假肥大性肌营养不良症

假 性 肥 大 型 进 行 性 肌 营 养 不 良 1. 疾 病 概 述 假 性 肥 大 型 进 行 性 肌 营 养 不 良 是 由 编 码 dystrophin 蛋 白 的 DMD 基 因 突 变 引 起 的 肌 肉 系 统 疾 病, 包 括 杜 氏 肌 营 养 不 良 (Duchenne muscular dystrophy, DMD) [OMIM310200] 和 贝 氏 肌 营 养 不 良 (Becker muscular dystrophy, BMD ) [OMIM300376] 这 是 儿 童 最 常 见 的 致 死 性 肌 肉 疾 病,DMD 发 病 率 为 1/3500 活 产 男 婴,BMD 发 病 率 为 1/30000 男 性 假 性 肥 大 型 进 行 性 肌 营 养 不 良 发 病 年 龄 早, 一 般 在 儿 童 期 发 病, 主 要 表 现 为 独 立 直 坐 和 独 立 行 走 的 时 间 较 同 龄 儿 童 晚, 由 于 肌 肉 虚 弱 而 引 起 步 履 蹒 跚 和 攀 爬 困 难 DMD 病 程 呈 进 行 性 发 展, 患 者 大 约 12 岁 丧 失 行 走 能 力, 约 18 岁 发 生 心 力 衰 竭, 绝 大 部 分 患 者 在 30 岁 以 前 死 于 呼 吸 衰 竭 和 心 力 衰 竭 致 病 基 因 DMD 位 于 Xp21.2, 突 变 后 影 响 其 编 码 的 dystrophin 蛋 白 在 横 纹 肌 组 织 表 达, 导 致 肢 体 近 端 骨 骼 肌 进 行 性 萎 缩 无 力, 以 盆 带 肌 无 力 为 突 出 症 状 与 DMD 相 比,BMD 起 病 年 龄 较 晚, 多 在 5 岁 之 后, 症 状 较 轻 进 展 较 缓 慢, 一 般 于 16 岁 之 后 失 去 独 立 行 走 能 力, 寿 命 可 达 到 30~50 岁 DMD/BMD 预 后 差, 目 前 尚 缺 乏 有 效 的 治 疗 手 段, 药 物 治 疗 只 能 起 到 暂 时 的 缓 解 作 用, 基 因 治 疗 尚 不 能 安 全 有 效 地 推 广 应 用 因 此 目 前 更 有 效 的 手 段 是 通 过 准 确 有 效 的 诊 断 技 术 明 确 患 者 的 基 因 突 变, 明 确 携 带 者 并 进 行 产 前 诊 断, 达 到 防 止 患 儿 出 生 的 目 的

2. 遗 传 方 式 DMD 和 BMD 是 X 连 锁 隐 性 遗 传 病, 一 般 为 女 性 携 带 致 病 基 因, 男 性 发 病 即 母 亲 带 有 致 病 基 因, 但 本 人 不 发 病, 当 把 致 病 基 因 遗 传 给 儿 子 时, 儿 子 就 会 发 病 ; 把 致 病 基 因 遗 传 给 女 儿 时, 女 儿 一 般 不 发 病, 但 女 儿 会 把 致 病 基 因 再 遗 传 给 自 己 的 后 代 ( 见 图 1) 约 30% 的 DMD/BMD 患 者 为 DMD 基 因 新 发 突 变 所 致, 其 母 亲 并 非 致 病 基 因 携 带 者 图 1 X 连 锁 隐 性 遗 传 示 意 图

3. DMD 基 因 概 述 3.1 DMD 基 因 定 位 克 隆 及 功 能 1868 年 Duchenne 首 次 描 述 此 病 1986 年 Monaco 等 首 次 将 DMD 基 因 定 位 于 Xp21.2 随 后 DMD 基 因 通 过 定 位 克 隆 方 法 分 离 确 定,1987 年 Koenig 等 克 隆 了 整 个 DMD 基 因 约 14kb 的 cdna DMD 基 因 是 人 类 最 大 的 基 因 之 一, 位 于 Xp21, 在 基 因 组 序 列 上 跨 越 了 2.5Mbp, 占 全 部 基 因 组 序 列 长 度 的 0.1%, 占 X 染 色 体 全 长 的 1.5% 该 基 因 99% 的 序 列 由 内 含 子 组 成, 编 码 区 包 括 79 个 外 显 子 及 7 个 组 织 特 异 性 的 启 动 子 ( 见 图 1-A) 其 mrna 序 列 长 14Kb, 主 要 表 达 于 骨 骼 肌 心 肌, 少 量 表 达 于 脑 组 织 由 于 不 同 启 动 子 启 动 转 录 的 位 置 不 同, 有 三 种 全 长 的 蛋 白 异 构 体, 具 有 相 同 的 外 显 子 数 目, 分 别 由 不 同 的 组 织 特 异 性 启 动 子 ( 脑 型 B 肌 型 M 蒲 肯 野 细 胞 型 P) 于 基 因 第 一 个 外 显 子 的 不 同 位 置 启 动 转 录 B 型 启 动 子 其 产 物 主 要 表 达 于 大 脑 皮 质 和 海 马 回 神 经 元 ;P 型 启 动 子 其 产 物 主 要 表 达 于 小 脑 蒲 肯 野 氏 细 胞, 在 骨 骼 肌 也 有 极 少 量 的 表 达 ;M 型 启 动 子, 其 产 物 主 要 表 达 于 骨 骼 肌 和 心 肌 组 织, 同 时 在 脑 神 经 胶 质 细 胞 也 有 少 量 表 达 肌 型 dystrophin 蛋 白 是 该 基 因 多 种 产 物 中 了 解 得 最 清 楚 的 一 种 肌 型 dystrophin 蛋 白 是 一 种 427KD 的 棒 状 蛋 白, 长 约 150nm, 分 为 4 个 区 域 ( 见 图 2):1 氨 基 端 区 域 : 与 α-actinin 蛋 白 同 源, 包 含 第 14~240 号 氨 基 酸, 跨 越 1~8 号 外 显 子 ;2 中 央 棒 状 区 : 包 含 253~3040 号 氨 基 酸, 跨 越 9~63 号 外 显 子, 由 24 个 三 聚 螺 旋 状 重 复 结 构 (repeat, R) 组 成, 每 个 重 复 结 构 由 109 个 氨 基 酸 组 成, 与 α-actin 和 spectrin 蛋 白 同 源 重 复 结 构 被 4 个 富 含 脯 氨 酸 的 铰 链 (hinge, H) 结 构 分 隔 开 ;3 富 含 半 胱 氨 酸 区 域 :(3080~3360 号 氨 基 酸 ), 跨 越 64~68 号 外 显 子 ;4 羧 基 端 区 域 :(3361-3685 号 氨 基 酸 ), 跨 越 68~79 号 外 显 子 图 2,DMD 基 因 及 其 不 同 形 式 蛋 白 示 意 图

