学 校 编 码 :10384 分 类 号 密 级 学 号 :24520101153288 UDC 硕 士 学 位 论 文 Brugada 综 合 征 SCN5A 基 因 R1628Q 突 变 的 功 能 表 达 研 究 Functional expression of SCN5A mutation R1628Q associated with Brugada syndrome 指 导 教 师 姓 名 : 曾 志 鹏 李 卫 华 教 授 专 业 名 称 : 心 血 管 内 科 论 文 提 交 日 期 : 2013 年 5 月 论 文 答 辩 日 期 : 2013 年 5 月 2013 年 6 月
厦 门 大 学 学 位 论 文 原 创 性 声 明 本 人 呈 交 的 学 位 论 文 是 本 人 在 导 师 指 导 下, 独 立 完 成 的 研 究 成 果 本 人 在 论 文 写 作 中 参 考 其 他 个 人 或 集 体 已 经 发 表 的 研 究 成 果, 均 在 文 中 以 适 当 方 式 明 确 标 明, 并 符 合 法 律 规 范 和 厦 门 大 学 研 究 生 学 术 活 动 规 范 ( 试 行 ) 另 外, 该 学 位 论 文 为 ( ) 课 题 ( 组 ) 的 研 究 成 果, 获 得 ( ) 课 题 ( 组 ) 经 费 或 实 验 室 的 资 助, 在 ( ) 实 验 室 完 成 ( 请 在 以 上 括 号 内 填 写 课 题 或 课 题 组 负 责 人 或 实 验 室 名 称, 未 有 此 项 声 明 内 容 的, 可 以 不 作 特 别 声 明 ) 声 明 人 ( 签 名 ): 年 月 日
厦 门 大 学 学 位 论 文 著 作 权 使 用 声 明 本 人 同 意 厦 门 大 学 根 据 中 华 人 民 共 和 国 学 位 条 例 暂 行 实 施 办 法 等 规 定 保 留 和 使 用 此 学 位 论 文, 并 向 主 管 部 门 或 其 指 定 机 构 送 交 学 位 论 文 ( 包 括 纸 质 版 和 电 子 版 ), 允 许 学 位 论 文 进 入 厦 门 大 学 图 书 馆 及 其 数 据 库 被 查 阅 借 阅 本 人 同 意 厦 门 大 学 将 学 位 论 文 加 入 全 国 博 士 硕 士 学 位 论 文 共 建 单 位 数 据 库 进 行 检 索, 将 学 位 论 文 的 标 题 和 摘 要 汇 编 出 版, 采 用 影 印 缩 印 或 者 其 它 方 式 合 理 复 制 学 位 论 文 本 学 位 论 文 属 于 : ( )1. 经 厦 门 大 学 保 密 委 员 会 审 查 核 定 的 保 密 学 位 论 文, 于 年 月 日 解 密, 解 密 后 适 用 上 述 授 权 ( )2. 不 保 密, 适 用 上 述 授 权 ( 请 在 以 上 相 应 括 号 内 打 或 填 上 相 应 内 容 保 密 学 位 论 文 应 是 已 经 厦 门 大 学 保 密 委 员 会 审 定 过 的 学 位 论 文, 未 经 厦 门 大 学 保 密 委 员 会 审 定 的 学 位 论 文 均 为 公 开 学 位 论 文 此 声 明 栏 不 填 写 的, 默 认 为 公 开 学 位 论 文, 均 适 用 上 述 授 权 ) 声 明 人 ( 签 名 ): 年 月 日
摘 要 目 的 体 外 构 建 含 R1628Q 突 变 的 人 心 脏 钠 离 子 通 道 α 亚 基 真 核 表 达 载 体 phl-hh1-r1628q 研 究 R1628Q 突 变 对 钠 通 道 电 生 理 性 质 的 影 响, 阐 明 Brugada 综 合 征 的 发 病 机 制, 为 疾 病 的 基 因 诊 断 和 分 子 治 疗 提 供 新 的 思 路 方 法 设 计 带 突 变 位 点 的 引 物, 以 含 有 人 心 脏 钠 离 子 通 道 cdna 的 质 粒 为 模 板 经 重 叠 延 伸 PCR 法 体 外 定 点 诱 变, 构 建 R1628Q 突 变 型 人 心 脏 钠 离 子 通 道 真 核 表 达 载 体 经 酶 切 和 DNA 测 序 验 证 后 与 心 脏 钠 离 子 通 道 β1 亚 基 质 粒 pegfp-n3-scn1b 瞬 时 共 同 转 染 到 HEK293,48 小 时 后 全 细 胞 记 录 钠 通 道 的 电 生 理 特 性 结 果 1. DNA 测 序 证 实 突 变 质 粒 phl-hh1-r1628q 构 建 成 功 2. hh1-r1628q 钠 通 道 的 平 均 峰 值 电 流 密 度 (-298.7±27.0pA/pF;n=22) 与 hh1-wt 的 平 均 峰 值 电 流 密 度 (-336.7±26.9pA/pF;n=30) 相 比, 无 显 著 性 差 异 (P>0.05) hh1-r1628q 钠 通 道 的 电 导 - 电 压 (g-v) 曲 线 与 hh1-wt 相 似,V 1/2 和 斜 率 因 子 k 的 统 计 学 处 理 无 显 著 差 异 (P>0.05) 3. hh1-r1628q 钠 电 流 的 衰 减 时 间 常 数 在 测 试 电 压 (-50mV 到 0mV) 明 显 快 于 hh1-wt(p<0.05) 相 比 hh1-wt,hh1-r1628q 钠 通 道 的 稳 态 失 活 曲 线 向 负 电 位 方 向 移 动 约 20.6mV, 统 计 学 处 理 有 显 著 差 异 (hh1- WT:-81.1±1.3mV,n=13;hH1-R1628Q:-101.7±1.2,n=18;P<0.05) 4. 