第 36 卷第 1 期 2015 年 1 月 DOI:10.15928/j.1674-3075.2015.01.013 水生态学杂志 JournalofHydroecology Vol.36,No.1 Jan. 2015 光照历史对小檗碱化感抑藻效应的影响 张媛媛, 戴 伟, 张树林, 毕相东, 张达娟 ( 天津市水产生态及养殖重点实验室, 天津农学院水产学院, 天津 300384) 摘要 : 蓝藻水华频发严重制约淡水养殖业的健康发展, 铜绿微囊藻 (Microcysticaeruginosa) 为富营养化水体中的优势种 ; 中草药黄连的主要化感物质小檗碱 (C 20 H 18 NO 4 ) 能够有效抑制铜绿微囊藻的生长, 并具有环境友好和毒副作用小的特点, 光照强度会影响小檗碱对铜绿微囊藻的抑杀效果 将铜绿微囊藻在光照和黑暗条件下分别培养 8d 后重新接种至相同的初始密度, 添加不同浓度小檗碱 (2mg/L 和 4mg/L) 后置于光照条件下继续培养 6d, 通过分析测定铜绿微囊藻细胞密度和叶绿素荧光参数, 研究施药前光照历史对小檗碱化感抑藻效应的影响 结果表明, 铜绿微囊藻在黑暗胁迫 8d 后表现出超补偿生长效应 ;2mg/L 小檗碱不能有效抑杀铜绿微囊藻, 藻细胞密度和叶绿素荧光参数 (F v /F m ΦPSⅡ ETR max Yield ) 均随培养时间延长先下降后升高,6d 时施药前黑暗处理组的藻细胞密度显著高于施药前光照处理组 (P<0.05);4mg/L 小檗碱能够有效抑藻,6d 时藻细胞全部死亡, 且施药前黑暗处理组与施药前光照处理组藻细胞密度和叶绿素荧光参数下降趋势相同 ; 黑暗胁迫诱导的超补偿生长效应不会影响高浓度 (4mg/L) 小檗碱的化感抑藻效应, 但会影响低浓度 (2mg/L) 小檗碱的化感抑藻效应 关键词 : 铜绿微囊藻 ; 光照历史 ; 小檗碱 ; 化感抑藻效应中图分类号 :Q945 文献标志码 :A 文章编号 :1674-3075(2015)01-0088-06 近年来, 蓝藻水华频繁暴发已成为制约淡水养殖业健康发展的主要瓶颈之一 当养殖水体处于富营养化状态时, 蓝藻大量繁殖形成水华, 使其他有益藻类生长受到强烈抑制, 水体中的溶氧等水化指标剧烈变化, 养殖水环境平衡遭到破坏, 严重时造成养殖对象不同程度的死亡 (Anderson,2009) 铜绿微囊藻 (Microcysticaeruginosa) 是蓝藻水华的主要种类, 在我国大部分富营养化的水体中, 其在数量上占有优势 出现频率最高 中草药黄连的主要化感物质小檗碱 (C 20 H 18 NO 4 ) 能够有效抑制铜绿微囊藻的生长 (Zhangetal,2010;2011); 作为环境友好型的化感物质, 其对环境的毒副作用小, 在养殖池塘蓝藻水华防控中具有广阔的应用前景 为科学有效地在实际生产中应用小檗碱抑杀有害蓝藻, 需探究环境因素对其化感抑藻效应的影响 前期研究发现, 施药期间的光照强度可影响小檗碱对铜绿微囊藻的抑杀效果 (Zhangetal,2013); 此外, 小檗碱能显著降 收稿日期 :2014-07-24 基金项目 : 国家自然科学基金面上项目 (31170442,31300393); 天津市高等学校创新团队基金项目 (TD12 5018); 天津农学院大学生创新创业训练计划项目 (201410061178) 作者简介 : 张媛媛,1990 年生, 女, 硕士研究生, 研究方向为水产动物增养殖学 E mail:zhangyy12@126.com 通信作者 : 张树林,1963 年生, 男, 教授, 研究方向为水生生物学 E mail:shulin63@163.com 低叶绿素 a 及 3 种藻胆素含量, 同时降低铜绿微囊藻的表观光合速率及可溶性糖含量 (Bietal, 2010); 以上研究表明, 小檗碱的化感杀藻机制与光合作用密切相关 由于光照历史会影响铜绿微囊藻的光合作用水平, 因此也可能对小檗碱的化感抑藻效应产生影响 本研究以铜绿微囊藻密度和叶绿素荧光参数作为检测指标, 探讨施药前不同光照条件对小檗碱化感抑藻效应的影响, 以期为实际应用中根据天气条件施加小檗碱抑杀养殖池塘有害蓝藻提供理论依据及参考数据 1 材料与方法 1.1 藻种培养试验用铜绿微囊藻藻种 (FACHB 905) 由中国科学院水生生物研究所淡水藻种库提供 采用 BG 11 培养基于光照培养箱中培养, 培养温度为 (25± 1), 光照强度为 40μmol/(m 2 s), 光暗周期为 12h 12h 1.2 试验处理施药前培养阶段 : 将培养至对数生长期的铜绿微囊藻置于 3000mL 锥形瓶中, 分别置于光照 [ 光照强度 40μmol/(m 2 s), 光暗周期为 12h 12h] 和持续黑暗条件下培养 8d 除光照不同外, 其他培养条件均相同 每一试验组均设 3 个平行, 施药前