A: 编 码 dystrophin 蛋 白 的 DMD 基 因, 位 于 Xp21, 黑 色 的 竖 线 代 表 分 布 于 整 个 基 因 上 的 79 个 外 显 子, 黑 色 箭 头 指 示 各 组 织 特 异 性 启 动 子 不 同 的 启 动 位 点, 分 别 以 不 同 的 字 母 缩 写 来 代 表,B( 脑 皮 质 ) M( 肌 组 织 ) P( 蒲 肯 野 细 胞 ) R( 视 网 膜 ) B3( 脑 组 织 ) S( 雪 旺 氏 细 胞 ) 和 G( 肌 组 织 之 外 的 多 种 组 织 器 官 ) B: 不 同 形 式 的 dystrophin 蛋 白 及 其 区 域 组 成, 氨 基 端 中 央 棒 状 区 域 富 含 半 胱 氨 酸 区 域 及 羧 基 端 区 域 Dystrophin 蛋 白 位 于 骨 骼 肌 和 心 肌 细 胞 膜 的 胞 质 面, 通 过 氨 基 端 及 部 分 中 央 棒 状 区 域 与 细 胞 内 的 肌 动 蛋 白 (F-actin) 相 连 接, 羧 基 端 与 细 胞 内 的 Syntrophins 蛋 白 相 连 ; 其 富 含 半 胱 氨 酸 区 以 及 羧 基 端 的 前 半 部 分, 通 过 位 于 肌 膜 上 的 dystroglycans 蛋 白 间 接 与 位 于 肌 膜 上 的 其 他 蛋 白 (sarcoglycan syntrophin 及 dystrobrevin 蛋 白 ) 互 相 作 用, 形 成 DAPC(dystrophin associated protein complex) 复 合 体 ( 见 图 3) 此 复 合 体 在 细 胞 外 基 质 和 细 胞 骨 架 蛋 白 之 间 形 成 了 一 个 物 理 的 连 接 结 构 跨 膜 结 构, 维 持 肌 膜 的 完 整 性, 保 护 肌 纤 维 和 肌 膜 在 长 期 的 反 复 机 械 收 缩 过 程 中 免 受 损 伤 和 坏 死, 起 到 机 械 保 护 和 结 构 支 持, 以 及 信 号 传 导 作 用 DMD 基 因 有 四 个 内 部 的 启 动 子 ( 见 图 1), 可 以 启 动 较 短 形 式 的 dystrophin 蛋 白 的 转 录, 它 们 不 具 有 结 合 actin 蛋 白 的 末 端, 但 保 留 了 富 含 半 胱 氨 酸 区 域 和 羧 基 末 端, 以 使 其 能 够 与 dystroglycan dystrobrevin 和 syntrophin 蛋 白 相 结 合 基 因 内 部 的 启 动 子 分 别 以 DMD 基 因 第 30 45 56 和 63 号 外 显 子 作 为 第 一 个 外 显 子 启 动 转 录, 其 产 物 分 别 为 260kDa (Dp260) 140kDa (Dp140) 116kDa (Dp116) 和 71kDa (Dp71) Dp260 在 视 网 膜 中 高 表 达, 同 时 在 脑 和 肌 组 织 中 与 全 长 型 的 dystrophin 蛋 白 共 表 达 ;Dp140 表 达 于 脑 视 网 膜 和 肾 组 织 ;Dp116 只 在 成 熟 的 外 周 神 经 组 织 ( 雪 旺 氏 细 胞 ) 中 表 达 ;Dp71 在 包 括 脑 视 网 膜 肾 脏 肝 脏 肺 脏 等 多 种 组 织 器 官 中 表 达, 而 不 在 骨 骼 肌 中 表 达

