国 内 外 多 肽 药 物 杂 质 研 究 比 较 生 化 药 品 及 基 因 工 程 药 物 室 任 雪 杂 质 研 究 及 控 制 是 药 品 质 量 控 制 的 核 心 内 容 之 一, 合 成 多 肽 药 物 药 学 研 究 技 术 指 导 原 则 中 提 出, 有 关 物 质 检 查 是 反 映 多 肽 化 学 纯 度 的 重 要 指 标 之 一, 有 关 物 质 检 查 的 方 法 学 验 证 应 能 证 明 所 采 用 的 方 法 可 以 有 效 分 离 目 标 多 肽 与 工 艺 杂 质 ( 例 如 缺 失 肽 ) 降 解 产 物 ( 例 如 二 硫 键 交 换 或 氧 化 产 物 ) 聚 合 物 等 [1] 杂 质 谱 是 对 存 在 于 药 品 中 所 有 已 知 杂 质 和 未 知 杂 质 的 总 的 描 述 在 多 肽 药 物 杂 质 研 究 方 面, 国 外 已 步 入 杂 质 谱 控 制 研 究 阶 段, 而 我 国 还 停 留 在 杂 质 控 制 研 究 阶 段 EP7.0 中 众 多 ( 但 不 是 全 部 ) 多 肽 药 物 品 种 项 下 都 对 已 知 杂 质 分 别 制 订 了 限 度, 并 列 出 了 已 知 杂 质 的 名 称 及 结 构 式 举 例 如 下 [2,4] : 1. 普 罗 瑞 林, 原 名 促 甲 状 腺 素 释 放 激 素, 氨 基 酸 序 列 为 :5- 氧 代 -L 谷 氨 酰 -L 组 氨 酰 -L 脯 氨 酰 胺, 是 人 工 合 成 的 三 肽 激 素, 与 天 然 下 丘 脑 神 经 素 完 全 一 致, 可 促 进 垂 体 促 甲 状 腺 素 的 合 成 和 释 放, 还 具 泌 乳 素 释 放 激 素 活 性 及 抗 休 克 活 性 普 罗 瑞 林 原 料 药 收 载 于 EP7.0,ChP2010 未 见 收 载 EP7.0 中 杂 质 项 下 列 举 了 5 种 已 知 杂 质, 分 别 为 A. 5- 氧 代 -L- 谷 氨 酰 -D- 组 氨 酰 -L- 脯 氨 酰 胺 ;B. 5- 氧 代 -D- 谷 氨 酰 -L- 组 氨 酰 -L- 脯 氨 酰 胺 ;C. 5- 氧 代 -L- 谷 氨 酰 -L- 组 氨 酸 ;D. 5- 氧 代 -L- 谷 氨 酰 -L- 组 氨 酰 -L- 脯 氨 酸 ;E. (3S, 8aS)-3-(1H- 咪 唑 -4- 酰 甲 基 ) 六 氢 吡 咯 并 [1,2-a] 吡 嗪 -1,4- 二 酮 ( 环 (-L- 组 氨 酰 -L- 脯 氨 酰 )) 其 中 杂 质 A 杂 质 B 为 消 旋 产 物 ; 杂 质 C 为 缺 失 肽 ; 杂 质 D 为 脱 酰 胺 产 物 ; 杂 质 E 为 缺 失 肽 环 化 产 物 在 含 量 测 定 及 有 关 物 质 项 下 的 系 统 适 用 性 要 求 中 规 定, 杂 质 A 与 主 峰 的 分 离 度 不 得 小 于 2.5 2. 