VAHTS TM Library Quantification Kit for Illumina NQ101-NQ106 www.vazyme.com Vazyme biotech co., ltd. 使用说明书 Version 7.1
目录 Contents www.vazyme.com 01/ 产品概述... 02 02/ 保存条件... 02 03/ 适用范围... 02 04/ 产品组分... 03 05/ 注意事项... 04 06/ 使用方法... 06 07/ 数据分析... 06 08/ 参考实例... 08 09/ 常见问题及解决方案... 09
01/ 产品概述 本品是使用染料 qpcr 法进行 Illumina 平台高通量测序文库浓度测定的专用试剂盒 其工作原理为使用标准品绘制标准曲线, 再根据标准曲线计算待测文库绝对浓度 试剂盒采用了一种基于抗体法热启动的新型染料法 qpcr 预混液 VAHTS TM SYBR qpcr Master Mix 该预混液具有特异性高 扩增效率高 GC 含量适应性广 检测灵敏度高等诸多优势, 非常适合进行文库浓度的绝对定量 试剂盒所提供的所有试剂都经过了严格的质量控制, 最大程度上保证了不同批次间实验结果的可重复性 02/ 保存条件 所有组分应置于 -20 C 保存,Master Mix 与 ROX 应避光 试剂在 30 个冻融循环内可以保持性能不下降 ; 如短期内反复使用,Library Dilution Buffer 和 Master Mix 可解冻后于 4 C 暂存,Master Mix 应避光, 有效期三个月 03/ 适用范围 本品是针对 Illumina 平台高通量测序文库浓度绝对定量而设计的 不论以何种方式构建, 只要文库末端包含 Illumina P5 和 P7 芯片结合序列 长度不超过 1 kb 且浓度不低于 0.0002 pm, 都可以使用本品进行绝对定量 此外, 本品还可用于检测实验环境中文库污染程度 试剂盒提供的 qpcr Primer Mix 中包含如下两种引物序列 : Primer 1: 5'-AATGATACGGCGACCACCGA-3' Primer 2: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3' 可预先通过引物序列确认文库是否可以被该引物对扩增 1
www.vazyme.com NQ104 试剂盒中的扩增预混液已预混 High ROX (ROX Reference Dye 1), 适用于上表 Type II 机型定量 PCR 仪 NQ103 试剂盒中的扩增预混液已预混 Low ROX (ROX Reference Dye 2), 适用于上表 Type III 机型定量 PCR 仪 ; NQ102 试剂盒中无单独包装或预混 ROX Reference Dye, 适用于上表 Type I 机型定量 PCR 仪 ; NQ101 试剂盒中提供单独包装的 ROX Reference Dye 1/2, 适用于所有定量 PCR 仪 使用时根据上表选择适合的 ROX Reference Dye; Type I 机型 : 不添加 ROX Reference Dye Type II 机型 : 添加 ROX Reference Dye 1 Type III 机型 : 添加 ROX Reference Dye 2 Applied Biosystems 7500, 7500 Fast, ViiA 7; Stratagene MX4000, MX3005P, MX3000P. Applied Biosystems 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT Fast; StepOne, StepOnePlus. Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000; Roche Applied Science LightCycler TM 480; Thermo Scientific PikoReal Cycler. SmartCycler ; Eppendorf Mastercycler ep realplex, realplex 2 s; Illumina Eco qpcr; Qiagen/Corbett Rotor-Gene Q, Bio-Rad CFX96, CFX384, icycler iq, iq 5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4 ; Cepheid 2. 