图 3: 肌 营 养 不 良 相 关 蛋 白 复 合 体 示 意 图 箭 头 指 示 不 同 蛋 白 异 常 引 起 的 不 同 肌 营 养 不 良 3.2 DMD 基 因 的 突 变 DMD 基 因 最 多 见 的 突 变 是 基 因 内 部 一 个 或 多 个 外 显 子 的 缺 失, 占 总 突 变 类 型 的 65% 而 重 复 型 突 变 的 发 生 率 因 检 测 手 段 敏 感 性 不 同 为 5% 到 15% 其 余 的 突 变 则 为 点 突 变 或 微 缺 失, 通 常 导 致 无 义 突 变 和 移 码 突 变 在 DMD 基 因 的 突 变 中, 约 有 30% 是 新 发 突 变, 而 非 遗 传 所 致 缺 失 几 乎 可 发 生 于 该 基 因 的 任 何 部 位, 但 存 在 两 个 缺 失 热 区 一 个 位 于 基 因 的 中 央 区 域, 是 最 多 见 的 缺 失 区 域, 多 包 括 45~55 号 外 显 子 之 间 的 一 个 或 多 个 外 显 子 的 缺 失, 其 5 端 断 裂 点 常 位 于 44 号 内 含 子 内,3 端 断 裂 点 多 位 于 50 号 内 含 子 ; 另 一 个 缺 失 热 区 位 于 基 因 的 5 端, 包 括 2~19 号 外 显 子 之 间 的 一 个 或 多 个 外 显 子 的 缺 失, 其 断 裂 点 常 发 生 在 2 号 或 7 号 内 含 子, 也 常 常 会 发 生 在 下 游 的 内 含 [ 错 误! 未 定 义 书 签 子 中 ] 位 于 缺 失 热 区 中 的 外 显 子 的 缺 失 占 全 部 各 种 缺 失 的 98% 形 成 缺 失 热 区 的 原 因 不 甚 明 了, 有 人 认 为 与 Xp21 区 域 染 色 质 结 构 有 关 重 复 突 变 与 缺 失 突 变 区 域 存 在 部 分 重 叠, 重 复 突 变 发 生 频 率 最 多 的 是 3~7 号 5~7 号 及 16~34 号 外 显 子 之 间 的 重 复 与 缺 失 突 变 不 同, 点 突 变 没 有 显 著 的 分 布 热 点, 随 机 地 分 布 于 整 个 基 因 上 如 果 将 基 因 按 长 度 分 为 4 等 分, 则 分 别 有 24% 31% 16% 29% 的 点 突 变 依 次 分 布 在 其 上 在 DMD 患 者 所 发 现 的 点 突 变 多 数 为 无 义 突 变 或 导 致 移 码 的 微 缺 失 或 微 插 入, 剪 接 位 点 的 突 变 也 比 较 多 见, 约 占 点 突 变 的 34% 而 且 某 些 错 义 或 无 义 的 点 突 变 位 于 外 显 子 剪 接 增 强 子, 可 引 起 外 显 子 的 跳 跃, 进 一 步 导 致 相 应 外 显 子 的 缺 失 3.3. 基 因 型 与 表 型 之 间 的 关 系 : 缺 失 重 复 与 阅 读 框 规 则 根 据 大 量 的 实 验 研 究 和 临 床 观 察 研 究 证 明, 在 缺 失 和 重 复 的 位 置 和 片 段 长 度 与 肌 病 的 临 床 症 状 严 重 程 度 之 间 并 不 存 在 简 单 的 相 关 关 系 例 如, 缺 失 较 小 的 44 号 外 显 子, 可 导 致 典 型 DMD 的 临 床 表 现 ; 然 而, 有 些 临 床 表 现 为 BMD 的 患 者, 却 存 在 该 基 因 50% 的 大 片 段 缺 失 缺 失 基 因 的 5 端 和 中 央 棒 状 区 域 可 导 致 中 等 或 相 对 较 重 程 度 的 肌 萎 缩 和 肌 无 力, 在 某 些 病 例, 此 区 域 中 的 缺 失, 只 引 起 肌 痛 和 肌 肉 抽 搐, 但 不 引 起 肌 无 力, 有 些 患 者 只 表 现 为 血 清 中 肌 酸 激 酶 水 平 的 增 高 因 此,Monaco 提 出 了 阅 读 框 规 则 (frame-shift hypothesis), 认 为 保 留 了 阅 读 框 (in frame) 的 突 变 通 常 仍 可 以 产 生 但 有 部 分 功 能 的 dystrophin 蛋 白 但 如 果, 缺 失 或 重 复 破 坏 了 阅 读 框 (out-of frame/ frame-shift), 则 引 起 RNA 的 不 稳 定, 所 产 生 的 截 短 蛋 白 量 极 少, 在 细 胞 中 迅 速 降 解, 不 能 发 挥 功 能 所 以, 影 响 基 因 开 放 阅 读 框 的 突 变 会 导 致 发 病 较 早 症 状 较 重 的 DMD; 不 影 响 阅 读 框 的 突 变 会

