4- 海 外 检 验 医 学 -- 年 4 月 第 4 卷 第 期 3;) " "+ " 7 $ & 37" &' -- #*4 5 * 综 述 新 一 代 测 序 技 术 从 基 础 研 究 到 临 床 诊 断!" #" $ % " " * 3 * 3!"#*$%" 33 背 景 3 在 过 去 的 4- 年 里 " 法 是 主 要 的 (5 测 序 方 法 同 时 也 是 (5 测 序 的 金 标 准 --, 年 第 一 个 大 规 模 并 行 焦 磷 酸 测 序 系 统 平 台 的 商 业 化 引 领 了 高 通 量 基 因 组 测 序 的 新 时 代 这 种 方 法 也 就 是 现 在 的 新 一 代 测 序 方 法 即 56 " & 内 容 3 本 文 综 述 了 这 些 商 业 化 56 平 台 的 基 本 原 理 尽 管 这 些 平 台 在 构 造 设 计 和 测 序 化 学 方 法 上 有 所 不 同 但 是 他 们 都 采 用 了 同 一 种 技 术 模 式 即 以 大 规 模 并 行 方 式 对 空 间 上 分 离 的 每 个 流 动 池 内 克 隆 扩 增 的 (5 模 板 或 单 个 (5 分 子 进 行 测 序 通 过 聚 合 酶 介 导 核 苷 酸 延 伸 的 反 复 循 环 或 者 是 连 续 的 寡 核 苷 酸 连 接 在 目 前 条 件 下 可 以 常 规 获 得 数 百 7+ 或 6+ 的 测 序 信 息 这 篇 综 述 主 要 关 注 56 对 基 础 研 究 的 影 响 对 生 物 信 息 学 的 要 求 以 及 将 这 项 技 术 应 用 于 临 床 诊 断 的 现 状 同 时 本 文 也 对 未 来 一 些 技 术 比 如 实 时 单 分 子 (5 测 序 和 纳 米 孔 测 序 做 一 展 望 小 结 3 从 --, 年 到 现 在 的 一 段 相 对 较 短 的 时 间 内 56 已 经 从 根 本 上 改 变 了 基 因 组 的 研 究 模 式 并 且 让 研 究 者 可 以 实 施 一 些 以 前 由 于 技 术 不 可 行 性 或 价 格 昂 贵 而 不 能 开 展 的 实 验 新 一 代 测 序 方 法 的 相 关 技 术 仍 在 继 续 发 展 技 术 稳 定 性 和 过 程 流 水 化 程 度 的 进 一 步 提 高 将 使 新 一 代 测 序 方 法 的 临 床 应 用 变 为 可 能 338 年 发 表 了 两 篇 描 述 (5 测 序 方 法 的 标 志 性 文 章 #" 7""! 和."# 6 #+ 报 道 了 将 末 端 标 记 的 (5 片 段 进 行 碱 基 特 异 性 的 化 学 裂 解 反 应 产 物 用 凝 胶 电 泳 方 法 分 离 另 一 方 法 由 1 $ & " 及 其 同 事 报 道 采 用 双 脱 氧 核 苷 酸 类 似 物 渗 入 (5 链 末 端 使 得 引 物 (5 合 成 过 程 中 出 现 碱 基 特 异 性 终 止 " 法 的 不 断 完 善 以 及 商 业 化 使 其 在 研 究 领 域 广 泛 运 用 并 最 终 应 用 于 临 床 诊 断 在 产 业 化 高 通 量 处 理 方 面 " 法 被 用 于 人 类 基 因 组 计 划 中 第 一 个 人 类 基 因 组 测 序 该 计 划 于 --4 年 完 成 历 时 4 年 花 费 亿 美 元 对 比 一 下 到 了 --/ 年 完 成 一 个 人 类 基 因 组 测 序 仅 需 用, 个 月 的 时 间 花 费 约,- 万 美 元 4 后 者 的 完 成 使 得 在 过 去, 年 中 新 出 现 并 获 得 快 速 发 展 的 56! "#"$ %# &"#"' # "# " % "' ( "! "' # ) "' "# " % "'* $$ & $ & ' " ' " "+ ",-- %' "." "# " % "' /0-/*1" /-,/0, -!" #) # " #"+*&!* **("! "$ *(*( &' & + $ "# ' ) 2* 技 术 的 能 力 得 到 重 视 目 前 已 有, 个 56 商 业 化 可 用 平 台 还 有 更 多 的 平 台 正 在 兴 建 为 了 加 快 研 究 步 伐 美 国 国 立 人 类 基 因 组 研 究 中 心 596 在 --/ 年 / 月 宣 布 资 助 一 系 列 项 目 作 为 项 目 革 新 基 因 组 测 序 技 术 计 划 的 一 部 分 其 目 标 是 花 费 --- 美 元 或 者 更 少 来 完 成 单 个 人 基 因 组 的 测 序 ' :: 222*! * ):,,/, 本 文 综 述 了 56 技 术 56 对 基 础 研 究 的 影 响 并 探 讨 56 有 多 大 应 用 潜 力 可 以 对 分 子 诊 断 产 生 实 质 性 影 响 一 56 平 台 基 本 原 理 56 平 台 有 一 个 共 同 技 术 特 征 就 是 对 在 空 间 上 分 离 的 单 个 流 动 池 中 克 隆 放 大 的 或 者 单 个 (5 分 子 进 行 大 规 模 并 行 测 序 这 种 设 计 是 对 " 法 的 一 个 颠 覆 " 法 是 基 于 对 单 个 测 序 反 应 中 链 末 端 终 止 产 物 的 电 泳 分 离 而 56 测 序 是 通 过 聚 合 酶 介 导 的 核 苷 酸 延 伸 循 环 反 应 或 者 是 核 苷 酸 的 反 复 链 接 作 为 一 种 大 规 模 并 行 测 序 程 序 不 同 56 平 台 在 一 次 运 行 中 可 以 产 生 数 百 7+ 到 数 百 6+ 的 核 苷 酸 序 列 信 息 下 面 对 不 同 平 台 进 行 介 绍 * 罗 氏 :0,0 生 命 科 学 0,0 技 术 源 于 焦 磷 酸 测 序 技 术 和 乳 胶 % 的 结 合 884 年 5 等 人 介 绍 了 一 种 测 序 方 法 采 用 化 学 发 光 法 检 测 聚 合 酶 作
海 外 检 验 医 学 -- 年 4 月 第 4 卷 第 期 3;) " "+ " 7 $ & 37" &' -- #*4 5 * 4 用 下 脱 氧 核 苷 三 磷 酸 $5 掺 入 时 释 放 的 焦 磷 酸 盐 0 " ' 等 人 对 此 进 行 改 良 并 使 其 成 为 商 业 化 测 序 技 术 发 展 的 基 础, 与 此 同 时 "2 和 6 ' 介 绍 了 另 一 种 截 然 不 同 的 油 包 水 胶 乳 微 室 内 单 分 子 % 技 术 --- 年 "'" '+ 创 建 了 0,0 生 命 科 学 整 合 了 单 分 子 胶 乳 % 和 焦 磷 酸 测 序 技 术 并 在 --, 年 推 出 第 一 个 商 业 用 56 平 台 6-0,0 公 司 7" # 及 其 同 事 在 此 平 台 上 运 用 鸟 枪 法 测 序 仅 运 行 一 个 批 次 便 完 成 了 解 脲 支 原 体 基 因 组,/- - 8+ 的 测 序 覆 盖 率 达 到 8 准 确 度 达 88*8 / -- 年 罗 氏 应 用 科 学 收 购 了 0,0 生 命 科 学 并 推 出 了 第 二 代 0,0 设 备 6 1 它 与 6 - 采 用 同 样 的 核 心 技 术 6 1 流 动 室 被 称 为 皮 升 小 室 平 板 由 光 导 纤 维 蚀 刻 而 成 其 最 新 型 号 平 板 的 蚀 刻 测 序 反 应 小 室 大 概 在 4*0 - 皮 升 每 个 小 室 壁 上 有 金 属 涂 层 以 增 加 信 噪 对 比 度 测 序 时 图 通 过 喷 雾 或 者 超 声 裂 解 法 制 备 (5 模 板 文 库 然 后 对 这 些 含 有 数 百 碱 基 的 (5 片 段 进 行 末 端 修 复 和 并 接 上 接 头 寡 核 苷 酸 将 模 板 文 库 稀 释 成 单 分 子 浓 度 后 变 性 与 包 被 有 接 头 核 酸 互 补 序 列 的 单 微 珠 进 行 杂 交 微 珠 被 分 别 置 于 油 包 水 微 孔 当 中 利 用 胶 乳 % 技 术 扩 增 单 个 (5 分 子 扩 增 后 去 除 乳 液 并 富 集 含 有 克 隆 放 大 (5 模 板 的 微 珠 然 后 再 次 将 微 珠 进 行 有 限 稀 释 并 置 入 各 个 皮 升 板 的 小 室 中 同 时 加 入 测 序 使 用 的 酶 在 6 1 平 台 中 皮 升 板 的 功 能 是 作 为 流 动 池 通 过 连 续 流 动 添 加 0 种 $5 反 复 在 其 中 进 行 焦 磷 酸 测 序 小 室 中 每 一 个 单 个 核 苷 酸 掺 入 时 模 板 被 克 隆 放 大 同 时 释 放 焦 磷 酸 以 及 皮 升 板 上 小 室 位 置 的 特 异 性 荧 光 荧 光 透 过 光 导 纤 维 板 并 被 配 备 了 电 耦 合 装 置 %%( 的 相 机 记 录 每 一 次 流 动 加 入 $5 试 剂 后 流 动 池 均 被 摄 像 并 用 以 进 行 信 噪 比 分 析 制 定 质 量 控 制 标 准 再 按 运 算 法 则 转 换 为 线 性 序 列 信 息 输 出 使 用 最 新 的 "! 