 孔 径 的 凝 胶 是 很 关 键 的 但 遗 憾 的 是 至 今 还 没 有 一 个 普 遍 的 规 律 可 循 分 离 蛋 白 质 的 实 践 证 明, 胶 的 孔 径 大 约 是 蛋 白 质 分 子 平 均 大 小 的 一 半 时 分 析 结 果 较 好 这 是 因 为 在 电 泳 时 凝 胶 孔 扩 大 了, 足 以 使 比 孔 径 大 的 蛋 白 质 通 过 实 用 中 常 按 样 品 的 分 子 量 大 小 来 选 择 适 宜 的 凝 胶 浓 度 如 下 表 : 表 4 不 同 分 子 量 范 围 所 选 用 的 凝 胶 浓 度
物 质 分 子 量 范 围 适 用 的 凝 胶 浓 度 (%) <10 4 20-30 蛋 1-4 10 4 15-20 白 4 10 4-1 10 5 10-15 质 1-1 10 5 5-10 >1 10 5 2-5 核 <10 4 15-20 酸 10 4-10 5 5-10 (RNA) 10 5-2 10 6 2-2.6 常 用 的 所 谓 标 准 胶 是 指 浓 度 为 7.5% 的 凝 胶, 大 多 数 生 物 体 内 的 蛋 白 质 在 此 胶 中 电 泳 都 能 得 到 满 意 的 结 果 当 分 析 一 个 未 知 样 品 时, 常 常 先 用 7.5% 的 标 准 凝 胶 或 用 4~10% 的 梯 度 凝 胶 来 测 试, 选 出 适 宜 的 凝 胶 浓 度 3. 凝 胶 的 机 械 性 能 凝 胶 的 机 械 强 度 和 弹 性 是 很 重 要 的 凝 胶 太 软 不 易 操 作, 凝 胶 太 硬 则 脆 易 折 断 凝 胶 的 机 械 性 能 弹 性 透 明 度 和 粘 着 度 都 取 决 于 凝 胶 总 浓 度 T% 和 Acr 与 Bis 两 者 之 比 ( 即 a :b) 其 中 a :b(w/w) 是 很 关 键 的 当 a :b<10 时, 凝 胶 变 脆, 呈 现 乳 白 色 ;a :b >100 时,5% 凝 胶 呈 现 糊 状, 易 于 断 裂 通 常 要 求 : T 为 2-5% 时 应 使 Acr/Bis=20; T 为 5-10% 时 应 使 Acr/Bis=40; T 为 15-20% 时 应 使 Acr/Bis=125-200; 即 当 Acr 的 浓 度 增 加 时,Bis 的 浓 度 要 作 适 当 的 降 低 下 面 经 验 公 式 供 参 考 (100ml 溶 液 量 ): 丙 烯 酰 胺 量 ( 克 ) 甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 量 ( 克 )= 常 数 ( 约 1.3) 4.SDS SDS- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 SDS- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 是 最 常 用 的 定 性 分 析 蛋 白 质 的 电 泳 方 法, 特 别 是 用 于 蛋 白 质 纯 度 检 测 和 分 子 量 测 定 如 上 所 述, 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 之 所 以 能 将 不 同 的 大 分 子 化 合 物 分 开, 是 由 于 这 些 分 子 所 带 净 电 荷 的 差 异 和 分 子 大 小 不 同 的 缘 故 但 可 能 有 这 样 的 情 况 : 两 个 分 子 量 不 同 的 蛋 白 质 以 相 同 的 速 度 向 阳 极 移 动 这 可 能 是 由 于 蛋 白 质 分 子 大 小 的 差 别 被 它 们 所 带 净 电 荷 的 差 别 所 补 偿 如 果 能 设 法 将 电 荷 差 异 这 一 因 素 除 去 或 减 小 到 可 以 忽 略 不 计 的 程 度, 那 么 分 子 在 凝 胶 上 迁 移 率 的 大 小 则 完 全 取 决 于 它 的 分 子 量 1967 年 Shapiro 等 人 首 先 试 图 在 十 二 烷 基 硫 酸 钠 存 在 下 分 离 蛋 白 与 质 混 合 物, 结 果 发 现, 当 在 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 系 统 中 加 入 SDS 后, 蛋 白 质 分 子 的 迁 移 率 主 要 取 决 于 它 的 分 子 量, 而 与 所 带 净 电 荷 和 形 状 无 关 并 进 一 步 有 实 验 证 明, 在 一 定 条 件 下, 蛋 白 质 的 迁 移 ; 率 与 蛋 白 质 的 分 子 量 的 对 数 成 比 例, 即 : MW=K(10-bm) lgmw=lgk-bm=k 1 -bm