表 现 为 BMD 总 体 上, 约 92% 的 缺 失 突 变 及 临 床 表 型 与 阅 读 框 规 则 相 符 [i] 因 而 认 为, 表 型 的 严 重 程 度 取 决 于 缺 失 或 重 复 是 否 影 响 了 开 放 阅 读 框, 而 不 取 决 于 缺 失 / 重 复 片 段 的 大 小 但 是, 也 有 患 者 的 基 因 型 与 表 型 之 间 不 符 合 阅 读 框 规 则 [13], 一 些 患 者 具 有 out-of-frame 突 变 但 表 型 为 BMD, 其 原 因 可 能 是 在 可 变 剪 接 的 过 程 中 产 生 了 外 显 子 跳 跃 (exon skipping), 其 蛋 白 通 常 保 留 羧 基 末 端, 仍 具 有 功 能 对 于 这 类 患 者, 通 过 蛋 白 的 免 疫 组 化 分 析, 有 助 于 证 实 是 否 有 dystrophin 蛋 白 产 生, 这 些 信 息 可 与 临 床 表 现 一 起 来 评 价 疾 病 的 严 重 程 度

4. 临 床 表 现 及 鉴 别 诊 断 4.1 临 床 表 现 1 大 多 数 DMD 患 者 于 5 岁 前 发 病, 近 半 数 病 人 在 学 会 行 走 之 前 就 出 现 本 病 的 表 现 某 些 幼 儿 学 会 行 走 或 跑 步 后, 却 出 现 了 不 愿 意 行 走 或 跑 活 力 下 降 易 于 跌 倒 的 现 象 2 盆 带 肌 受 累 出 现 最 早, 病 情 呈 进 行 性 发 展 患 者 的 行 走 跑 步 和 上 下 楼 梯 日 益 困 难, 步 态 蹒 跚 日 益 明 显, 出 现 典 型 的 Gowers 征 ( 见 图 4): 即 由 卧 位 起 立 时, 先 翻 身 转 为 俯 卧 位, 屈 膝 髋 关 节, 用 手 按 压 膝 部 以 辅 助 股 四 头 肌 的 肌 力, 双 手 攀 附 下 肢 缓 慢 地 站 立 3 胸 带 肌 和 上 臂 肌 受 累 后 出 现 上 肢 无 力 和 翼 状 肩 当 肌 纤 维 消 失 时, 腱 反 射 减 弱, 直 至 消 失 4 部 分 患 者 可 有 心 脏 受 累, 可 出 现 不 同 类 型 的 心 律 失 常, 心 肌 纤 维 丧 失 和 左 心 室 壁 基 底 部 被 纤 维 化 组 织 取 代 在 部 分 病 例 中 可 观 察 到 轻 度 的 非 进 行 性 的 智 力 发 育 迟 缓 5 大 多 患 者 在 13 岁 之 前 失 去 独 立 行 走 能 力, 随 着 病 情 加 重, 死 亡 多 发 生 于 青 春 期 后 期, 不 到 20%~25% 的 患 者 可 以 存 活 到 25 岁 肺 部 感 染 和 呼 吸 衰 竭 是 导 致 死 亡 的 主 要 原 因, 部 分 为 心 脏 失 代 偿 所 致 6 腓 肠 肌 和 某 些 其 他 肌 肉 的 肥 大 在 本 病 的 早 期 呈 进 行 性 发 展, 但 大 多 数 肌 肉, 甚 至 最 初 肥 大 的 肌 肉, 最 终 体 积 缩 小 只 有 腓 肠 肌 程 度 较 轻 的 股 外 侧 肌 和 三 角 肌 为 持 续 性 肥 大 肥 大 的 肌 肉 坚 实 而 有 弹 性 ( 橡 皮 样 ), 但 不 如 健 康 的 肌 肉 有 力 且 肌 张 力 较 低, 为 假 性 肥 大 7 BMD 多 在 5~15 岁 发 病, 临 床 表 现 与 DMD 相 似 : 首 先 累 及 骨 盆 带 肌 和 下 肢 近 端 肌 肉, 有 腓 肠 肌 假 性 肥 大, 逐 渐 波 及 肩 胛 带 肌 ; 但 发 病 年 龄 较 晚, 进 展 缓 慢, 病 情 较 轻,12 岁 尚 能 行 走, 心 脏 很 少 受 累, 智 力 正 常, 寿 命 可 达 到 30~50 岁

图 4,Gower 征 4.2 鉴 别 诊 断 1 肢 带 型 肌 营 养 不 良 (LGMD) 临 床 症 状 与 DMD 相 似, 为 常 染 色 体 遗 传 性 疾 病, 无 性 别 差 异 肢 带 型 肌 营 养 不 良 是 由 编 码 sarcoglycans 蛋 白 和 编 码 其 它 与 肌 肉 细 胞 膜 蛋 白 相 关 的 基 因 突 变 引 起 的 2 Emery-Dreifuss 肌 肉 综 合 症 (EDMD) 主 要 临 床 特 征 是 从 婴 儿 期 患 者 关 节 挛 缩, 早 期 肱 部 和 腓 部 出 现 缓 慢 加 重 的 肌 无 力, 晚 期 蔓 延 到 肩 胛 和 盆 骨 部 ; 心 律 不 齐 可 引 发 昏 厥, 耐 力 不 足 ; 发 病 年 龄 和 病 情 的 严 重 程 度 与 心 脏 的 受 累 程 度 在 同 一 个 家 系 中 也 会 有 所 不 同 一 般 情 况, 在 患 者 发 病 的 前 十 年 中 表 现 为 关 节 挛 缩, 之 后 出 现 肌 无 力, 二 十 年 后 心 脏 才 会 受 累 有 两 个 基 因 与 疾 病 相 关, 一 个 是 位 于 X 染 色 体 的 编 码 emerin 蛋 白 的 基 因 EMD, 另 一 个 是 编 码 核 纤 层 蛋 白 A/C 的 LMNA 基 因 ( 常 染 色 体 显 性 遗 传 EDMD 和 常 染 色 体 隐 性 遗 传 EDMD) 3 脊 肌 萎 缩 症 (SMA) SMA 的 主 要 症 状 包 括 : 肌 肉 缺 乏 弹 性, 面 部 和 眼 部 肌 肉 肌 无 力, 累 及 到 脊 髓 前 角 细 胞, 肌 束 震 颤 和 腱 反 射 丧 失 SMA 是 SMN 基 因 突 变 引 起 的, 为 常 染 色 体 隐 性 遗 传

