细 胞 培 养 主 讲 人 : 罗 素 慧 电 话 :13920830786 邮 箱 :suhui12345@126.com
培 训 的 目 的 让 实 验 者 对 细 胞 培 养 有 初 步 的 认 识, 了 解 细 胞 室 的 环 境 和 管 理 制 度, 以 便 顺 利 开 展 实 验 合 理 配 置 实 验 资 源, 提 高 实 验 室 的 利 用 效 率, 增 进 彼 此 了 解, 相 互 沟 通 交 流
主 要 内 容 细 胞 培 养 细 胞 培 养 室 仪 器 设 备 使 用 及 注 意 事 项 常 见 问 题 及 解 决 方 法
细 胞 培 养 细 胞 培 养 是 指 离 散 细 胞 的 培 养, 这 些 细 胞 是 经 酶 学 的 机 械 的 或 化 学 的 方 法 从 来 源 组 织 原 代 培 养 物 细 胞 系 或 细 胞 株 中 获 得 的
细 胞 培 养 的 分 类 原 代 培 养 : 是 指 细 胞 分 离 之 后 至 第 一 次 传 代 之 前 的 细 胞 培 养 阶 段 但 通 常 把 第 一 代 到 第 十 代 的 细 胞 统 称 为 原 代 培 养 传 代 培 养 : 当 原 代 培 养 成 功 以 后, 随 着 培 养 时 间 的 延 长 和 细 胞 不 断 分 裂, 接 触 性 抑 制 或 营 养 物 不 足 和 代 谢 物 积 累 需 要 将 培 养 物 分 割 成 小 的 部 分, 重 新 接 种 到 另 外 的 培 养 器 皿 内, 再 进 行 培 养
传 代 和 细 胞 系 悬 浮 培 养 贴 壁 培 养
技 术 方 法 细 胞 分 离 原 代 培 养 传 代 培 养 组 织 块 剪 切, 消 化 法 或 机 械 分 离 法 使 组 织 进 一 步 分 散, 过 细 胞 筛, 获 得 细 胞 悬 液 细 胞 悬 液 计 数 后, 加 入 培 养 液, 按 一 定 浓 度 接 种 到 培 养 瓶, 放 入 孵 箱 中 进 行 培 养 将 原 代 培 养 细 胞 用 胰 酶 和 EDTA 消 化 处 理 后, 收 集 洗 涤, 再 分 装 至 含 有 新 鲜 培 养 液 的 培 养 瓶 中 继 续 培 养
细 胞 冻 存 贴 壁 细 胞 用 胰 蛋 白 酶 消 化 后, 以 1 10 6 个 细 胞 /ml 的 浓 度 用 培 养 基 重 悬 加 入 10%V/V 的 细 胞 保 护 剂 DMSO 或 甘 油 将 细 胞 加 入 到 预 先 标 记 好 的 冻 存 管 中 将 冻 存 管 置 于 隔 热 的 泡 沫 管 中, 于 -70 至 少 存 放 4h 转 移 至 液 氮 罐 中 注 意 : 冻 存 时 间, 细 胞 经 5 代 倍 增 生 长, 获 得 足 够 量 的 细 胞 再 进 行 冻 存 缓 慢 冷 冻, 梯 度 降 温
细 胞 复 苏 从 液 氮 中 取 出 冻 存 管, 转 移 至 37 水 中 细 胞 复 苏 后, 用 70% 酒 精 擦 拭 冻 存 管, 将 细 胞 移 至 培 养 瓶 中 用 培 养 基 缓 慢 稀 释, 放 入 培 养 箱 培 养 24h 后, 弃 去 旧 培 养 基, 加 入 新 培 养 基 注 意 : 从 液 氮 中 取 出 冻 存 管, 温 水 中 迅 速 复 苏 ; 复 苏 时, 如 果 冻 存 管 保 存 在 液 相 中, 应 避 免 爆 破 的 危 险
细 胞 培 养 室 环 境 准 备 区 (308) 缓 冲 区 (308) 1 号 细 胞 室 (308) 2 号 细 胞 室 (308) 3 号 细 胞 室 (201)