亮 丙 瑞 林, 是 化 学 合 成 的 两 端 封 闭 的 水 溶 性 九 肽, 氨 基 酸 序 列 为 :5- 氧 代 -L- 脯 氨 酰 -L- 组 氨 酰 -L- 色 氨 酰 -L- 丝 氨 酰 -L- 酪 氨 酰 -D- 亮 氨 酰 -L- 亮 氨 酰 -L 精 氨 酰 -N- 乙 基 -L- 脯 氨 酰 胺, 为 下 丘 脑 产 生 的 类 黄 体 生 成 激 素 释 放 激 素 ( 或 称 促 性 腺 激 素 释 放 激 素 ) 的 高 活 性 类 似 物 连 续 使 用 用 于 抑 制 前 列 腺 恶 性 肿 瘤 中 枢 性 性 早 熟 子 宫 肌 瘤 及 子 宫 内 膜 异 位 症, 以 醋 酸 盐 形 式 起 作 用 亮 丙 瑞 林 原 料 药 收 载 于 EP7.0,ChP2010 未 见 收 载 EP7.0 中 杂 质 项 下 列 举 了 11 种 已 知 杂 质, 对 其 中 杂 质 A B C D 规 定 了 限 度 范 围 除 杂 质 D 为 4 位 丝 氨 酸 侧 链 羟 基 被 乙 酰 化 的 产 物 外, 杂 质 A 至 I 均 为 第 1 或 2 或 3 或 4 或 5 或 6 或 7 位 氨 基 酸 各 自 发 生 不 同 消 旋 的 产 物 ; 杂 质 J 为 8 位 精 氨 酸 侧 链 胍 基 化 衍 生 物 ; 杂 质 K 为 4 位 丝 氨 酸 脱 水 衍 生 物 即 [4- 去
氢 丙 氨 酸 ] 亮 丙 瑞 林 在 含 量 测 定 及 有 关 物 质 项 下 的 系 统 适 用 性 要 求 中 规 定, 杂 质 B 峰 与 主 峰 的 分 离 度 不 得 小 于 1.5 3. 缩 宫 素, 是 人 工 合 成 或 取 自 健 康 家 畜 的 垂 体 后 叶 组 织 的 环 形 九 肽 激 素, 氨 基 酸 序 列 为 L- 半 胱 氨 酰 -L- 酪 氨 酰 -L- 异 亮 氨 酰 -L- 谷 氨 酰 胺 酰 -L- 门 冬 酰 胺 酰 -L- 半 胱 氨 酰 -L- 脯 氨 酰 -L- 亮 氨 酰 -L- 甘 氨 酰 胺 环 (1 6) 二 硫 化 物, 在 胎 生 哺 乳 动 物 中 具 有 刺 激 子 宫 收 缩 和 泌 乳 的 作 用 缩 宫 素 原 料 药 收 载 于 EP7.0,ChP2010 未 见 收 载 虽 然 在 EP7.0 中 未 列 举 可 检 测 杂 质, 但 在 含 量 测 定 及 有 关 物 质 项 下 的 系 统 适 用 性 要 求 中 均 有 规 定, 主 峰 与 去 氨 加 压 素 峰 ( 缩 宫 素 的 结 构 与 去 氨 加 压 素 的 结 构 十 分 近 似, 仅 在 第 1 3 8 位 有 区 别 ) 的 分 离 度 不 得 小 于 5.0 4. 醋 酸 去 氨 加 压 素, 是 血 管 加 压 素 的 合 成 类 似 物, 氨 基 酸 序 列 为 3- 巯 基 丙 酰 -L- 酪 氨 酰 -L- 苯 丙 氨 酰 -L- 谷 氨 酰 胺 酰 -L- 门 冬 酰 胺 酰 -L- 半 胱 氨 酰 -L- 脯 氨 酰 -D- 精 氨 酰 -L- 甘 氨 酰 胺 环 (1 6) 二 硫 化 物 在 血 液 中 稳 定 性 增 加, 半 衰 期 延 长, 较 血 管 加 压 素 和 赖 氨 加 压 素 具 有 更 强 和 更 持 久 的 抗 利 尿 活 性, 且 加 压 的 副 作 用 比 精 加 压 素 降 低 400~800 倍, 同 样 也 可 激 活 血 液 因 子 Ⅷ 和 纤 溶 酶 原 活 性 用 于 中 枢 性 尿 崩 症, 遗 尿 症, 术 中 止 血 及 预 防 出 血, 及 出 血 性 疾 病 醋 酸 去 氨 加 压 素 原 料 药 收 载 于 EP7.0,USP32,ChP2010 未 见 收 载 EP7.0 中 杂 质 项 下 列 举 了 7 