5. 实 验 室 诊 断 5.1 血 清 酶 测 定 : 血 清 肌 酸 磷 酸 激 酶 (CK) 增 高 是 诊 断 本 病 重 要 而 敏 感 的 指 标, 患 者 在 出 生 后 即 可 有 CK 的 增 高 一 般 患 者 在 3-8 岁 CK 值 达 高 峰, 以 后 逐 渐 下 降, 瘫 痪 以 后 明 显 下 降 甚 至 正 常 患 者 CK 值 常 为 正 常 值 的 10-100 倍 BMD 患 者 较 DMD 患 者 的 CK 测 定 值 稍 低, 常 为 正 常 值 的 5 倍 以 上,LGMD 患 者 的 CK 值 可 轻 度 或 中 度 增 高 血 清 肌 红 蛋 白 (MB) 在 本 病 早 期 及 基 因 携 带 者 中 多 显 著 增 高 血 清 丙 酮 酸 酶 (PK) 也 很 敏 感, 但 正 常 人 血 清 PK 值 随 年 龄 增 长 而 降 低, 因 此 不 同 年 龄 组 要 用 不 同 标 准 值 醛 缩 酶 (ADL), 乳 酸 脱 氢 酶 (LDH), 谷 草 转 氨 酶 (GOT), 谷 丙 转 氨 酶 (GPT) 等, 也 可 增 高, 但 均 非 肌 病 的 特 异 改 变, 亦 不 敏 感 5.2 尿 检 查 : 尿 肌 酸 排 出 增 多, 肌 酐 减 少 5.3 肌 电 图 : 表 现 为 肌 源 性 损 害, 可 见 插 入 电 位 延 长, 肌 松 弛 时 出 现 自 发 电 位, 轻 收 缩 时 运 动 单 位 电 位 的 平 均 波 幅 和 平 均 进 限 均 较 正 常 为 低, 也 可 见 短 棘 波 多 相 电 位, 强 收 缩 时 可 见 病 理 干 扰 相, 峰 值 电 压 小 于 1000μv, 运 动 神 经 传 导 速 度 正 常 5.4 肌 活 检 :DMD 患 者 肌 肉 基 本 病 理 改 变 为 肌 纤 维 坏 死 和 再 生, 肌 膜 核 内 移, 出 现 肌 细 胞 萎 缩 与 代 偿 性 增 大 相 嵌 分 布 的 典 型 表 现, 并 随 着 病 情 进 展 这 种 肌 细 胞 大 小 差 异 不 断 增 加 肥 大 肌 细 胞 的 横 纹 肌 消 失, 光 镜 下 呈 玻 璃 样 变 ; 坏 死 肌 细 胞 出 现 空 泡 增 多, 絮 样 变 性 颗 粒 变 性 和 吞 噬 现 象 肌 细 胞 间 质 内 可 见 大 量 脂 肪 和 结 缔 组 织 增 生 肌 活 检 免 疫 组 化 检 查 可 见 dystrophin 蛋 白 缺 失 或 异 常