化 学 技 术 6 1 一 个 运 行 批 次 可 以 产 生 大 约 - 个 序 列 读 取 信 息 阅 读 长 度 0-- 碱 基 产 生 长 达, 亿 碱 基 对 的 序 列 0,0 技 术 读 码 长 度 更 长 有 利 于 基 因 组 序 列 的 整 合 8 一 个 值 得 关 注 的 问 题 是 对 长 度 <4 0 个 碱 基 同 聚 物 的 准 确 测 定 碱 基 同 聚 物 理 论 上 可 产 生 倍 于 4 碱 基 同 聚 物 的 荧 光 实 际 上 荧 光 产 生 是 多 样 的 随 着 同 聚 物 长 度 增 加 其 对 序 列 长 度 预 测 的 准 确 度 会 降 低 /- 0,0 平 台 曾 报 道 前 文 提 及 的 皮 升 小 室 的 金 属 涂 层 可 提 高 同 聚 物 测 序 的 准 确 性 本 文 后 述 56 数 据 分 析 章 节 中 将 讨 论 0,0 技 术 测 序 的 序 列 覆 盖 度 和 准 确 度 * 75: ; 88 年 英 国 化 学 家 '" " ="#" + "!" " 和 (") $ >#!" 提 出 将 单 个 (5 分 子 附 着 在 微 球 上 进 行 测 序 的 概 念 88/ 年 他 们 发 明 了 # " 在 早 期 探 索 过 程 中 他 们 进 行 单 链 (5 分 子 测 序 的 梦 想 未 能 实 现 原 因 是 需 要 对 克 隆 放 大 的 模 板 序 列 转 移 后 才 能 测 序 -- 年 第 一 代 短 阅 读 测 序 平 台 # "6! "#? 商 品 化 继 而 被 #! " 收 购 该 基 因 组 分 析 仪 采 用 了 流 动 池 它 由 光 学 透 明 的 载 玻 片 以 及 表 面 结 合 有 寡 核 苷 酸 锚 定 序 列 的 / 个 通 道 组 成 图 将 (5 模 板 分 解 成 几 百 + 长 的 片 段 并 进 行 末 端 修 复 形 成,@ 端 磷 酸 化 的 平 端 利 用 聚 合 酶 延 伸 ># 2 片 段 的 特 性 在 这 些,@ 端 磷 酸 化 平 端 (5 片 段 的 4@ 端 添 加 一 个 碱 基 这 些 准 备 工 作 使 得 获 取 的 (5 片 段 能 够 与 4@ 端 带 有 碱 基 的 寡 核 苷 酸 接 头 序 列 结 合 增 加 连 接 效 率 这 些 接 头 寡 核 苷 酸 序 列 与 流 动 池 中 锚 定 序 列 是 互 补 的 经 过 有 限 稀 释 和 接 头 寡 核 苷 酸 链 修 饰 后 将 单 链 (5 模 板 添 加 到 流 动 池 与 锚 定 寡 核 苷 酸 链 杂 交 而 固 定 与 胶 乳 % 不 同 (5 模 板 在 流 动 池 中 以 桥 形 方 式 扩 增 这 种 方 式 需 要 被 捕 获 的 模 板 (5 形 成 拱 形 并 和 邻 近 的 锚 定 寡 核 苷 酸 杂 交 多 个 扩 增 循 环 后 单 链 (5 模 板 便 克 隆 放 大 形 成 了 拱 形 的 簇 每 个 簇 大 约 有 --- 个 克 隆 分 子 每 个 流 动 池 可 产 生 大 约,- - 个 独 立 的 簇 测 序 前 先 将 这 些 簇 变 性 随 后 进 行 化 学 分 裂 反 应 和 洗 涤 仅 留 下 正 向 链 进 行 单 末 端 测 序 测 序 时 先 将 测 序 引 物 与 接 头 互 补 序 列 杂 交 随 后 加 入 聚 合 酶 和 有 0 种 不 同 荧 光 标 记 的 可 逆 终 止 子 这 些 终 止 子 依 照 序 列 互 补 掺 入 每 个 克 隆 簇 当 中 掺 入 完 成 后 洗 掉 未 参 加 反 应 的 试 剂 扫 描 并 记 录 各 个 簇 的 荧 光 接 下 来 通 过 一 系 列 的 化 学 步 骤 之 后 可 逆 的 染 色 终 止 子 被 还 原 荧 光 标 记 被 剪 切 并 被 洗 脱 即 进 入 下 一 轮 测 序 循 环 这 种 通 过 合 成 来 测 序 的 循 环 过 程 读 取 4 个 碱 基 长 度 大 约 需 要 *, 天 按 每 个 流 动 池 有,- - 个 簇 计 算 每 个 分 析 批 次 产 生 的 序 列 信 息 输 出 <6+ 最 新 的 56 平 台 6! "#? 改 进 了 光 学 系 统 从 而 可 以 分 析 更 高 密 度 的 模 板 簇 同 时 伴 随 着 测 序 化 学 的 改 进 和 具 有 测 序,- 个 以 上 碱 基 的 优 势 测 序 信 息 量 的 进 一 步 增 加 是 能 够 实 现 的 #! " 以 及 其 他 56 技 术 公 司 都 设 计 了 模 板 分 子 末 端 测 序 的 策 略 这 些 双 末 端 测 序 提 供 了 定 位 信 息 从 而 方 便 了 序 列 的 排 列 和 组 合 尤 其 是 在 短 片 段 的 测 序 中 4
4 海 外 检 验 医 学 -- 年 4 月 第 4 卷 第 期 3;) " "+ " 7 $ & 37" &' -- #*4 5 * #! " 的 一 个 技 术 问 题 是 测 序 准 确 性 随 着 (5 测 序 长 度 增 加 而 下 降 0 这 种 现 象 最 初 是 由 于 移 相 噪 音 造 成 的 在 一 个 给 定 的 测 序 循 环 中 核 苷 酸 掺 入 可 能 多 了 或 者 少 了 或 者 出 现 终 止 子 还 原 失 败 随 着 循 环 数 增 加 偏 差 积 累 导 致 一 簇 模 板 链 中 产 生 各 种 长 度 的 不 均 一 片 段 这 种 异 质 性 降 低 了 信 号 纯 度 减 少 了 碱 基 识 别 的 精 密 性 尤 其 是 4@ 末 端 的 读 取 目 前 研 究 人 员 正 试 图 从 测 序 化 学 图 像 数 据 分
海 外 检 验 医 学 -- 年 4 月 第 4 卷 第 期 3;) " "+ " 7 $ & 37" &' -- #*4 5 * 44 析 运 算 法 则 和 结 果 解 释 方 面 设 法 减 轻 移 相,. #&! " 的 研 究 者 们 对 运 用 #! " 平 台 具 有 丰 富 的 经 验 已 经 发 表 了 一 系 列 针 对 文 库 准 备 的 技 术 改 进 方 案 包 括 超 声 波 裂 解 时 适 度 聚 焦 以 增 加 裂 解 片 段 的 重 现 性 使 用 另 一 种 连 接 酶 以 增 加 接 头 序 列 的 连 接 效 率 采 用 改 进 的 胶 回 收 方 案 减 少 #! " 读 取 数 据 时 的 6A% 偏 倚 4* ( =; B 7 : ; ( ; (