种 可 检 测 杂 质, 其 中 杂 质 A B 和 C 分 别 为 5 位 门 冬 酰 胺 或 4 位 谷 氨 酰 胺 或 9 位 甘 氨 酰 胺 的 脱 酰 胺 产 物 ; 杂 质 D 为 8 位 L- 精 氨 酸 消 旋 化 产 物 ; 杂 质 E 和 F 分 别 为 4 位 谷 氨 酰 胺 或 5 位 门 冬 酰 胺 乙 酰 氨 甲 基 化 的 产 物 ; 杂 质 G 为 9 位 甘 氨 酰 胺 二 甲 基 化 产 物 EP7.0 及 USP32 在 含 量 测 定 及 有 关 物 质 项 下 的 系 统 适 用 性 要 求 中 均 有 规 定, 主 峰 与 缩 宫 素 峰 ( 缩 宫 素 的 结 构 与 去 氨 加 压 素 的 结 构 十 分 近 似, 仅 在 第 1 3 8 位 有 区 别 ) 的 分 离 度 不 得 小 于 1.5 5. 卡 贝 缩 宫 素, 是 合 成 的 缩 宫 素 类 似 物, 氨 基 酸 序 列 为 丁 酰 -L- 甲 基 酪 氨 酰 -L- 异 亮 氨 酰 -L- 谷 氨 酰 胺 酰 -L- 门 冬 酰 胺 酰 -L- 半 胱 氨 酰 -L- 脯 氨 酰 -L- 亮 氨 酰 -L- 甘 氨 酰 胺 环 (1 6) 一 硫 化 物, 据 报 道 有 更 长 的 作 用 时 间 有 关 研 究 显 示, 卡 贝 缩 宫 素 中 可 检 测 到 以 下 4 种 已 知 杂 质, 分 别 为 5 位 门 冬 酰 胺 消 旋 化 产 物 6 位 半 胱 氨 酸 消 旋 化 产 物 卡 贝 缩 宫 素 亚 砜 I 卡 贝 缩 宫 素 亚 砜 II 4 位 谷 氨 酰 胺 脱 酰 胺 产 物 9 位 甘 氨 酰 胺 脱 酰 胺 产 物 系 统 适 用 性 要 求 中 涉 及 到 5 位 门 冬 酰 胺 消 旋 化 产 物 峰 与 主 峰 的 分 离 度 不 小 于 1.5, 有 关 物 质 检 查 中 对 前 四 种 列 出 的 杂 质 分 别 规 定 了 相 对 保 留 时 间 和 限 度 范 围 6. 苯 赖 升 压 素, 是 合 成 的 醋 酸 九 肽, 为 血 管 加 压 素 类 似 物, 氨 基 酸 序 列 为 :L- 半 胱 氨 酰 -L- 苯 丙 氨 酰 -L- 苯 丙 氨 酰 -L- 谷 氨 酰 胺 酰 -L 门 冬 酰 胺 酰 -L 半 胱 氨 酰 -L- 脯 氨 酰 -L- 赖 氨 酰 -L- 甘 氨 酰 胺 环 (1,6)- 二 硫 化 物 其 抗 利 尿 作 用 弱 于 血 管 加 压 素 当 禁 用 拟 交 感 神 经 药 时, 被 用
作 口 腔 使 用 局 麻 药 后 的 血 管 收 缩 剂, 也 作 为 治 疗 口 腔 疼 痛 和 炎 症 的 制 剂 成 分 之 一 苯 赖 升 压 素 原 料 药 收 载 于 EP7.0,ChP2010 未 见 收 载 EP7.0 中 杂 质 项 下 列 举 了 6 种 已 知 杂 质, 对 每 一 种 已 知 杂 质 都 规 定 了 限 度 范 围 杂 质 A 为 1,6 位 半 胱 氨 酸 开 环 并 乙 酰 胺 甲 基 化 的 还 原 产 物, 杂 质 B 和 F 分 别 为 4 位 谷 氨 酰 胺 或 5 位 门 冬 酰 胺 脱 酰 胺 产 物 ; 杂 质 C 和 D 分 别 为 (1,6, )( 1,,6) 或 (1,1, )( 6,6, ) 二 硫 键 产 物 ; 杂 质 E 为 N 端 乙 酰 化 产 物 在 含 量 测 定 及 有 关 物 质 项 下 的 系 统 适 用 性 要 求 中 规 定, 杂 质 C 峰 与 杂 质 D 峰 的 分 离 度 不 得 小 于 1.5 7. 