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第 卷 第 期 陕西师范大学学报 自然科学版 年 月! & ' & & 文章编号 -.-' 金黄色葡萄球菌肠毒素 7 的原核表达 纯化及鉴定 张 琨 张月娟 万 一 陕西省微生物研究所分子生物学研究中心 陕西西安 摘 要 为高效获取金黄色葡萄球菌肠毒素 用于 的快速检测 通过原核表达方法表达 对其纯化方法进行研究 并通过 &' & 和制备的 纳米磁性免疫层析快速检测试纸条检测其抗原性 研究表明 成功克隆入原核表达载体 7B 并在 '&>4? 中得到有效表达 表达量达 采用 柱亲和层析和? 阴离子层析两步纯化得到纯度为 的 &' & 和 免疫层析快速检测试纸条检测显示所纯化的重组 具有 的抗原性 可用于 快速检测试纸的应用研究 关键词 金黄色葡萄球菌肠毒素 原核表达 纯化 免疫层析快速检测 中图分类号 文献标志码 6 7 &- &'& 5& & 3&!3 ' & 4!5 & ' ' & '& &! & & &'& & & 0 '&! &''&. &! &'' ' ' & & & & & 0 '' & ' & 0 ' & & &' & & & '' ' & & &''0& 0 '&& &&! &''??6 & & & '& &! &''& ' & ' & 0 & & ' 0' & '? &! & 7 &&! &'' '& 3 ' 0 ' & &' & & & '' ' & & & & & '&. & & ' ' & &!. &! &'' '' 金黄色葡萄球菌肠毒素 ' & &! 为一类结构相关 毒力相似 抗原性不同的胞外蛋白质 是金黄色葡萄球菌 0 4>&>&&13 1 13 引起食物中毒的主要因 素 目前 已成为一个世界性卫生问题 据统计 由其引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的比例在美国为 在加拿大达到 我国每 年也有多起此类中毒事件发生 根据 血清学特征可将其分为 十个毒素血清型 其中 最为耐热 产毒量最大 食入. 剂量就能诱发人的临床症状 而. 剂量就足以致死 快速检测出食品中的 才能有效控制食物中毒的发生和蔓延 一方面可用于 单克隆抗体的制备及作 收稿日期 基金项目 西安市科技局现代农业推进计划 5 < 陕西省科学院应用基础研究项目 < 通信作者 万一 男 研究员 0 '

陕西师范大学学报 自然科学版 第 卷 为阳性抗原在 引起的食物中毒的快速诊断中发挥作用 另一方面 还是一种具有超抗原活性的 外毒素 其作为超抗原可激活比普通抗原多达数千倍的 7 淋巴细胞 产生细胞介素 干扰素和肿瘤坏 死因子 从而达到抗肿瘤的作用 在治疗自身免 疫性疾病 抗肿瘤等方面具有良好应用前景 因此 蛋白的高效制备显得较为重要 基于以上背景 本研究全基因合成 基因序列 使之在大肠杆菌中得到高效表达 对 的纯化方法进行了摸索 通过 &' & 鉴定其抗原性 并初步测试了 作为抗原应用于免疫层析快速检测试纸开发研究的可行性 材料和方法 材料 7B 质粒 参考 5 中的 基因序列 &. 同时在基因序列两端添加 和 > 酶切位点 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成基因并克隆至 7B 载体中 得到 7B 质粒 纳米磁性免疫层析快速检测试纸条 本实验室自行制备 培养基 培养基 分别称取蛋白胨 酵母粉 氯化钠 加水溶解后调节 值至 定容到 固体培养基中加入 的琼脂 高压灭菌 主要试剂限制性内切酶 > 低相对分子质量标准蛋白均购自 7. 