药 学 学 报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (3): 367 372 367 研 究 论 文 HIV-1 初 始 传 播 病 毒 药 物 敏 感 性 研 究 丁 寄 葳 1 1,, 赵 建 元 2, 米 泽 云 1, 魏 涛 2*, 岑 山 1* (1. 中 国 医 学 科 学 院 北 京 协 和 医 学 院 医 药 生 物 技 术 研 究 所, 北 京 100050; 2. 北 京 联 合 大 学 应 用 文 理 学 院, 北 京 100192) 摘 要 : 人 类 免 疫 缺 陷 病 毒 (human immunodeficiency virus type 1, HIV-1) 黏 膜 感 染 绝 大 多 数 由 一 个 或 者 少 数 几 个 病 毒 建 立 并 最 终 发 展 为 系 统 感 染, 上 述 病 毒 称 为 初 始 传 播 病 毒 (transmitted/founder virus, T/F 病 毒 ) 研 究 T/F 病 毒 对 不 同 抗 HIV-1 药 物 的 敏 感 性, 可 为 艾 滋 病 高 危 人 群 提 供 优 化 的 暴 露 前 预 防 性 治 疗 (pre-exposure prophylaxis, PrEP) 策 略 本 文 首 先 构 建 了 含 荧 光 素 酶 报 告 基 因 的 T/F 病 毒 单 轮 感 染 系 统, 进 而 分 析 比 较 了 长 期 感 染 病 毒 和 T/F 病 毒 对 不 同 抗 HIV-1 药 物 的 敏 感 性 实 验 结 果 显 示, 与 同 一 亚 型 的 长 期 感 染 病 毒 相 比, T/F 病 毒 对 HIV-1 核 苷 类 逆 转 录 酶 抑 制 剂 (nucleoside reverse transcriptase inhibitors, NRTIs) 整 合 酶 抑 制 剂 (integrase inhibitors, INIs) 及 蛋 白 酶 抑 制 剂 (protease inhibitors, PIs) 的 敏 感 性 并 没 有 表 现 出 显 著 性 差 异 (P > 0.05), 而 对 非 核 苷 类 逆 转 录 酶 抑 制 剂 (non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors, NNRTIs) 表 现 出 一 定 的 耐 药 性, IC 50 显 著 提 高 (P < 0.05) 这 一 结 果 提 示, 对 于 艾 滋 病 高 危 人 群 的 暴 露 前 预 防 性 治 疗 应 避 免 选 择 NNRTIs 关 键 词 : HIV-1; 暴 露 前 预 防 性 治 疗 ; 初 始 传 播 病 毒 ; 报 告 基 因 ; 抗 HIV-1 药 物 中 图 分 类 号 : R966 文 献 标 识 码 : A 文 章 编 号 : 0513-4870 (2016) 03-0367-06 The sensitivity of transmitted/founder HIV-1 to anti-hiv drugs DING Ji-wei 1, ZHAO Jian-yuan 1, 2, MI Ze-yun 1, WEI Tao 2*, CEN Shan 1* (1. Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China; 2. College of Arts and Science of Beijing Union University, Beijing 100192, China ) Abstract: The majority of mucosal HIV-1 infection is initially established by a few HIV-1 viral variants, followed by the development of overt systemic infection, and these viral variants are known as transmitted/ founder viruses (T/F viruses). Investigation of the sensitivity of T/F virus to different anti-hiv-1 drugs will provide the best strategies of pre-exposure prophylaxis (PrEP) for high-risk groups of HIV-infected patients. Herein we constructed for the first time, a luciferase reporter system for HIV-1 T/F viruses, and then compared the drug sensitivity between T/F viruses and chronic infection virus. The result showed that the 50% inhibitory concentration (IC 50 ) of nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NRTIs), integrase