替 可 克 肽, 为 人 工 合 成 的 二 十 四 肽, 其 氨 基 酸 序 列 与 人 促 肾 上 腺 皮 质 激 素 的 前 24 个 残 基 相 同, 为 L- 丝 氨 酰 -L- 酪 氨 酰 -L- 丝 氨 酰 -L- 甲 硫 氨 酰 -L- 谷 氨 酰 -L- 组 氨 酰 -L- 苯 丙 氨 酰 -L- 精 氨 酰 -L- 色 氨 酰 -L- 甘 氨 酰 -L- 赖 氨 酰 -L- 脯 氨 酰 -L- 缬 氨 酰 -L- 甘 氨 酰 -L- 赖 氨 酰 -L- 赖 氨 酰 -L- 精 氨 酰 -L- 精 氨 酰 -L- 脯 氨 酰 -L- 缬 氨 酰 -L- 赖 氨 酰 -L- 缬 氨 酰 -L- 酪 氨 酰 -L- 脯 氨 酸 可 利 用 形 式 为 含 水 醋 酸 盐, 有 增 加 肾 上 腺 分 泌 皮 质 激 素 的 速 度, 用 于 肾 上 腺 皮 质 功 能 减 退 替 可 克 肽 原 料 药 收 载 于 EP7.0,ChP2010 未 见 收 载 EP7.0 中 杂 质 项 下 列 举 了 1 种 已 知 杂 质 A 和 1 种 未 知 杂 质 B, 并 对 这 两 种 杂 质 都 规 定 了 限 度 范 围, 其 中 A 为 4 位 甲 硫 氨 酸 亚 砜 化 产 物 在 含 量 测 定 及 有 关 物 质 项 下 的 系 统 适 用 性 要 求 中 规 定, 杂 质 B 峰 的 峰 高 与 替 可 克 肽 峰 的 峰 谷 之 比 不 得 小 于 3 8. 鲑 降 钙 素, 是 通 过 化 学 合 成 法 或 重 组 DNA 技 术 法 获 得 的 与 天 然 鲑 降 钙 素 结 构 相 同 的 由 32 个 氨 基 酸 组 成 的 多 肽, 氨 基 酸 序 列 为 L- 半 胱 氨 酰 -L- 丝 氨 酰 -L- 门 冬 酰 胺 酰 -L- 亮 氨 酰 -L- 丝 氨 酰 -L- 苏 氨 酰 -L- 半 胱 氨 酰 -L- 缬 氨 酰 -L- 亮 氨 酰 -L- 甘 氨 酰 -L- 赖 氨 酰 -L- 亮 氨 酰 -L- 丝 氨 酰 -L- 谷 氨 酰 胺 酰 -L- 谷 氨 酰 -L- 亮 氨 酰 -L- 组 氨 酰 -L- 赖 氨 酰 -L- 亮 氨 酰 -L- 谷 氨 酰 胺 酰 -L- 苏 氨 酰 -L- 酪 氨 酰 -L- 脯 氨 酰 -L- 精 氨 酰 -L- 苏 氨 酰 -L- 门 冬 酰 胺 酰 -L- 苏 氨 酰 -L- 甘 氨 酰 -L- 丝 氨 酰 -L- 甘 氨 酰 -L- 苏 氨 酰 -L- 脯 氨 酰 胺 ( 二 硫 桥 :1 7) 它 通 过 抑 制 破 骨 细 胞 活 性 抑 制 骨 盐 溶 解 以 及 对 肾 脏 及 胃 肠 道 的 调 节, 使 血 钙 降 低, 能 显 著 降 低 高 周 转 性 骨 病 的 骨 钙 流 失, 是 用 于 骨 质 疏 松 变 形 性 骨 炎 高 钙 血 症 的 治 疗 药 物 鲑 降 钙 素 原 料 药 收 载 于 EP7.0,USP32,ChP2010 EP7.0 中 杂 质 项 下 列 举 了 7 种 可 检 测 杂 质, 并 对 虽 有 杂 质 规 定 了 限 度 