式 中 :MW 为 蛋 白 质 的 分 子 量,K,K 1 为 常 数 ;b 为 斜 率 ;m 为 迁 移 率 据 此,SDS- 凝 胶 电 泳 可 用 来 测 定 蛋 白 质 的 分 子 量 具 体 做 法 是, 先 作 一 个 已 知 蛋 白 质 分 子 量 迁 移 率 与 分 子 量 的 对 数 标 准 曲 线 ( 图 9), 未 知 分 子 量 蛋 白 质 样 品 在 同 样 条 件 下 电 泳, 测 出 其 迁 移 率, 再 从 图 中 求 出 未 知 蛋 白 质 样 品 的 分 子 量 现 在, 经 SDS- 凝 胶 电 泳 研 究 过 的 蛋 白 质 已 有 100 多 种 用 这 种 方 法 测 定 蛋 白 质 的 分 子 量, 简 便 快 速, 只 需 要 简 单 的 设 备 和 微 克 量 的 蛋 白 质 样 品, 测 定 精 确 度 也 较 高 ( 误 差 一 般 在 ±10% 以 内 ) 因 此, 近 几 年 来,SDS- 凝 胶 电 泳 测 定 分 子 量 的 方 法, 已 得 到 非 常 广 泛 的 应 用 和 迅 速 的 发 展 对 数 分 子 量 浓 度 增 加 凝 胶 SDS 作 用 原 理 如 下 : 图 9 SDS 凝 胶 电 泳 的 标 准 曲 线 Rm 表 示 相 对 迁 移 率 SDS 是 十 二 烷 基 硫 酸 钠 (sodium dodecyl sulfate,sds) 的 简 称, 它 是 一 种 阴 离 子 表 面 活 性 剂, 加 入 到 电 泳 系 统 中 能 使 蛋 白 质 的 氢 键 和 疏 水 键 打 开, 并 结 合 到 蛋 白 质 分 子 上 ( 在 一 定 条 件 下, 大 多 数 蛋 白 质 与 SDS 的 结 合 比 为 1.4g SDS/1g 蛋 白 质 ) 由 于 十 二 烷 基 硫 酸 根 CH 3 (CH 2 ) 10 CH 2 -OSO 3 - 带 负 电, 使 各 种 蛋 白 质 -SDS 复 合 物 都 带 上 相 同 密 度 的 负 电 荷, 其 数 量 远 远 超 过 了 蛋 白 质 分 子 原 有 的 电 荷 量, 从 而 掩 盖 了 不 同 种 类 蛋 白 质 间 原 有 的 电 荷 差 别 ( 图 10) 这 样 就 使 电 泳 迁 移 率 只 取 决 于 分 子 大 小 这 一 因 素, 于 是 根 据 标 准 蛋 白 质 分 子 量 的 对 数 和 迁 移 率 所 作 的 标 准 曲 线, 可 求 得 未 知 物 的 分 子 量 SDS 与 蛋 白 质 结 合 后, 还 引 起 了 蛋 白 质 构 象 的 一 系 列 改 变, 其 主 要 表 现 是 :1 各 种 SDS- 蛋 白 质 复 合 物 的 构 象 趋 于 一 致 ;2 使 具 有 四 级 结 构 的 蛋 白 质 拆 成 组 成 它 们 的 亚 单 位 形 式 实 验 证 明, 蛋 白 质 的 SDS 复 合 物 在 水 溶 液 中 均 呈 长 椭 圆 棒 形, 不 同 蛋 白 质 的 SDS 复 合 物 的 短 轴 长 度 都 一 样, 约 为 18Å, 而 长 轴 则 随 蛋 白 质 的 分 子 量 成 正 比 的 变 化 ( 图 10) 这 样 的 蛋 白 质 -SDS 复 合 物, 在 凝 胶 电 泳 中 的 迁 移 率, 不 再 受 蛋 白 质 原 有 电 荷 和 形 状 的 影 响, 而 只 是 椭 圆 棒 长 度, 也 就 是 蛋 白 质 分 子 量 的 函 数 此 外, 由 于 SDS 是 一 种 良 好 的 解 离 剂, 可 促 进 蛋 白 质 溶 解, 因 而 也 适 宜 于 那 些 成 分 复 杂, 溶 解 度 差 的 蛋 白 质 的 分 析 实 践 还 证 明,SDS- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 对 样 品 的 分 辨 力 要 高 得 多 R m
