Enzyme 酵素 εν ζυημ 基礎動力機制 1 酵素的命名 E1 2 酵素的構成 E2 3 酵素動力學 E3 4 酵素的抑制 E4 5 酵素的催化機制 E5 調 節 應用 6 酵素活性的調節 E6 7 細胞代謝與酵素調控 E7 8 酵素在生物技術上的應用
基因表現的控制點 mrn DN proteins 原核細胞 ribosome 轉錄控制 RN rocessing RN Transport RN Degradation 轉譯控制 活性調節 降解控制 ost-translational control 反應較快速 DN 5 process mature mrn cap 5 3 tail proteins 3 真核細胞 mrn Juang RH (2007) BCbasics
6 酵素活性的調節 抑制劑 4 胜鍵裂解 6.1 S o I or I inhibitor I x I x proteolysis S o 回饋控制 6.4 磷酸化 6.2 S o R x regulator effector R x S phosphorylation o (+) 信息傳導分子 6.3 x (-) 調節次體 or S o + cm or calmodulin Juang RH (2007) BCbasics
酵素活性受到溫度與酸鹼度影響 ctivity (%) 100 50 epsin Urease rginase 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 ph 0 20 40 60 80 100 Temperature (C) dapted from Kleinsmith & Kish (1995) rinciples of Cell and Molecular Biology (2e) p.47
6.1 蛋白質裂解 不可逆的共價性修飾 一些蛋白質裂解的例子 胰島素 Insulin ( 非酵素 ): chain & B chain; C chain 凝血機制 Fibrin Thrombin 傷口以 cascade ( 梯瀑式 ) 誘發極為危險的凝血反應 蛋白脢原活化機制 Trypsin, Chymotrypsin, Elastase CT 切出新的 N- 端 (Ile16) 可結合 sp194 定位 Ser195 Zymogen 脢原 ( 危險的酵素 ) 以胞器隔離之 麻啡 morphine vs 腦啡 endophine 競爭腦中接受器 先合成一長條多元体, 再裂解成小分子腦啡單位 (YGGFM) 蛋白脢家族與其分子演化 Juang RH (2007) BCbasics
Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.406 凝血機制是一連串蛋白脢的作用 Fibrin
是蛋白脢Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.407 都
怪頭博士的絕妙發明 Scientific merican (1998) pril p.92
梯瀑式放大效應 XII Cascade XI IX X 一傳十十傳百 T F ns 1 Enzyme n Juang RH (2007) BCbasics
蛋白脢之間互相裂解活化 Trypsinogen Enteropeptidase Chymotrypsinogen Trypsin T roelastase rocarboxypeptidase π-chymotrypsin C Elastase Carboxypeptidase α-chymotrypsin dapted from Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.404
dapted from Dressler & otter (1991) Discovering Enzymes, p.206 Chymotrypsin 要先經裂解後才有活性 C T C L13 I16 Y146 149 + NH3 Ile 16 Gly 193 sp 194 Ser 195 Stryer (1995) Biochemistry (4e) p.222
危險的酵素可用胞器隔離Lysosome 溶脢體 lberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p. 667 Stryer (1995) Biochemistry (4e) p.248
先合成一長條蛋白再修剪出腦啡分子 Enkephalin e he Gly Met Gly Tyr Trypsin-like endo-protease e e e e e e e e Dressler & otter (1991) Discovering Enzymes, p.247
Metal rotease 蛋白脢及其專一性抑制劑 分類常見例催化機制圖解基質特異性抑制劑 Carboxypeptidase Zn 2+ H196 E72 H69 Nonpolar EDT EGT Serine rotease Chymotrypsin Trypsin D102 S195-O - H57 romatic Basic DF TLCK TCK Cysteine rotease apain C25-S - H195 Nonspecific CMB Leupeptin spartyl rotease epsin Renin D215 H 2 O D32 Nonspecific epstatin Juang RH (2007) BCbasics
兩種蛋白脢胺基酸序列的相似性 lberts et al (1994) Molecular Biology of the Cell (3e) p. 120 identical deletion conserved similar lberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p. 143