经 一 定 间 隔 时 间 -20mV 预 刺 激 后 细 胞 进 入 中 间 失 活 状 态, 可 以 得 到 中 间 失 活 的 时 间 依 赖 性 曲 线 发 现 hh1-wt 和 hh1-r1628q 的 失 活 通 道 比 例 在 各 时 间 下 均 有 显 著 性 差 异, 如 经 1000ms 电 压 为 -20mV 的 预 刺 激 后 R1628Q 进 入 中 间 失 活 状 态 的 比 例 明 显 提 高, 是 WT 的 3.6 倍 (hh1-wt:19.6±1.5%, n=9; versus hh1-r1628q:69.6±1.4%, n=8, P<0.05)
5. 失 活 后 恢 复 曲 线 经 双 指 数 方 程 拟 合 后 得 到 快 恢 复 时 间 常 数 τf(hh1-wt: 3.2±0.2ms, n=11; hh1-r1628q: 22.5±1.0ms, n=12, P<0.05) 和 慢 恢 复 时 间 常 数 τs (hh1-wt:104.1±20ms, n=11; hh1-r1628q:139.0±14.0ms, n=12, P>0.05) hh1-r1628q 与 hh1-wt 相 比, 快 恢 复 时 间 常 数 τf 明 显 延 长, 而 慢 恢 复 时 间 常 数 τs 差 异 无 统 计 学 意 义 结 论 1. 成 功 构 建 了 Brugada 综 合 征 SCN5A 基 因 R1628Q 突 变 的 真 核 表 达 质 粒 2. R1628Q 突 变 对 通 道 激 活 和 电 流 密 度 无 明 显 影 响 ; 加 快 了 通 道 衰 减 和 稳 态 失 活, 延 长 了 失 活 后 快 恢 复 时 间, 加 快 通 道 进 入 中 间 失 活 状 态, 提 示 DⅣS4 可 能 参 与 了 通 道 失 活 过 程 关 键 字 :Brugada 综 合 征 SCN5A 膜 片 钳 技 术 定 点 诱 变
Abstract Objective To explore the functional effect of R1628Q mutation on SCN5A,we construct human cardiac sodium channel alpha subunit cdna(hh1) mutated recombinant phl-hh1-r1628q via site-directed mutagenesis in vitro, and study the current and electrophysiological properties of the sodium channel using patch-clamp whole-cell recording in HEK293 cell into which the hh1-wt or hh1-r1628q is transfected. These studies can further clarify the pathogenesis of the disease and provide new ideas for molecular diagnosis and gene therapy. Method We design primers that include mutation base. cdna encoding alpha subunit of the human cardiac sodium channel is used as a template for site-directed mutagenesis by overlap extension PCR method in vitro, then construct the phl-hh1-r1628q. The recombinant plasmid is verified by enzyme digestion and DNA sequencing. The plasmid and plasmid pegfp-n3-scn1b encoding cardiac sodium channel beta1 subunit are transiently transfected into HEK293 cell lines. 