作 SDS 凝 胶 电 泳 前, 蛋 白 质 要 作 预 处 理, 使 它 充 分 地 变 性 并 还 原 成 单 一 地 亚 基 结 构 一 般 是 在 1%SDS,5% 巯 基 乙 醇 地 0.01M Tris-HCl 缓 冲 液 中,100 保 温 5 分 钟 巯 基 乙 醇 的 作 用 是 使 蛋 白 质 分 子 中 的 二 硫 键 还 原 图 10 蛋 白 质 的 SDS 复 合 物 SDS 遮 蔽 了 蛋 白 质 分 子 的 原 有 电 荷 近 来 实 验 表 明,SDS- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 在 梯 度 中 比 在 均 匀 凝 胶 中 有 更 好 的 分 辨 力, 可 获 得 更 狭 小 的 分 辨 带 SDS- 凝 胶 电 泳 的 不 足 之 处 是, 样 品 经 SDS 处 理 后, 其 生 物 活 性 完 全 丧 失 该 电 泳 是 在 一 个 不 连 续 的 (discontinuous) 电 泳 系 统 里, 在 直 立 双 玻 璃 板 之 间 进 行, 电 泳 装 置 如 图 11 图 11 SDS- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 装 置 示 意 图 (1) 电 泳 系 统 的 不 连 续 性 : 不 连 续 体 系 由 电 极 缓 冲 液 浓 缩 胶 及 分 离 胶 所 组 成 浓 缩 胶 是 由 过 硫 酸 铵 催 化 聚 合 而 成 的 大 孔 胶, 凝 胶 缓 冲 液 为 ph6.8 的 Tris-HC1 分 离 胶 是 由 过 硫 酸 铵 催 化 聚 合 而 成 的 小 孔 胶, 凝 胶 缓 冲 液 为 ph8.8 Tris-HC1 电 极 缓 冲 液 是 ph8.3 Tris- 甘 氨 酸 缓 冲 液 2 种 孔 径 的 凝 胶 2 种 缓 冲 体 系 3 种 ph 值 使 不 连 续 体 系 形 成 了 凝 胶 孔 径 ph 值 缓 冲 液 离 子 成 分 的 不 连 续 性 (2)SDS- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 过 程 中 的 三 种 效 应 SDS- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 的 分 离 效 果 好, 具 有 很 高 的 分 辨 力, 这 是 因 为 在 SDS- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 过 程 中 的 下 列 三 种 效 应 在 起 作 用 1 样 品 的 浓 缩 效 应 :
样 品 在 电 泳 过 程 中 首 先 通 过 浓 缩 胶 而 被 浓 缩 这 是 由 于 在 电 泳 缓 冲 液 中 主 要 存 在 三 种 阴 离 子,Cl - 甘 氨 酸 阴 离 子 以 及 蛋 白 质 -SDS 复 合 物, 在 浓 缩 胶 的 ph 值 下, 甘 氨 酸 只 有 少 量 的 电 离, 所 以 其 电 泳 迁 移 率 最 小, 而 Cl - 的 电 泳 迁 移 率 最 大 在 电 场 的 作 用 下, Cl - 最 初 的 迁 移 速 度 最 快, 这 样 在 Cl - 后 面 形 成 低 离 子 浓 度 区 域, 即 低 电 导 区, 而 低 电 导 区 会 产 生 较 高 的 电 场 强 度, 因 此 Cl - 后 面 的 离 子 在 较 高 的 电 场 强 度 作 用 下 会 加 速 移 动 达 到 稳 定 状 态 后,Cl - 和 甘 氨 酸 之 间 形 成 稳 定 移 动 的 界 面 而 蛋 白 质 -SDS 复 合 物 由 于 相 对 量 较 少, 聚 集 在 甘 氨 酸 和 Cl - 的 界 面 附 近 而 被 浓 缩 成 很 窄 的 区 带 ( 可 以 被 浓 缩 300 倍 ), 所 以 在 浓 缩 胶 中 Cl - 是 快 离 子 ( 前 导 离 子 ), 甘 氨 酸 是 慢 离 子 ( 尾 随 离 子 ) 当 甘 氨 酸 到 达 分 离 胶 后, 由 于 分 离 胶 的 ph 值 ( 通 常 ph=8.8) 较 大, 甘 氨 酸 离 解 度 加 大, 电 泳 迁 移 速 度 变 大 超 过 蛋 白 质 -SDS 复 合 物, 甘 氨 酸 和 Cl - 的 界 面 很 快 超 过 蛋 白 质 -SDS 复 合 物 这 时 蛋 白 质 -SDS 复 合 物 在 分 离 胶 中 以 本 身 的 电 泳 迁 移 速 度 进 行 电 泳, 向 正 极 移 动 2 电 荷 效 应 : 蛋 白 质 混 合 物 在 凝 胶 界 面 被 高 度 浓 缩, 堆 积 成 层, 形 成 一 狭 小 的 高 浓 度 的 蛋 白 区, 但 由 于 每 种 蛋 白 质 分 子 所 载 有 效 电 荷 3 凝 胶 对 分 子 的 筛 选 效 应 : 当 蛋 白 质 通 过 浓 缩 胶 进 入 分 离 胶 时, 由 于 ph 值 和 凝 胶 孔 径 突 然 改 变 ( 选 择 分 离 胶 的 ph 值 为 8.9, 电 泳 时 经 实 际 测 量 为 ph9.5), 使 甘 氨 酸 的 解 离 度 增 大, 它 的 有 效 泳 动 率 也 增 大, 此 时 甘 氨 酸 很 快 就 赶 上 了 并 超 