预 约 申 请 和 培 训 考 核 预 约 申 请 : 提 前 一 个 星 期 进 行 预 约, 并 填 写 细 胞 培 养 室 申 请 表, 导 师 签 字, 中 心 主 任 签 字 培 训 考 核 : 每 个 学 生 进 入 细 胞 室 之 前 都 要 经 过 培 训, 并 通 过 考 核 后, 才 可 以 进 入 细 胞 培 养 室 进 行 实 验
细 胞 培 养 室 使 用 规 范 1 准 备 工 作 a. 进 入 培 养 间 之 前 应 洗 净 双 手, 准 备 间 更 换 专 用 拖 鞋 并 登 记 b. 风 淋 5s( 不 能 随 意 关 闭 ) c. 进 入 缓 冲 间 后 更 换 细 胞 室 专 用 白 大 衣, 戴 无 粉 尘 无 菌 手 套 口 罩 ; d. 进 入 超 净 室 后 将 所 带 物 品 放 入 传 递 窗 中 紫 外 灯 照 射 灭 菌 ; e. 预 热 培 养 基 PBS 胰 酶 等 溶 液 ;
2. 实 验 过 程 a. 关 闭 生 物 安 全 柜 内 紫 外 灯, 打 开 通 风 开 关 ; b. 等 待 大 约 5min 后, 双 臂 缓 慢 进 入 前 窗 口, 再 对 物 品 进 行 处 理 ; c. 擦 拭 工 作 面, 所 有 操 作 应 在 离 前 窗 10cm 以 外 的 工 作 区 进 行 ; d. 小 心 取 用 无 菌 实 验 物 品, 勿 碰 触 吸 管 尖 头 部 或 是 容 器 瓶 口, 亦 不 要 在 打 开 容 器 的 正 上 方 操 作 实 验 ; 打 开 的 容 器 盖 应 口 向 下, 放 在 干 净 的 区 域
无 菌 技 术 细 胞 培 养 的 成 功 很 大 程 度 上 取 决 于 无 菌 技 术 无 菌 技 术 的 作 用 是 在 环 境 微 生 物 与 无 菌 的 细 胞 培 养 物 之 间 形 成 一 道 屏 障, 它 通 过 一 套 操 作 流 程 来 降 低 培 养 物 被 污 染 的 可 能 无 菌 技 术 的 组 成 要 素 包 括 : 无 菌 环 境 无 菌 试 剂 和 培 养 基 以 及 灭 菌 操 作
无 菌 环 境 安 静 的 工 作 区 域 禁 止 喧 闹, 说 笑 工 作 面 工 作 面 保 持 整 洁, 只 放 置 所 需 物 品 ; 不 能 用 作 储 存 区 个 人 卫 生 操 作 前 后 应 洗 手, 穿 戴 个 人 防 护 设 备 试 剂 和 培 养 基 商 品 化 试 剂 或 采 用 适 当 的 灭 菌 方 法 ( 如 : 高 压 无 菌 过 滤 ) 培 养 物 细 胞 系 或 细 胞 株 没 有 发 生 生 物 污 染
无 菌 操 作 擦 拭 : 工 作 前 后 和 过 程 中, 特 别 是 有 溢 出 物 后, 要 擦 拭 工 作 面 各 种 瓶 子, 特 别 是 从 冰 箱 取 来 的 瓶 子, 进 入 生 物 安 全 柜 前 要 用 酒 精 擦 拭 加 盖 : 购 买 密 封 性 好 的 瓶 子, 暂 时 不 用 的 液 体, 在 盖 子 与 瓶 颈 结 合 部 用 封 口 膜 封 住 试 剂 瓶 和 培 养 瓶 的 操 作 培 养 瓶 平 放, 试 剂 瓶 可 直 立 放 置, 但 不 能 让 手 或 其 他 物 品 在 开 口 的 容 器 或 无 菌 吸 管 上 方 往 来 移 液 : 购 买 一 次 性 无 菌 塑 料 吸 管 和 枪 头, 避 免 用 嘴 吹 吸 管 倒 出 液 体 : 倾 倒 的 主 要 危 害 是 产 生 了 连 接 试 剂 瓶 内 外 的 液 体 桥, 这 样 可 能 会 使 污 染 物 进 入 试 剂 瓶