范 围 其 中 杂 质 E F G 仅 针 对 由 重 组 技 术 得 到 鲑 降 钙 素, 杂 质 A B C D 针 对 化 学 合 成 或 重 组 技 术 得 到 的 鲑 降 钙 素 杂 质 A 为 N 端 乙 酰 化 的 鲑 降 钙 素 ; 杂 质 B 为 9 位 亮 氨 酸 消 旋 化 产 物 ; 杂 质 C 为 22 位 酪 氨 酸 脱 除 产 物 ; 杂 质 D 为 O 酰 基 化 鲑 降 钙 素 ; 杂 质 E 为 33 位 加 甘 氨 酸 产 物 ; 杂 质 F 为 二 硫 键 被 氧 化 的 磺 酸 化 产 物 ; 杂 质 G 为 33 位 加 甘 氨 酸 且 二 硫 键 被 氧 化 的 磺 酸 化 产 物 EP7.0 及 USP32 在 含 量 测 定 及 有 关 物 质 项 下 的 系 统 适 用 性 要 求 中 均 有 规 定, 主 峰 与 杂 质 A 的 分 离 度 不 得 小 于 3(USP32) 或 5.0
(EP7.0), 杂 质 A 的 对 称 因 子 不 得 大 于 2.5; 主 峰 与 杂 质 E 的 分 离 度 不 得 小 于 3.0 ChP2010 中 未 记 载 任 何 可 检 测 杂 质 结 构, 未 对 任 何 可 检 测 杂 质 进 行 限 度 规 定, 仅 将 N- 乙 酰 - 半 胱 氨 酰 1 - 降 钙 素 ( 即 杂 质 A) 用 作 系 统 适 用 性 溶 液 成 分 之 一, 规 定 N- 乙 酰 - 半 胱 氨 酰 1 - 降 钙 素 峰 与 鲑 降 钙 素 峰 的 分 离 度 应 不 小 于 3.0,N- 乙 酰 - 半 胱 氨 酰 1- 降 钙 素 的 对 称 因 子 应 不 大 于 2.5 [3] 以 上 文 8 个 品 种 为 例, 我 们 可 以 窥 豹 一 斑 地 看 出, 从 短 的 三 肽 到 长 的 三 十 二 肽, 无 论 含 二 硫 键 的 环 肽 还 是 线 性 肽, 国 外 企 业 对 多 肽 类 药 物 有 关 物 质 的 研 究 都 是 比 较 深 入 的, 每 个 品 种 确 定 结 构 的 相 关 肽 均 有 2 到 11 个 不 等 已 知 结 构 的 合 成 肽 杂 质 共 40 种, 其 中 消 旋 肽 14 种, 占 35%; 脱 酰 胺 肽 8 种, 占 20%; 氧 化 肽 4 种, 占 10%; 缺 失 肽 3 种, 占 8%; 错 位 肽 2 种, 占 5%; 其 他 如 乙 酰 化 肽 甲 基 化 肽 胍 基 化 肽 或 脱 水 肽 共 9 种, 占 22% 用 于 系 统 适 用 性 的 杂 质 肽 中, 有 38% 为 消 旋 肽 相 比 较 而 言, 我 国 在 该 方 面 做 的 工 作 还 不 够, 各 级 质 量 标 准 一 般 仅 在 极 为 有 限 的 品 种 项 下 用 相 关 肽 做 了 系 统 适 用 性 试 验, 基 本 未 规 定 过 相 关 肽 的 相 对 保 留 时 间 及 限 度 范 围, 通 常 仅 采 用 面 积 归 一 化 法 或 自 身 对 照 法 进 行 有 关 物 质 检 查, 有 的 品 种 如 缩 宫 素 根 本 未 将 有 关 物 质 检 查 列 入 质 量 标 准 当 然, 随 着 为 人 民 用 药 安 全 有 效 服 务 意 识 的 增 强, 注 射 剂 标 准 提 高 任 务 药 品 评 价 性 抽 验 