越 了 蛋 白 质 分 子, 因 而 高 电 位 梯 度 消 失, 使 蛋 白 质 样 品 进 入 一 个 均 一 的 电 位 梯 度 和 ph 条 件 的 分 离 胶 中, 分 离 胶 的 孔 径 较 小, 分 子 量 或 构 象 不 同 的 蛋 白 质 通 过 分 离 胶, 受 阻 滞 的 程 度 不 同, 因 此 表 现 出 不 同 的 泳 动 率, 颗 粒 小 的 移 动 快, 颗 粒 大 的 移 动 慢, 此 即 凝 胶 对 分 子 的 筛 选 效 应, 即 分 子 筛 效 应, 即 使 净 电 荷 相 似, 泳 动 率 相 同 的 蛋 白 质 分 子, 也 会 由 于 这 种 筛 选 效 应 在 分 离 胶 中 被 分 开 ( 三 ) 等 电 聚 焦 电 泳 1. 等 电 聚 焦 电 泳 的 基 本 原 理 等 电 聚 焦 电 泳 (isoelectric focusing gel electrophoresis,ife) 是 根 据 蛋 白 质 分 子 的 等 电 点 进 行 分 离 的 一 种 技 术 在 等 电 聚 焦 中, 利 用 两 性 电 解 质 载 体 形 成 一 个 连 续 而 稳 定 的 线 性 ph 梯 度, 使 ph 值 从 正 极 向 负 极 逐 渐 增 加 蛋 白 质 分 子 在 偏 离 其 等 电 点 的 ph 值 位 置 带 有 电 荷, 因 此 在 电 场 中 可 以 移 动 当 蛋 白 质 移 动 到 ph 等 于 pi 区 域 时, 其 净 电 荷 等 于 零, 在 电 场 中 不 再 移 动, 据 此 可 将 不 同 等 电 点 的 蛋 白 质 分 离 ( 图 12) 20 世 纪 70 年 代,Vesterberg 合 成 了 一 些 脂 肪 族 多 氨 基 多 羧 基 酸 的 两 性 电 解 质 它 们 在 ph 3.5 到 ph 10 之 间 可 以 形 成 一 个 平 滑 的 ph 梯 度, 覆 盖 了 大 多 数 蛋 白 质 的 pi 值 后 来,Vesterberg 又 将 ph 范 围 扩 大 至 ph 2.5~11 的 范 围 这 种 两 性 电 解 质 载 体 已 由 瑞 典 LKB 公 司 商 品 化, 其 商 品 名 为 Ampholine 由 于 两 性 电 解 质 的 发 展, 使 等 电 聚 焦 成 为 一 项 广 泛 应 用 的 分 析 和 制 备 技 术 2. 等 电 聚 焦 电 泳 的 优 缺 点 及 其 主 要 用 途 等 电 聚 焦 电 泳 与 常 规 电 泳 比 较 有 很 多 优 点 :
(1) 样 品 加 样 位 置 和 体 积 不 受 严 格 限 制, 样 品 可 混 入 胶 中 或 放 在 胶 上 任 何 位 置 ; (2) 分 辨 率 很 高, 可 将 pi 相 差 0.01 的 蛋 白 质 组 分 分 开 ; (3)IFE 电 泳 结 束 就 可 测 定 pi; (4) 分 析 型 电 泳 一 般 可 在 两 小 时 内 完 成, 分 离 速 度 快 ; (5) 经 IFE 分 离 的 蛋 白 质 不 变 性, 可 保 持 原 有 生 物 活 性, 两 性 电 解 质 载 体 经 硫 酸 铵 沉 淀 透 析 分 子 筛 和 电 泳 等 方 法 可 与 蛋 白 质 分 开 IFE 的 缺 点 是 : (1) 许 多 蛋 白 质 在 pi 附 近 可 产 生 沉 淀, 从 而 影 响 分 离 效 果, 可 在 凝 胶 介 质 中 加 入 尿 素 或 非 离 子 去 垢 剂 加 以 解 决 ; (2) 样 品 含 盐 应 尽 量 少, 避 免 高 盐 浓 度 下 高 压 电 泳 时 产 生 大 电 流 而 发 热, 但 无 盐 时, 一 些 蛋 白 质 溶 解 度 太 低, 可 在 样 品 中 适 当 加 两 性 电 解 质 或 甘 氨 酸 来 解 决 ; (3) 两 性 电 解 质 可 与 蛋 白 质 发 生 静 电 作 用, 而 紧 密 结 合 形 成 复 合 物, 这 可 使 蛋 白 质 与 抗 体 的 反 应 性 降 低 或 酶 活 性 降 低, 可 用 高 离 子 强 度 (0.1~0.5 mol/l)ph 值 为 7 的 挥 发 性 缓 冲 液 来 破 坏 其 静 电 作 用 等 电 聚 焦 可 用 于 蛋 白 质 和 两 性 分 子 的 分 离 分 析 及 等 电 点 的 测 定, 也 可 用 于 临 床 疾 病 诊 断 及 法 医 学 鉴 定 下 : 3. 