3. 实 验 结 束 a. 将 生 物 安 全 柜 继 续 运 行 5 min 来 完 成 净 化 过 程 ; b. 将 柜 内 物 品 移 出 前, 应 使 用 有 效 的 消 毒 剂 擦 拭 ; c. 将 废 液 缸 内 废 液 及 垃 圾 倒 入 细 胞 间 外 的 医 疗 垃 圾 桶 内 ; d. 用 75% 酒 精 对 生 物 安 全 柜 的 台 面 进 行 擦 拭 ; e. 等 待 5min 后, 关 闭 前 窗, 关 灯, 关 风 机 ; f. 物 品 收 拾 摆 放 整 齐 及 时 将 废 物 清 理 干 净 并 拿 出 细 胞 室
注 意 1. 进 入 细 胞 室 后 必 须 穿 白 大 衣, 戴 口 罩, 手 套, 长 头 发 的 女 生 要 将 头 发 绑 起 来 2. 每 次 限 操 作 一 种 细 胞, 并 且 一 种 细 胞 对 应 一 瓶 培 养 基, 避 免 细 胞 交 叉 污 染 3. 每 间 细 胞 间 禁 止 同 时 进 入 4 个 人 操 作, 不 可 在 细 胞 间 大 声 喧 哗 谈 笑 和 打 闹 4. 如 果 发 生 污 染 请 报 告 管 理 员, 以 便 及 时 处 理 5. 非 本 实 验 室 的 人 员 未 经 允 许 不 得 进 入 细 胞 间
细 胞 室 值 日 规 定 1. 每 位 需 要 在 细 胞 室 培 养 细 胞 的 实 验 人 员 必 须 参 加 值 日, 由 管 理 员 统 一 安 排 ; 2. 每 周 彻 底 打 扫 一 次 细 胞 间 ( 时 间 为 每 周 五 下 午 4:30-5:30), 包 括 : 实 验 桌 面 地 板 缓 冲 间 等 3. 用 消 毒 水 擦 拭 全 部 仪 器 和 物 品 表 面, 包 括 门 墙 壁 桌 面 生 物 安 全 柜 外 表 面 培 养 箱 外 表 面 ; 4. 用 消 毒 水 清 洗 地 板, 清 洗 拖 鞋 ; 5. 观 察 细 胞 培 养 箱 的 温 度 和 CO 2 浓 度 是 否 正 常, 需 补 充 CO2 时 及 时 报 告 管 理 员 6. 更 换 细 胞 培 养 箱 中 水 槽 的 水, 加 入 1000-1500ml 灭 菌 后 的 蒸 馏 水 ; 7. 清 洗 水 浴 锅, 更 换 水 浴 锅 中 的 水, 加 入 蒸 馏 水 ;
细 胞 培 养 主 要 用 品 细 胞 室 1. 净 化 级 工 作 室 风 淋 室 传 递 窗 生 物 安 全 柜 紫 外 灯 2.CO 2 培 养 箱 倒 置 显 微 镜 离 心 机 水 浴 锅 3. 液 氮 罐 超 低 温 冰 箱 ( 管 理 老 师 分 配 ) 4. 移 液 器 ( 中 心 借 用 ) 细 胞 培 养 所 需 其 它 仪 器 : 灭 菌 锅 (308) 送 风 干 燥 箱 (317) 细 胞 计 数 仪 (310) 纯 水 仪 (314) 消 耗 性 物 品 : 酸 液 吸 管 培 养 皿 无 菌 容 器 消 毒 剂
空 调 机 组 和 紫 外 每 天 进 入 细 胞 间 人 员 需 先 打 开 细 胞 间 和 生 物 安 全 柜 的 紫 外 灯 20-30 分 钟 灭 菌, 然 后 进 行 操 作 空 调 机 组 房 间 非 管 理 人 员 严 禁 进 入, 如 有 问 题 需 与 实 验 室 管 理 人 员 联 系 生 物 安 全 柜 注 意 : 无 需 使 用 酒 精 灯 a. 使 用 前 紫 外 灯 照 射 20 分 钟, 之 后 通 风 5 分 钟 b. 实 验 前 后 均 要 用 75% 的 酒 精 清 洁 台 面 c. 实 验 结 束 后, 关 闭 电 源 开 关, 下 一 人 使 用 前 仍 需 照 射 紫 外 灯 20 分 钟 d. 柜 内 实 验 物 品 分 区 域 摆 放, 禁 止 放 置 过 多 物 品 以 免 影 响 紫 外 线 照 射 效 果