工 作 的 逐 年 展 开, 我 们 力 求 对 质 量 标 准 不 断 进 行 提 高 完 善, 向 国 际 一 流 水 平 看 齐 例 如, 在 2010 年 由 江 苏 省 食 品 药 品 检 验 所 完 成 的 缩 宫 素 注 射 液 评 价 性 抽 验 工 作 研 究 中 发 现, 现 行 标 准 不 能 有 效 控 制 药 品 质 量, 体 现 在 有 关 物 质 偏 高, 制 剂 中 的 有 关 物 质 由 原 料 引 入, 须 增 加 有 关 物 质 检 查 江 苏 省 所 投 入 了 很 大 的 人 力 物 力, 采 用 强 降 解 试 验 半 制 备 等 措 施, 通 过 LC-MS 等 分 析 手 段, 对 缩 宫 素 注 射 液 中 的 有 关 物 质 进 行 了 深 入 探 索 式 研 究 但 是, 其 实 最 有 条 件 进 行 药 品 杂 质 深 入 研 究 的 不 是 各 级 检 验 所, 而 是 生 产 企 业 自 身 企 业 是 药 品 生 产 人 和 最 终 责 任 人, 最 熟 知 自 己 产 品 的 生 产 过 程 及 在 生 产 过 程 中 哪 些 步 骤 可 能 引 入 哪 些 杂 质, 并 结 合 一 些 分 析 手 段 如 LC-MS-MS 或 CE-MS-MS, 能 够 比 较 方 便 对 杂 质 谱 控 制 有 较 全 面 和 细 致 的 把 握, 进 而 可 以 改 进 生 产 工 艺, 提 高 产 品 质 量 随 着 科 技 的 不 断 发 展 及 对 药 品 质 量 要 求 的 不 断 提 高, 要 求 企 业 在 杂 质 控 制 方 面 加 大 投 入 力 度, 提 高 产 品 的 质 量 控 制 水 平 及 产 品 的 质 量 当 然, 质 量 不 是 检 测 出 来 的, 单 单 讲 是 生 产 出 来 的 也 不 尽 然, 现 在 都 在 宣 传 QbD, 全 称 是 Quality by design, 即 质 量 源 于 设 计 这 个 仿 制 药 结 构 是 确 定 了, 但 生 产 工 艺 不 一 定 与 原 研 厂 一 致, 而 生 产 工 艺 的 不 同 直 接 导 致 药 品 有 关 物 质 种 类 数 量 含 量 产 生 差 异, 很 可 能 出 现 新 的 杂 质 或 超 量 杂 质, 这 就 需 要 按 创 新 药 思 路 进 行 质 量 研 究, 对 新 的 生 产 工 艺 进 行 风 险 评 估, 制 定 质 量 标 准 [5]
不 积 跬 步, 无 以 至 千 里 ; 不 积 小 流, 无 以 成 江 海 作 为 为 人 民 用 药 安 全 有 效 把 关 的 生 产 者 和 检 验 者 们, 需 要 不 断 更 新 和 提 高 知 识 和 技 术, 积 累 杂 质 谱 控 制 的 经 验, 并 落 实 到 实 处, 力 求 将 我 们 的 药 品 质 量 推 向 一 个 更 完 美 的 水 平 参 考 文 献 1 合 成 多 肽 药 物 药 学 研 究 技 术 指 导 原 则, 2007 2 EP7.0 3 ChP( 中 国 药 典 ). 2010. Vol Ⅱ( 二 部 ) 4 李 大 魁, 金 有 豫, 汤 光 等 译. 马 丁 代 尔 药 物 大 典 ( 原 著 第 35 版 ). 化 学 工 业 出 版 社. 5 张 哲 峰. 浅 谈 杂 质 研 究 中 的 风 险 控 制