根据反应时 ROX Reference Dye 是否需要添加及需要添加的种类分类, 主流定量 PCR 仪可分为以下三类 : 包含 50 ml Library Dilution Buffer 进行 500 次定量反应 (20 μl reaction);nq105 为标准品试剂盒, 包含 DNA Standard 1-6, 包装量可用于 8 次标准曲线绘制 (3 孔重复 );NQ106 为文库稀释液试剂盒, 包装说明 1. NQ101 NQ102 NQ103 NQ104 为扩增组分试剂盒, 包含 VAHTS SYBR qpcr Master Mix qpcr Primer Mix 以及单独包装 ROX ( 仅 NQ101), 包装量足够 Library Dilution Buffer 50 ml DNA Standard 1-6 6 96 μl 50 ROX Reference Dye 2 200 μl 50 ROX Reference Dye 1 200 μl qpcr Primer Mix 2 0.5 ml VAHTS SYBR qpcr Master Mix (High ROX Premixed) 4 1.25 ml VAHTS SYBR qpcr Master Mix (Low ROX Premixed) 4 1.25 ml VAHTS SYBR qpcr Master Mix 4 1.25 ml 组分包装量 NQ101 NQ102 NQ103 NQ104 NQ105 NQ106 2 04/ 产品组分
05/ 注意事项 05-1/ 移液注意事项因 qpcr 反应极其灵敏, 移液的准确程度对反应结果影响显著 开始实验前, 请务必仔细阅读以下内容 : 1. 所有组分应充分解冻并彻底摇匀 短暂离心收集液体至管底后开盖使用 ; 2. 高浓度 DNA 溶液粘稠,DNA 分子分散度较差, 应避免直接进行大体积稀释 ( 如一次性稀释 10,000 倍 ), 推荐进行多次小体积稀释 如 : 需对文库进行 10,000 倍稀释, 可将文库进行两次 100 倍连续稀释 ; 3. 尽量使用带滤芯的枪头, 以避免气溶胶污染 ; 4. 尽量避免使用排枪 ; 5. 每次移液都应更换枪头, 避免产生交叉污染 ; 6. 试剂吸取时避免枪头过度深入液体, 以免粘液 ; 7. 排出液体时, 枪头应尽可能接近反应管管底 ; 8. 排完液体后应继续上下吹打 2-3 次漂洗枪头 ; 9. 液体完全排出后, 应仔细检查确认枪头内无液体残留 05-2/ 文库浓度和稀释度文库必须稀释至标准曲线有效 C T 范围内进行定量反应 浓度计算时, 有效 C T 范围之外的 C T 不应用于计算 如文库只有一个稀释度, 应重新稀释合适倍数后重复试验 ; 如文库有多个稀释梯度, 选取有效范围内 C T 进行浓度计算 标准曲线有效 C T 范围选取方案参见 07/ 数据分析 文库稀释可参照过往经验或使用其他测定方式测定的浓度作为参考进行 下表为可定量文库浓度范围 : 摩尔浓度 : 质量浓度 : 拷贝数浓度 : 20-0.0002 pm 5.5-0.000055 pg/μl 12 10 6-12 10 1 copies/μl 05-3/ 文库稀释应使用稀释液 ( 自行配制,10 mm Tris-HCl,pH 8.0 @25 C,0.05% Tween 20; 或从 Vazyme 购买, #NQ106) 进行 DNA 稀释, 请勿使用水作为稀释液 文库应现用现稀释, 用完丢弃 ;qpcr 反应之前, 应将稀释后的文库和解冻后的 DNA Standards 置于冰上存放 05-4/ 污染与无模板阴性对照 (NTC,No Template Control) 1. PCR 产物因操作不当极容易产生污染, 进而导致定量结果不准确 可信度不高等问题 推荐将反应体系配制区和模板制备区进行物理隔离 使用专用的移液器等设备 使用带滤芯的枪头 并定时对各实验区域进行清洁 ( 使用 0.5% 次氯酸钠或 10% 漂白剂进行擦拭清理 ) 2. 反应体系配制过程中 DNA Standards 的加入应按照从低浓度至高浓度 (DNA Standard 6 至 1) 的顺序进行, 每次移液都应更换新的枪头, 以避免气溶胶污染 3. 每次实验都应平行进行 NTC 阴性对照反应, 配合融解曲线进行扩增特异性和体系污染程度分析 因扩增引物序列为 Illumina 平台固定序列而非 qpcr 专用引物序列, 且反复进行文库稀释定量时气溶胶污染无法完全避免,NTC 阴性对照反应出现扩增进而产生 C T 属正常情况 先根据 NTC 阴性对照确定标准曲线有效 C T 范围 ( 方案参见 07/ 数据分析 ), 再进行标准曲线绘制和浓度计算 3