等 电 聚 焦 电 泳 中 的 几 个 基 本 问 题 (1) 两 性 电 介 质 载 体 ph p I 1 p I 2 p I 3 pi 要 求 有 稳 定 的 ph 梯 度, 常 用 载 体 是 由 多 乙 烯 多 胺 和 丙 烯 酸 加 成 反 应 而 得 反 应 式 如 0 蛋 白 质 1 0 蛋 白 质 2 0 蛋 白 质 3 负 极 ( ) 正 极 ( + ) 图 12 等 电 聚 焦 电 泳 原 理 示 意 图 p H 增 加 R 1 -N + H 2 -(CH 2 )-N + H 2 -R 2 + CH 2 =CH-COO 多 乙 烯 多 胺 丙 烯 酸 H 2 O, 70 16~ 20 R 1 -N + H 2 -CH 2 -N + H-R 2 CH 2 -CH-COO 理 想 载 体 应 具 备 以 下 条 件 : 1 足 够 的 缓 冲 容 量, 从 而 不 受 上 样 量 得 影 响 ; 2 等 点 处 足 够 的 均 匀 的 电 导, 从 而 使 各 成 分 有 效 聚 焦 ; 3 分 子 量 小, 便 于 用 透 析 或 凝 胶 过 滤 法 除 去 ; 4 化 学 组 分 与 被 检 物 不 同, 再 280nm 紫 外 吸 收 小 于 0.05, 从 而 不 影 响 分 离 后 蛋 白 的
紫 外 设 定 ; 5 不 与 被 分 离 物 反 应 (2)pH 梯 度 的 建 立 两 性 电 解 质 载 体 经 电 场 作 用 可 建 立 从 正 极 到 负 极 ph 值 逐 渐 增 加 的 ph 梯 度, 其 过 程 如 下 : 将 两 性 电 解 质 载 体 溶 液 引 入 电 泳 管, 并 在 电 泳 仪 的 正 极 槽 注 入 稀 酸, 负 极 槽 中 注 入 稀 碱, 电 泳 开 始 前, 电 泳 管 中 各 段 ph 相 同, 为 两 性 电 解 质 载 体 混 合 物 的 平 均 ph(pho), 而 正 极 酸 液 的 ph 很 低 (pha), 负 极 碱 液 的 ph 很 高 (phb), 如 图 13 p H p H b p H o p H p H b p I n 电 泳 前 p H a p I 3 p I 2p p I 1 p H a 电 泳 后 - 电 泳 管 + - 电 泳 管 + 图 13 ph 梯 度 建 立 过 程 示 意 图 电 泳 开 始 后,pI 最 低 的 两 性 电 解 质 载 体 带 负 电 荷, 向 正 极 移 动, 其 中 pi 最 低 者 ph1 移 到 酸 液 面 后 由 于 ph 突 然 下 降, 其 负 电 荷 被 中 和, 因 此 不 能 再 向 前 移 动 ; 类 似 的 pi 值 次 低 者 不 能 超 越 ph1 而 排 在 其 靠 负 极 的 一 侧 ; 以 此 类 推, 经 过 一 定 时 间 后, 从 正 极 到 负 极 排 成 一 个 ph 梯 度 只 要 保 持 电 场 作 用 和 抗 对 流 介 质 防 止 混 合, 那 么 将 形 成 一 个 稳 定 的 连 续 的 线 性 的 ph 梯 度 (3) 抗 对 流 介 质 为 了 保 持 ph 梯 度 和 防 止 已 分 离 样 品 再 混 合, 一 般 常 用 蔗 糖 密 度 梯 度 和 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 溶 液 中 电 泳 多 采 取 蔗 糖 密 度 梯 度 它 不 带 电 荷, 对 蛋 白 质 无 害 而 且 是 液 体 可 以 用 分 部 收 集 器 收 集 但 是 所 用 仪 器 复 杂, 适 用 于 制 备 性 分 离 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 的 电 渗 小,pH 梯 度 漂 移 低, 且 时 间 短, 操 作 简 便 一 般 选 取 5% 的 凝 胶 即 可 4. 试 剂 (1) 等 电 聚 焦 电 泳 凝 胶 制 胶 所 需 试 剂 1 凝 胶 母 液 :24.75% 丙 烯 酰 胺 /0.75% 双 丙 烯 酰 胺 溶 液, 过 滤 后 4 储 存 2 两 性 电 解 质 310% 过 硫 酸 铵 425% 甘 油 5TEMED (2) 等 电 聚 焦 电 泳 凝 胶 制 胶 混 合 液 凝 胶 母 液 2.0 ml,25% 甘 油 2.0 ml,40% 两 性 电 解 质 0.5 ml,h 2 O 5.5 ml,10% 过 硫 酸