40 海 外 检 验 医 学 -- 年 4 月 第 4 卷 第 期 3;) " "+ " 7 $ & 37" &' -- #*4 5 * $ ;# &# $ " "$ ( & *- 系 统 平 台 由 # $ =! ' :: 222* # $*" # $+!*&! 公 司 研 制 推 出 是 基 于 寡 核 苷 酸 连 接 的 快 速 测 序 技 术 这 种 方 法 由 6 %' &' 实 验 室 发 明 --, 年 随 大 肠 杆 菌 基 因 组 的 重 新 测 序 结 果 一 起 报 道 # $ =! 对 这 项 技 术 进 行 了 改 进 并 于 -- 年 推 出 了 ; ( 设 备 样 品 准 备 部 分 与 罗 氏 的 0,0 技 术 类 似 将 (5 片 段 与 寡 接 头 核 苷 酸 序 列 连 接 再 附 着 在 珠 子 上 通 过 胶 乳 % 进 行 克 隆 扩 增 携 带 克 隆 扩 增 模 板 的 珠 子 固 定 于 一 个 玻 璃 化 流 动 池 表 面 测 序 过 程 从 退 火 使 引 物 寡 核 苷 酸 与 模 板 接 头 序 列 连 接 处 互 补 的 接 头 序 列 杂 交 开 始 图 4 这 种 测 序 方 法 不 像 前 两 种 那 样 提 供 4@ 羟 基 末 端 然 后 通 过 聚 合 酶 介 导 延 伸 而 是 先 给 引 物 接 上,@ 端 磷 酸 基 团 以 便 在 第 一 次 连 接 测 序 阶 段 与 访 问 探 针 连 接 每 个 访 问 探 针 都 是 八 聚 体 从 4@ 到,@ 方 向 包 含 了 个 探 针 特 异 的 碱 基 和 个 退 化 的 碱 基 并 在,@ 端 分 别 标 记 了 0 种 荧 光 标 记 之 一 这 个 探 针 特 异 的 碱 基 构 成 0 种 碱 基 两 两 组 合 的 种 可 能 之 一 比 如 6 等 等 连 接 测 序 第 一 步 加 入 热 稳 定 性 连 接 酶 和 代 表 种 个 碱 基 组 合 的 访 问 探 针 退 火 时 这 些 探 针 迅 速 接 近 模 板 上 结 合 的 引 物 退 火 之 后 进 行 链 接 反 应 并 洗 去 未 结 合 的 探 针 在 剪 切 链 接 的 探 针 之 前 采 集 荧 光 信 号 洗 涤 是 为 了 除 去 荧 光 和 再 生,@ 端 磷 酸 基 团 在 后 续 测 序 步 骤 中 访 问 探 针 链 接 到 先 前 存 在 的 五 聚 物 的,@ 端 磷 酸 基 团 这 样 的 反 复 次 链 接 称 为 一 个 循 环 从 而 延 长 了 最 初 的 引 物 合 成 链 接 着 进 行 变 性 加 入 新 的 测 序 引 物 进 行 退 火 该 引 物 在 接 头 序 列 处 偏 移 个 碱 基 C 循 环, 轮 之 后 每 轮 新 的 引 物 都 减 少 个 碱 基 C C4 等 等 通 过 这 种 方 式 每 个 模 板 核 酸 被 测 序 遍 仪 器 运 行 天 可 识 别 4, 个 碱 基 长 度 通 过 分 析 这 些 含 有 种 可 能 的 碱 基 组 合 访 问 探 针 的 链 接 结 果 得 到 序 列 信 息 通 过 采 用 偏 移 引 物 能 够 对 接 头 序 列 的 数 个 碱 基 进 行 测 序 这 些 信 息 可 提 供 序 列 基 准 起 始 点 这 些 起 始 点 被 用 来 联 系 颜 色 空 间 编 码 方 案 和 推 算 下 游 模 板 序 列 的 运 算 法 则 图 每 个 分 析 批 次 使 用 个 流 动 池 共 可 获 得 06+ 或 者 更 多 的 序 列 信 息 为 了 减 少 移 相 所 致 的 信 号 衰 减 未 延 伸 序 列 在 连 接 之 前 给 以 加 帽 修 饰 加 帽 和 高 保 真 性 连 接 反 应 以 及 每 个 独 立 连 接 循 环 中 对 每 个 碱 基 访 问 次 以 保 证 测 序 的 准 确 度 对, 个 核 苷 酸 序 列 测 序 在 序 列 覆 盖 率 为, 倍 时 公 司 给 出 序 列 一 致 性 准 确 度 为 88*8 在 一 项 独 立 的 跟 踪 实 验 中 %' &' 实 验 室 采 用 (""' 7 和 ( )! 协 作 形 成 并 推 出 一 种 连 接 测 序 平 台 即 # " 6*-- ' ::222* # " * 表 总 结 了 6 1 6! "#? 和 ; ( 平 台 的 特 征 0*9 %; 生 物 科 学 和 单 分 子 测 序 第 一 个 单 分 子 测 序 平 台 9 # & 由 9 # & = & & 公 司 ' ::222*' # & + *&! 推 出 公 司 称 天 可 输 出 6+ 序 列 信 息 这 一 技 术 来 源 于 = "#") 等 人 --4 年 的 研 究 成 果 / 该 方 法 不 需 要 进 行 模 板 扩 增 但 需 要 裂 解 (5 模 板 4@ 端 多 聚 腺 苷 酸 化 并 用 荧 光 标 记 最 后 一 个 腺 苷 变 性 的 多 聚 腺 嘌 呤 链 与 固 定 在 流 动 池 表 面 捕 获 密 度 为 每 平 方 厘 米 -/ 个 模 板 链 的 多 聚 寡 核 苷 酸 链 进 行 杂 交 通 过 %%( 相 机 记 录 荧 光 位 置 信 息 在 测 序 之 前 去 除 标 记 物 并 将 其 清 洗 掉 测 序 时 流 动 池 内 加 入 聚 合 酶 和 0 种 %, 标 记 的 $5 之 一 之 后 摄 像 以 检 测 其 掺 入 各 个 模 板 链 的 情 况 去 除 标 记 并 洗 涤 之 后 再 加 入 另 一 种 %, 标 记 的 $5 重 复 上 述 过 程 每 一 个 测 序 循 环 包 括 连 续 加 入 聚 合 酶 和 分 别 加 入 0 种 被 标 记 的 $5 称 为 个 "$ 一 次 测 序 约 需, D4- 个 "$ 测 序 长 度 已 经 达 到 0, D,- 碱 基 9 # & 平 台 曾 用 于 噬 菌 体 74 基 因 组 0- 个 碱 基 对 的 测 序 这 项 研 究 提 出 了 基 于 合 成 测 序 法 的 所 有 单 分 子 测 序 方 法 均 潜 在 的 非 常 重 要 的 技 术 问 题 第 一 对 模 板 分 子 进 行 次 测 序 可 略 微 提 高 测 序 的 准 确 度 通 道 测 序 第 二 在 添 加 指 定 $5 进 行 同 聚 化 延 伸 时 由 于 聚 合 酶 添 加 了 额 外 的 相 同 的 碱 基 使 得 同 聚 物 测 序 准 确 度 下 降 9 # & 因 此 已 经 发 明 了 专 用 的 标 记 $5 命 名 为 虚 拟 终 止 子 公 司 报 道 利 用 它 可 以 降 低 聚 合 酶 连 续 合 成 的 能 力 只 允 许 单 碱 基 掺 入 从 而 提 高 了 同 聚 物 测 序 的 准 确 度 有 趣 的 是 较 长 序 列 如,- 个 核 苷 酸 的 测 序 率 低 于 较 短 序 列 如, 个 核 苷 酸 这 可 能 是 因 为 模 板 分 子 存 在 一 些 二 级 结 构 比 如 发 卡 结 构 二 56 对 基 础 研 究 的 影 响 自 第 一 个 商 业 化 平 台 推 出 以 来 短 短 0 年 56 已 经 显 著 加 快 了 基 因 组 学 研 究 的 众 多 领 域 使 以 前 在 技 术 上 不 能 够 实 现 或 非 常 昂 贵 的 实 验 现 在 变 得 可 行 我 们 这 里 描 述 56 的 主 要 应 用 并 综 述 56 数 据 的 分 析 * 基 因 组 分 析 56 的 高 通 量 处 理 能 力 已 经 被 用 来 进 行 全 基 因 组 测 序 从 微 生 物 到 人 类 都 有 应
海外检验医学?E!E 年 R 月第 R 卷第! 期QYA, / (, 4 (=4 C. / 4 ). / ;U, 6* 8 * ', QU4 / 8 9?E!E" Z. 5 BR" S. B! "包括最近进行的细胞遗传学正常的 种新的(肿瘤特异性的基因突变 )?D* ' 与 & 5 5 +3* '4和 急性髓系白血病细胞基因组的测序" 后者证实为一 <Y=* @短序列测序技术相比 "HDH 技术可识别更长 用 )R"GJ V"!!"?EJ?H*! RD!