05-5/ 扩增曲线基线设置因 DNA Standard 1 的摩尔浓度远远高于常规 qpcr 模板, 其 C T 往往非常小 (7~9) 而大部分 qpcr 仪器都默认将 3-15 循环设置为基线 (Baseline), 有时会造成 DNA Standard 1 的 C T 错误的增高, 进而影响标准曲线的线性关系 手动设置基线 (Baseline) 为 1-3 循环可以有效避免这种情况发生 05-6/ 文库浓度长度矫正荧光染料 SYBR Green I 结合 DNA 后产生的荧光强度与 DNA 分子量成正比 例如 : 两个 250 bp 的双链 DNA 分子产生的荧光强度与一个 500 bp 的双链 DNA 分子产生的荧光强度相当 因此, 在进行文库浓度绝对定量时, 必须根据 DNA Standards 的长度 (452 bp) 和文库平均长度对文库摩尔浓度进行长度矫正 ( 方案参见 07/ 数据分析 ) 05-7/ 融解曲线分析融解曲线在配合 NTC 阴性对照进行污染程度分析以及确认标准曲线最大有效 C T 时至关重要, 推荐每次实验都进行融解曲线采集步骤 DNA Standards 产生的融解曲线呈现特征双峰 ( 下图蓝色箭头标记 ) 造成双峰的原因为 DNA Standards (452 bp dsdna) 的不同位置在不同温度下解链, 而不是非特异性扩增产物 此外,DNA Standard 1-3 摩尔浓度极高, 循环结束时扩增产物过多, 会导致部分产物在 Tm 附近无法完全解链 因此,DNA Standard 1-3 产生的融解曲线有时会出现翘尾现象 ( 下图红色箭头标记 ), 属正常情况 05-8/ 其他定量方法 www.vazyme.com 高通量测序文库有多种浓度测定方式, 如光谱测定法 (NanoDrop TM 等 ) 荧光染料法(Qubit PicoGreen 等 ) 电泳检测法(2100 Bioanalyzer TapeStation LabChip GX 等 ) qpcr 检测法等 其中,qPCR 检测法因只测定可扩增文库 ( 双端接头完整 ), 测定值与真实值最接近 一般来说, qpcr 法测定的文库浓度会比其他方法略低一些, 可使用其他方法粗略测定的文库浓度作为参考, 选取合适的文库稀释度进行 qpcr 法浓度测定 然而, 当文库被过度扩增时 ( 如扩增循环数太多 ), 扩增产物中大量存在的非严谨型退火产物 ( 部分双链 ) 会导致 qpcr 法测定的文库浓度会比其他方法高一些 此时, 若使用其他方法粗略测定的文库浓度作为稀释参考, 会出现文库稀释度不足的情况 4
06/ 使用方法 1. 准备适量文库稀释液 ( 参见 05/ 注意事项 05-3/ 文库稀释 ) 文库稀释液可于 4 C 保存 使用前置于室温孵育 30 min; 用完后放回 4 C 保存 2. 使用稀释液将文库进行适度稀释 文库浓度不同, 最佳稀释倍数不尽相同 推荐稀释度为 1/1,000-1/100,000, 并至少设置一个额外的 2 倍稀释, 如 1/10,000 和 1/20,000 文库应现用现稀释, 稀释后置于冰上备用, 用完丢弃 3. 解冻 VAHTS SYBR qpcr Master Mix (Without ROX, Low ROX Premixed or High ROX Premixed) qpcr Primer Mix ROX Reference Dye ( 如需要 ) DNA Standard 1-6, 解冻后上下颠倒充分混匀, 并短暂离心将溶液收集至管底, 置于冰上备用 用完后立即放回 -20 C 保存 4. 