生 物 安 全 柜 禁 止 使 用 明 火
垂 直 式 层 流
二 氧 化 碳 培 养 箱 a. 打 开 前 先 用 75% 酒 精 消 毒 双 手 b. 打 开 时 应 注 意 不 要 说 话, 尽 量 屏 住 呼 吸, 以 免 污 染 c. 箱 体 底 部 的 蒸 馏 水 保 持 饱 和 湿 度, 每 周 一 换 d. 放 培 养 箱 的 细 胞 瓶 请 做 好 个 人 标 记, 按 规 定 相 对 固 定 的 位 置 格 放 置 培 养, 做 好 及 时 观 察 和 处 理, 防 止 细 胞 培 养 过 久 造 成 染 菌 防 止 他 人 误 拿 e.co 2 感 应 器 不 能 触 碰, 不 能 溅 上 液 体! f. 如 发 现 二 氧 化 碳 减 压 阀 显 示 CO 2 即 将 用 完, 需 及 时 报 告 管 理 员
清 洁 : 1. 经 常 用 软 布 沾 上 肥 皂 水 来 擦 拭 培 养 箱 外 表 面 2. 将 软 布 上 的 皂 液 漂 洗 干 净 后, 再 次 擦 拭 培 养 箱 外 表 面 消 毒 : 醇 溶 液 消 毒 (70% 异 丙 醇 和 30% 蒸 馏 水 配 成 消 毒 液 ) 和 高 温 消 毒 注 意 : 1. 进 行 高 温 消 毒 前 培 养 箱 必 须 经 过 充 分 清 洁 并 已 完 全 干 燥, 必 须 取 出 CO2 感 应 器 的 黑 色 保 护 罩 2. 在 高 温 消 毒 过 程 中, 切 勿 打 开 内 外 箱 门, 否 则 可 能 造 成 严 重 烫 伤, 另 培 养 箱 的 外 表 面 也 将 达 到 很 高 温 度, 严 禁 以 手 触 摸
倒 置 显 微 镜 a. 在 使 用 倒 置 显 微 镜 进 行 观 察 时, 一 定 要 小 心 轻 放, 防 止 培 养 液 溅 到 物 镜 或 载 物 台 上, 如 有 发 生, 先 将 光 源 旋 到 最 小, 关 闭 开 关, 用 擦 镜 纸 擦 净 b. 使 用 后 将 光 源 旋 到 最 小, 关 闭 电 源, 将 防 尘 布 盖 好 c. 填 写 使 用 记 录
水 浴 锅 用 于 预 热 培 养 基 PBS 胰 酶 等 溶 液, 定 期 ( 每 周 五 ) 更 换 水 与 清 洁, 从 水 浴 锅 拿 出 的 瓶 子 应 用 75% 酒 精 擦 拭 后 放 入 生 物 安 全 柜 一 定 要 注 意 水 位, 不 能 干 烧! 离 心 机 离 心 前 务 必 配 平 ( 用 天 平 进 行 ), 小 心 避 免 离 心 管 在 离 心 过 程 中 损 坏 卡 住 角 转 子, 溅 落 的 液 体 及 时 清 理, 用 完 关 闭 电 源, 填 写 使 用 记 录
细 胞 间 冰 箱 细 胞 室 冰 箱 仅 用 于 储 存 细 胞 培 养 相 关 物 品, 请 标 注 姓 名, 按 规 定 位 置 存 放, 并 定 期 清 理 毕 业 前 将 自 己 的 物 品 清 理 或 转 接, 否 则 由 中 心 自 行 处 理 液 氮 液 氮 罐 严 禁 储 存 细 胞 外 其 他 生 物 样 品, 使 用 时 带 上 防 护 手 套, 避 免 烫 伤, 快 拿 快 放, 每 次 使 用 后 都 要 按 一 下 Reset, 填 写 使 用 记 录