4 海 外 检 验 医 学 -- 年 4 月 第 4 卷 第 期 3;) " "+ " 7 $ & 37" &' -- #*4 5 * 的 序 列 这 有 利 于 在 缺 少 参 考 基 因 组 的 情 况 下 进 行 基 因 组 的 整 合 比 如 从 头 组 合 就 测 序 而 言 长 序 列 和 短 序 列 测 序 技 术 都 已 被 成 功 应 用 在 一 项 每 个 等 位 基 因 覆 盖 度, 倍 的 比 较 性 研 究 中 0,0 #! " 和 ; ( 技 术 都 能 准 确 检 测 单 个 核 苷 酸 变 异 - 有 关 覆 盖 度 的 关 键 问 题 将 在 56 数 据 分 析 章 节 进 一 步 讨 论 0,0 可 以 为 数 百 长 度 范 围 内 的 碱 基 对 提 供 核 苷 酸 单 倍 体 信 息 有 人 预 言 其 更 适 用 于 检 测 较 大 的 插 入 和 缺 失 片 段 适 用 于 包 含 重 复 序 列 区 域 的 排 列 这 几 种 技 术 在 检 测 插 入 与 缺 失 方 面 的 能 力 还 需 要 做 进 一 步 的 比 较 研 究 每 种 平 台 都 有 对 (5 文 库 双 末 端 测 序 的 可 选 策 略 末 端 配 对 测 序 除 了 有 效 倍 增 测 序 输 出 信 息 对 于 一 个 给 定 的 片 段 信 息 读 取 是 相 互 联 系 的 了 解 这 一 点 将 增 强 测 序 信 息 的 排 列 和 组 合 能 力 尤 其 是 在 短 序 列 测 序 过 程 中 配 对 末 端 测 序 已 被 用 于 绘 制 基 因 组 结 构 变 异 包 括 缺 失 插 入 重 排 4 56 技 术 拥 有 对 完 整 人 类 基 因 组 测 序 能 力 并 且 测 序 费 用 大 幅 减 少 由 此 激 励 了 国 际 力 量 的 投 入 在 未 来 - 年 里 拟 进 行 数 千 人 类 基 因 组 的 测 序 这 将 会 使 得 我 们 对 人 类 遗 传 变 异 的 鉴 定 和 分 类 达 到 一 个 前 所 未 有 的 水 平 * 靶 基 因 组 再 测 序 对 基 因 组 亚 区 和 基 因 集 的 测 序 可 用 来 鉴 定 基 因 多 态 性 与 癌 症 相 关 的 基 因 突 变 以 及 全 基 因 组 相 关 研 究 发 现 的 与 疾 病 有 关 区 域 的 基 因 突 变 / 8 相 关 区 域 的 序 列 长 度 可 能 在 数 百 >+ 到 数 个 7+ 之 间 不 等 尤 其 是 那 些 与 疾 病 相 关 的 基 因 突 变 为 了 更 好 地 利 用 56 对 这 些 候 选 区 域 进 行 测 序 多 种 基 因 组 富 集 方 法 步 骤 包 括 传 统 的 和 新 发 现 的 方 法 都 被 纳 入 整 个 实 验 设 计 当 中 重 叠 长 片 段 % 可 以 扩 增 出 长 达 数 百 >+ 的 扩 增 子 但 对 于 更 大 的 基 因 组 区 域 并 不 适 用 最 近 通 过 将 片 段 化 变 性 后 的 人 基 因 组 (5 和 与 目 标 区 域 互 补 的 寡 核 苷 酸 捕 获 探 针 进 行 杂 交 然 后 洗 脱 已 经 能 够 富 集 这 些 区 域 的 (5 4-44 捕 获 探 针 可 以 固 定 于 固 体 表 面 &' 5!+# 6 ' ::222E!+# E&! # &' # ' ::222E " # *&! "$ 1 + ' ::222E + E&! 或 存 在 于 溶 液 中 # 目 前 的 5!+# 6 芯 片 涵 盖 了 4,- --- 个 - D8-+ 长 度 的 寡 核 苷 酸 探 针 相 互 之 间 间 隔, D - 个 核 苷 酸 去 除 那 些 与 重 复 区 域 互 补 的 寡 核 苷 酸 探 针 片 段 富 集 (5 时 将, D - 基 因 组 (5 片 段 化 并 通 过 通 用 % 引 物 位 点 与 寡 核 苷 酸 链 连 接 变 性 并 与 芯 片 杂 交 4 天 通 过 % 进 行 模 板 (5 扩 增 洗 脱 并 富 集 56 所 需 的 (5 文 库 在 已 报 道 的 研 究 中 在 4,- > 的 芯 片 中 最 长 已 测 序 到, 7+ 的 序 列 其 中 - D, 的 序 列 与 目 标 区 域 图 谱 一 致 如 果 存 在 其 他 非 目 标 区 域 测 序 图 谱 则 提 示 存 在 非 特 异 性 捕 获 新 一 代 的 5!+# 6 芯 片 使 用 了 * - 个 探 针 以 捕 捉 更 大 的 基 因 组 区 域 安 捷 伦 液 相 技 术 采 用 了 长 达 - 个 碱 基 的 寡 核 苷 酸 探 针 每 个 探 针 末 端 包 含 有 通 用 % 引 物 的 互 补 序 列 和 一 个 限 制 性 核 酸 内 切 酶 位 点 寡 核 苷 酸 文 库 通 过 % 进 行 放 大 限 制 性 酶 消 化 后 连 接 含 有 聚 合 酶 启 动 位 点 的 接 头 序 列 体 外 采 用 生 物 素 化 的 进 行 转 录 产 生 单 链 生 物 素 化 的 &5 捕 获 序 列 捕 获 时 4 的 变 性 基 因 组 (5 片 段 在 溶 液 中 与 &5 杂 交 0 ' 杂 交 后 将 (5 和 &5 杂 合 双 链 结 合 到 包 被 有 亲 和 素 的 磁 珠 上 然 后 酶 切 消 化 &5 剩 下 富 集 的 单 链 (5 用 于 56 另 一 种 由 " ("& 公 司 发 明 的 富 集 (5 的 方 法 ' ::222* " $"& &' # E &! 运 用 了 微 流 体 技 术 每 一 个 胶 乳 液 滴 内 包 含 一 对 针 对 目 标 基 因 组 区 域 的 % 引 物 所 有 这 些 液 滴 便 组 成 了 引 物 文 库 池 另 一 组 胶 乳 液 滴 包 含 了 基 因 组 (5 和 % 试 剂 这 样 就 形 成 了 两 个 独 立 的 液 滴 流 一 个 包 含 引 物 库 一 个 包 含 基 因 组 (5 和 % 反 应 试 剂 将 他 们 以 比 例 混 合 并 流 过 微 流 通 道 在 电 脉 冲 作 用 下 发 生 物 理 混 合 每 一 个 混 合 后 的 液 滴 中 都 包 含 有 独 立 的 一 对 引 物 基 因 组
海 外 检 验 医 学 -- 年 4 月 第 4 卷 第 期 3;) " "+ " 7 $ & 37" &' -- #*4 5 * 4 (5 和 % 反 应 试 剂 使 液 滴 沉 积 在 8 孔 盘 通 过 % 进 行 扩 增 扩 增 后 去 除 乳 液 合 并 各 扩 增 产 物 用 于 56 4* 宏 基 因 组 学 56 已 经 在 环 境 和 临 床 样 品 微 生 物 多 样 性 研 究 方 面 产 生 了 巨 大 的 影 响 就 操 作 而 言 先 从 样 品 中 提 取 目 标 基 因 组 (5 转 换 成 56 文 库 然 后 测 序 输 出 的 序 列 结 果 与 该 样 品 中 可 能 存 在 的 微 生 物 的 参 考 序 列 进 行 比 对 相 关 性 较 近 的 物 种 可 以 识 别 相 关 性 较 远 的 物 种 需 要 推 断 另 外 从 头 整 合 这 些 数 据 集 合 能 够 发 现 一 些 可 以 证 实 现 有 物 种 和 潜 在 的 新 物 种 的 信 息 获 取 定 性 基 因 组 信 息 并 分 析 检 出 序 列 的 相 对 丰 度 可 以 用 来 推 论 某 种 微 生 物 的 定 量 信 息 迄 今 大 部 分 基 于 56 的 宏 基 因 组 学 研 究 都 采 用 了 0,0 技 术 以 及 和 它 相 关 的 更 长 测 序 长 度 信 息 从 而 有 利 于 与 微 生 物 参 考 基 因 组 进 行 比 对 有 利 于 从 头 组 合 以 前 未 鉴 定 出 的 微 生 物 基 404, 因 组 宏 基 因 组 研 究 的 例 子 包 括 分 析 海 洋 和 土 壤 微 生 物 种 群 4 鉴 定 器 官 移 植 病 人 身 上 的 新 型 沙 粒 病 毒 4 4/ 鉴 定 人 类 口 腔 内 以 及 胖 瘦 不 同 的 双 胞 胎 胃 肠 道 内 的 微 生 物 群 48 0* 转 录 组 