在 qpcr 管中配制如下反应 : VAHTS SYBR qpcr Master Mix (Without ROX, Low or High ROX Premixed) 10.0 μl qpcr Primer Mix 2.0 μl ROX Reference Dye 1/2 a 0.4 μl DNA Standard 1-6 或稀释后的文库或灭菌蒸馏水 b 4.0 μl 灭菌蒸馏水 c To 20.0 μl a b c 仅使用 NQ101 产品时, 根据 qpcr 机型选择合适 ROX 添加 ; 使用其他试剂盒时请勿添加, 将该组分用灭菌蒸馏水代替即可 在 NTC 阴性对照反应管中加入灭菌蒸馏水 ; 在样品反应管中加入稀释后的文库 ; 在标准曲线反应管中加入 DNA Standards 加入 DNA Standards 时, 应按照 DNA Standard 6 至 1 的顺序 ( 低浓度至高浓度 ) 依次加入, 以免气溶胶污染影响标准曲线的线性 推荐进行 20 μl 反应 如需进行 10 μl 反应, 可将体系各组分等比减少即可 5. 按照下述条件进行 qpcr 反应 : Stage 1 Stage 2 Stage 3 预变性 a 循环反应 b 融解曲线 Reps:1 Reps:35 Reps:1 95 C 95 C 60 C 95 C 60 C 95 C a 如文库平均长度超过 600 bp, 应将退火延伸时间由 45 sec 延长至 90 sec b 不同仪器融解曲线采集程序不尽相同, 使用仪器默认程序即可 5 min 30 sec 45 sec 15 sec 60 sec 15 sec 07/ 数据分析 07-01/ 标准曲线制作 1. 根据复孔间 C T 差异 0.2 的原则, 对 DNA Standards 原始 C T 进行过滤, 并计算平均 C T 如移液操作足够精确, 三个复孔之间的 C T 差异均应不超过 0.2 如果两个复孔 C T 比较接近, 与第三个复孔之间的 C T 差异较大, 可删除第三个复孔数据, 使用前两个复孔的 C T 计算平均 C T 如多个复孔之间的 C T 差异均超过 0.2, 需重复实验 5
2. 参照 NTC 阴性对照 C T 确认标准曲线 C T 有效范围 如 C T (NTC) > C T (DNA Standard 6) + 3, 则最大有效 C T 为 C T (DNA Standard 6), 应使用 DNA Standard 1-6 所产生的 C T 绘制标准曲线 ; 如 C T (DNA Standard 6) + 3 > C T (NTC) > C T (DNA Standard 5) + 3, 则最大有效 C T 为 C T (DNA Standard 5), 应使用 DNA Standard 1-5 所产生的 C T 绘制标准曲线 ; 如 C T (DNA Standard 5) + 3 > C T (NTC) > C T (DNA Standard 4) + 3, 则最大有效 C T 为 C T (DNA Standard 4), 应使用 DNA Standard 1-4 所产生的 C T 绘制标准曲线 ; 基于定量准确性考虑, 请至少使用 4 个 C T (DNA Standards) 绘制标准曲线 如 C T (DNA Standard 4)+ 3 > C T (NTC), 提示定量体系存在严重污染, 需更换体系中所有组分后重复试验 3. 绘制标准曲线 使用有效范围内的 C T ( 作为纵坐标 ) 和下表对应 Log[pM]( 作为横坐标 ) 绘制标准曲线 绘制的标准曲线相关系数 R 2 应不低于 0.99, 斜率应位于 -3.1~-3.6 之间 ( 表示扩增效率位于 90%~ 110% 之间 ) 如标准曲线参数不佳, 应重复试验 Standard 名称 Standard 摩尔浓度 Standard 质量浓度 Log[pM] DNA Standard 1 20 pm 5.5 pg/μl Log[20] DNA Standard 2 2 pm 0.55 pg/μl Log[2] DNA Standard 3 0.2 pm 0.055 pg/μl Log[0.2] DNA Standard 4 0.02 pm 0.0055 pg/μl Log[0.02] DNA Standard 5 0.002 pm 0.00055 pg/μl Log[0.002] DNA Standard 6 0.0002 pm 0.000055 pg/μl Log[0.0002] 表中所列 Standard 浓度非反应终浓度 只要 DNA Standards 和稀释文库使用体积一致, 无需换算反应终浓度 07-02/ 文库浓度计算 1. 