2015 年第 1 期张媛媛媛等, 光照历史对小檗碱化感抑藻效应的影响 89 培养阶段的光照组和黑暗组分别编为 A 组和 B 组 施药后培养阶段 : 正常光照条件下,2mg/L 小檗碱不能有效抑杀铜绿微囊藻, 而 4mg/L 小檗碱能够达到有效抑杀微囊藻的效果 将施药前培养 8d 的藻液混合摇匀后以相同初始密度转接于 250mL 锥形瓶中, 分别加入小檗碱 ( 东北制药总厂 ) 至终浓度为 2mg/L 和 4mg/L, 在光照条件下 [ 光照强度 40μmol/(m 2 s), 光暗周期为 12h 12h] 培养 6d; 此阶段施药前黑暗处理组和施药前光照处理组培养条件完全相同, 每一试验组均设 3 个平行 施药后培养阶段的对照组和试验组按照前期黑暗无药 前期黑暗加入 2mg/L 小檗碱 前期黑暗加入 4mg/L 小檗碱 前期光照无药 前期光照加入 2mg/L 小檗碱 前期光照加入 4mg/L 小檗碱依次编为 1 2 3 4 5 6 号 在培养过程中每天取藻液测定藻密度及叶绿素荧光参数 1.3 密度计数于液面下 1cm 处吸取藻液加入血球计数板框内, 显微镜下计数测定藻细胞密度 1.4 参数测定用 Phyto Pam 叶绿素荧光仪测定叶绿素荧光诱导动力学参数 取 1mL 藻液于样品杯中, 藻液不经暗适应, 将频率设置为 1, 首先用弱光测定初始荧光 (F 0 ), 待样品室中荧光稳定后给一个强闪光 [3500μmol/(m 2 s), 脉冲时间 0.7s], 测得最大荧光 (F m ); 然后在光化光 [164μmol/(m 2 s)] 下适应 1min, 当藻液荧光基本稳定时, 测得稳态荧光 (F s ), 之后再给一个强闪光, 测得光适应下的最大荧光 (F m ) 和最大电子传递速率 (ETR max ) 检测指标根据叶绿素荧光基础参数 (F 0 F m F s F m ) 计算出最大光能转化效率 (F v /F m ) 实际光能转化效率 (ΦPSⅡ ) 及有效光能转化效率 (Yield ) 计算公式如下: 2 结果与分析 2.1 藻细胞密度的变化 2.1.1 施药前培养阶段光照处理组铜绿微囊藻细胞密度随培养时间延长呈上升趋势, 而黑暗处理组藻细胞密度保持不变 ( 图 1) 图 1 施药前培养阶段铜绿微囊藻密度变化 Fig.1 VariationsofMicrocysticaeruginosacel densitypriortoberberineexposure 2.1.2 施药后培养阶段未添加小檗碱的试验组藻细胞密度均随培养时间延长逐渐升高, 在相同的培养时间内, 施药前黑暗处理组铜绿微囊藻生长速度快于施药前光照处理组生长速度 ( 图 2) 随着培养时间延长,2mg/L 小檗碱添加组的藻细胞密度均先下降 后升高, 说明 2mg/L 小檗碱不能有效化感抑藻, 存在反弹 由于施药前光照条件影响 2mg/L 小檗碱的化感抑藻效应,6d 时施药前黑暗处理组的藻细胞密度显著高于施药前光照处理组 (P<0.05);4mg/L 小檗碱添加组的藻细胞密度随培养时间延长均呈下降趋势, 施药前黑暗处理组与施药前光照处理组藻细胞密度下降趋势相同,6d 时藻细胞均全部死亡 施药前光照条件不会影响有效抑藻高浓度 (4mg/L) 小檗碱的化感抑藻效应 F v /F m = F m -F 0 F m (1) ΦPSⅡ = F m -F s F m (2) F v =F m -F 0 (3) Yield = F v F m (4) 1 F 0 = 1-1 + 1 (5) F 0 F m F m 图 2 施药后培养阶段铜绿微囊藻密度的变化 Fig.2 VariationsofMicrocysticaeruginosacel densityafterberberineexposure
90 第 36 卷第 1 期水生态学杂志 2015 年 1 月 2.2 藻细胞叶绿素荧光参数的变化 2.2.1 施药前培养阶段光照处理组铜绿微囊藻细胞叶绿素荧光参数 (F v /F m ΦPSⅡ ETR max Yield ) 变化均不显著 ; 而黑暗处理组藻细胞叶绿素荧光参数均随培养时间延长呈下降趋势, 说明在黑暗条件下藻细胞光合作用逐渐受到抑制 ( 图 3) 2.2.2 施药后培养阶段重新接种会引起藻细胞叶绿素荧光参数升高, 未添加小檗碱的各试验组藻细胞叶绿素荧光参数在重新接种 1d 后下降至稳定, 但施药前黑暗处理组叶绿素荧光参数均高于施 药前的光照处理组 ( 图 4) 在相同培养条件下, 光照组重新接种后叶绿素荧光参数降低 分析其原因, 可能在于重新接种前后培养液体积差异大 导致藻细胞实际受光条件不同所致 ;2mg/L 小檗碱添加组的叶绿素荧光参数均呈先下降 