测 序 56 提 供 了 一 种 功 能 强 大 称 为 5 的 新 方 法 可 用 来 绘 制 和 定 量 生 物 样 品 中 的 转 录 本 分 离 总 5 剔 除 核 糖 体 5 的 5 或 有 多 聚 尾 巴 的 5 反 转 录 成 &(5 典 型 的 实 验 方 案 使 用 随 机 六 聚 物 引 物 反 转 录 生 成 单 链 &(5 随 后 用 5 酶 9 和 (5 聚 合 酶 生 成 第 二 链 然 后 将 &(5 片 段 化 并 与 56 接 头 序 列 连 接 对 于 小 的 5 比 如! 5 和 小 干 扰 5 首 选 使 用 小 5 富 集 方 法 通 过 凝 胶 电 泳 按 大 小 选 择 富 集 或 者 综 合 应 用 这 些 方 法 进 行 分 离 用 5 连 接 酶 连 接 5 与 接 头 序 列 紧 接 着 在 进 行 56 处 理 前 通 常 是 进 行 % 扩 增 测 序 结 果 与 参 考 基 因 组 比 对 与 已 知 转 录 本 序 列 比 较 或 从 头 组 合 构 建 基 因 组 转 录 图 谱 尽 管 5 作 为 一 门 技 术 仍 处 于 初 期 阶 段 但 它 已 经 显 示 出 一 些 超 过 基 因 表 达 芯 片 的 优 势 0- 首 先 芯 片 依 赖 于 固 定 其 中 的 已 知 基 因 组 序 列 而 5 不 受 该 限 制 的 约 束 可 以 在 不 知 道 转 录 本 起 源 基 因 位 置 的 情 况 下 鉴 定 转 录 产 物 与 芯 片 相 比 5 具 有 单 碱 基 分 辨 能 力 在 区 分 5 亚 型 检 测 等 位 基 因 表 达 揭 示 序 列 突 变 方 面 显 示 出 更 好 的 能 力 单 个 基 因 外 显 子 读 取 信 息 总 数 经 过 使 用 该 外 显 子 长 度 标 准 化 后 可 用 于 推 断 该 基 因 的 表 达 水 平 外 显 子 长 度 可 以 被 惟 一 绘 制 这 种 方 法 获 得 的 结 果 与 定 量 % 和 5 示 踪 实 验 结 果 明 显 相 关 5 用 于 表 达 水 平 检 测 的 能 力 在 4 D0 个 数 量 级 而 表 达 芯 片 为 个 数 量 级 综 上 所 述 5 技 术 同 时 提 高 了 高 转 录 本 和 低 转 录 本 的 检 测 能 力 当 前 5 被 用 于 证 实 和 修 订 基 因 注 释 信 息 包 括,@ 端 和 4@ 端 外 显 子 和 内 含 子 界 限 后 者 通 过 外 显 子 连 接 处 图 谱 读 码 信 息 获 得 外 显 子 连 接 位 点 定 义 为 6 6 剪 接 一 致 的 位 点 有 关 剪 接 多 样 性 的 定 性 和 定 量 信 息 均 可 以 进 行 推 断 5 已 被 应 用 于 大 量 的 生 物 有 机 体 中 包 括 酿 酒 酵 母 拟 南 芥 小 鼠 和 人 类 细 胞 0-,,* 绘 制 (5 结 合 蛋 白 图 谱 和 染 色 体 分 析 %' &' &'!"!! & " "$! & " " ' + $?" 技 术 的 发 展 极 大 地 促 进 了 对 基 因 组 调 节 蛋 白 的 认 识, 这 种 方 法 通 过 化 学 方 法 通 常 用 低 浓 度 甲 醛 处 理 使 与 基 因 组 (5 有 接 触 的 蛋 白 质 与 它 们 结 合 的 位 点 发 生 交 联 再 通 过 超 声 波 裂 解 法 或 者 用 微 球 菌 核 酸 酶 消 化 使 (5 片 段 化 使 用 针 对 感 兴 趣 蛋 白 的 特 异 性 抗 体 免 疫 沉 淀 与 (5 交 联 的 蛋 白 质 分 离 纯 化 免 疫 沉 淀 中 的 (5 与 寡 核 苷 酸 芯 片 序 列 来 自 对 应 的 基 因 组 杂 交 从 而 可 以 鉴 定 出 蛋 白 质 与 (5 的 结 合 位 点 该 方 法 已 经 成 功 地 用 于 鉴 定 转 录 因 子 和 组 蛋 白 的 结 合 位 点 目 前 在 多 种 实 验 环 境 中 %' &' 技 术 正 被 %' 逐 渐 取 代 该 技 术 中 用 免 疫 沉 淀 技 术 获 取 的 (5 用 于 构 建 56 的 文 库 56 测 序 获 得 的 信 息 绘 制 于 感 兴 趣 的 参 考 基 因 组 图 谱 形 成 一 个 基 因 组 范 围 内 的 (5 蛋 白 质 结 合 位 点 图 谱,4,, 截 至 目 前 针 对 人 5 1 神 经 元 细 胞 限 制 沉 默 因 子 和 信 号 转 导 激 活 转 录 因 子 蛋 白 基 因 结 合 位 点 研 究 表 明 %' 分 辨 率 优 于 %' &' 因 为 前 者 不 仅 证 实 了 既 往 鉴 定 的 结 合 位 点 还 鉴 定 了 新 的 结 合 位 点,, 与 5 类 似 %' 具 有 不 需 要 预 先 知 道 蛋 白 质 结 合 位 点 在 基 因 组 中 的 定 位 的 重 要 优 势 在 研 究 转 录 因 子 之 外 56 正 被 用 于 绘 制 基 因 组 甲 基 化 图 谱 一 种 方 法 是 采 用 传 统 的 重 亚 硫 酸 盐 使 (5 转 化 接 着 做 56 这 种 方 法 已 经 应 用 于 全 基 因 组 和 基 因 组 亚 区 研 究,/,8 研 究 正 试 图 发 展 一 种 新 的 %' 同 类 技 术 这 种 方 法 将 偶 合 针 对 甲 基 化 胞 嘧 啶 的 单 克 隆 抗 体 和 免 疫 共 沉 淀 技 术 然 后 通 过 56 检 测 基 因 组 甲 基 化 - 三 56 数 据 分 析 56 实 验 产 生 了 前 所 未 有 的 海 量 数 据 这 对 数 据 管 理 存 储 尤 其 是 分 析 带 来 了 挑 战 和 机 遇
4/ 海 外 检 验 医 学 -- 年 4 月 第 4 卷 第 期 3;) " "+ " 7 $ & 37" &' -- #*4 5 * 56 测 序 的 每 个 循 环 当 中 都 要 从 流 动 池 表 面 采 集 荧 光 或 者 发 光 的 图 像 这 些 大 量 的 图 像 集 合 组 成 56 的 数 据 图 0 如 此 大 的 数 据 量 需 要 一 个 资 源 密 集 型 数 据 管 道 系 统 来 进 行 数 据 的 储 存 管 理 和 处 理 0,0 6 1 #! " ; ( 单 个 运 行 批 次 产 生 的 数 据 量 大 概 分 别 是,6= =, = 数 据 管 道 的 主 要 处 理 特 征 是 将 图 像 信 号 转 变 为 序 列 读 取 也 就 是 碱 基 识 别 的 计 算 强 度 首 先 每 个 珠 子 或 者 簇 被 识 别 并 定 位 于 系 列 图 像 中 图 像 数 据 参 数 诸 如 强 度 背 景 噪 音 等 被 用 于 平 台 相 关 的 运 算 法 则 中 进 行 计 算 产 生 读 取 序 列 信 息 和 每 个 碱 基 错 误 概 率 相 关 的 性 质 评 分 尽 管 许 多 研 究 者 使 用 平 台 特 异 的 数 据 管 道 软 件 识 别 碱 基 另 外 已 经 发 展 出 许 多 其 他 可 供 选 择 的 先 进 软 件 和 统 计 分 析 技 术 这 些 可 选 程 序 的 特 点 包 括 读 取 时 掺 入 不 确 定 碱 基 改 良 剔 除 读 取 末 端 可 靠 性 差 的 碱 基 使 用 数 据 集 合 进 行 软 件 训 练, 研 究 表 明 整 合 这 些 软 件 的 特 点 可 以 减 少 读 取 错 误 提 高 序 列 排 列 能 力 尤 其 是 当 平 台 用 于 长 序 列 读 取 时 然 而 这 些 优 势 的 使 用 需 要 强 大 的 计 算 机 资 源 以 处 理 大 量 图 像 数 据 56 碱 基 识 别 过 程 中 计 算 的 质 量 值 可 以 为 碱 基 线 性 排 列 组 合 以 及 变 异 体 分 析 提 供 重 要 信 息
