检验医学 年 月第 卷第 期 ) + ) + *(1 "1 ;14 15 1 ++ 文章编号 中图分类号 文献标志码!" 某院产 )+8! 大肠埃希菌多位点序列分型研究 潘 军 许青霞 肖伟强 常彦敏 沈 勇 郑州大学附属肿瘤医院检验科 河南郑州 摘要 目的 了解郑州大学附属肿瘤医院临床和环境中产超广谱 内酰胺酶 ;$! 大肠埃希菌多位点序列分型 ( ; 及其遗传进化关系 为监测产 ;$! 菌株的流行和医院感染控制提供依据 方法 采用基因扩增和测序的方法对 株产 ;$! 大肠埃希菌 个管家基因进行序列分析 并与 ( ; 数据库比对 得到每个菌株相应的等位基因号 结果 株产 ;$! 大肠埃希菌获得 种序列分型 ; 其中 株为 ; 型 株为 ; 型 结论 产 ;$! 大肠埃希菌遗传背景多样化 ; 型和 ; 型为本研究主要型别 其它型别散在分布 关键词 超广谱 内酰胺酶 大肠埃希菌 多位点序列分型 #" #!! # "'%!"# ' )+8!*%#!%"! 3 # % '. (5 -. / ) "1+ /* ) /$!, + $!!" " " + "01! ) 1 152+ 2!!1 21" 1 *4 " ( ; )" 1"1 10+ 2 +" + 19 1" 1!4125 1 ) ) )5)!1 ;$!4 + 2 " 5 ) ) )" 1) 1 %)" 1 >+!4 ) + E 1" 6 +2 " 01! * )" +4 +0 1 1 1 1 1" 1 +15+" + " + ;$!4 + 2 "!+ ) 1! 14 15 )" +!4 ) " 1 +" +" + "! 1"1)54) +" )"!1 21" 1)") *!!31 141 + 51 + +2!17114 " 1"1!+!+ ) 1!+ ;$! 4 + 2 " 5 ) ) ) )" ) 1 1!31 1 +54) 1 3 +!1)! "1 ) ( ; ) ) )!1!!#"!+ ) +!1 21" 1 *41!; 31 1+ )"1 " 1!+ ) 1!+ ;$!4 + 2 " 5 ) ) ) " 3 1 131 1 ; )" ;#!! ;$!4 + 2 " 5 ) ) ) )! 01! 1 1"1) 7 +2"! )" ; )" ; ) 1 15+! 4 10) 1" *41! 3 1+ 1 *41!31 1! ) 1 1 ' $! 9 1" 1!4125 1 ) ) )5)!15 ) ) )(2+ 2!!1 21" 1 *4 " 大肠埃希菌是肠道内大量存在的正常菌群 但当机体抵抗力下降或侵入肠外组织或器官时 可作为条件致病菌引起肠道外感染 近年来 由于大量使用抗菌药物以及耐药质粒相互传递 造成耐药菌株明显增加 引起医院内感染呈上升趋势 多位点序列分型 52+ 2!!1 21" 1 *4 " ( ; 是近年来发展很快的分子生物学分析方法 具有很高的分辨能力 以 个管家基因为基础 具有相对变化缓慢的突变积累效应 结果以序列分型!1 21" 1 *41; 表示 不同的菌株对应不同的 ; 从而可对菌株的等位基因进行多样性比较 ( ; 既适于分子流行病学研究 也可用于分子进化学研究 因此 我们对分离到的 株产超广谱 内酰胺酶 19 1" 1!4125 1 ) ) )5)!1 ;$! 大肠埃希菌进行 ( ; 研究 材料和方法一 菌株来源收集各种临床和环境样本中分离的产 ;$! 大肠埃希菌 株 采用法国生物梅里埃公司的全自动微生物鉴定系统 B 及配套的革兰阴性菌 卡进行鉴定 经分离鉴定确定为大肠埃希菌 菌株于甘油保存管中 / 保存备用 质控菌株为大肠埃希菌 %% 来自中国菌种保存中心 基金项目 河南省科技厅重点科技攻关项目 作者简介 潘 军 女 年生 硕士 主管技师 主要从事临床微生物与细菌耐药机制研究 通讯作者 许青霞 联系电话