6. 基 因 诊 断 DMD 基 因 巨 大, 突 变 类 型 多 样, 因 此, 若 对 DMD 基 因 多 种 类 型 突 变 进 行 有 效 检 测, 则 需 要 联 合 采 用 多 种 技 术, 采 用 一 定 的 技 术 路 线, 对 突 变 进 行 综 合 分 析 缺 失 / 重 复 突 变 检 测 在 DMD 基 因 的 缺 失 检 测 中, 最 常 用 的 是 18 个 外 显 子 的 多 重 PCR 技 术, 即 通 过 两 组 9 重 PCR 对 DMD 基 因 缺 失 热 区 的 18 个 外 显 子 进 行 缺 失 检 测, 该 技 术 可 检 测 到 98% 的 DMD 基 因 缺 失 型 突 变 其 缺 点 是 不 能 检 测 非 缺 失 热 区 中 的 外 显 子, 且 不 能 检 测 重 复 突 变 对 于 男 性 DMD/BMD 患 者, 其 缺 失 可 通 过 常 规 的 多 重 PCR 方 法 来 检 测, 而 对 于 缺 失 型 女 性 携 带 者, 由 于 其 存 在 一 条 正 常 的 X 染 色 体 而 难 于 检 测, 同 样 对 于 重 复 型 突 变, 均 需 要 对 基 因 进 行 定 量 检 测 目 前 对 基 因 进 行 定 量 检 测 的 技 术 有 荧 光 定 量 PCR(Real-time PCR) 技 术 MLPA 技 术 和 基 因 芯 片 技 术 点 突 变 或 微 缺 失 微 插 入 的 检 测 DMD 基 因 没 有 固 定 的 点 突 变 及 突 变 热 区, 所 以 对 点 突 变 的 检 测 工 作 量 大 费 用 高 且 难 度 大 检 测 方 法 包 括 在 mrna 基 础 上 直 接 对 cdna 序 列 的 分 析, 在 基 因 组 DNA 基 础 上 的 突 变 筛 查, 以 及 对 DMD 基 因 79 个 外 显 子 进 行 序 列 分 析 等 其 中 最 有 效 的 技 术 是 在 mrna 基 础 上 对 cdna 的 分 析, 可 直 接 找 到 致 病 突 变, 其 难 点 是, 技 术 难 度 较 大, 需 要 肌 组 织 活 检 直 接 对 79 个 外 显 子 进 行 序 列 分 析 的 方 法 工 作 量 大, 费 用 也 较 高 因 此 对 于 一 般 的 实 验 室, 仍 多 采 用 筛 查 的 方 法, 其 中 变 性 高 效 液 相 色 谱 技 术 (denatruring high-performance liquid chromatography, DHPLC) 操 作 较 简 便 快 速 连 锁 分 析 单 体 型 分 析 在 DMD 产 前 诊 断 中, 如 果 先 证 者 已 检 出 致 病 突 变, 则 可 直 接 检 测 胎 儿 是 否 存 在 相 应 的 致 病 突 变, 做 出 明 确 的 产 前 诊 断 ; 如 果 先 证 者 未 检 出 致 病 突 变, 则 DMD 基 因 的 单 体 型 分 析 是 间 接 且 有 效 的 途 径 由 于 DMD 基 因 内 部 微 卫 星 标 记 之 间 的 重 组 频 率 为 12%, 故 通 过 连 锁 分 析 来 判 断 携 带 者 或 产 前 诊 断 时, 将 可 能 导 致 分 析 不 全 面 甚 至 误 诊 的 情 况 6.1 检 测 对 象 1 临 床 诊 断 为 DMD 的 患 者 2 曾 生 育 DMD 患 儿 或 家 族 中 有 DMD 患 者 的 女 性 3 对 有 患 DMD 风 险 的 胎 儿 进 行 产 前 诊 断 6.2 检 测 流 程 1 先 证 者 进 行 DMD 的 临 床 诊 断

2 对 临 床 诊 断 为 DMD 的 患 者 进 行 DMD 基 因 18 个 外 显 子 的 多 重 PCR 检 测, 若 发 现 外 显 子 的 缺 失 即 可 确 诊 为 DMD 基 因 缺 失 型 患 者 3 对 于 多 重 PCR 检 测 未 见 缺 失 的 患 者 可 采 用 DHPLC 和 测 序 技 术 对 其 DMD 基 因 进 行 点 突 变 的 检 测 4 进 行 产 前 诊 断 的 胎 儿 应 进 行 性 别 鉴 定 5 对 于 先 证 者 已 明 确 致 病 突 变 的 产 前 诊 断, 可 针 对 该 突 变 对 胎 儿 进 行 检 测, 并 结 合 连 锁 分 析 的 方 法 进 一 步 证 实 检 测 结 果 6 对 于 先 证 者 未 明 确 致 病 突 变 的 产 前 诊 断, 可 通 过 连 锁 分 析 的 方 法 间 接 判 断 胎 儿 是 否 患 病 6.3 检 测 方 法 1 mpcr 扩 增 检 测 缺 失 突 变 对 缺 失 热 区 的 18 个 外 显 子 分 为 A 组 和 B 组 进 行 mpcr 扩 增,A 组 引 物 扩 增 4 8 17 19 44 45 48 51 和 60 号 外 显 子,B 组 引 物 扩 增 Pm( 启 动 子 ) 3 6 12 13 43 47 50 和 52 号 外 显 子 两 组 mpcr 扩 增 产 物 经 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 进 行 检 测, 以 确 定 是 否 有 外 显 子 的 缺 失 当 mpcr 检 测 到 单 个 或 多 个 外 显 子 缺 失 时, 应 用 相 应 引 物 进 行 单 个 外 显 子 扩 增, 或 缺 失 片 段 两 端 及 外 侧 外 显 子 的 单 独 扩 增, 以 进 一 步 证 实 检 测 结 果, 同 时 检 测 缺 失 片 段 两 侧 的 外 显 子 是 否 缺 失, 以 确 定 缺 失 的 范 围 该 技 术 可 检 测 到 98% 的 DMD 基 因 缺 失 型 突 变 2 应 用 DHPLC 技 术 进 行 点 突 变 的 检 测 应 用 DHPLC 技 术, 对 未 检 测 到 缺 失 突 变 的 患 者 进 行 DMD 基 因 全 部 外 显 子 的 筛 查, 包 括 基 因 5 - 端 启 动 子 区 域 79 个 外 显 子 和 3 - 端 下 游 部 分 碱 基, 共 86 个 片 段, 包 括 1 号 外 显 子 在 内 的 DMD 基 因 5 - 端 序 列 分 为 3 个 片 段, 包 括 79 号 外 显 子 在 内 的 3 - 端 序 列 分 为 7 个 片 段 来 检 测 和 分 析 将 DHPLC 检 测 到 异 源 双 峰 的 PCR 产 物, 酶 切 后 进 行 DNA 序 列 测 定, 以 确 定 点 突 变 3 胎 儿 性 别 鉴 定 以 胎 儿 羊 水 细 胞 gdna 为 模 板,PCR 扩 增 检 测 胎 儿 Y 染 色 体 性 别 决 定 基 因 (sex-determing region Y gene,sry), 确 定 性 别 当 SRY 基 因 和 内 对 照 (DMD 基 因 6 号 外 显 子 ) 均 有 PCR 产 物 时 为 SRY 阳 性, 表 明 待 诊 胎 儿 为 男 性 ; 只 有 内 对 照 产 物 而 没 有 SRY 基 因 PCR 产 物 时, 为 SRY 阴 性, 表 明 待 诊 胎 儿 为 女 性 4 单 体 型 分 析 女 性 携 带 者 检 测