铵 40 μl,temed 10 μl 5. 等 电 聚 焦 电 泳 的 基 本 操 作 聚 丙 烯 酰 胺 水 平 薄 层 等 电 聚 焦 (horizontal thin layer polyacrylamide, IFE) 是 一 种 常 见 的 分 析 用 等 电 聚 焦 方 法, 具 有 样 品 用 量 少 操 作 简 便 可 同 时 分 析 多 个 样 品 电 泳 时 间 短 及 分 辨 率 高 等 特 点 这 里 以 该 法 为 例 介 绍 Bio-Rad 公 司 的 MoiIII 系 统 ( 图 14) 的 基 本 操 作 过 程 A 图 14 等 电 聚 焦 电 泳 装 置 及 电 泳 结 果 举 例 A: Bio-Rad Model III IEF 电 泳 装 置 B: 电 泳 结 果 举 例 :1 为 等 电 点 标 准 品 ;2-5 为 系 列 稀 释 的 过 氧 化 物 酶 (1) 胶 的 制 备 取 玻 璃 (65 125 mm 2 ) 一 片, 滴 上 双 蒸 水 1 滴, 另 取 一 塑 料 薄 膜 盖 在 玻 璃 片 上, 使 二 者 紧 密 结 合, 排 除 气 泡, 按 仪 器 说 明 将 模 具 安 装 好, 使 玻 璃 板 在 模 具 盒 内 三 面 贴 着 盒 壁, 一 面 敞 开 (2) 加 样 及 电 泳 将 制 备 好 的 凝 胶 面 朝 上, 胶 表 面 覆 盖 带 有 加 样 孔 的 塑 料 薄 膜, 使 胶 与 膜 紧 密 结 合 蛋 白 质 样 品 溶 于 50% 甘 油 中, 每 孔 上 样 量 0.5~2 μl 加 样 5~10 min 后 样 品 进 入 胶 内, 揭 去 塑 料 膜, 用 水 将 电 极 湿 润, 把 加 有 样 品 的 凝 胶 面 朝 下, 再 将 凝 胶 的 两 端 直 接 放 在 石 墨 电 极 上, 盖 好 电 泳 槽 盖, 在 稳 压 条 件 下 聚 焦 :100 V 15 min,200 V 15 min,450 V 60 min, 20 下 进 行 (3) 染 色 和 脱 色 先 将 凝 胶 在 固 定 液 (12% 三 氯 醋 酸 ) 中 浸 泡 24 h( 多 次 更 换 固 定 液, 使 两 性 电 解 质 充 分 洗 去 ), 然 后 在 0.25% 考 马 斯 亮 兰 R-250 染 色 液 中 浸 泡 3~5 h 用 脱 色 液 (27% 乙 醇 7% 醋 酸 ) 使 凝 胶 背 景 颜 色 除 去, 至 蛋 白 带 清 晰 为 止 凝 胶 表 面 用 浸 水 的 多 孔 聚 乙 烯 膜 覆 盖, 除 气 泡 并 保 持 膜 平 整, 室 温 下 干 燥 保 存 6. 等 电 聚 焦 电 泳 的 注 意 事 项 (1) 等 电 聚 焦 电 泳 的 支 持 介 质 为 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶, 用 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 只 可 分 析 分 子 量 小 于 30 万 kda 的 蛋 白 质 在 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 中 添 加 甘 油 可 以 增 加 凝 胶 的 机 械 稳 定 性 和 渗 透 能 力, 减 少 电 泳 时 凝 胶 表 面 的 渗 出 水, 并 可 以 增 加 凝 胶 与 玻 璃 的 粘 着 度 (2) 制 胶 过 程 中, 溶 液 体 积 根 据 凝 胶 的 大 小 按 比 例 增 减, 载 体 两 性 电 解 质 的 量 亦 应 按 凝 胶 的 厚 薄 适 量 增 减, 过 硫 酸 铵 和 TEMED 的 量 视 聚 合 快 慢 增 减 通 常 情 况 下, 凝 胶 B
聚 合 应 在 30 min 到 1 h 内 完 成, 过 快 聚 合 表 示 过 硫 酸 铵 和 / 或 TEMED 用 量 过 多, 此 时 凝 胶 太 硬 易 龟 裂, 且 在 电 泳 时 易 烧 胶 聚 合 太 慢, 甚 至 不 聚 合, 则 表 示 聚 合 的 两 种 试 剂 用 量 不 当, 或 凝 胶 系 统 中 的 试 剂 不 纯 或 已 失 效 特 别 要 注 意 过 硫 酸 铵 的 生 产 日 期 (3) 两 性 电 解 质 载 体 有 Ampholine(LKB 公 司 ) Servalyte(Serva 公 司 ) Pharmalyte (Pharmacia 公 司 ) 及 国 产 两 性 电 解 质 载 体 两 性 电 解 质 载 体 选 择 的 主 要 依 据 是 被 测 蛋 白 质 的 等 电 点 范 围 (4) 样 品 要 脱 盐, 否 则 区 带 扭 曲 ; 要 彻 底 溶 解, 未 彻 底 溶 解 的 颗 粒 易 引 起 拖 尾 ; 样 品 溶 液 中 可 加 变 性 剂, 如 尿 素 (6~8 mol/l) 和 去 污 剂 等 加 样 量 取 决 于 样 品 中 蛋 白 质 的 种 类 及 检 测 方 法 的 灵 敏 度 一 般 认 