检验医学 年 月第 卷第 期 ) + ) + *(1 "1 ;14 15 1 ++ 二 试剂与仪器细菌基因组提取试剂盒 北京天根生化科技有限公司 4 & 标准带 A 4 上海生工生物工程有限公司 试验所用引物 上海生工生物工程有限公司 # 159 ) 酶 大连宝生物工程有限公司 1"1 54 聚合酶链反应 4+ *51 )!1 )" 1) +"#% 扩增仪 美国 44 1 $+!*! 15! 公司 ( + 2 1 台式微量冷冻离心机 美国 $1 75)" %+2 1 公司 4 ) 凝胶成像系统 美国 # + 1"; 54 1 公司 &<<% 型电泳仪 北京市六一仪器厂 $B 测序仪 上海生工生物工程有限公司 三 ;$! 的表型确认试验根据美国临床实验室标准化协会 1 % " ) )" ) + ) + *; )" )!B"! 2 1% ;B 的推荐方法 血琼脂培养基复苏冰冻保存菌株 挑取单个菌落于无菌生理盐水中调至 麦氏单位 涂抹在水解酪蛋白胨平板上 待干后贴加头孢他啶 头孢他啶 克拉维酸 和头孢噻肟 头孢噻肟 克拉维酸 组药物敏感性纸片 其中任何一组抑菌圈直径增大 55 时 则判为产 ;$! 菌株 质控菌株为大肠埃希菌 %% 四 & 模板提取从 过夜培养的血琼脂培养基中挑取单个菌落 A 个 然后按照基因组 & 提取试剂盒说明书提取细菌 & / 保存 五 ( ; 选择大肠埃希菌的 个管家基因 *7 /!. +6)*.*! 和 ) 作为目的基因进行 #% 扩增 引物序列参考文献 合成 见表 #% 扩增条件 预变性 5" 然后 变性 5" 退火 5" 延伸 5" 个循环 最后 延伸 5" #% 扩增产物经试剂盒纯化后 由上海生工生物工程有限公司用 $B 测序仪进行双向测序 将测序结果拼接后提交网站 4 5! 3) 3 7 ) 27 5!! + 进行比对分析 得到相应的 ; 数据库中不能完全比对的 确认为新的 ; 新的等位基因序列 ; 和菌株资料均递交至网站 4 5! 3) 3 7 ) 27 5! + 251"!!2 5!+"O 5 六 数据分析采用网络软件 4 42 5! + )") *!! 对 ( ; 数据进行分析 构建 ;4! 11 进化关系树 表 ( 个管家基因引物序列及退火温度 管家基因引物序列 长度 4 退火温度 *7 % % % % %% %% % %% % /!. % % % %% % % % % % % % +6 % % % %% % %%% % % % % % )* %% % % % % % %.* % %%% % % % %% %% %% %%%% % %%! % % % %%%% % % ) % %% % %%%%% % % % %%%
检验医学 年 月第 卷第 期 ) + ) + *(1 "1 ;14 15 1 ++ 结 果一 体外药物敏感性试验 株产 ;$! 大肠埃希菌中 株来源于引流液 血液 中段尿 脓液和痰液等临床样本 株来自环境或正常部位包括患者手 陪护手 床把手 床头柜 门和大便 株产 ;$! 大肠埃希菌对亚胺培南 美罗培南的敏感率为, 未出现耐药株 对阿莫西林 克拉维酸的敏感率仅为, 对头孢类抗菌药物的耐药率为, 对氟喹诺酮类抗菌药物的耐药率为, 左右 对哌拉西林 他唑巴坦 阿米卡星 呋喃妥因的敏感率较高 对所有 内酰胺类抗菌药物均耐药 二 个管家基因 #% 扩增将 株产 ;$! 大肠埃希菌的 个管家基因分别进行 #% 扩增 得到 个管家基因预期片段长度 A 4 ( ; 个管家基因 #% 扩增产物电泳图见图 三 ( ; 对 株产 ;$! 大肠埃希菌 个管家基因分别进行扩增 将 #% 扩增产物纯化后进行测序分析 测序结果提交网站与对应基因的等位基因 谱 *74/!. 4+64)*4.* 4! 4) 比对得到每个菌株等位基因号 获得 种不同的 ; 其中 ; 型 株 ; 型 株 ; 型 株 ; 型 株 ; 型 株 ; 型 株 ; 型 株 ; 型 株 其余为不同的 ; 其中 株来自临床感染病例产 ;$! 大肠埃希菌 株来自环境或正常部位产 ;$! 大肠埃希菌 ( ; 结果见表 表 对 株产 ;$! 大肠埃希菌 ( ; 的结果采用 ;4! 11 软件进行无根系统进化树分析 结果显示 ; 呈现散在分布 依据 ;4! 11 进化关系图所示 ; 型和 ; 型属于同一分支 ; 型和 ; 型属于同一分支 具有较近的亲缘关系 见图 注 ( 为 &)"" 1 A 分别为 *7/!. )*! +6).* 基因图 (( ; 个管家基因 #% 扩增产物电泳图 表, 株临床感染病例产 ;$! 大肠埃希菌 ( ; 结果 菌株编号 样本种类 科室 管家基因 *7 /!. +6 )*.*! ) ; 引流液 肝胆一 ; 引流液 肝胆一 ; 血液 肝胆一 ; 血液 肝胆二 ; 痰液 淋巴综合 ; 痰液 胸二 ; 痰液 胸二 ; 痰液 胸三 ; 穿刺液 肝胆二 ; 引流液 肝胆三 ; 血液 普三 ; 脓液 普六 ; 引流液 普五 ; 血液 普五 ; 中段尿 普五 ; 引流液 普一 ; 腹水 重症监护病房 ;