inhibitors (INIs) and protease inhibitors (PIs) were not significantly different between the T/F viruses and chronic infection viruses of the same subtype (P > 0.05), while non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs) showed a moderate resistance to T/F viruses, with a significant increase in IC 50 (P < 0.05). The conclusion suggests that when patients are in high-risk or in the acute infection of HIV-1, NNRTIs should be avoided in the first-line antiretroviral therapy regimens. 收 稿 日 期 : 2015-04-16; 修 回 日 期 : 2015-07-01. 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 委 员 会 - 加 拿 大 国 立 卫 生 研 究 院 研 究 基 金 课 题 (CIHR) 合 作 基 金 资 助 项 目 (81361128017). * 通 讯 作 者 Tel / Fax: 86-10-63037279, E-mail: shancen@hotmail.com; Tel: 86-10-62004604, Fax: 86-10-62004536, E-mail: weitao@buu.edu.cn 共 同 第 一 作 者. DOI: 10.16438/j.0513-4870.2015-0359
368 药 学 学 报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (3): 367 372 Key words: HIV-1; pre-exposure prophylaxis; founder virus; reporter gene; anti-hiv drug HIV-1 引 起 的 获 得 性 免 疫 缺 陷 综 合 征 (acquired immunodeficiency syndrome, AIDS, 简 称 艾 滋 病 ), 是 [1, 一 种 危 害 严 重 的 病 毒 传 染 性 疾 病 2] 据 联 合 国 艾 滋 病 规 划 署 估 计, 2014 年 全 球 约 有 3 950 万 名 艾 滋 病 患 者, 其 中 新 增 感 染 人 数 为 430 万 人, 另 有 290 万 人 死 于 与 艾 滋 病 相 关 的 疾 病 [3] FDA 已 批 准 了 20 多 种 抗 HIV-1 的 药 物, 这 些 药 物 组 成 的 高 效 抗 逆 转 录 病 毒 治 疗 (highly active antiretroviral therapy, HAART) 提 高 了 艾 滋 病 患 者 的 生 活 质 量, 也 延 长 了 患 者 的 生 命 [4] 目 前, 临 床 上 使 用 的 抗 HIV-1 药 物 主 要 是 逆 转 录 酶 抑 制 剂 (reverse transcriptase inhibitors, RTIs) 蛋 白 酶 抑 制 剂 (protease inhibitors, PIs) 融 合 抑 制 剂 和 整 合 酶 抑 制 剂 (integrase inhibitors, INIs) RTIs 包 括 核 苷 类 逆 转 录 酶 抑 制 剂 (nucleoside reverse transcriptase inhibitors, NRTIs), 如 齐 多 夫 定 (zidovudine, AZT) 拉 米 夫 定 (lamivudine, 3TC) 和 司 他 夫 定 (stavudine, D4T) 等 ; 非 核 苷 类 逆 转 录 酶 抑 制 剂 (non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors, NNRTIs), 如 依 法 韦 仑 (efavirenz, EFV) 奈 韦 拉 平 (nevirapine, NVP) 和 地 拉 夫 定 (delavirdine, DLV) 等 PIs 主 要 有 沙 奎 那 韦 (saquinavir, SQV) 茚 地 那 韦 (indinavir, IDV) 和 (ritanovir, RTV) 等 融 合 抑 制 剂 主 要 有 西 夫 韦 地 (enfuvirtide, T20) 和 马 拉 韦 罗 (maraviroc, MVC) INIs 主 要 有 埃 替 格 韦 (elvitegravir, EVG) 和 雷 特 格 韦 (raltegravir, RAL) [5, 6] 尽 管 药 物 治 疗 已 经 取 得 极 大 的 成 功, 但 是 由 于 没 有 疫 苗, HIV-1 感 染 的 预 防 仍 然 面 临 严 重 挑 战 近 几 年, HIV-1 的 暴 