Subtilisin 的修飾與其活性變化 活性區的胺基酸 酵素種類 Triad: Ser His sp 相對活性 No enzyme 1 Subtilisin 10,000,000,000 Ser, His & sp la 4,000 His & sp la 37,000 Ser la 5,000 sp la 330,000 sn 155 Leu 10,000,000 (sn 155 可穩定過渡狀態 ) Site-directed mutagenesis dapted from Dressler & otter (1991) Discovering Enzymes, p.245
Serine 蛋白脢家族與 che Ser 195 His 57 sp 102 Chymotrypsin Gly sp Ser Gly Gly ro Leu Trypsin Gly sp Ser Gly Gly ro Val Elastase Gly sp Ser Gly Gly ro Leu Thrombin Gly sp Ser Gly Gly ro he lasmin Gly sp Ser Gly Gly ro Leu cetylcholinesterase Gly Glu Ser la Gly Gly la Chymotrypsin Val Thr la la His Cys Gly Trypsin Val Ser la Gly His Cys Tyr Elastase Leu Thr la la His Cys Ile Thrombin Leu Thr la la His Cys Leu lasmin Leu Thr la la His Cys Leu cetylcholinesterase His Chymotrypsin Thr Ile sn sn sp Ile Thr Trypsin Tyr Leu sn sn sp Ile Met Elastase Ser Lys Gly sn sp Ile la Thrombin sn Leu sp rg sp Ile la lasmin he Thr rg Lys sp Ile la cetylcholinesterase sp dapted from Dressler & otter (1991) Discovering Enzymes, p.244
Dale, Loewi (1936) 神經細胞接合處的化學傳導 cetylcholine O CH + 3 CH 3 C O CH 2 CH 2 N CH 3 CH 3 che O CH 3 C OH Sarin + Choline CH 3 + HO CH 2 CH 2 N CH 3 CH 3 dapted from Dressler & otter (1991) Discovering Enzymes, p.239
che 催化機制類似 Ser 蛋白脢 O CH + 3 CH 3 C O CH 2 CH 2 N CH 3 CH 3 O - C H H O CH 3 C O - C CH 3 + O CH 2 CH 2 N CH 3 H CH 3 H che che O CH 3 C OH O - C H H cylation Deacylation H 2 O O CH 3 C O C H-O-H CH 3 + HO CH 2 CH 2 N CH 3 CH 3 H che che dapted from Dressler & otter (1991) Discovering Enzymes, p.243
不同酵素可能採取類似的催化機制 O - C 有用的組合 Hi, Everybody! 有趣的組合 Sesame Triad Juang RH (2007) BCbasics
分子層次也有演化的力量 Molecular Thyroglobulin Evolution O C C O C Ester bond eptide bond O C N C C H cetylcholinesterase esterase 趨同演化 Serine rotease Ser 族蛋白脢 分解 acetylcholine Convergent evolution sp--his--ser sp--his--ser Divergent evolution 趨異演化 Chymotrypsin Trypsin Elastase Thrombin lasmin Juang RH (2007) BCbasics
教宗平反達爾文 Wadman (1996) Nature 383 p.753
蛋白脢裂解有很複雜的調控機制 蛋白脢裂解為單方向而不可逆 如何控制之? (+) 以蛋白脢抑制劑 (protease inhibitor) 抑制降解 (-) 已降解而活化者 進一步以完全降解清除之 蛋白質降解也是一般的細胞生理調節方式 : roteasome 降解被 ubiquitin 標示的蛋白質 Chaperonin 幫助蛋白質捲成正確的構形 Intein & Extein: 轉譯後的蛋白質再經剪接處理, 去除 intein Juang RH (2007) BCbasics
roteasome 降解標有 ubiquitin 的蛋白質 Goldberg (1995) Science 268: 522 Harvard Medical School Lowe et al (1995) Science 268: 533
少數蛋白質也有轉譯後之剪接 RN Exon 1 Intron Exon 2 Exon 1 Exon 2 rotein Extein 1 Intein Extein 2 Extein 1 Extein 2 Juang RH (2007) BCbasics
6.2 磷酸化 : 可逆性共價修飾 Ser Thr Tyr (His) OH Kinase 磷酸化 Fischer, Kreb (1978) 蛋白質 去磷酸化 hosphatase 蛋白質構形改變 Glycogen phosphorylase b 非活化型 活化型 Glycogen phosphorylase a 活化型 非活化型 Juang RH (2007) BCbasics