生物公司 胰蛋白胨 酵母提取物购自英国 1! & 公司 溶菌酶? '& 购自西安沃尔森生物技术公司 67? 丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺购自 & &' 公司 脱氧胆酸钠 氯化钠 磷酸二氢钠 磷酸二氢钾 氯化钾等其他试剂均为国产分析纯 小鼠抗 单克隆抗体 53 购自美国 3& & & & 山羊抗小鼠二抗 购自杭州隆基生物技术有限责任公司 5 发光试剂盒购自上海史瑞克生物有限公司 主要仪器设备 7 5 台式离心机 上海安亭科学仪器厂? 35 大容量冷冻离心机 湖南湘仪仪器公司 1 7 涡旋仪 其林贝尔仪器公司 6 5 型精密 计 上海雷磁仪器厂 生化培养箱 重庆四达实验仪器厂 恒温摇床 上海一恒 实验仪器厂 蛋白电泳仪 北京市六一仪器厂? 高流速琼脂糖微球和 柱填料 西安保赛生物科技公司 7 纯化仪 公司 1 7 表达载体的构建及诱导表达提取 7B 质粒 用 和 > 进行双酶切验证 同时 将 7B 质粒转入感受态大肠杆菌? 将在含 的 平板上筛选到的阳性克隆命名为 7B? 并送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序 以验证阳性克隆中的 基因序列 从平板中挑取 7B? 单克隆 在含 的 液体培养基中 摇床培养过夜 次日按 转接至新鲜的含 的 液体培养基中 摇瓶培养至 为 时 用终浓度为 的 67 诱导 离心收集菌体?6 检测 蛋白表达 以未诱导的含 7B 质粒的重组菌作为对照 1 7 蛋白的纯化将 发酵菌体用裂解缓冲液 7 ' 值为 悬浮 加入溶菌酶 裂解 再加入? '& 35 及脱氧胆酸钠 充分搅拌至不黏稠 离心 分别收集上清和沉淀?6 检测 的表达形式 菌体裂解上清液透析至上样缓冲液 6 值为 中 过 柱亲和层析进行纯化 用含 咪唑的上样缓冲液洗脱目的蛋白 收集洗脱峰 目的蛋白透析至水中? 6 检测纯化结果 透析后洗脱峰冻干后 溶解于上样缓冲液 5 7 ' 5 值为 中 过? 柱进行二次纯化 上样后收集穿过峰 透析至纯水中?6 检测纯化结果 1 7 蛋白的鉴定 的 &' & 鉴定 参照 分子克隆实验指南 蛋白样品经?6 后电转移至 5 膜上进行 &' & 分析 一抗为小鼠抗 单克隆抗体 二抗为 6 标记的山羊抗兔 免疫层析法鉴定 将特异性检测 的试纸条和 溶液平衡至室温 在样品垫上加入 浓度为 的 溶液 同时以 值为 的 6 溶液为阴性对照 后直接用肉眼观测条带颜色的深

!! 第 期!! 张琨 等金黄色葡萄球菌肠毒素 Y 的原核表达纯化及鉴定 浅从而判断检测结果&! 结果分析!?!Y泳道 & 收 集 穿 过 峰 获 得 纯 度 为 AB& j 的 目 的蛋白 Y.> < 扫描&!'LU 表达质粒的鉴定 1Y 质粒经 N 和 Zb 双酶 切鉴定在??XW 处有明显 条带结果 见图 大 小 与预期相符&同时测 序 结 果 也 表 明 所 合 成 的 1Y 基因序 列 与 'SYL 上 1Y 的 基 因 序 列 O.Y.F! JNCB! 一致& 图 > 'LU 的表达及 <柱纯化结果 图!MLH5_ & 'LU 质粒酶切鉴定 I! -3 MLH5_ & 'LU F M &BXW c'j >> -' & 1Y 质粒' &质粒 1Y 双酶切&!'LU 的诱导表达 与未诱导图 泳道 相比经诱导 的 WUX > 'O' 'LU JM --!M. J! '4纯化层析图谱' Y! '4柱纯化结果& & B XW c'j >> -'& 1YYK K cd裂菌 上 清'& '4柱 纯 化 穿 过 峰'D& 55 咪唑洗脱峰' K 咪唑洗脱峰& 55 f 1YYK cd图 泳 道 在 A& Fc 附 近有新生 条 带 产 生大 小 与 预 期 理 论 值 基 本 相 符& Y.>1< 分 析 表 明 1YYK cd目的蛋白占全菌总蛋白的 B& Cj & 图! 表达产物的 'O' &T4]L 分析!'O' M! 35!M & BXW c'j >> -'& U X f 1 Y Y K c D W 未诱导'& 1YYK cd诱导& > 'LU 的纯化 目 的 蛋 白 在 菌 体 裂 解 上 清 和 沉 淀 中 均 有 表 达& 5K 咪唑可以有效洗脱目的蛋白洗脱的 55 1Y 蛋白经 Y.