后升高趋势, 施药前黑暗处理组叶绿素荧光参数均高于施药前的光照处理组, 与藻细胞密度变化趋势相同 ; 施药前黑暗处理组与施药前光照处理组铜绿微囊藻在添加 4mg/L 小檗碱后, 叶绿素荧光参数均在第 1 天下降至 0 并在试验期间保持为 0, 未出现反弹升高 图 3 施药前培养阶段铜绿微囊藻叶绿素荧光参数的变化 Fig.3 VariationsofMicrocysticaeruginosachlorophylfluorescenceparameterspriortoberberineexposure 图 4 施药后培养阶段铜绿微囊藻叶绿素荧光参数的变化 Fig.4 VariationsofMicrocysticaeruginosachlorophylfluorescenceparametersafterberberineexposure
2015 年第 1 期张媛媛媛等, 光照历史对小檗碱化感抑藻效应的影响 91 3 讨论 3.1 黑暗对铜绿微囊藻光合作用与生长的影响光照是影响藻类生长繁殖的重要生态因子之一, 也是其生长的主要能量来源, 在一定的 ph 温度和营养条件下, 影响光合作用产物的合成, 从而决定藻类的生长繁殖和密度 ( 孙儒泳等,1993) 本次试验结果表明, 在黑暗胁迫条件下培养 8d, 铜绿微囊叶绿素荧光参数下降, 藻细胞光合作用受抑 产物合成能力下降, 致使藻细胞分裂受阻 ( 秦红杰和李敦海,2010); 由于可利用光合作用时积累在细胞体内的糖原作为能量来源 ( 孔繁翔和高光,2005), 因而藻细胞在 8d 内可以维持其生命活动并保持活力和密度不变 3.2 黑暗胁迫后铜绿微囊藻的超补偿生长响应大量研究发现, 微藻作为广泛分布的光合有机体, 与植物一样存在光限制胁迫后的超补偿生长现象 ( 张珍萍等,2005;Caietal,2008) 无毒铜绿微囊藻 (FACHB 469) 经完全黑暗胁迫处理 7d 后, 具有明显的超补偿生长性能 ( 毕相东等,2011) 铜绿微囊藻 (FACHB 905) 作为产毒藻株, 黑暗胁迫处理 8d 后同样表现出超补偿生长现象 在自然条件下, 虽然不会出现连续黑暗的极端天气, 但阴雨连绵的天气比较常见, 自然水华多发生在连续的阴雨天之后 ( 徐宁等,2001); 因此, 光限制胁迫诱发的超补偿生长效应可能是水华暴发的原因之一 目前, 关于铜绿微囊藻受黑暗胁迫后发生超补偿生长的深层次机理尚不清楚 本研究发现, 与始终处于光照条件下的铜绿微囊藻叶绿素荧光参数相比, 黑暗胁迫后叶绿素荧光参数升高 ; 因此, 对黑暗胁迫后植物光合作用的进一步研究, 将有助于揭示黑暗胁迫后超补偿生长的深层次机理 无论有毒还是无毒的铜绿微囊藻, 均在黑暗胁迫解除初期即表现出超补偿生长效应, 与光限制胁迫后的蛋白核小球藻 (Chlorelapyrenoidesa) 和营养胁迫后的四列藻 (Tetraselmistetrathele) 表现一致 ( 刘宁宁和段舜山,2002; 段舜山等,2003); 而高温胁迫 UV B 和盐胁迫后的超补偿生长效应一般出现在胁迫解除后的中后期 ( 秦红杰和李敦海, 2010) 究其原因, 可能在于光限制胁迫与营养胁迫导致藻细胞光合作用受抑, 但并未造成光合系统损伤 ; 高温胁迫 UV B 和盐胁迫致使藻细胞光合系统发生可逆性损伤, 损伤后光合系统的自我修复导致胁迫解除后补偿生长出现延滞期 3.3 超补偿生长对小檗碱抑藻效应的影响高浓度小檗碱能够有效抑杀铜绿微囊藻, 使光合系统发生不可逆损伤, 因此添加 4mg/L 小檗碱 1d 后, 叶绿素荧光参数即下降至 0 并保持, 其抑藻效应不受前期光照条件影响 ;6d 时藻细胞全部死亡 低浓度小檗碱导致藻细胞光合系统发生可自我修复的可逆性损伤, 因此添加 2mg/L 小檗碱 1d 后铜绿微囊藻叶绿素荧光参数下降至 0 随着培养时间延长, 损伤不断修复, 叶绿素荧光参数升高, 光合作用能力增强, 后期藻细胞又开始分裂增殖 由于黑暗胁迫可诱导产生超补偿生长效应, 恢复光照后黑暗 ( 施药前 ) 处理组的光合作用水平高于光照 ( 施药前 ) 处理组, 而添加低浓度小檗碱 (2mg/L) 可导致 3 个处理组的光合系统发生相同的可逆性损伤 ; 因此, 前期黑暗条件下培养的铜绿微囊藻在添加 2mg/L 小檗碱后, 相比前期光照条件下培养的铜绿微囊藻具有更强的光合作用能力 综上所述, 黑暗胁迫诱导产生的超补偿生长效应不会影响有效抑藻高浓度小檗碱的化感抑藻效应, 但会影响无效抑藻低浓度小檗碱的化感抑藻效应 自然条件下, 连续阴雨天后养殖池塘易暴发蓝藻水华, 使用小檗碱抑杀时, 需要根据蓝藻暴发密度选择有效的抑藻浓度, 避免因小檗碱施药量不足引起的低效抑杀后发生的快速反弹现象 参考文献毕相东, 张树林, 张鹏.2011. 