海 外 检 验 医 学 -- 年 4 月 第 4 卷 第 期 3;) " "+ " 7 $ & 37" &' -- #*4 5 * 48 尽 管 不 同 平 台 间 计 算 的 质 量 值 不 同 但 它 们 都 与 88/ 年 " 测 序 数 据 引 入 的 ' $ 评 分 相 关 4 0 ' $ 评 分 的 质 量 值 使 用 了 一 种 数 学 标 度 将 错 误 识 别 的 估 计 概 率 转 换 为 对 数 标 度 C -# - 错 误 识 别 概 率 为 - -* 所 对 应 的 ' $ 分 值 分 别 是 - -4- 以 质 量 值 估 计 的 56 的 错 误 率 与 以 下 几 点 有 关 信 噪 比 水 平 邻 近 微 珠 或 者 簇 的 互 相 干 扰 移 相 研 究 者 已 进 行 了 大 量 的 研 究 工 作 以 了 解 和 提 高 质 量 分 数 的 准 确 度 以 及 潜 在 的 误 差 源 -0 包 括 在 0,0 平 台 上 同 聚 物 识 别 长 度 的 不 准 确 度 和 #! " 平 台 的 碱 基 替 代 误 差 的 偏 移 对 这 些 错 误 特 征 的 研 究 催 生 了 一 些 新 的 软 件 这 些 软 件 可 以 在 没 有 其 他 额 外 碱 基 信 号 的 情 况 下 提 高 质 量 评 分 的 准 确 度 进 而 提 高 测 序 准 确 度, 质 量 值 是 剔 除 低 质 量 读 取 修 饰 低 质 量 值 的 碱 基 增 加 排 列 准 确 度 以 及 识 别 共 有 序 列 和 变 异 序 列 的 重 要 工 具 对 于 分 析 数 据 的 排 列 和 组 合 56 比 " 法 困 难 得 多 因 为 前 者 读 取 序 列 长 度 较 短 读 取 序 列 太 短 时 就 不 能 对 数 据 集 合 中 的 大 部 分 序 列 进 行 惟 一 性 的 排 列 这 是 短 读 取 序 列 排 列 组 合 时 的 缺 陷 同 样 在 序 列 较 长 较 复 杂 或 是 参 考 序 列 时 能 够 进 行 惟 一 性 排 列 的 序 列 数 量 也 会 减 少 因 为 这 些 序 列 中 包 含 有 重 复 序 列 的 几 率 较 高 最 好 的 例 子 是 在 一 个 模 型 研 究 中 在 对 大 肠 杆 菌 基 因 组 测 序 时 读 取 长 度 为 / + 获 取 序 列 中 8 的 序 列 排 列 具 有 惟 一 性 在 对 人 类 基 因 组 测 序 时 读 取 长 度 为 4- + 仅 有 8- 获 取 的 序 列 排 列 是 惟 一 的 / 8 除 了 存 在 重 复 序 列 关 联 密 切 的 基 因 家 族 中 的 同 源 序 列 假 基 因 也 可 以 降 低 测 序 序 列 排 列 或 组 合 的 惟 一 性 非 惟 一 读 取 序 列 的 排 列 方 式 由 软 件 处 理 通 过 读 取 大 量 可 排 列 的 位 置 或 者 是 留 下 的 排 列 空 隙 的 分 布 来 实 现 从 头 组 合 时 将 剔 除 这 些 序 列 因 而 导 致 较 短 的 和 更 大 量 的 组 合 毗 连 序 列 群 在 选 择 合 适 的 测 序 平 台 及 其 可 读 序 列 长 度 尤 其 是 要 从 头 组 合 测 序 序 列 时 这 些 因 素 是 与 测 序 结 果 密 切 相 关 的 8 单 个 56 读 取 的 错 误 率 高 于 " 测 序 法 " 法 体 现 的 不 仅 是 成 熟 的 化 学 法 还 有 " 法 的 示 踪 峰 代 表 了 高 度 冗 余 的 大 量 被 终 止 的 延 伸 延 伸 反 应 56 的 准 确 度 通 过 对 同 一 序 列 多 次 测 序 获 得 由 大 规 模 并 行 测 序 过 程 实 现 每 个 测 序 信 息 形 成 测 序 覆 盖 度 通 过 这 个 过 程 衍 生 出 一 致 序 列 组 合 排 列 和 分 析 56 数 据 需 要 大 量 重 叠 的 读 取 序 列 或 有 效 序 列 实 际 操 作 中 同 一 测 序 区 域 的 覆 盖 度 是 变 化 的 除 了 文 库 准 备 过 程 中 的 样 随 机 性 之 外 模 板 序 列 与 接 头 序 列 连 接 差 异 模 板 克 隆 扩 增 差 异 都 与 覆 盖 度 变 化 有 关 - 覆 盖 度 不 足 会 导 致 不 能 检 测 实 际 存 在 的 核 苷 酸 变 异 在 检 测 杂 合 子 时 产 生 假 阴 性 结 果 其 影 响 程 度 甚 至 超 过 测 序 错 误 4 研 究 表 明 在 0,0 平 台 上 覆 盖 度 低 于 - D4- 倍 将 降 低 其 识 别 单 核 苷 酸 多 态 性 的 准 确 度, 对 于 #! " 系 统 尽 管 在 特 定 再 测 序 应 用 中 - D4- 倍 覆 盖 度 已 经 足 够 但 已 有 研 究 采 用 更 高 的 覆 盖 度 比 如,- D - 个 重 叠 来 提 高 短 读 取 序 列 排 列 和 组 合 的 准 确 度 0 正 如 上 面 所 提 到 的 对 酵 母 基 因 组 序 列 的 比 较 研 究 表 明 在 每 个 等 位 基 因 覆 盖 度, 倍 时 0,0#! " ; (4 种 技 术 的 准 确 度 都 很 好 - 由 于 参 考 序 列 存 在 大 量 的 变 异 导 致 序 列 不 能 排 列 时 会 产 生 覆 盖 空 隙 目 标 序 列 中 重 复 区 重 复 序 列 的 排 列 也 会 影 响 覆 盖 度 在 多 个 位 置 排 列 效 果 一 样 的 一 些 读 取 序 列 可 能 被 随 机 分 布 或 者 是 被 弃 用 取 决 于 处 理 软 件 的 类 型 在 从 头 排 列 的 软 件 中 含 有 典 型 不 确 定 排 列 结 果 的 读 取 被 弃 用 因 而 输 出 大 量 排 列 好 的 读 取 组 或 者 是 毗 连 序 列 群 但 没 有 相 对 顺 序 的 有 关 信 息 目 前 已 开 发 了 许 多 种 可 以 处 理 排 列 和 组 合 的 软 件 为 研 究 者 使 用 见 在 线 补 充 材 料 表 大 部 分 采 用 了 操 作 系 统 也 有 的 采 用 的 是. $ 2 操 作 系 统 要 求 0 位 操 作 系 统 7= 的 内 存 和 多 核 % 数 据 量 硬 件 软 件 程 序 包 及 其 设 置 不 同 处 理 时 间 从 几 分 钟 到 多 少 小 时 不 等 因 此 要 求 系 统 有 很 强 的 计 算 能 力 尽 管 出 现 越 来 越 多 的 关 于 基 因 排 列 组 合 的 运 算 法 则 我 们 仍 然 需 要 权 衡 速 度 和 准 确 度 孰 轻 孰 重 因 为 这 些 算 法 中 大 部 分 但 不 是 全 部 的 排 列 都 被 评 估 同 时 在 理 想 的 排 列 效 果 和 计 算 机 效 率 之 间 也 需 要 寻 求 平 衡 56 软 件 特 点 随 应 用 有 所 不 同 通 常 包 括 排 列 从 头 组 合 排 列 预 览 发 现 变 异 程 序 等 另 外 也 正 在 开 发 一 些 56 数 据 统 计 的 分 析 工 具 比 如 7 6! & 研 究 所 可 用 于 排 列 和 组 合 有 参 考 序 列 读 取 的 常 用 软 件 包 括! 7 7 " ; 4 9 7 等 ' ::&! + * &* * $ :'! : 这 些 软 件 支 持 ; ( 彩 色 空 间 分 析 支 持 从 头 组 合 方 式 的 软 件 有 $ " - 0 9%6, > 8 #) ;$ ) ' :: "*! &* *& : 最 新 可 商 业 化 提 供 的 用 于 排 列 和 从 头 组 合 的 软 件 包 括 (5" 222*$"" *&! 6 & 222*
! HE! 海外检验医学?E!E 年 R 月第 R 卷第! 期QYA, / (, 4 (=4 C. / 4 ). / ;U, 6* 8 * ', QU4 / 8 9?E!E" Z. 5 B R" S. B! (. ) :, ', ) * 8 ( B8. 3& 和 7=7C*. %PPPB8 5 8 C*. B8. 3& 可处理 度(基因组注释和变异分析' 图 D 给出了? 种不同 获取数据" 使得使用者能够看到读取的排列( 覆盖 ST< 数据软件处理结果的一些例子'