露 前 预 防 性 治 疗 (pre-exposure prophylaxis, PrEP) 受 到 广 泛 关 注 和 高 度 重 视 PrEP 即 将 抗 HIV-1 药 物 用 于 HIV-1 感 染 高 危 人 群, 使 其 获 得 预 防 主 动 权 的 方 法, 是 降 低 感 染 HIV-1 风 险 的 一 项 新 型 干 预 措 施 目 前 应 用 于 PrEP 的 候 选 药 物 较 少, 常 见 的 候 选 药 物 有 替 诺 福 韦 (tenofovir, TDF) 和 3TC 此 外, 一 些 抗 HIV-1 药 物 是 否 可 以 用 于 PrEP 目 前 尚 在 研 究 中 HIV-1 融 合 抑 制 剂 可 以 直 接 阻 断 病 毒 感 染, 因 此 在 PrEP 中 的 应 用 显 得 尤 为 重 要 但 是, T20 作 为 一 种 多 肽 药 物, 半 衰 期 较 短 且 使 用 剂 量 比 较 大, 因 此 用 于 预 防 给 药 的 可 行 性 不 大 而 MVC 是 一 种 CCR5 拮 抗 剂, 它 在 PrEP 的 应 用 目 前 尚 存 争 议 虽 然 在 人 源 化 小 鼠 模 型 中 MVC 可 以 有 效 地 预 防 HIV 经 阴 道 感 染 [7], 但 有 报 道 MVC 不 能 预 防 猕 猴 模 型 的 HIV 经 直 肠 感 染 [8], 并 且 有 证 据 显 示 MVC 在 人 源 化 小 鼠 体 内 半 衰 期 比 较 短 [9] 在 HIV-1 黏 膜 传 播 过 程 中, 病 毒 的 遗 传 多 样 性 是 显 著 减 少 的, 表 现 出 严 重 的 遗 传 瓶 颈 效 应 和 有 限 的 早 期 进 化 研 究 发 现, 只 有 少 数 的 一 株 或 几 株 HIV-1 病 毒 可 以 建 立 有 效 感 染, 这 种 病 毒 被 称 为 初 始 传 播 病 毒 (transmitted/founder virus, T/F 病 毒 ) [10, 11] 研 究 T/F 病 毒 的 生 物 学 和 早 期 进 化 特 征, 有 助 于 阐 明 HIV-1 建 立 感 染 的 关 键 因 素 目 前, T/F 病 毒 的 研 究 多 [11, 侧 重 于 包 膜 蛋 白 的 进 化 特 征 12] T/F 病 毒 对 抗 HIV-1 药 物 敏 感 性 的 系 统 研 究, 将 为 艾 滋 病 高 危 人 群 预 防 性 治 疗 提 供 最 优 的 药 物 选 用 策 略, 为 PrEP 方 案 的 优 化 提 供 重 要 的 实 验 依 据, 然 而 此 方 面 的 研 究 国 内 外 尚 未 见 报 道 因 此, 本 文 首 先 构 建 了 含 荧 光 素 酶 报 告 系 统 T/F 病 毒 的 克 隆, 以 荧 光 素 酶 作 为 报 告 基 因, 进 而 在 几 大 类 抗 艾 滋 病 药 物 中 分 别 选 取 了 两 种 有 代 表 性 的 药 物 用 于 研 究 T/F 病 毒 HIV-1 药 物 的 敏 感 性, 以 期 为 艾 滋 病 高 危 人 群 预 防 性 治 疗 提 供 最 优 的 药 物 选 用 策 略 材 料 与 方 法 实 验 材 料 质 粒 pzm246f-10 pzm247fv2 和 pzm247fv1 [13] (NIH AIDS Reagents Program Catalog 分 别 为 11828 11829 和 11941) 由 NIH AIDS Reagent Program 惠 赠 pindie-c1 质 粒 由 加 拿 大 梁 臣 教 授 惠 赠 ; pnl4-3(luc) 和 phcmv-g (VSV-G) 质 粒 由 美 国 Johnny He 教 授 提 供 ; puc19 质 粒 购 自 美 国 Invitrogen 公 司 抗 HIV-1 药 物 3TC D4T EFV NVP RAL SQV 和 IDV 均 由 美 国 国 立 卫 生 研 究 院 (NIH) 惠 赠, 且 都 溶 于 二 甲 基 亚 砜 (DMSO) 转 染 试 剂 Lipofectamine 2000 购 自 美 国 Invitrogen 公 司 ; 同 源 重 组 试 剂 盒 (In-Fusion HD cloning kit) 购 自 美 国 Clontech 公 司 ; 荧 光 素 酶 活 性 测 定 试 剂 盒 Luciferase Assay System 购 自 美 国 Promega 公 司 质 粒 构 建 应 用 同 源 重 组 技 术, 将 T/F 病 毒 及 同 一 亚 型 的 慢 性 感 染 病 毒 Indie-C1 5' 端 长 末 端 重 复 序 列 (5'-long terminal repeat, 5'-LTR) 至 包 膜 蛋 白 之 前 的 序 列 (nt) 与 NL4-3(Luc) 包 膜 蛋 白 至 3' LTR 之 间 的 序 列 (nt) 融 合 并 连 接 到 puc19 载 体, 从 而 构 建 一 个 含 荧 光 素 酶 报 告 系 统 的 嵌 合 病 毒 具 体 步 骤 : 首 先 将 T/F 病 毒 株 pzm246f-10 pzm247fv2 和 pzm247fv1