根据复孔间 C T 差异 0.2 的原则, 对稀释文库原始 C T 进行过滤, 并计算平均 C T 如移液操作足够精确, 三个复孔之间的 C T 差异均应不超过 0.2 如果两个复孔 C T 比较接近, 与第三个复孔之间的 C T 差异较大, 可删除第三个复孔数据, 使用前两个复孔的 C T 计算平均 C T 如三个复孔之间的 C T 差异均超过 0.2, 需重复实验 2. 根据标准曲线计算稀释文库的浓度 (pm) 稀释文库的 C T 只有位于标准曲线有效 C T 范围之内才可用于浓度计算 请勿使用标准曲线有效 C T 范围之外的 C T 计算稀释文库的浓度 3. 根据下述公式对稀释文库的浓度 (pm) 进行长度矫正 矫正后的稀释文库浓度 (pm) = [452 bp / 文库平均长度 (bp)] 稀释文库的浓度 (pm) www.vazyme.com 4. 根据下述公式计算原始文库浓度 (nm) 原始文库浓度 (nm) = 矫正后的稀释文库浓度 (pm) 稀释倍数 /1,000 6
08/ 参考实例 初始材料 VAHTS TM Nano DNA Library Prep Kit for Illumina (Vazyme #ND601) 制备的两个插入长度约 350 bp 的 DNA 文库 ( 文库总长度 ~470 bp) 经 Agilent Bioanalyzer 2100 High Sensitivity DNA Assay 检测获得文库的长度 浓度信息见 Table 2 文库稀释将两个文库分别进行 1/10,000 稀释 ( 两次 1/100) 和 1/20,000 稀释 (1/10,000 稀释产物再稀释一倍 ) a. 根据复孔间 C T 差异 0.2 的原则, 过滤 DNA Standards 原始 C T 去除 DNA Standard 6 第三个重复孔数据 (Table 1, C T 列 ), 并计算平均 C T (Table 1, 平均 C T 列 ) b. 根据 C T (NTC) 确认最大有效 C T 为 C T (DNA Standard 6), 使用平均 C T (DNA Standard 1-6) 与其对应的摩尔浓度对数值 (Table 1, Log[pM] 列 ) 绘制标准曲线 (Figure 1) Table 1. DNA Standards 的 C T 值 DNA Standard Log[pM] C T 8.37 平均 C T ΔC T* 1 Log[20] 8.36 8.33-8.27 11.83 2 Log[2] 11.74 11.78 3.45 11.78 15.26 3 Log[0.2] 15.28 15.22 3.44 15.12 18.78 4 Log[0.02] 18.73 18.70 3.48 18.59 22.16 5 Log[0.002] 22.05 22.10 3.40 22.10 25.51 6 Log[0.0002] 25.47 25.49 3.39 25.17 30.87 NTC - 31.26 30.95-30.73 *ΔCT 应位于 3.1-3.6 之间 文库浓度计算 a. b. c. d. 根据复孔间 C T 差异 0.2 的原则, 过滤稀释文库原始 C T 去除 Library 2 1/20,000 稀释组第二个重复孔数据 (Table 2, Library2,1/20,000 列 ), 并计算平均 C T (Table 2, 第 5 行 ) 根据标准曲线计算稀释文库的浓度 (Table 2, 第 7 行 ) 根据文库平均长度, 计算矫正后的稀释文库浓度 (Table 2, 第 8 行 ) 根据稀释倍数计算各稀释度初始文库浓度 (Table 2, 第 9 行 ) 和平均初始文库浓度 (Table 2, 第 11 行 ) 7
Figure 1. Standard Curve CT Table 2. 文库定量数据表 行 名称 Library 1 Library 2 1 文库平均总长度 (Bioanalyzer) 475 bp 470 bp 2 文库近似浓度 (Bioanalyzer) 25.74 ng/μl = 82.08 nm 36.22 ng/μl = 116.77 nm 3 文库稀释倍数 1/10,000 1/20,000 1/10,000 1/20,000 9.91 10.82 9.15 10.31 4 复孔 CT 9.95 10.93 9.24 10.03 9.88 10.89 9.25 10.28 5 6 平均 CT ΔCT 9.91 10.88 0.97 9.21 10.30 1.09 7 稀释文库计算浓度 (pm) 