血糖濃度的調節 Cori & Cori (1947) Signal Transduction Tyrosine-kinase-linked receptor 降低血糖 高血糖 血液中 Insulin 胰島素 荷 Glycogen synthase 肝胰臟爾臟肝糖葡萄糖 蒙 低血糖 胰增糖素 Glucagon GT-protein-linked receptor Ref: E6-38 Glycogen phosphorylase 升高血糖 Juang RH (2007) BCbasics
細胞對血中葡萄糖濃度反應迅速 Glycogen phosphorylase Glycogen synthase Enzyme activity 葡萄糖反應非常迅速 0 2 4 6 8 Time (min) 不是基因層次的控制 dapted from Stryer (1995) Biochemistry (4e) p.597
肝糖與澱粉 Mathews et al (1999) Biochemistry (3e) p.299 Glycogen Glycogen phosphorylase Glc-1- Glycogen synthase U Ref: N3-3 UD-Glc Juang RH (2007) BCbasics
肝糖磷解脢 G Glucagon rotein kinase + cm Glycogen 磷酸化 + 6.2 6.3 Glc-1- Glc-6- Glycolysis Glycogen phosphorylase a* n n-1 G kinase T hosphatase Glycogen phosphorylase b (inactive) R T Glucose (-) Caffeine (-) 6.4 M (+) T (-) Glc-6- (-) Juang RH (2007) BCbasics
肝糖磷解脢的分子構形 Stryer (1995) Biochemistry (4e) p.591, 592
肝糖磷解脢之磷酸化影響分子構形 rg 69 Ser 14 rg 43 T R Stryer (1995) Biochemistry (4e) p.593
磷酸化造成劇烈的構形變動 Cyclin-dependent kinase 磷酸脢 (+) T Cyclin 磷酸化 (-) Cdk 磷酸化 (+) Cyclin 降解 (-) 磷酸片段被正電荷抓住 lberts et al (1994) Molecular Biology of the Cell (3e) p. 202, 205
dapted from lberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p. 182 T D rotein Kinase 兩種以磷酸為主角的信號系統 Signal In Signal In GD GEF GD 磷酸化 GT 結合 GT rotein hosphatase G GT Signal Out Signal Out
rotein Kinase 基本構造與演化家族 (1) 激脢進行磷酸化需 T 多為不可逆 (2) 反方向的去磷酸反應需 phosphatase (3) 二者合組磷酸化循環, 類似分子開關 (4) 非常龐大的群族, 序列具有高保守性 (5) 對目標蛋白質的專一性強度大小不一 外來基因插入點 lberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p. 178, 179
lberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p. 857, 858 cm 控制 rotein Kinase 活性 Regulatory subunits R C R C Catalytic subunits cm R R ctive kinase C C 細胞核 CREB 活化 C CREB DN 基因表現 ON
cm 是第二傳信者 (Second Messenger) Sutherland (1971) denylate cyclase Receptor Glucagon 結環脢 G protein G protein T cm Cyclic M (second messenger) 蛋白質激脢 蛋白質激脢 rotein kinase 肝糖磷解脢激脢 肝糖磷解脢激脢 Cascade Glycogen phosphorylase kinase 未活化型 活化型 肝糖磷解脢 b Glycogen 肝糖磷解脢 a Glycogen phosphorylase 肝糖 Glc-1- Juang RH (2007) BCbasics
細胞膜上的信息接受器與傳遞 Gilman, Rodbell (1994) denylate cyclase Glucagon G-protein-linked Receptor + Signal α GT α GT -GD +GT α GD β γ α GD β γ 肝糖分解 G protein 另有一大類 Ion-channel-linked Receptor Insulin Enzyme-linked Receptor α + Signal Glycogen Synthase active Glycogen Synthase rotein hosphatase 肝糖合成 活化 kinase SH2 domain β Juang RH (2007) BCbasics