丁 寄 葳 等 : HIV-1 初 始 传 播 病 毒 药 物 敏 感 性 研 究 369 及 慢 性 感 染 株 pindie-c1 通 过 PCR 扩 增 得 到 各 自 5' LTR 至 包 膜 蛋 白 之 前 的 序 列 ( 其 中 在 PCR 引 物 上 增 加 了 SalI 和 SacII 两 个 限 制 性 内 切 酶 位 点 ), 随 后 利 用 同 源 重 组 技 术, 将 各 自 对 应 的 序 列 连 接 到 puc19 载 体, 最 后 转 化 E.coil DH5α, 通 过 测 序 验 证 获 得 相 应 质 粒 利 用 SalI 将 上 述 构 建 得 到 的 克 隆 切 成 线 性 片 段, 同 时 利 用 PCR 将 pnl4-3(luc) 包 膜 蛋 白 至 3' LTR 之 间 的 序 列 进 行 扩 增, 应 用 同 源 重 组 技 术 将 两 个 片 段 进 行 连 接, 即 得 到 含 荧 光 素 酶 报 告 系 统 T/F 病 毒 的 克 隆 这 些 嵌 合 病 毒 载 体 分 别 命 名 为 11828(Luc) 11829(Luc) 11941(Luc) 和 Indie(Luc) 构 建 所 用 引 物 如 表 1 所 示 细 胞 培 养 及 转 染 293T 细 胞 培 养 于 含 10% 胎 牛 血 清 (FBS) 的 DMEM 培 养 基 中 6 孔 板 每 孔 接 种 细 胞 数 为 4 10 5 个, 培 养 24 h 后 用 Lipofectamine 2000 转 染, 详 细 参 见 使 用 说 明 SupT1 细 胞 ( 本 室 保 存 ) 培 养 于 含 10% FBS 的 RPMI 1640 培 养 基 中 荧 光 素 酶 表 达 的 测 定 构 建 得 到 的 质 粒 转 染 293T 细 胞, 48 h 后 收 获 细 胞 弃 旧 培 养 基, 加 入 预 冷 的 PBS 1 ml, 吹 打 并 收 集 细 胞, 2000 g 离 心 5 min, 1 Luciferase Cell Culture Lysis 100 μl 冰 上 裂 解 细 胞 30 min, 每 10 min 涡 旋 振 荡 一 次 取 样 品 6 μl 加 入 荧 光 素 酶 底 物 40 μl, 使 用 试 剂 盒 Luciferase Assay System 测 定 裂 解 液 的 荧 光 素 酶 活 性 病 毒 感 染 性 测 定 96 孔 板 每 孔 接 种 1 10 5 个 SupT1 细 胞 (200 μl) 取 所 得 上 清 病 毒 液 10 μl 感 染 SupT1 细 胞 培 养 48 h 后, 移 液 器 反 复 吹 打 混 匀 细 胞, 取 出 细 胞 悬 液 50 μl, 加 入 等 体 积 2 Luciferase Cell Culture Lysis 裂 解 细 胞 使 用 试 剂 盒 Luciferase Assay System 测 定 裂 解 液 的 荧 光 素 酶 活 性 根 据 报 告 基 因 荧 光 素 酶 活 性 的 大 小 得 出 感 染 性 病 毒 的 量 p24 ELISA 收 集 含 病 毒 颗 粒 的 上 清 液, 使 用 人 类 免 疫 缺 陷 病 毒 抗 原 抗 体 诊 断 试 剂 盒 ( 万 泰 生 物 药 业 ), 参 照 说 明 书 进 行 除 空 白 孔 外, 每 孔 加 入 生 物 素 试 剂 20 μl, 同 时 梯 度 稀 释 标 准 样 品, 然 后 每 孔 加 入 标 准 样 品 和 病 毒 上 清 100 μl, 轻 轻 振 荡 混 匀, 37 孵 育 60 min 洗 涤 液 清 洗 5 遍 ; 每 孔 各 加 入 酶 标 试 剂 100 μl, 37 静 置 60 min, 洗 涤 液 清 洗 5 遍 ; 然 后 每 孔 加 入 显 色 试 剂 A 和 B 各 50 μl, 轻 轻 振 荡 混 匀, 37 下 反 应 不 超 过 30 min ( 视 反 应 物 颜 色 深 浅 决 定 ) 后, 加 入 反 应 终 止 液 50 μl, 轻 轻 振 荡, 于 450 nm 波 长 下 测 定 吸 光 度 值 Western blot 检 测 细 胞 蛋 白 样 品 收 取 : 弃 旧 培 养 基, 预 冷 PBS 清 洗, 加 入 预 冷 PBS 1 ml, 刮 取 6 孔 板 中 细 胞, 2 000 g 离 心 5 min 去 上 清 液 加 入 预 冷 PBS 50 µl 重 悬, 再 加 入 2 蛋 白 上 样 缓 冲 液 50 µl 裂 解 细 胞 沸 水 浴 10 min, 每 隔 3 min 涡 旋 振 荡 蛋 白 样 品 储 存 于 20 或 者 80 Western blot 流 程 : 12% SDS-PAGE 分 离 蛋 白 样 品 70 V 恒 压 湿 法 转 膜 1 h 后, 5% 脱 脂 奶 粉 室 温 封 闭 1 h 先 后 与 一 抗 和 二 抗 孵 育, 然 后 ECL 显 色 抗 体 使 用 浓 度 为 α-gag (1 5 000, 由 本 实 验 室 自 制 ), β-actin (1 5 000, Abcam); 二 抗 山 羊 抗 兔 IgG (1 5 000), 山 羊 抗 小 鼠 IgG (1 5 000) 药 物 敏 感 性 测 定 293T 细 胞 于 6 孔 板 每 孔 接 种 5 10 5 个 500 ng T/F virus(luc) 或 