7.03 3.67 11.24 5.42 8 长度矫正后的稀释文库浓度 (pm) 6.69 3.49 10.81 5.21 9 初始文库浓度 (nm) 66.93 69.86 108.14 104.16 10 11 不同稀释度文库定量差平均初始文库浓度 4.4% 68.40 nm = 21.45 ng/μl 3.8% 106.15 nm = 32.93 ng/μl 09/ 常见问题及解决方案 扩增效率偏出 90%~110% 范围 1 如 C T (NTC) - C T (DNA Standard 6) < 3 或者 C T (DNA Standard 6) - C T (DNA Standard 5) < 3.1, 且计算扩增效率超过 100%, 提示反应体系有污染 应根据 NTC 阴性对照的融解曲线确认污染源 ( 文库污染或 DNA Standards 污染 ) 绘制标准曲线时, 应先根据 C T (NTC) 确定标准曲线有效 C T 值范围, 舍弃受污染影响的 C T, 使用剩余的 C T 绘制 2 不恰当的基线 (Baseline) 设置会增大 C T (DNA Standard 1), 进而影响扩增效率计算 手动调整基线 (Baseline) 为 1-3 循环 3 移液精确度差 www.vazyme.com R 2 < 0.99 1 移液精确度差 2 所有试剂在使用前应充分解冻并彻底混匀 3 仪器相关问题 确认所用 ROX Reference Dye 与定量仪器匹配 8
标曲扩增曲线分布不均一 1C T (DNA Standard 6) - C T (DNA Standard 5) < 3.1, 提示反应体系有污染 应根据 NTC 阴性对照的融解曲线确认污染源 ( 文库污染或 DNA Standards 污染 ) 2C T (DNA Standard 2) - C T (DNA Standard 1) < 3.1, 提示基线 (Baseline) 设置不当 手动调整基线 (Baseline) 为 1-3 3DNA Standards 之间的 ΔC T > 3.6, 提示扩增效率差 确认所有试剂在使用前都已充分解冻并彻底混匀 ; 确认所有组分浓度正确以及反应程序无误 4长时间强光照射会导致 VAHTS SYBR qpcr Master Mix 荧光值下降, 进而造成 ΔC T > 3.6 应按照推荐方式避光贮存试剂 复孔重复性差 1移液精确度差 2所有试剂在使用前应充分解冻并彻底混匀 3仪器相关问题 确认所用 ROX Reference Dye 与定量仪器匹配 文库各稀释度 ΔC T 与稀释倍数差异不一致 1移液精确度差 2所有试剂在使用前应充分解冻并彻底混匀 3文库难于扩增 GC/AT 含量过高或长度超过 1 kb 的文库扩增效率较差, 定量波动性大 4文库降解 文库应现用现稀释, 稀释好的文库应置于冰上备用, 用完丢弃 文库各稀释度计算的初始文库浓度差异超过 10% 1移液精确度差 2所有试剂在使用前应充分解冻并彻底混匀 3文库难于扩增 GC/AT 含量过高或长度超过 1 kb 的文库扩增效率较差, 定量波动性大 4文库降解 文库应现用现稀释, 稀释好的文库应置于冰上备用, 用完丢弃 稀释文库 C T 超过标准曲线有效 C T 范围 1C T ( 稀释文库 ) < C T (DNA Standard 1), 提示文库稀释度不够, 多见于过度扩增的文库 提高文库稀释倍数重复实验 2C T ( 稀释文库 ) > C T (DNA Standard 6), 提示文库稀释度过高或构建失败 常规文库在 1/10,000 左右的稀释度时得到的 C T 不应超过 C T (DNA Standard 6) 减少稀释倍数重复实验 DNA Standard 1 C T 异常不恰当的基线 (Baseline) 设置会增大 C T (DNA Standard 1) 手动调整基线(Baseline) 为 1-3 循环 仪器相关问题 确认所用 ROX Reference Dye 与定量仪器匹配 DNA Standards 有扩增, 而文库没有或 C T 很大 1文库接头序列错误 : 建议核对文库末端序列与试剂盒提供的引物序列是否匹配 2稀释度过高 : 建议减少稀释倍数, 重复实验 3文库降解 : 文库应现用现稀释, 稀释好的文库应置于冰上备用, 用完丢弃 9
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