为,0.5~1 mg 蛋 白 /ml 为 宜, 最 适 加 样 体 积 约 10~30 l, 对 不 稳 定 的 样 品 可 进 行 预 电 泳 (5) 电 极 缓 冲 液 应 根 据 两 性 电 解 质 ph 范 围 加 以 选 择, 可 参 见 相 应 产 品 说 明 书 (6) 样 品 可 直 接 加 在 胶 的 顶 部, 亦 可 以 在 胶 聚 合 前 加 到 胶 的 混 合 物 内 一 起 聚 合, 这 需 视 样 品 的 浓 度 及 稳 定 性 而 定 如 果 样 品 比 较 浓, 且 易 失 活, 一 般 在 电 泳 前 加 到 胶 的 顶 部 为 了 不 使 样 品 接 触 电 极 溶 液, 在 加 样 后, 再 将 胶 管 顶 部 充 满 1% 两 性 电 解 质 样 品 也 可 以 经 预 电 泳 后 再 加 入, 这 也 要 看 蛋 白 质 样 品 对 ph 的 敏 感 程 度 四 层 析 法 色 层 分 析 法, 简 称 为 层 析 法 (Chromatography methods), 也 称 色 谱 法, 一 般 指 待 分 离 液 体 ( 流 动 相,mobile phase) 经 过 一 个 固 态 物 质 ( 固 定 相,solid phase; 基 质,matrix) 后 所 发 生 的 组 分 分 布 变 化 混 合 物 中 各 组 分 理 化 性 质 的 差 别 ( 如 分 子 形 状 和 大 小 分 子 极 性 及 分 子 亲 和 力 等 ) 使 它 们 以 不 同 程 度 分 布 在 两 个 相 中, 从 而 以 不 同 速 度 相 对 于 固 相 移 动 而 达 到 分 离 层 析 和 电 泳 同 为 生 物 化 学 中 生 物 大 分 子 的 分 离 纯 化 常 用 的 手 段, 两 者 相 辅 相 成, 各 有 所 长 在 蛋 白 质 大 量 制 备 时, 层 析 比 电 泳 更 有 优 势 ( 一 ) 层 析 技 术 的 发 展 简 史 及 科 学 意 义 层 析 技 术 在 20 世 纪 初 开 始 形 成 1906 年 俄 国 植 物 学 家 M.Tswett 将 绿 叶 的 石 油 醚 提 取 液 与 CaCO 3 细 粉 混 合 时, 发 现 许 多 色 素 被 CaCO 3 吸 附, 后 来 他 将 CaCO 3 装 入 一 个 柱 内, 让 一 定 量 的 绿 叶 石 油 醚 提 取 液 通 过 CaCO 3 填 装 的 柱 子 结 果 将 叶 绿 素 分 成 许 多 不 同 的 色 带, 且 各 色 带 间 是 无 色 的 区 带, 这 也 是 层 析 技 术 亦 称 为 色 谱 的 缘 由 1931 年,R.Kuhu 等 人 利 用 层 析 技 术 成 功 地 将 卵 黄 中 的 叶 黄 素 分 成 黄 体 素 和 玉 米 黄 质 素 两 种 成 分 这 一 创 举 推 动 了 层 析 法 的 发 展 和 应 用 1941 年,A.J.P.Martin 和 R.L.M.Synge 用 硅 胶 装 柱, 使 混 合 液 中 的 氨 基 酸 经 柱 层 析 彼 此 得 到 分 离 层 析 法 与 其 他 经 典 分 离 方 法 ( 蒸 馏 结 晶 和 萃 取 等 ) 相 比 操 作 简 便 分 离 效 率 高, 在 科 学 研 究 医 药 卫 生 环 境 保 护 及 化 工 等 领 域 均 有 广 泛 应 用 层 析 法 不 仅 用 于 一 般 化 合 物 的 定 性 定 量 分 析, 也 广 泛 用 于 生 物 大 分 子 ( 蛋 白 质 酶 核 酸 多 糖 和 多 肽 ) 生 物 初 级 代 谢 产 物 ( 如 氨 基 酸 核 苷 酸 有 机 酸 和 脂 肪 酸 ) 及 次 级 代 谢 产 物 ( 如 糖 苷 色 素 生 物 碱 和 萜 类 等 ) 等 的 分 离 与 纯 化 层 析 是 生 物 工 程 技 术 下 游 加 工 过 程 中 最 主 要 的
纯 化 技 术 近 年 来, 由 于 各 种 固 定 相 种 类 的 不 断 改 进 更 新, 使 分 离 效 率 越 来 越 高 ; 层 析 检 测 系 统 如 紫 外 分 光 光 度 法 荧 光 法 电 化 学 法 等 也 日 趋 准 确 快 速, 使 层 析 技 术 迅 速 发 展, 逐 渐 完 善 特 别 是 大 型 专 用 自 动 化 仪 器 和 分 析 系 统 的 出 现, 使 层 析 在 分 离 效 率 自 动 化 程 度 和 应 用 范 围 上 都 远 远 超 过 经 典 层 析 法 电 子 计 算 机 技 术 的 发 展 使 层 析 技 术 向 智 能 化 发 展, 智 能 化 色 谱 仪 具 有 推 荐 实 验 条 件 