铜绿微囊藻在光限制胁迫下的超补偿生长响应 [J]. 水生态学杂志,32(1):94-98. 段舜山, 郭羽丰, 刘振乾, 等.2003. 四列藻在营养限制胁迫下的超补偿生长研究 [J]. 生态学报,23(7):1297-1304. 孔繁翔, 高光.2005. 大型浅水富营养化湖泊中蓝藻水华形成机理的思考 [J]. 生态学报,25(3):589-595. 刘宁宁, 段舜山.2002. 蛋白核小球藻在光胁迫下的超补偿现象 [J]. 生态科学,21(1):53-54. 秦红杰, 李敦海.2010. 铜绿微囊藻高温胁迫后的超补偿生长 [J]. 环境科学,31(7):1504-1509. 孙儒泳, 李博, 诸葛阳.1993. 普通生态学 [M]. 北京 : 高等教育出版社. 徐宁, 陈菊芳, 王朝晖, 等.2001. 广东大亚湾藻类水华的动力学分析 [J]. 海洋环境科学,20(2):18-22. 张珍萍, 段舜山, 刘振乾, 等.2005. 眼点拟微绿球藻在黑暗胁迫下的超补偿生长响应 [J]. 暨南大学学报 : 自然科学版,26(3):412-416. AndersonD M.2009.Approachestomonitoring,controland
92 第 36 卷第 1 期水生态学杂志 2015 年 1 月 managementofharmfulalgalblooms(habs)[j].ocean andcoastalmanagement,52(7):342-347. BiXD,ZhangSL,ZhangB,etal.2010.EfectsofBerberine onthephotosyntheticpigmentscompositionsandultra structureofcyanobacterium (Microcystisaeruginosa)[J]. InternationalConferenceonCelular,MolecularBiology, BiophysicsandBioengineering(CMBB2010),2:258-262. CaiZhuoping,WeiWei,DuanShunshan.2008.Compensatory growthinmarinediatomphaeodactylumtricorhutum(bacil lariophyceae)afterdarknesanduvradiation[j].ecology andenvironmnet,17(5):1748-1753. ZhangSL,DaiW,BiXD,etal.2013.Efectofenvironmen talfactorsonalelopathicinhibitionofmicrocystisaerugino sabyberberine[j].waterscienceandtechnology,68 (2):419-424. ZhangSL,ZhangB,DaiW,etal.2011.Oxidativedamage andantioxidantresponsesinmicrocystisaeruginosaexposed tothealelochemicalberberineisolatedfrom goldenthread [J].JournalofPlantPhysiology,168(7):639-643. ZhangSL,ZhangB,XingKZ,etal.2010.Inhibitoryefect ofgoldenthread(coptischinensis)andberberineonmicro cystisaeruginosa[j].waterscienceandtechnology,61 (3):763-769. ( 责任编辑万月华 )
2015 年第 1 期张媛媛媛等, 光照历史对小檗碱化感抑藻效应的影响 93 EfectsofLightAcclimationonAlelopathicInhibitionof MicrocystisaeruginosabyBerberine ZHANGYuan yuan,daiwei,zhangshu lin,bixiang dong,zhangda juan (TianjinKeyLaboratoryofAqua EcologyandAquaculture,ColegeofFisheries, TianjinAgriculturalUniversity,Tianjin 300384,P.R.China) Abstract:Frequentoccurenceofcyanobacteriabloomsrestrictsthehealthydevelopmentoffreshwateraquaculture, andmicrocysticaeruginosaisthedominantspeciesineutrophicwaters.berberine(c 