Indie-C1(Luc) 与 500 ng phcmv-g 质 粒 共 转 染 细 胞 转 染 48 h 后, 取 上 清, 0.22 μm 滤 膜 过 滤, 测 定 细 胞 内 荧 光 素 酶 活 性 SupT1 细 胞 以 每 毫 升 5 10 5 个 接 种 于 96 孔 板 中, 每 孔 接 种 200 μl, 并 加 入 上 述 293T 细 胞 中 获 得 的 上 清 液 ( 病 毒 与 细 胞 的 体 积 比 为 1 20) 10 μl, 然 后 每 孔 加 入 不 同 浓 度 的 待 测 化 合 物 2 μl, 每 种 药 物 设 3 组 平 行 孔, 并 设 空 白 和 DMSO 阴 性 对 照, 培 养 48 h 后, 使 用 试 剂 盒 Luciferase Assay System 测 定 裂 解 液 的 荧 光 Table 1 Sequences of primers for T/F virus(luc). F: Forward; R: Reverse Primers pzm246-f pzm246-r pzm247-f pzm247-r pindie-c1-f pindie-c1-r pnl4-3(pzm246)-f pnl4-3(pzm246)-r pnl4-3(pzm247)-f pnl4-3(pzm247)-r pnl4-3(pindie-c1)-f pnl4-3(pindie-c1)-r Sequences (5' 3') AGC TCG GTA CCC GGG TGG AAG GGT TAA TTT ACT CTA AGA A TGC CTG CAG GTC GAC CTA TAA ATC ATC AAA AAG CCT AAT A AGC TCG GTA CCC GGG TGG AAG GGT TAG TTT ACT CCA AGA TGC CTG CAG GTC GAC TTA TAA GTC AAT AGC ACC CAA AAG C AGC TCG GTA CCC GGG TGG AAG GGT TAA TTT ACT CCA AGA TGC CTG CAG GTC GAC TTA CAA ATC ATT AAC ATC CAA AAG C TGA TTT ATA GGT CGA TGC TAC AGA AAA ATT GTG GGT TGC CTG CAG GTC GAC TGC TAG AGA TTT TCC ACA CT TGA CTT ATA AGT CGA TGC TAC AGA AAA ATT GTG GGT TGC CTG CAG GTC GAC TGC TAG AGA TTT TCC ACA CT TGA TTT GTA AGT CGA TGC TAC AGA AAA ATT GTG G TGC CTG CAG GTC GAC TGC TAG AGA TTT TCC ACA CT
370 药 学 学 报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (3): 367 372 素 酶 活 性 根 据 报 告 基 因 荧 光 素 酶 活 性 的 高 低 来 衡 量 感 染 病 毒 的 量 随 后 利 用 得 到 的 感 染 病 毒 的 量 计 算 药 物 对 不 同 毒 株 的 IC 50 值 对 蛋 白 酶 抑 制 剂 等 药 物 晚 期 活 性 的 测 定, 选 在 转 染 293T 细 胞 产 生 假 病 毒 后 6 h 加 入 阳 性 药 物, 48 h 收 获 假 病 毒 感 染 SupT1 细 胞 其 余 步 骤 与 早 期 药 物 测 定 方 法 相 同 数 据 处 理 每 组 实 验 重 复 3 次, 组 间 比 较 采 用 t 检 验 11828(Luc) 11829(Luc) 和 11941(Luc) 与 慢 性 感 染 株 Indie-C1(Luc) 相 比, 均 无 显 著 性 差 异 (P > 0.05) ( 图 2) 结 果 1 含 有 荧 光 素 酶 报 告 基 因 的 单 循 环 HIV-1 T/F 病 毒 克 隆 的 构 建 为 了 便 于 测 定 T/F 病 毒 及 同 一 亚 型 的 慢 性 感 染 病 毒 的 药 物 敏 感 性, 首 先 利 用 同 源 重 组 技 术, 构 建 了 含 有 荧 光 素 酶 报 告 基 因 的 单 循 环 HIV-1 克 隆 其 中, T/F 病 毒 分 别 命 名 为 11828(Luc) 11829(Luc) 和 11941(Luc), 以 及 慢 性 感 染 病 毒 Indie(Luc) 将 构 建 的 质 粒 与 表 达 VSV-G 的 质 粒 共 转 染 293T 细 胞, 以 常 用 的 单 循 环 HIV-1 克 隆 NL4-3(Luc) 为 对 照 48 h 收 获 细 胞, Western blot 检 测 主 要 蛋 白 的 表 达, 实 验 结 果 显 示, 病 毒 蛋 白 Gag 能 够 高 效 表 达 ( 图 1A) 利 用 酶 标 仪 检 测 荧 光 素 酶 的 活 性, 荧 光 素 酶 值 均 在 10 7 RLU 以 上, 说 明 报 告 基 因 荧 光 素 酶 成 功 表 达 ( 图 1B) 随 后, 通 过 ELISA 定 量 的 等 量 假 型 病 毒 感 染 SupT1 细 胞, 检 测 感 染 细 胞 中 荧 光 素 