48 hours after transfection, the whole-cell patch-clamp recording is used to study the electrophysiological properties and current of sodium channels. Result 1. Site-mutagenesis in the phl-hh1-r1628q was confirmed by DNA sequencing. 2.On average, no significant difference was observed between peak current density or the midpoint of conductance-voltage curve for hh1-wt and hh1-r1628q. The peak current density of cells expressing hh1-r1628q was similar to the those expressing hh1-wt (hh1-wt:-336.7±26.9pa/pf;n=30; hh1-r1628q: -298.7±27.0pA/pF;n=22; P>0.05).The conductance-voltage curve of hh1-r1628q channels was shifted 2.3mV toward more negative potentials compared with hh1-wt (hh1-wt:34.5±1.5mv,n=8;hh1-r1628q:32.2±1.4,n=11; P>0.05). 3. Cells expressing hh1-r1628q exhibited a midpoint (V 1/2 ) of the steady-state inactivation that was shifted 20.6mV toward negative potentials compared to
hh1-wt(hh1-wt:-81.1±1.3mv,n=13;hh1-r1628q:-101.7±1.2,n=18;p<0.05).the time courses of current decay were faster for the R1628Q mutant compared to WT during the test potential range from -50mV to 0mV.The differences had statistical significance(p<0.05). 4. Using a two-pusle protocol to characterize the development of intermidate currents(i M ), with progressively longer prepusle duration, sodium current diminished more in cells expressing hh1-r1628q than those transfected with hh1-wt. The differences between hh1-wt and hh1-r1628q are significant at all prepulse durations at the level of P<0.05. At a prepusle duration of 1000ms, the proportional decrement in channel availability was 3.6-fold greater for R1628Q compared with hh1-wt (hh1-wt 19.6±1.5%, n=9; versus hh1-r1628q 69.6±1.4%, n=8, P<0.05). 5. The recovery from inactivation curves for hh1-wt and hh1-r1628q have been fit with two exponential components where the fast time constantτf(hh1-wt: 3.2±0.2ms, n=11; hh1-r1628q: 22.5±1.0ms, n=12, P<0.05) and the slow time constant τ s (hh1-wt: 104.1±20ms, n=11; hh1-r1628q: 139.0±14.0ms, n=12, P>0.05)were acquired. Conclusion 1. We have successfully constructed eukaryotic expression plasmid mutation R1628Q associated with Brugada syndrome. 