G kinase G kinase hosphatase G b Glucagon K Glycogen synthase Glycogen synthase rotein phosphatase-1 肝糖降解 G a Glycogen 肝糖合成 rotein phosphatase-1 rotein phosphatase inhibitor-1 active rotein phosphatase inhibitor-1 inactive dapted from Kleinsmith & Kish (1995) rinciples of Cell and Molecular Biology (2e) p.217
細胞核內外的信息傳導 (Ras vs. 53) 細胞的生理功能是由許多分子的交互作用機制所控制 受體 外部信息 細胞膜 細胞質 援軍蛋白 Ras 轉譯 信號蛋白 效應酵素 核糖體 抑制者 細胞核 細胞凋亡 mrn 53 E2F 轉錄因子 目標基因 轉錄 mrn 啟動細胞分裂 Juang RH (2007) BCbasics
6.3 cm 與 Calmodulin cm Calmodulin Stryer (1995) Biochemistry (4e) p.343 Nelson & Cox (2000) Lehninger rinciples of Biochemistry (3e) p.458 O 5 O= O - R 3 O Inositol 3 Diacylglycerol
Calmodulin 的作用模式 lberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p. 865
信息傳導基本模式 各種荷爾蒙 專一性確認 各種接受體 Hormone Signal Receptor 傳至胞內 不同的 G-protein 啟動機制 各種關鍵酵素 酵素放大 各種信息分子 信息放大 各種效應 G Cyclase Transducer Effector Enzyme Effector Effect Juang RH (2007) BCbasics
許多蛋白質都有磷酸化 我也是..
6.4 異位脢 TCase ctive relaxed form Carbamoyl phosphate O H 2 N-C-O-O 3 2- = + spartate COO - CH 2 HN-C-COO - H H - - - - TCase Carbamoyl aspartate COO - O CH 2 H 2 N-C-N-C-COO - H H = - - - - 四級構造 T CT R R CCC R R R R Catalytic subunits Regulatory subunits CT CT CT CT CT CT Feedback inhibition CT CCC Catalytic subunits Inactive tense form 核酸代謝 Juang RH (2007) BCbasics
TCase 分子構形改變影響活性 Tense form Relaxed form Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.403
TCase 分子構形變化情形 C subunits only Tense form Relaxed form Stryer (1995) Biochemistry (4e) p.241
異位脢的迴饋控制 可逆性非共價修飾 llosteric enzyme: 酵素的代謝物會影響該酵素的活性 spartate transcarbamoylase: (TCase) 其下游產物 CT 迴饋抑制酵素活性 (-) T 會增加 TCase 的活性 (+) T 與 CT 競爭同一調節區 (R) 基質 sp 的動力學作圖得 S 形曲線 (sigmoidal) TCase 乃合作式協力現象 cooperative TCase 的分子構形有 relax (active) 及 tense S 形曲線轉折點可看做酵素對基質濃度的感應點 ( 開關 ) Juang RH (2007) BCbasics
型曲線可以感受基質的濃度S v o Noncooperative (Hyperbolic) Sigmoidal 的 S 型曲線 T CT 正效應物 (T) 使 S 曲線變回拋物線 Cooperative (Sigmoidal) 但負效應物 (CT) 則保持原來 S 曲線 v o 誇張 S 型曲線可以得到一條劇烈轉折線及 On/Off 決定點 Off [Substrate] On 異位脢因此可以感受環境基質濃度而調整其活性大小 Juang RH (2007) BCbasics
異位脢的作用模型實例 Kinetics Models Cooperation R = Relax (active) S R v o [S] llosteric site S R (+) R S llosteric site Homotropic (+) Concerted X T v o (+) [S] S (+) R T S Heterotropic (+) Sequential T = Tense (inactive) v o [S] (-) X I (-) T T X Heterotropic (-) Concerted Juang RH (2007) BCbasics
肝糖磷解脢的活性調節作用 共價性修飾 T G kinase G phosphatase 1 T R M T Glc-6- Glucose Caffeine 非共價性修飾Glucose Caffeine 飾 E6-30 立即變化R Garrett & Grisham (1999) Biochemistry (2e) p.679
肝糖磷解脢異位調節的機制M Stryer (1995) Biochemistry (4e) p.592
Cartoon by I. Geis 血紅素攜氧率 100 80 60 40 20 0 血紅蛋白也有異位調節現象 運動中肌肉休息中肌肉 Myoglobin Hemoglobin 0 20 40 60 80 100 120 環境中氧濃度 Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.214, 216