实 验 方 法 优 化 实 验 条 件 和 解 析 试 验 结 果 之 功 能 层 析 法 已 成 为 生 化 各 领 域 的 基 本 技 术, 是 当 今 生 物 物 质 分 离 纯 化 的 最 有 效 的 手 段 之 一 ( 二 ) 层 析 技 术 的 基 本 原 理 1941 年 Martin 和 Synge 根 据 氨 基 酸 在 水 与 氯 仿 两 相 中 分 配 系 数 的 不 同 而 建 立 分 配 层 析 技 术 时 提 出 了 液 - 液 分 配 层 析 的 塔 板 (plate) 理 论 该 理 论 的 第 一 个 概 念 是, 认 为 混 合 物 中 各 组 分 的 物 理 性 质 不 同, 当 这 些 物 质 处 于 互 相 接 触 的 两 相 之 中 时, 不 同 物 质 在 两 相 中 的 分 布 会 不 同 例 如 在 液 - 液 分 配 层 析 柱 上 的 某 一 段, 将 A B 两 种 物 质 溶 解 于 一 定 量 的 S 溶 液 中 ( 作 为 固 定 相 ), 然 后 加 入 一 定 量 的 M 溶 液 ( 为 流 动 相 ) A B 两 种 物 质 即 进 入 固 定 相 又 进 入 流 动 相, 在 固 定 相 中 分 子 受 阻 不 能 前 进, 而 在 流 动 相 中 的 分 子 以 流 动 相 的 速 度 沿 柱 前 进 在 层 析 分 离 过 程 中, 流 动 相 起 运 载 作 用, 固 定 相 起 阻 滞 作 用,AB 两 种 物 质 根 据 其 在 不 同 相 中 的 分 配 系 数 进 行 分 配 分 配 系 数 可 以 用 K 表 示 : K = 溶 质 在 固 定 相 中 的 浓 度 / 溶 质 在 流 动 相 中 的 浓 度 = C S / C M K 值 大 表 示 物 质 在 柱 中 牢 固 地 吸 附 在 固 定 相 中, 在 固 定 相 中 停 留 的 时 间 长, 而 在 流 动 相 中 迁 移 的 速 度 慢, 溶 质 出 现 在 流 动 相 中 较 晚 相 反 K 值 小, 溶 质 出 现 在 洗 脱 液 中 较 早 由 于 混 合 物 中 各 组 分 的 K 值 的 差 异 性, 即 可 使 各 组 分 分 离 在 不 同 的 层 析 技 术 中, K 值 的 含 义 不 同, 在 吸 附 层 析 中,K 为 吸 收 平 衡 系 数, 分 配 层 析 中 K 为 分 配 系 数, 离 子 交 换 层 析 中,K 为 交 换 系 数, 在 亲 和 层 析 中 为 亲 和 常 数 塔 板 理 论 的 第 二 个 概 念 是, 层 析 分 离 的 分 配 原 理 与 分 馏 塔 分 离 挥 发 性 混 合 物 的 原 理 相 似, 层 析 柱 的 分 离 结 果 与 柱 的 效 率 有 关 柱 效 可 用 理 论 塔 板 数 (number of theoretical plate) 的 多 少 来 表 示, 即 将 一 根 层 析 柱 看 成 是 由 许 多 塔 板 叠 加 构 成 的 在 每 一 个 塔 板 内, 样 品 混 合 物 将 在 流 动 相 和 固 定 相 间 达 到 平 衡, 经 多 次 平 衡 后, 相 当 于 一 系 列 分 液 漏 斗 的 液 - 液 萃 取 过 程 如 图 15 所 示, 当 流 动 相 M 与 固 定 相 S 接 触 时,A B 两 种 溶 质 按 各 自 的 分 配 系 数 进 行 分 配 如 A 物 质 的 K=9, 而 B 物 质 的 K=1, 则 溶 质 A 有 十 分 之 一 流 入 流 动 相, 溶 质 B 有 十 分 之 五 流 入 流 动 相 流 动 相 继 续 向 下 移 动, 流 动 相 2(M2) 与 固 定 相 2(S2) 接 触 ; 固 定 相 第 一 段 (S1) 则 又 接 触 没 有 溶 质 的 流 动 相 M2, 溶 质 继 续 在 两 相 中 进 行 分 配 如 此 逐 渐 下 移, 经 多 次 分 配 后,A 物 质 主 要 分 布 在 M3 M4 层,B 物 质 主 要 停 留 在 M2 M3 层, 两 种 物 质 经 多 次 反 复 分 配 后, 分 配 系 数 不 同 的 物 质 就 被 分 离 Martin 和 Synge 计 算 了 硅 酸 柱 的 理 论 塔 板 数,1cm 的 层 析 柱 最 少 有 50 个 理 论 塔 板, 即 在 一 根 20cm 的 层 析 柱 上 最 少 可 进 行 1 000 次 分 配, 可 将 分 配 系 数 不 同 的 物 质 分 离 开 来 最 好 的 分 馏 柱 才 有 20 个 塔 板, 可 见 层 析 柱 分 离 效 率 是 非 常 高 的