20 H 18 NO 4 ),theprimaryalel ochemicalsubstanceofthechineseherbalmedicinerhizomacoptidis,canefectivelyinhibitm.aeruginosagrowth withenvironment-friendlycharacteristicsandlowsideefectsbutlightintensityinfluencestheinhibitoryefects. Theaimofthisstudywastofurtherinvestigatetheefectsofacclimationtolightconditionsonalelopathicinhibition ofm.aeruginosabyberberine.beforeexposuretoberberine,twogroupsofm.aeruginosa(a,b)intriplicate wereculturedina3000mlconicalflaskfor8dunderthesameconditionexceptforlightintensity.groupawas exposedtoalightintensityof40μmol/(m 2 s)underaregimeofalternating12hrperiodsoflightanddark,while GroupBwasalwaysinthedark.Aftertheacclimationperiod,M.aeruginosainGroupsAandB,withthesame initialceldensity,wereexposedtodiferentconcentrations(2mg/land4mg/l)ofberberinefor6dunderthe samelightconditions.thisresultedinsixgroups,eachintriplicate:no1,bcontrolgroup;no2,b2mg/lber berinegroup;no3,b4mg/lberberinegroup;no4,acontrolgroup;no5,a2mg/lberberinegroup;no6, A4mg/Lberberinegroup.Theceldensitiesandchlorophylfluorescenceparameters(F v /F m,φpsⅡ,etrand Yield)ofM.aeruginosaforeachgroupweredeterminedandusedtoevaluateefectsoflightacclimationconditions onalelopathicinhibitionofm.aeruginosabyberberine.theresultsshowthatm.aeruginosashowedover-com pensatorygrowthaftercultureindarkfor8d;2mg/lberberinecouldnotinhibitm.aeruginosagrowthefectively, andceldensitiesandchlorophylfluorescenceparametersdecreasedfirstandthenincreasedsignificantly.afterex posuretoberberinefor6d,celdensitiesofalgaeingroupno.2weresignificantlyhigherthanthoseingroupno 4(P<0.05);However,4mg/LBerberineinhibitedM.aeruginosagrowthefectively,with100% deathofalgal celsin6d.nodiferencesinceldensitiesandchlorophylfluorescenceparameterswereobservedbetweengroup No.3andgroupNo.6.Darknes inducedcompensatorygrowthappearstoafectthealelopathicinhibitoryefectof 2mg/Lberberinebutnotof4mg/Lberberine. Keywords:Microcystisaeruginosa;lightacclimationconditions;berberine;alelopathicinhibition