> < 扫 描 显 示 纯 度 为 A& j 图? 'LU 的 OL4L 纯化结果? 'O' 'LUM. 纯化层析图谱' 柱纯化结果& J& cj Y& cj 图 DY 泳道!&cJ 柱 二 次 纯 化 后 1c1 TJO & BXW c'j >> -'& '4柱纯化洗脱峰'& cj 纯化穿 过 峰'D& K 'S洗 脱 峰' K 55 5 分析显 示 在 穿 过 峰 中 有 单 一 的 目 的 蛋 白 条 带 图 'S洗脱峰&

!? 陕西师范大学学报!自然科学版?!'LU 的鉴定 &! \ X 鉴 定! \ X 结 果 显 示在相对分子质量 A& Fc 附 近 检 测 到 目 的 蛋 白 图! 泳道 表 明 1YYK cd 的诱导表达产 物 可 特 异 地 与 小 鼠 抗 1Y 单 克 隆 抗 体结合而 未 诱 导 菌 体 的 总 蛋 白 则 不 能 与 小 鼠 抗 1Y 单 克 隆 抗 体 结 合 图! 泳 道 & 结 果 表 明 1YYK cd在 YK cd宿 主 菌中得到了有效表达& &! 免疫层析法鉴定! 将不 同浓度 的 1Y 蛋白 液滴加在本实 验 室 制 备 的 1Y 纳 米 磁 性 免 疫 层 析 快速检测试纸条结合垫处 B54. 后在 U 线 处出现 阳性 条 带条 带 的 深 浅 与 1Y 的 浓 度 呈 正 相 关而 阴性对照在 U 线处无条带出现图 B&1Y 检测试 纸是根据双抗夹心 法 原 理 制 备 的样 品 垫 上 喷 点 有 表面 偶 联 抗 1Y 单 抗 的 顺 磁 微 粒U 线 固 定 有 与 1Y 特异性结合的另一种抗 1Y 单抗 S 线固 定 有 能跟磁珠 表 面 抗 体 特 异 结 合 的 二 抗& 当 含 有 1Y 的溶液在层析作 用 下 通 过 试 纸 条 时 1Y 与 磁 珠 结 合并在 U 线处与另 一 种 抗 1Y 单 抗 结 合磁 珠 在 U 线处聚集而显色呈现阳性 反应'但不 含 1Y 的 溶 液则不能在 U 线 处 不 显 色呈 现 为 阴 性 反 应结 果 见图 &该检测法进一步证明 1Y 蛋白作为抗原能 第!! 卷 够与小鼠抗 1Y 单克隆抗体特 异性 结合可以用于 1Y 试纸的制备研究& >! 讨论 获取 1Y 的传统方 案 主 要 是 从 产 1Y 的 葡 萄 球菌中分离纯化这种方法需要大量培养菌体且纯 化效率较 低 & 有 研 究 采 用 基 因 工 程 的 方 法 来 克 服这些缺陷如 杨 立 泉 等?将 1Y 克 隆 至 WO?d 0载体中进行表达获得的 1Y 表达量为DD& Bj ' 宋云扬等 C在 载 体 系 统 中 对 1Y 进 行表达表达量在 Dj 左右& 在 本 研 究 中 我 们 实 现 了 1Y 在 原 核 表 达 系 统 中 的 高 效 表 达表 达 量 为 B& Cj '本研究所表达的蛋白为融合蛋白根据文献 报道融合蛋白能够在一定程 度上 降低 1Y 的毒性 避免可能引起的毒性反应 A& 已有多 篇 文 献 报 道 了 1Y 纯 化 方 法如 张 亮 等 通过盐 析 1T 阳 离 子 层 析 柱金 属 鳌 合 层 析 柱 cj 阴离子四次柱层析纯 化获 得纯 度 Aj 以 上重组 1Y 蛋白' M 等人 采 用 羧 甲 基 阳 离 子 交 换纤 维 素 SD 和 葡 聚 糖 凝 胶 O?B 柱 层 析 对 1Y 进行纯化获得 纯度 为 A&!j 的 1Y 蛋 白'朱 D 俊友等 采 用 羧 甲 基 阳 离 子 交 换 纤 维 素 SD 和葡聚糖凝 胶 O?B 柱 两 步 层 析 也 纯 化 出 较 纯 的 1Y&本研究采用 '4柱 亲 和 层 析 和 cj 阴 离 子 层析柱两 步 纯 化获 得 了 纯 度 为 AB& j 的 1Y 蛋 白在精简了纯化步骤的同时提高了目的蛋白纯度& \ X 鉴定表明本 研 究 纯 化 的 1Y 具 有良好的抗原性'利 用 本 实 验 室 制 备 的 免 疫 层 析 试 纸对纯化 1Y 蛋白进行进一步 验证表 明试 纸条不 仅可 检 测 到 1Y 蛋 白且 检 测 结 果 呈 浓 度 正 相 关 性&因 此本 研 究 获 得 的 1Y 蛋 白 可 应 用 于 1Y 图 'LU 的 ^ & 5 鉴定 ^ & 5 - 'LU 1 &未经诱导的 1YYK cd' &诱导后的 1YYK cd& 免疫层析快速诊断产品的开发研究&?! 