2. The mutation had no little effect on conductance-voltage curve and current density but accelerated current decay and shifted steady-state inactivation in hyperpolarizing direction. It dramatically enhanced into intermediate inactivation from the closed state and extended the fast recovery time after deactivation. These finding suggested that D IV S4 maybe involved in inactivation process of channel and a mutation underlying Brugada syndrome in the voltage-sensor of cardiac sodium channels can alter the biophysical properties of the channel. Keywords: Brugada syndrome; SCN5A; patch-clamp technology; site-mutagenesis
目 录 第 一 章 前 言... 1 第 二 章 构 建 SCN5A 基 因 R1628Q 突 变 的 hh1 真 核 表 达 载 体... 6 2.1 概 述... 6 2.2 材 料 和 方 法... 6 2.3 实 验 结 果... 16 第 三 章 SCN5A 基 因 R1628Q 突 变 在 HEK293 中 的 功 能 表 达 研 究.18 3.1 概 述... 18 3.2 材 料 和 方 法... 18 3.3 实 验 结 果... 24 第 四 章 讨 论... 32 第 五 章 结 论... 43 英 文 缩 略 词 表... 48 致 谢... 49 综 述... 50
Table of Contents Chapter1 Introduction... 1 Chapter2 Constructed vector carrying R1628Q mutation... 6 2.1 Overview... 6 2.2 Material and method... 6 2.3 Result... 16 Chapter3 the Functional expression of SCN5A mutation R1628Q in HEK293 cell lines...18 3.1 Overview... 18 3.2 Material and method... 18 3.3 Result... 24 Chapter4 Discussion...32 Chapter5 Conclusion...43 Abbreviation...48 Acknowledgement...49 Review...50
第 一 章 前 言 第 一 章 前 言 1992 年 西 班 牙 学 者 Brugada 兄 弟 首 次 报 道 了 一 组 具 有 室 颤 (VF) 病 史 且 心 电 图 表 现 右 束 支 传 导 阻 滞 和 右 胸 导 联 (V 1 -V 3 )ST 段 抬 高 的 病 例, 而 患 者 无 器 质 性 心 脏 病 的 证 据, 并 将 这 些 病 症 统 称 为 一 种 综 合 征 [1] 随 后 此 病 症 被 命 名 为 Brugada 综 合 征, 其 主 要 特 征 为 心 脏 结 构 及 功 能 正 常,ECG 右 胸 导 联 (V 1 -V 3 ) ST 段 抬 高 伴 或 不 伴 右 束 支 传 导 阻 滞 及 因 多 形 性 室 速 和 或 室 颤 所 致 的 心 源 性 猝 死 [2] 近 20 多 年 来, 因 该 病 在 东 南 亚 日 本 等 地 区 及 亚 裔 族 群 中 的 高 发 病 率 与 高 猝 死 率, 及 与 健 康 成 人 和 婴 幼 儿 猝 死 密 切 相 关 而 倍 受 临 床 医 生 和 研 究 者 们 的 广 泛 关 注, 临 床 病 例 报 道 和 基 因 发 病 机 制 危 险 分 层 治 疗 等 方 面 的 研 究 文 章 迅 速 增 多 据 流 行 病 学 调 查 发 现 该 病 在 欧 洲 人 群 中 的 发 病 率 是 (1-5)/10000 [3], 而 在 东 南 亚 高 达 12/10000, 是 年 龄 少 于 50 岁 无 心 脏 病 史 人 群 中 最 常 见 的 猝 死 原 因, 占 所 有 心 源 性 猝 死 的 4% 和 无 结 构 性 心 脏 病 变 患 者 猝 死 的 20% [4] 我 国 尚 缺 乏 大 规 模 的 临 床 研 究 数 据, 但 是 一 些 国 内 学 者 在 广 东 省 健 康 成 人 体 检 心 电 图 中 发 现 Brugada 心 电 