在 DMD 基 因 内 部 及 下 游 200kb 范 围 内 选 择 11 个 杂 合 度 较 高 的 微 卫 星 (STR) 位 点, 大 部 分 为 (CA)n 重 复, 进 行 DMD 基 因 的 单 体 型 分 析, 以 间 接 判 断 胎 儿 是 否 患 病 或 女 性 是 否 为 携 带 者, 由 于 DMD 基 因 内 部 微 卫 星 标 记 之 间 的 重 组 频 率 为 12%, 故 通 过 连 锁 分 析 来 判 断 携 带 者 或 产 前 诊 断 时, 将 可 能 导 致 分 析 不 全 面 甚 至 误 诊 的 情 况 7. 遗 传 咨 询 对 受 累 家 系 成 员 进 行 遗 传 咨 询 旨 在 对 家 系 中 DMD/BMD 的 再 发 风 险 进 行 评 估 并 进 行 预 防 1 DMD/BMD 为 X 连 锁 隐 性 遗 传 性 疾 病, 女 性 可 为 致 病 基 因 的 携 带 者, 其 生 育 的 男 性 后 代 有 50% 为 患 者, 女 性 后 代 有 50% 为 携 带 者 2 若 患 者 母 亲 的 家 族 中 还 有 其 他 患 病 个 体, 则 该 母 亲 为 致 病 基 因 携 带 者, 母 亲 家 族 中 的 其 他 女 性 成 员 亦 可 能 为 致 病 突 变 的 携 带 者 3 散 发 患 者 的 母 亲 有 2/3 的 可 能 为 致 病 基 因 的 携 带 者, 若 突 变 发 生 在 先 证 者 外 祖 母 受 孕 时 的 卵 子, 则 母 亲 所 有 细 胞 皆 携 带 有 致 病 突 变 若 突 变 发 生 在 母 亲 的 胚 胎 早 期, 则 为 体 细 胞 嵌 合 体, 外 周 血 可 能 检 测 不 到 致 病 基 因 突 变 亦 可 仅 发 生 在 母 亲 的 卵 子 中 ( 生 殖 腺 嵌 合 体 ), 其 可 能 性 为 15%-20%, 该 突 变 在 外 周 血 中 不 能 检 出 4 散 发 患 者 的 母 亲 亦 可 能 正 常 个 体, 先 证 者 为 新 发 突 变, 突 变 可 能 发 生 在 胚 胎 早 期, 患 者 部 分 细 胞 存 在 突 变 5 约 8% 的 女 性 携 带 者 可 有 不 同 程 度 的 症 状, 且 有 较 高 患 扩 张 性 心 脏 病 的 风 险 6 男 性 DMD 患 者 一 般 不 能 生 育 男 性 DMD 患 者 可 生 育, 其 女 性 后 代 均 为 携 带 者, 男 性 后 代 一 般 不 患 该 病 7 对 于 曾 生 育 DMD 患 者 的 母 亲 或 有 DMD 家 族 史 的 育 龄 女 性 在 生 育 时, 均 应 在 对 先 证 者 进 行 基 因 诊 断 的 基 础 上 进 行 产 前 诊 断, 以 防 止 类 似 患 儿 的 出 生