海 外 检 验 医 学 -- 年 4 月 第 4 卷 第 期 3;) " "+ " 7 $ & 37" &' -- #*4 5 * 0 5 数 据 分 析 时 有 一 些 独 特 的 要 求 需 要 在 转 录 本 剪 切 区 和 # 尾 位 置 进 行 排 列 但 是 现 行 的 软 件 通 过 增 加 对 剪 切 位 点 基 序 的 识 别 依 据 低 覆 盖 序 列 排 列 鉴 定 内 含 子 外 显 子 边 界 等 功 能 已 经 做 的 比 较 深 入 0 解 密 众 多 转 录 本 亚 型 需 要 将 读 取 信 息 绘 制 于 已 知 的 和 假 定 的 剪 切 位 点 有 些 方 法 中 还 需 要 提 供 大 量 采 用 独 立 的 起 始 位 点 获 取 的 独 立 剪 切 点 的 读 取 信 息, 56 软 件 已 用 于 小 鼠 转 录 组 分 析 04 56 将 这 些 惟 一 对 应 的 读 取 信 息 定 位 至 其 在 基 因 组 的 起 源 位 点 将 与 数 个 位 点 都 匹 配 的 读 取 信 息 或 多 个 读 取 信 息 对 应 至 最 可 能 的 起 源 位 点 不 能 与 已 知 外 显 子 匹 配 的 读 取 信 息 按 照 与 候 选 外 显 子 或 外 显 子 部 分 序 列 的 同 源 性 分 组 56 转 录 组 数 据 间 比 例 相 近 因 而 可 以 从 组 合 或 排 列 数 据 的 覆 盖 度 进 行 5 的 定 量 56 用 标 准 化 的 惟 一 读 取 剪 切 读 取 和 多 量 读 取 的 信 息 对 转 录 本 定 量! 5 研 究 还 需 要 考 虑 其 他 一 些 分 析 包 括 5 发 卡 等 二 级 结 构 分 析 组 合 以 匹 配 已 知! 5 数 据 库 以 及 在 56 数 据 库 中 查 找 /! 5 的 互 补 片 段 后 者 在 大 米 发 育 和 鸡 胚 研 究 中 有 报 道 %9 技 术 研 究 产 生 的 分 析 方 法 和 分 析 软 件 对 比 %' &' 具 有 更 大 的 优 势 换 句 话 说 产 生 了 富 集 更 大 更 多 信 息 量 的 数 据 集 %9 可 分 辨 数 据 中 单 碱 基 这 使 得 其 在 8 和 7% /- 计 划 中 提 高 了 对 结 合 位 点 的 评 估 蛋 白 结 合 区 域 的 排 列 数 据 通 常 有 个 特 征 性 的 偏 移 峰 两 者 都 仅 由 前 向 或 反 向 读 取 信 息 汇 集 而 成 这 些 峰 是 短 %9 技 术 中 中 间 位 置 有 结 合 位 点 的 (5 片 断 被 免 疫 沉 淀 的 标 志 分 析 软 件 也 利 用 这 些 峰 评 估 这 些 峰 平 均 位 置 附 近 的 结 合 位 点 其 他 一 些 程 序 特 征 包 括 对 错 误 识 别 结 合 位 点 最 小 化 错 误 概 率 估 计 基 序 分 析 等 统 计 方 面 的 改 进 见 在 线 补 充 数 据 表 四 56 的 临 床 前 景 从 56 对 基 础 研 究 产 生 的 巨 大 影 响 我 们 有 理 由 期 待 将 其 转 化 到 分 子 诊 断 领 域 转 化 过 程 中 涉 及 的 关 键 问 题 包 括 技 术 步 骤 的 复 杂 性 耐 用 性 准 确 度 及 其 成 本 56 平 台 将 从 流 水 线 作 业 自 动 化 优 良 的 化 学 方 法 较 少 的 花 费 先 进 的 数 据 处 理 分 析 中 体 现 其 价 值 所 在 56 目 前 的 成 本 较 高 主 要 是 由 于 主 体 设 备 的 投 资 从 罗 氏 0,0 #! " 和 ; ( 约 - 万 美 金 到 9 # & 平 台 约 4, 万 美 金 和 测 序 试 剂 成 本 罗 氏 0,0#! " 和 ; ( 约 4,-- D0,-- 美 金 而 9 # & 平 台 需 要 / --- 美 金 尽 管 如 此 平 均 到 每 个 碱 基 其 测 序 成 本 要 比 用 " 法 便 宜 同 时 有 大 量 数 据 的 信 息 输 出 这 样 就 可 以 理 解 为 什 么 基 因 中 心 核 心 部 门 和 商 业 合 同 企 业 都 很 容 易 采 用 此 种 新 的 测 序 技 术 测 序 工 作 流 程 包 含 了 对 样 本 文 库 的 准 备 这 需 要 大 量 分 子 生 物 学 的 步 骤 以 及 D0 天 才 能 完 成 不 同 平 台 有 所 不 同 除 了 分 子 生 物 学 知 识 之 外 还 需 要 生 物 信 息 学 的 专 业 知 识 后 者 因 为 有 了 系 统 变 得 比 较 容 易 用 独 立 流 动 池 通 道 或 空 间 同 时 分 析 大 量 的 标 本 可 以 很 容 易 实 现 56 平 台 的 高 吞 吐 能 力 另 外 可 将 独 特 可 识 别 的 序 列 或 者 是 条 形 码 与 单 个 样 本 连 接 之 后 再 混 合 和 测 序 通 过 计 算 机 对 采 集 数 据 进 行 去 卷 积 分 析 进 而 获 得 样 本 序 列 / /4 在 大 规 模 的 参 考 实 验 室 将 56 用 于 临 床 诊 断 还 处 于 早 期 研 究 阶 段 目 前 正 应 用 于 那 些 需 要 大 量 的 测 序 数 据 信 息 相 对 定 量 和 高 灵 敏 度 度 检 测 的 领 域 比 如 说 之 前 提 到 的 镜 检 或 循 环 系 统 中 的 肿 瘤 细 胞 突 变 的 检 测 在 线 粒 体 疾 病 领 域 56 可 用 于 对 线 粒 体 *, >+ 完 整 基 因 组 的 测 序 检 测 异 质 性 突 变 的 百 分 数 分 析 影 响 线 粒 体 代 谢 的 蛋 白 质 对 应 的 核 基 因 序 列 所 有 这 些 通 过 一 个 分 析 运 行 批 次 就 可 以 完 成 在 我 们 的 实 验 室 里 正 在 进 行 微 生 物 基 因 组 的 测 序 以 这 种 方 法 来 改 进 微 生 物 鉴 定 和 支 持 临 床 流 行 病 的 调 查 已 有 报 道 用 56 检 测 和 相 对 定 量 9 类 似 物 种 也 可 用 于 监 测 抗 药 性 /0 对 于 人 类 基 因 组 许 多 基 因 突 变 后 可 引 起 物 理 发 现 和 临 床 表 型 之 间 存 在 的 交 叠 情 况 有 关 于 此 的 研 究 呼 声 越 来 越 高 比 如 个 不 同 的 基 因 可 能 与 肥 厚 性 心 肌 病 病 理 相 关 联 /, / 这 种 情 况 下 要 进 行 综 合 诊 断 性 评 估 就 需 要 对 - 万 D - 万 碱 基 进 行 测 序 上 面 提 到 的 56 和 基 因 组 富 集 技 术 联 合 应 用 是 应 对 这 种 技 术 挑 战 的 一 个 很 有 希 望 的 方 法 最 近 B*7*( 和 ' " 领 导 的 研 究 小 组 将 56 应 用 到 胎 儿 非 整 倍 体 染 色 体 的 检 测 上 / // 之 前 的 工 作 表 明 在 怀 孕 期 间 母 亲 的 血 液 里 可 以 同 时 检 测 到 胎 儿 和 母 亲 的 游 离 核 酸 已 有 多 种 利 用 游 离 胎 儿 核 酸 分 析 技 术 检 测 胎 儿 的 非 整 倍 体 包 括 对 感 兴 趣 染 色 体 的 胎 盘!5 分 析 比 如 号 染 色 体 和 通 过 数 字 % 分 析 比 较 大 量 的 靶 染 色 体 位 点 与 参 考 染 色 体 位 点 以 确 定 染 色 体 的 相 对 剂 量 /8 8 基 于 相 对 染 色 体 剂 量 的 概 念 和 " 组 分 别 证 实 了 把 怀 孕 母 亲 血 液 中 的 胎 儿 游 离 (5 分 离 提 取 做 成 #! " 文 库 然 后 测 序 并 将 测