图 征 的 发 生 率 为 1.82, 表 明 Brugada 综 合 征 在 我 国 的 发 病 率 可 能 并 不 低 [5] 2002 年, 欧 洲 和 美 国 心 脏 病 学 会 联 合 召 开 会 议 制 定 了 统 一 的 临 床 诊 断 标 准 2005 年, 对 其 进 行 了 修 订, 并 对 危 险 分 层 药 物 及 植 入 式 除 颤 仪 (ICD) 治 疗 等 做 出 详 细 的 建 议 Brugada 综 合 征 的 特 点 有 : 1 该 病 多 发 生 于 成 年 男 性, 平 均 年 龄 40 岁, 男 女 发 病 率 比 为 8 1, 平 均 猝 死 发 生 年 龄 为 (40±15) 岁, 临 床 表 现 多 样, 可 为 静 息 基 因 突 变 携 带 者 药 物 激 发 试 验 心 电 图 异 常 者 晕 厥 反 复 发 作 者 等, 甚 至 部 分 以 猝 死 为 首 发 表 现, 常 在 夜 间 睡 眠 时 发 生 [4] 2 心 电 图 是 该 病 最 重 要 的 是 诊 断 依 据, 特 征 性 心 电 图 改 变 是 右 胸 导 联 (V 1- V 3 )ST 段 呈 抬 高 伴 或 不 伴 有 右 束 支 传 导 阻 滞 异 常 心 电 图 可 以 分 为 三 型, 即 下 斜 型 (type 1 ECG) 马 鞍 型 (type 2 ECG) 和 圆 顶 型 (type 3 ECG) 只 有 [4] type 1 心 电 图 表 现 具 有 诊 断 意 义 ( 见 图 1.1) 1
Brugada 综 合 征 SCN5A 基 因 R1628Q 突 变 的 功 能 表 达 研 究 图 1.1 经 抢 救 复 苏 后 的 Brugada 综 合 征 患 者 胸 前 导 联 心 电 图 数 天 内 心 电 图 呈 动 态 改 变 箭 头 指 向 为 J 波 左 图 呈 1 型 ECG 表 现, 右 侧 分 别 是 2 型 和 3 型 [4] ECG 表 现 Figure1.1 Precordial leads of a resuscitated patient with Brugada syndrome. Note the dynamic ECG changes in the course of a couple of days. All 3 patterns are shown. Arrows denote the J-wave. The left panel shows a clear type 1 ECG. Between 7 2-99 and 13 2-99, types 2 and 3 are shown. Calibrations are given [4]. 3 异 常 心 电 图 可 呈 现 动 态 改 变, 具 有 间 歇 性 多 变 性 隐 匿 性 非 经 典 部 位 等 特 点 在 药 物 自 主 神 经 发 热 等 作 用 下 可 诱 发 出 典 型 的 BrS 心 电 图 改 变 [3] 4 该 病 与 猝 死 密 切 相 关, 目 前 尚 无 有 效 的 药 物 治 疗 方 法,ICD 是 公 认 能 防 止 猝 死 的 唯 一 有 效 措 施 所 以 根 据 危 险 分 层, 植 入 ICD 是 治 疗 BrS 患 者 的 唯 一 有 效 手 段 Brugada 综 合 征 是 一 种 常 染 色 体 不 完 全 显 性 遗 传 病 自 Chen 等 [6] 通 过 SSCP 技 术 和 序 列 分 析 法 在 三 个 Brugada 综 合 征 患 者 家 族 中 发 现 了 SCN5A 突 变 以 来, 已 经 发 现 十 多 个 致 病 基 因, 其 中 既 有 编 码 心 脏 离 子 通 道 α 亚 单 位 的 结 构 基 因, 也 有 编 码 β 亚 单 位 和 调 节 因 子 的 调 节 亚 基, 分 别 是 SCN5A SCN1B SCN2B SCN3B GPDL1 CACNA1C CACNB2 KCNE3 KCNJ8 CACNA2D1 KCND3 MOG1 [7] SLMAP 等 但 钠 离 子 通 道 的 异 常 最 常 见, 大 约 11 28% 的 Brugada 综 合 征 患 者 携 带 SCN5A 基 因 的 突 变, 且 具 有 家 族 史 的 患 者 突 变 频 率 明 显 高 于 散 发 患 者, 已 [8] 经 发 现 了 300 多 个 突 变 SCN5A 编 码 心 脏 钠 离 子 通 道 α 亚 基,α 亚 基 由 4 个 高 度 同 源 结 构 域 (DⅠ-DⅣ) 通 过 细 胞 内 环 相 连, 每 个 结 构 域 有 6 次 跨 膜 片 段 (S1-S6), 其 中 S5 和 S6 片 段 之 间 构 成 通 道 的 孔 壁 或 者 P 环,S4 富 含 带 有 正 电 2
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