结论 合 成 的 1Y 基 因 成 功 克 隆 至 原 核 表 达 载 体 经双酶切鉴定 1Y 的基因大小为?? XW与 预 期 相 符'同 时 测 序 结 果 也 表 明 合 成 的 1Y 基 因 与 'SYL 中 1Y 的 基 因 序 列 O.Y.F! JNCB! 一 致& 将 1Y 质 粒 转 化 入 b 7 R 图 A! 免疫层析试纸条检测结果 A!H! -. 7 & 55K1Y'& & 55K1Y' D& & 55K1Y'阴性对照& YK cd中1y 得 到 有 效 表 达大 小 为 C&!Fc表达量达 为 B& Cj '通 过 '4柱 亲 和 层 析 和 cj 阴 离 子 层 析 两 步 纯 化 获 得 纯 度 为 AB& j 的 1Y\ X 和 1Y 免 疫 层 析 快 速 检 测 试 纸条检 测显示所 纯化 的重 组 1Y 具 有 1Y 的抗原

第 期 张琨等 金黄色葡萄球菌肠毒素 的原核表达 纯化及鉴定 性 本研究所纯化的 在食品中 快速检测研究中具有一定的应用价值 参考文献 6 31? & 5 ' ' & & & ' &' & & & &! & & 3 李毅 金黄色葡萄球菌及其肠毒素研究进展 中国卫生杂志 韩秀兰 柳连顺 李云 等 一起金黄色葡萄球菌 5 肠毒素引起食物中毒的检测分析 中华流行病学杂志 郑春梅 郑彬 一起金黄色葡萄球菌肠毒素致食物中毒的调查 中国校医 13 3 & &! ' & 3 6 571 & &! ' 7! '? 5 31??& & && &! ' 5& &' 0 4>&>&&13 1 13 & ' ' & ' & & 3? 5? 33 3 & 7 ' &' '&' & &' ' & &! & &' 5?1? 1 1 & & &! ' & 7 &' & 7 & & & & & &' & 5 1 3? 5?1 3&!' & & & &'&! ' ' & '& &! ' & 7 &' 7! & 6 姚咏明 盛志勇 金黄色葡萄球麓肠毒素基因与多器官功能障碍综合征 中国危重病急救医学 7 3 16 3 1 & 6 & & ' & &! ' & ' & &' & 5? 5 7 & 6 & & && &'& &! ' & & ' &! &! ' ' '0 4> &>&&13 1 13' & ' '& & ' 5 3?6 7 3 3 & & & & & &! & & ' & '& ' & & ' 0 4>&>&&13 1 13 3 11 ' 73 ' 分子克隆实验指南 3 版 金冬雁 黎孟枫 译 北京 科学出版社 何宏 金黄色葡萄球菌肠毒素 编码基因的克隆及原核表达? 青岛 青岛大学病原微生物学研究所 杨立泉 吴文芳 时成波 等 金黄色葡萄球菌肠毒素 基因的克隆和在大肠杆菌中高效表达 生物工程学报 宋云扬 王惠芳 李艳军 等 金黄色葡萄球菌肠毒素 的基因克隆与表达 免疫学杂志 3 7 6 75 & 5 ' ' &' & &! ' & & & 胥全彬 刘传暄 马清钧 等 金黄色葡萄球菌肠毒素 的基因克隆 表达及活性试验 生物工程学报 张亮 张国利 陈萍 等 金黄色葡萄球菌肠毒素 的原核表达及纯化 中国生物制品学杂志 6 7 3 5& ' & &! '0 ' '&& ' & &' & & 3& & 朱俊友 李玉峰 金黄色葡萄球菌肠毒素 的分离纯化 食品工业科技 责任编辑 王 勇