酶 的 活 性 结 果 显 示, 荧 光 素 酶 值 大 于 10 5 RLU, 说 明 所 产 生 的 假 型 HIV-1 病 毒 能 有 效 感 染 细 胞, 尽 管 感 染 性 低 于 对 照 NL4-3(Luc) ( 图 1C) 2 T/F 病 毒 对 NRTIs 的 敏 感 性 为 了 比 较 T/F 病 毒 对 NRTIs 的 敏 感 性, 作 者 选 择 了 有 代 表 性 的 两 种 药 物 3TC 和 D4T 用 于 实 验, 两 种 药 物 都 以 浓 度 梯 度 添 加 SupT1, 空 白 组 加 入 DMSO 对 两 种 药 物 的 敏 感 性 验 证 中, 经 t 检 验, T/F 病 毒 Figure 2 Effects of 3TC (A) and D4T (B) on viral replication. represents the standard errors of three independent experiments. D4T: Stavudine; 3TC: Lamivudine 3 T/F 病 毒 对 NNRTIs 的 敏 感 性 作 者 进 一 步 研 究 了 T/F 病 毒 对 NNRTIs 的 敏 感 性, 选 择 了 有 代 表 性 的 两 种 药 物 EFV 和 NVP 在 EFV 的 实 验 中, 11828(Luc) 和 11941(Luc) 与 Indie-C1(Luc) 相 比, 表 现 出 显 著 性 差 异 (P < 0.05); 而 11829(Luc) 与 Indie-C1(Luc) 相 比, 并 没 有 显 著 性 差 异 (P > 0.05) ( 图 3A) 在 NVP 的 实 验 中, 11828(Luc) 11829(Luc) 和 11941(Luc) 与 慢 性 感 染 株 Indie-C1(Luc) 相 比, 均 表 现 出 显 著 性 差 异 (P < 0.05), 且 11828(Luc) 与 Indie-C1(Luc) 的 IC 50 值 相 比, 提 高 了 6 倍 以 上 ( 图 3B) 4 T/F 病 毒 对 INIs 的 敏 感 性 选 择 INIs 的 代 表 性 药 物 RAL 来 比 较 T/F 病 毒 对 INIs 的 敏 感 性 结 果 显 示, 11828(Luc) 11829(Luc) 和 11941(Luc) 与 Indie-C1(Luc) 相 比, 无 显 著 性 差 异 (P > 0.05) ( 图 4) Figure 1 Regulated T/F virus (Luc) and Indie-C1(Luc) expression in 293T cells. (A) Expression of T/F virus and chronic virus constructs; (B) Luciferase activity in producer cells expressing T/F or chronic viruses constructs; (C) Luciferase activity of pseudotyped T/F and chronic viruses in SupT1 cells. RLU: Relative light units
丁 寄 葳 等 : HIV-1 初 始 传 播 病 毒 药 物 敏 感 性 研 究 371 Figure 3 Effects of EFV (A) and NVP (B) on viral replication. represents the standard errors of three independent experiments. * P < 0.05, ** P < 0.01 vs Indie-C1(Luc). EFV: Efavirenz; NVP: Nevirapine Figure 4 Effects of raltegravir (RAL) on viral replication. represents the standard errors of three independent experiments 5 T/F 病 毒 对 PIs 的 敏 感 性 T/F 病 毒 对 PIs 敏 感 性 的 影 响 选 择 了 有 代 表 性 的 两 类 药 物 SQV 和 IDV 对 两 种 药 物 的 敏 感 性 验 证 中, T/F 病 毒 11828(Luc) 11829(Luc) 和 11941(Luc) 与 慢 性 感 染 株 Indie-C1(Luc) 相 比, 均 无 显 著 性 差 异 (P > 0.05) ( 图 5) 6 T/F 病 毒 与 慢 性 感 染 株 逆 转 录 酶 蛋 白 序 列 比 对 分 析 鉴 于 T/F 病 毒 对 NNRTIs 表 现 出 一 定 的 耐 药 性, 作 者 对 T/F 病 毒 与 慢 性 感 染 病 毒 逆 转 录 酶 的 蛋 白 序 列 进 行 了 比 对, 以 期 发 现 与 敏 感 性 下 降 相 关 的 序 列 变 异 结 果 显 示, 与 慢 性 感 染 病 毒 相 比, T/F 病 毒 11828 株 的 蛋 白 同 源 性 为 95%, 其 中 以 下 位 点 发 生 突 变, D39E I60V I69T Y121D D123G I165T R166K E207N I292V