移 液 器 和 电 动 助 吸 器 生 物 安 全 柜 配 有 5ml 1ml 200ul 10ul 手 动 移 液 器 及 电 动 移 液 器 各 一 把, 用 前 可 用 75% 酒 精 擦 拭, 严 禁 倒 吸 液 体 进 入 移 液 器 内 在 相 应 量 程 内 使 用, 用 完 后 调 回
灭 菌 锅 在 使 用 前 务 必 检 查 水 位, 调 好 时 间, 压 力 平 稳 并 开 始 倒 计 时 后, 方 可 离 开 及 时 取 出 高 压 物 品 如 灭 菌 液 体 时, 不 可 提 前 放 气 送 风 干 燥 箱 高 压 物 品 至 少 60 烘 4h, 不 要 随 意 调 动 烤 箱 的 设 定 值, 及 时 清 理 自 己 的 物 品, 如 有 需 使 用 更 高 温 度 的, 与 管 理 老 师 联 系
细 胞 计 数 仪 测 量 浓 度 范 围 :1 10 4 3 10 7 /ml 测 量 直 径 范 围 :5-180μm 样 品 体 积 :20μl 测 量 时 间 :20 秒 分 析 参 数 : 总 细 胞 浓 度, 活 细 胞 浓 度, 死 细 胞 浓 度, 活 率, 平 均 细 胞 直 径, 平 均 细 胞 圆 度, 结 团 率
纯 水 仪 a. 开 机 : 先 开 水 再 开 电, 关 机 : 先 关 电 再 关 水 b. 水 箱 内 水 位 低 于 16% 就 不 能 再 取 水, 待 机 器 产 满 后 再 次 取 水 c. 红 灯 亮 代 表 出 现 警 报, 及 时 联 系 管 理 老 师 d. 黄 灯 亮 表 示 需 要 更 换 耗 材 e. 水 流 速 较 快, 注 意 擦 看, 以 免 漏 出 酸 液 泡 酸 物 品 需 先 用 洗 涤 剂 洗 净 晾 干, 然 后 泡 酸, 泡 酸 时 必 须 穿 好 实 验 服, 带 耐 酸 手 套 和 防 护 眼 罩 不 可 穿 凉 鞋
污 染 对 于 新 手 来 说, 进 行 组 织 培 养 时 维 持 无 菌 状 态 是 最 困 难 的 挑 战, 然 而, 在 一 些 情 况 下, 甚 至 很 有 经 验 的 老 手 也 会 遇 到 污 染 的 问 题 污 染 的 途 径 无 菌 技 术 材 料 和 试 剂 仪 器 设 备 和 装 置 生 物 材 料 的 传 入
常 见 的 生 物 污 染 细 菌 霉 菌 酵 母 病 毒 支 原 体 以 及 其 他 细 胞 系 的 交 叉 污 染 细 菌 :PH 值 降 低 云 雾 状, 镜 下 可 见 移 动 的 颗 粒 霉 菌 :PH 值 增 高 浑 浊 呈 集 落 或 者 菌 丝 状 酵 母 :PH 值 变 化 较 小 浑 浊 呈 卵 圆 形, 可 牙 生 出 较 小 的 颗 粒 病 毒 : 对 宿 主 有 非 常 严 格 的 要 求, 所 以 在 培 养 人 或 灵 长 类 动 物 细 胞 时 要 特 别 注 意 支 原 体 : 细 胞 增 殖 速 度 降 低 饱 和 密 度 下 降 以 及 悬 浮 培 养 物 凝 集 解 决 办 法 : 无 菌 操 作
常 规 安 全 : 操 作 者 : 穿 戴 好 防 护 服, 按 规 范 操 作 设 备 : 检 查 安 全 可 靠 性, 注 意 电 路 安 全 玻 璃 器 皿 和 锐 利 物 品 : 泡 酸 高 压 使 用 过 程 中 针 头 化 学 毒 性 : 毒 性 物 质 ( 粉 状 / 雾 状 剂 )DMSO( 强 溶 剂 ) 气 体 :CO2/02/N2 液 氮 : 冻 伤 窒 息 和 爆 炸 灼 烧 : 高 压 灭 菌 锅, 烘 箱 火 : 乙 醇, 醇 类 放 射 性 : 生 物 危 害 性 :
谢 谢 各 位 同 学 的 参 与, 祝 实 验 顺 利!