0 海 外 检 验 医 学 -- 年 4 月 第 4 卷 第 期 3;) " "+ " 7 $ & 37" &' -- #*4 5 * 序 信 息 与 人 类 基 因 组 比 对 的 可 行 性 通 过 计 数 与 染 色 体 匹 配 的 读 取 信 息 的 数 量 能 够 确 定 每 一 条 染 色 体 的 相 对 剂 量 如 果 胎 儿 的 非 整 倍 体 存 在 那 么 理 论 上 数 据 集 合 中 与 受 影 响 染 色 体 匹 配 的 序 列 读 取 数 量 应 该 是 过 表 达 且 有 统 计 意 义 的 这 种 理 论 在 对 / 和 4 三 体 综 合 征 的 孕 妇 研 究 中 得 到 了 证 实 这 些 研 究 为 评 估 胎 儿 非 整 倍 体 提 供 新 的 途 径 同 时 也 为 利 用 基 于 56 技 术 分 析 非 病 理 和 病 理 生 理 状 态 下 的 游 离 (5 打 下 了 基 础 五 新 兴 技 术 发 展 中 的 新 单 分 子 测 序 技 术 将 会 减 少 测 序 所 用 的 时 间 成 本 流 水 化 样 本 准 备 过 程 6 ' ::222*) + *&! 和 "& &= & & ' ::222*"& &+ & & *&! 正 在 研 究 合 成 实 时 测 序 技 术 6 采 用 的 方 法 中 使 用 了 荧 光 供 体 分 子 标 记 的 (5 聚 合 酶 把 (5 聚 合 酶 固 定 在 玻 璃 载 玻 片 表 面 在 引 物 指 引 下 指 导 模 板 链 的 延 伸 在 核 苷 酸 上 标 记 荧 光 接 收 分 子 在 光 能 作 用 下 核 苷 酸 掺 入 时 聚 合 酶 和 核 苷 酸 分 子 的 荧 光 激 发 和 接 受 分 子 发 生 能 量 共 振 转 移 核 苷 酸 上 荧 光 接 受 分 子 标 记 在 磷 酸 位 置 在 其 掺 入 (5 链 期 间 被 清 除 该 公 司 设 想 他 们 开 发 的 由 固 定 (5 聚 合 酶 构 成 的 大 规 模 平 行 测 序 平 台 每 秒 能 检 测 - 碱 基 "& &= & & 采 用 单 分 子 实 时 测 序 和 通 过 磷 酸 化 连 接 荧 光 标 记 的 $5 (5 测 序 在 数 千 个 直 径 为,- D--! 的 反 应 孔 里 完 成 这 些 反 应 孔 由 透 明 含 ; 的 固 体 制 成 的 光 波 导 组 成 表 面 有 薄 的 金 属 涂 层 每 个 孔 都 是 纳 米 级 透 光 小 室 仅 底 部 :4 透 光 可 检 测 容 积 大 约 是 -? - - C (5 聚 合 酶 : 模 板 混 合 物 固 定 在 孔 的 底 部 加 入 0 种 不 同 标 记 的 $5 在 (5 聚 合 酶 聚 合 核 苷 酸 的 时 候 每 个 碱 基 在 检 测 体 系 内 只 停 留 几 十 毫 秒 的 时 间 按 照 实 际 停 留 时 间 与 所 需 时 间 的 长 短 顺 序 依 次 放 入 或 取 出 单 个 核 苷 酸 荧 光 激 发 后 通 过 光 学 波 导 捕 获 核 苷 酸 掺 入 情 况 荧 光 颜 色 反 应 参 入 $5 的 种 类 测 序 时 "& &= & & 采 用 改 进 的 ' 8 (5 聚 合 酶 它 能 增 强 系 统 中 磷 酸 化 荧 光 标 记 $5 的 掺 入 的 动 力 过 程 另 外 ' 8 聚 合 酶 持 续 性 高 还 有 链 取 代 活 性 利 用 这 些 优 势 在 以 一 条 环 化 的 单 链 (5 分 子 作 为 模 板 时 "& & = & & 测 序 读 取 长 度 超 过 0--- 个 碱 基 在 这 种 构 象 里 ' 8 (5 聚 合 酶 围 绕 这 个 环 形 模 板 执 行 了 多 次 折 叠 (5 链 的 替 代 合 成 平 均 (5 合 成 速 率 大 约 是 0 个 碱 基 : 秒 通 过 多 次 模 板 循 环 测 序 产 生 的 一 致 序 列 读 取 可 以 找 出 实 际 观 察 到 的 错 误 包 括 缺 失 插 入 和 错 配 目 前 正 在 进 行 化 学 反 应 以 及 平 台 设 备 的 进 一 步 改 进 争 取 在 -- 年 商 品 化 8 80 最 新 的 新 兴 技 术 是 通 过 检 测 (5 分 子 经 过 D,! 或 更 大 一 点 直 径 的 纳 米 孔 来 进 行 测 序 纳 米 孔 装 配 在 无 机 膜 上 固 相 纳 米 孔 用 脂 质 膜 的 蛋 白 通 道 组 合 而 成 或 者 是 配 置 在 多 聚 物 纳 米 液 流 通 道 上 给 纳 米 孔 膜 上 加 上 电 流 以 驱 动 带 负 电 (5 分 子 通 过 纳 米 孔 同 时 监 测 膜 表 面 电 导 率 在 皮 安 培 范 围 内 的 改 变 5= ' ::222*"+ *&! 正 试 图 将 纳 米 孔 和 杂 交 测 序 进 行 结 合 其 中 杂 交 是 采 用 单 链 (5 分 子 和 已 知 序 列 的 六 聚 体 文 库 杂 交 杂 交 后 的 (5 采 用 纳 米 孔 检 测 六 聚 体 杂 交 区 域 不 同 时 其 电 流 改 变 不 同 这 种 杂 交 类 型 用 于 绘 制 退 火 区 域 和 测 序 ; $ 5" 技 术 公 司 ' :: 222*" &'*&! 用 重 建 脂 质 层 膜 上 的 " 溶 血 素 蛋 白 形 成 的 纳 米 通 道 进 行 测 序 纳 米 孔 位 于 单 独 的 矩 阵 小 室 中 单 链 (5 分 子 置 入 小 室 后 被 外 切 酶 逐 步 消 化 释 放 的 单 个 核 苷 酸 进 入 纳 米 孔 改 变 电 流 每 个 碱 基 都 形 成 特 征 性 的 电 流 变 化 8,8 尽 管 这 项 技 术 研 究 仍 然 较 表 浅 596 正 投 入 大 量 的 资 金 用 于 各 种 已 在 开 发 中 的 纳 米 孔 测 序 技 术 并 把 它 作 为 其 能 实 现 --- 美 元 基 因 组 的 一 部 分 关 于 纳 米 孔 测 序 的 进 一 步 介 绍 读 者 可 参 考 最 新 的 文 献 8 8/ 六 结 论 过 去 的 几 年 见 证 了 56 的 产 生 一 种 具 有 共 同 技 术 基 础 的 能 够 对 克 隆 扩 增 的 (5 分 子 进 行 大 规 模 并 行 测 序 的 技 术 --/ 年 第 一 台 基 于 单 分 子 (5 测 序 的 56 平 台 投 产 实 时 单 分 子 (5 测 序 技 术 和 基 于 纳 米 孔 的 测 序 技 术 正 处 于 研 发 阶 段 56 因 为 规 模 和 可 行 性 已 经 对 基 础 基 因 组 的 研 究 产 生 了 重 大 影 响 在 未 来 的 几 年 时 间 里 56 将 有 希 望 转 化 到 临 床 疾 病 诊 断 的 应 用 当 中 要 成 功 促 成 这 种 转 变 还 需 要 一 些 必 要 因 素 包 括 作 业 流 程 尤 其 是 样 本 准 备 过 程 的 流 水 化 提 高 技 术 稳 定 性 通 过 一 些 验 证 研 究 证 实 其 测 序 结 果 的 准 确 性 在 生 物 信 息 学 方 面 56 产 生 的 海 量 序 列 数 据 输 出 对 于 临 床 诊 实 验 室 也 将 是 一 个 的 挑 战 除 了 数 据 处 理 之 外 被 分 析 区 基 因 组 的 变 异 情 况 也 需 要 进 一 步 的 确 定 以 保 证 能 够 对 测 序 结 果 给 予 合 理 的 解 释 虽 然 将 56 运 用 到 临 床 诊 断 还 有 相 当 多 的 工 作 要 做 但 是 其 潜 在 的 应 用 前 景 非 常 广 阔 令 人 兴 奋
海 外 检 验 医 学 -- 年 4 月 第 4 卷 第 期 3;) " "+ " 7 $ & 37" &' -- #*4 5 * 04 作 者 贡 献 $% " & % ' " % #$% % % %"%$" % %&% %% & 4 $ % & " %" % #$% %% " " % " $ % &% ' % %% & % # &% % % "& %"%$" % % " & &% $# % "* 作 者 潜 在 利 益 冲 突 声 明 $% " ' % % " & "%& %%* 赞 助 商 参 与 的 工 作 ( &$ )% ' "% % % &% $ " % % & &% $ " %* 致 谢 ( ' &% *+(, $ %% + *, & $ % & $ % &- %'&-%. % %$%, / $ $#0"% %" $#,* 翻 译 王 迪 3 唐 古 生 3 沈 茜 上 海 第 二 军 医 大 学 附 属 长 海 医 院 检 验 科 审 校 李 君 中 华 医 学 会 杂 志 社 参 考 文 献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