S322A R357M T359S M377T T400I D432E I434V A435P E449D L452I P461K K464I I465V T477A Y483Q S491L I521V S554N 和 K558R 11829 与 慢 性 感 染 株 相 比, 蛋 白 序 列 同 源 性 为 95.4%, 其 中 以 下 位 点 发 生 突 变, A36V D39E I60V I69T Y121D I165T R166K I202V Q245K R277K Q278N A286T Q334N N348I Figure 5 Effects of SQV (A) and IDV (B) on viral replication. represents the standard errors of three independent experiments. IDV: Indinavir; SQV: Saquinavir M377L S379G T386I D432E A435I V437A L452I I466V Y483Q K527Q S554T 和 K558R 11941 与 慢 性 感 染 株 相 比, 蛋 白 序 列 同 源 性 为 95.7%, 其 中 T27S A36E D39M I69T I165T R166K R277K Q278N A286T Q334H M377L T386I D432E A435L V437A L452I I466V Y483Q S491L K527Q S554T 和 K558R 位 点 发 生 突 变 通 过 比 对, 作 者 发 现 11828 11829 和 11941 三 株 病 毒 存 在 多 个 相 同 或 相 似 的 位 点 突 变, 如 相 同 突 变 : I69T I165T R166K D432E L452I Y483Q 和 K558R; 相 似 突 变 : M377T(L) A435P(L, I) 和 S554N(T) ( 表 2), 这 些 位 点 的 突 变 在 已 知 NNRTIs 的 耐 药 性 突 变 中 尚 未 发 现 Table 2 Key non-consensus residues in the reverse transcriptase of T/F virus Indie-C1 11828 11829 11941 Region 讨 论 I69 T T T Catalytic domain I165 T T T Catalytic domain R166 K K K Catalytic domain D432 E E E RVT_connect L452 I I I RNaseH Y483 Q Q Q RNaseH K558 R R R RNaseH M377 T L L RVT_connect A435 P I L RNaseH S554 N T T RNaseH 由 于 HIV 病 毒 基 因 组 相 对 比 较 复 杂, 部 分 HIV-1 病 毒 会 在 感 染 初 期 通 过 快 速 的 基 因 组 重 组 从 而 逃 逸 宿 主 体 内 的 免 疫 反 应, 在 受 感 染 者 体 内 存 活 并 进 一 步 繁 殖, 这 样 在 感 染 者 体 内 HIV-1 病 毒 就 形 成 了 一 个 以 优 势 株 为 主 的 相 关 突 变 株 病 毒 群 即 称 为 T/F 病 毒, 以
372 药 学 学 报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (3): 367 372 利 于 其 在 不 良 环 境 下 生 存 目 前, 对 HIV-1 的 治 疗 主 要 是 利 用 药 物 针 对 病 毒 生 命 周 期 的 各 个 重 要 环 节 进 行 阻 断, 因 此, 进 一 步 了 解 T/F 病 毒 对 不 同 药 物 的 敏 感 性, 将 为 艾 滋 病 PrEP 提 供 重 要 的 理 论 支 持 本 研 究 首 次 构 建 了 含 荧 光 素 酶 报 告 系 统 的 T/F 病 毒 克 隆, 进 而 验 证 了 T/F 病 毒 对 目 前 临 床 上 使 用 的 几 大 类 抗 HIV-1 药 物 的 敏 感 性 研 究 发 现, T/F 病 毒 对 NNRTIs 的 敏 感 性 较 差 通 过 氨 基 酸 序 列 比 对, 作 者 发 现 11828 11829 和 11941 三 株 病 毒 存 在 多 个 相 同 或 相 似 的 突 变 位 点, 且 主 要 集 中 于 RNaseH 结 构 域 NNRTI 的 已 知 耐 药 性 突 变 位 点 则 集 中 于 聚 合 酶 附 近, 可 以 抑 制 dntp 的 结 合 作 者 推 测 在 C 亚 型 的 T/F 病 毒 中, 这 些 RNaseH 位 点 的 突 变 可 以 通 过 影 响 RNaseH 活 性 而 影 响 逆 转 录 酶 的 活 性 和 对 NNRTIs 的 敏 感 性 因 为 T/F 病 毒 的 突 变 并 非 由 于 药 物 的 选 择 压 力 所 致, 所 以 上 述 突 变 可 能 是 病 毒 建 立 感 染 过 程 中 自 然 选 择 的 结 果, 为 病 毒 的 复 制 与 传 播 提 供 一 定 的 进 化 优 势 尽 管 目 前 T/F 病 毒 对 NNRTIs 敏 感 性 下 降 的 机 制 尚 不 清 楚, 但 该 研 究 结 果 提 示 作 者, 当 对 高 危 人 群 进 行 PrEP 时, 医 生 选 择 RTIs 时 应 尽 量 避 免 选 择 NNRTIs References [1] Barré-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F, et al. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS) [J]. Science, 1983, 220: 868 871. [2] Lu XF, Chen ZW. The development of anti-hiv-1 drugs [J]. Acta Pharm Sin ( 药 学 学 报 ), 2010, 45: 165 176. [3] Shaw GM, Hunter E. HIV transmission [J]. Cold Spring Harb Perspect Med, 2012, 2: a006965. [4] Ramana LN, Anand AR, Sethuraman S, et al. Targeting strategies for delivery of anti-hiv drugs [J]. J Control Release, 2014, 192: 271 283. [5] Han Y, Wind-Rotolo M, Yang HC, et al. Experimental approaches to the study of HIV-1 latency [J]. Nat Rev Microbiol, 2007, 5: 95 106. [6] Serrao E, Odde S, Ramkumar K, et al. Raltegravir, elvitegravir, and metoogravir: the birth of me-too HIV-1 integrase inhibitors [J]. Retrovirology, 2009, 6: 25. [7] Neff CP, Ndolo T, Tandon A, et al. Oral pre-exposure prophylaxis by anti-retrovirals raltegravir and maraviroc protects against HIV-1 vaginal transmission in a humanized mouse model [J]. PLoS One, 2010, 5: e15257. [8] Massud I, Aung W, Martin A, et al. Lack of prophylactic efficacy of oral maraviroc in macaques despite high drug concentrations in rectal tissues [J]. J Virol, 2013, 87: 8952 8961. [9] Veselinovic M, Yang KH, LeCureux J, et al. HIV pre-exposure prophylaxis: mucosal tissue drug distribution of RT inhibitor tenofovir and entry inhibitor maraviroc in a humanized mouse model [J]. Virology, 2014, 464 465: 253 263. [10] Keele BF. Identifying and characterizing recently transmitted viruses [J]. Curr Opin HIV AIDS, 2010, 5: 327 334. [11] Salazar-Gonzalez JF, Bailes E, Pham KT, et al. Deciphering human immunodeficiency virus type 1 transmission and early envelope diversification by single-genome amplification and sequencing [J]. J Virol, 2008, 82: 3952 3970. [12] Sagar M, Laeyendecker O, Lee S, et al. Selection of HIV variants with signature genotypic characteristics during heterosexual transmission [J] J Infect Dis, 2009, 199: 580 589. [13] Salazar-Gonzalez JF, Salazar MG, Keele BF, et al. Genetic identity, biological phenotype, and evolutionary pathways of transmitted/founder viruses in acute and early HIV-1 infection [J]. J Exp Med, 2009, 206: 1273 1289.