8. 治 疗 及 预 防 DMD/BMD 目 前 尚 无 特 异 性 治 疗, 以 对 症 治 疗 为 主 合 理 的 对 症 治 疗 可 以 延 长 患 者 的 存 活 时 间 及 改 善 其 生 活 质 量 8.1 激 素 治 疗 有 研 究 表 明 强 的 松 等 激 素 类 药 物 具 有 膜 稳 定 效 应 以 及 一 定 的 抗 炎 作 用, 其 可 以 提 高 DMD 个 体 的 肌 肉 强 度 和 功 能 大 于 5 岁 的 男 孩 可 用 强 的 松 (0.75/mg/kg/day) 予 以 治 疗, 如 不 出 现 严 重 的 副 作 用 可 以 持 续 使 用 随 着 强 的 松 剂 量 的 逐 渐 减 少 至 0.3 mg/kg/day, 患 者 运 动 会 有 所 改 善 激 素 治 疗 的 副 作 用 包 括 体 重 增 加 类 库 兴 氏 综 合 征 症 状, 身 材 矮 小, 痤 疮, 毛 发 过 度 生 长, 胃 肠 综 合 症 及 行 为 改 变 等, 若 出 现 以 上 症 状, 可 以 减 小 药 物 剂 量 或 停 药 8.2 扩 张 性 心 肌 病 的 治 疗 血 管 紧 张 素 转 换 酶 抑 制 剂 和 β- 受 体 阻 断 剂 可 应 用 于 早 期 心 肌 病, 该 治 疗 可 使 早 期 的 左 心 室 大 小 和 收 缩 功 能 恢 复 正 常 对 于 重 症 患 者 可 进 行 心 脏 移 植 8.3 饮 食 及 理 疗 患 者 需 食 用 富 含 维 生 素 D 和 钙 的 均 衡 食 品, 以 提 高 骨 密 度, 减 少 骨 折 的 风 险 如 果 血 清 中 维 生 素 D 浓 度 低 于 20ng/ml, 则 需 给 以 药 剂 补 充 物 理 疗 法 可 提 高 患 者 运 动 能 力 并 预 防 挛 缩 8.4 预 防 10 岁 以 上 的 患 者 应 定 期 进 行 心 肺 功 能 的 监 控 对 于 女 性 携 带 者, 十 几 岁 后 应 进 行 心 脏 的 监 控, 以 预 防 扩 张 性 心 脏 病 的 发 生 对 于 有 脊 柱 侧 凸 的 患 者 应 给 与 矫 正, 必 要 时 进 行 手 术 治 疗 9. DMD 治 疗 的 研 究 进 展 9.1 基 因 治 疗 采 用 外 源 性 载 体 将 全 长 或 微 dys 基 因 介 导 入 病 变 细 胞 使 其 表 达 功 能 蛋 白, 达 到 修 复 作 用 目 前 的 主 要 策 略 有 : 1 质 粒 直 接 注 射 将 纯 化 的 dyscdna 微 dys 和 全 长 dys 通 过 肌 肉 或 腹 腔 注 射 注 入 DMD 的 模 型 动 物 体 内, 得 到 了 肌 细 胞 中 dys 蛋 白 的 表 达 该 方 法 的 优 点 : 简 单, 易 于 操 作 ; 无 生 物 载 体 引 起 的 毒 性 反 应 缺 点 : 表 达 效 率 低, 时 间 短, 分 布 局 限, 不 能 整 合 在 真 核 细 胞 的 基 因 组 内, 随 分 裂 逐 代 稀 释 直 至 消 失 该 方 法 很 少 用 2 非 病 毒 载 体 即 利 用 DNA 所 带 的 阴 离 子 与 带 阳 离 子 的 脂 质 体 进 行 物 理 性 结 合, 将 结 合 体 注 射 入 体 内, 利 用 细 胞 的 内 吞 作 用 转 移 基 因 其

优 点 是 外 源 性 基 因 容 量 大, 无 抗 原 蛋 白 和 生 物 毒 性 ; 缺 点 是 转 染 率 不 高, 分 布 局 限, 对 肌 细 胞 的 靶 向 作 用 差, 且 表 达 时 间 短 3 病 毒 载 体 修 饰 病 毒 转 染 是 目 前 认 为 较 为 有 效 的 治 疗 办 法 常 用 的 病 毒 载 体 有 逆 转 录 病 毒 (RV) 单 纯 疱 疹 病 毒 (HSV) 和 腺 病 毒 (Adv) 等 其 优 点 是 转 染 力 强, 表 达 效 率 较 高 ; 缺 点 是 细 胞 毒 性 大, 安 全 性 较 差 虽 然 基 因 治 疗 的 研 究 取 得 了 很 大 进 展, 但 是 还 存 在 很 多 弊 病 : 随 机 的 非 完 整 的 DNA 插 入 可 能 会 引 起 细 胞 突 变 原 癌 基 因 激 活 ; 插 入 基 因 的 表 达 不 能 完 全 替 代 消 失 的 dys 及 其 相 关 蛋 白 的 功 能 ; 表 达 的 外 源 性 蛋 白, 可 引 起 免 疫 排 斥 反 应 ; 基 因 治 疗 只 能 修 复 未 变 性 的 细 胞, 能 逆 转 已 变 性 的 细 胞 理 想 的 基 因 治 疗 应 是 : 将 目 的 基 因 有 效 转 染 至 各 个 时 期 的 肌 细 胞, 得 到 高 效 表 达 ; 分 布 广 泛, 遍 布 所 有 病 损 组 织 ; 细 胞 毒 性 反 应 小 ; 表 达 时 间 长 ; 有 靶 向 性, 对 病 损 组 织 以 外 的 部 分 无 负 面 影 响 可 见, 目 前 的 基 因 治 疗 尚 未 达 到 这 些 要 求 9.2 细 胞 移 植 疗 法 成 肌 细 胞 移 植 治 疗 是 一 种 能 成 功 地 将 人 类 基 因 组 完 整 转 移 的 方 式, 即 将 分 离 培 养 的 患 者 亲 属 的 成 肌 细 胞 局 部 注 射 到 患 者 肌 肉 内, 使 供 体 成 肌 细 胞 在 患 者 肌 细 胞 中 存 在 并 表 达 dys 蛋 白, 从 而 达 到 改 善 肌 肉 功 能 的 目 的, 该 法 是 目 前 被 美 国 食 品 药 品 管 理 局 批 准 的 唯 一 可 用 于 临 床 实 验 的 DMD 治 疗 方 法 骨 髓 细 胞 移 植 治 疗 是 将 供 体 的 具 有 多 向 分 化 功 能 的 造 血 干 细 胞 和 基 质 细 胞 通 过 静 脉 移 植 入 患 者 体 内, 在 变 性 肌 肉 组 织 中 的 趋 化 因 子 的 趋 化 作 用 下, 使 其 与 粒 细 胞 巨 噬 细 胞 等 一 起 进 入 肌 组 织 中, 在 变 性 微 环 境 诱 导 下 逐 渐 分 化 成 肌 源 性 细 胞

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