检验医学 年 月第 卷第 期 ) + ) + *(1 "1 ;14 15 1 ++ 表 - 株环境或正常部位产 ;$! 大肠埃希菌 ( ; 结果 菌株编号样本种类 科室 管家基因 *7 /!. +6 )*.*! ) ; 大便 肝胆一 ; 大便 肝胆一 ; 大便 肝胆二 ; 患者手 淋巴综合 ; 陪护手 肝胆二 ; 患者手 胸二 ; 床把手 普五 ; 床头柜 胸二 ; 门 胸二 ; 图, 大肠埃希菌 ( ; ;4! 11 进化关系图 讨 论 ( ; 是一个具有高分辨率的分子生物学方法 克服了脉冲场凝胶电泳分型的不足 由于大肠埃希菌的基因具有高度一致性 管家基因的进化非常慢 多态性位点较少 由于其中任何一个管家基因都有许多等位基因 菌株间有相同等位基因谱的可能性极小 通过网络对不同地区分离的菌株进行等位基因比较 由此得到的结果在世界各地实验室之间具有可比性 可以追踪菌株间的遗传关系和进化过程 进行群体进化研究和分子流行病学研究 本研究 ( ; 结果显示 株产 ;$! 大肠埃希菌共分为 种不同的 ; 其中 ; 型 株 ; 型 株 ; 型 株 ; 型 株 ; 型 株 ; 型 株 ; 型 株 ; 型 株 其余为不同的 ; ; 为散在分布 其中 ; 和 ; 仅管家基因.* 不同 ; 和 ; 仅管家基因! 有差别 用 ;4! 11 软件分析 ; 和 ; 均属于克隆复合体 %% 提示来源于不同科室的菌株其 遗传背景呈多样化 潘伟光等对广东地区 株产 ;$! 大肠埃希菌进行了 ( ; 分析 发现 种不同的 ; ; 型 株和 ; 型 株相对集中 其余型别为散在分布 本研究结果与上述文献 报道结果相符 E> 等对中国西部地区 家医院分离的 株大肠埃希菌进行研究 发现 株产 % =( 酶 其中 ; 型 株 另外 株是新的 ; 型别 ; ; ; ; 和 ; 欲进一步了解河南地区产 ;$! 大肠埃希菌的流行情况 还需增加医院和菌株数量进行深入分析研究 但短期内无法再收集到符合条件的菌株 实验例数无法增加 这是本研究的不足之处 多重耐药大肠埃希菌最主要的流行克隆株是 ; 克隆株 目前已有多篇文献报道过 ; 克隆株在全世界范围内流行 这种克隆株的特征是产 % =( 酶 属于 $ 进化亚群 大多数菌株表现为血清型 >( ; 为 ; 即产 % =( 型 >$; 克隆株 此种克隆株携带高致病性肠外毒素 容易引起尿路感染 菌血症和新生儿血流感染 而 ; ; ; ; 已成为其他最常见的 ; 据报道在南美已经有大肠埃希菌 ; 和 ; 引起社区发生的感染 ; 克隆株已参与传播基因编码 % =( 酶 54% 内酰胺酶 碳青霉烯酶或甲基化酶 5 5 $ 最近的研究报道 ; 和 ; 在产 ;$! 和非产 ;$! 之间某一特定的位置发生变异 另有报道称 ; 已经从人类或家禽中产 % =( 型 ;$! 大肠埃希菌中分离到 本研究中也有这些型别的菌株 说明在中国中部地区也可能存在此种流行克隆株
检验医学 年 月第 卷第 期 ) + ) + *(1 "1 ;14 15 1 ++ 本研究 种不同的 ; 中相对集中的是 株 ; 来源于胸二病区床头柜和门以及患者痰液样本 很可能由于患者感染的产 ;$! 大肠埃希菌污染周围环境 在住院患者陪护人员手 病房门把手 床把手及床头柜均分离出产 ;$! 大肠埃希菌 且 ; 相同属于同一克隆株 这些因素均可造成产 ;$! 大肠埃希菌在患者与患者之间传播 导致医院感染的发生 提示 ; 可能是该病区流行的克隆菌株 需要进一步研究分析确认是否为 ; 型克隆株的传播 另外 本研究医院环境中也检测到 ; ; ; ; ; 种型别 呈散在分布 药物敏感性资料显示 株产 ;$! 大肠埃希菌对亚胺培南 美罗培南敏感性较高 未出现耐碳青霉烯酶的大肠埃希菌 对哌拉西林 他唑巴坦 阿米卡星 呋喃妥因耐药率较低 对氟喹诺酮类抗菌药物的耐药率较高 对所有 内酰胺类抗菌药物均耐药 应引起临床高度重视 产 ;$! 大肠埃希菌是医院感染的常见耐药菌之一 可长期潜伏在医院环境中 通过各种途径在各科室之间相互传播 随时引起医院感染 造成耐药菌株院内流行 因此 应加强医院感染易感因素控制及耐药监测 重视病房消毒隔离工作和加强医护人员管理 切断各种感染途径 有效预防和控制医院感染的发生 参考文献 彭乃杰 林哈妮 夏菲 等 碳青霉稀类耐药肺炎克雷伯菌耐药机制和多位点序列分型研究 D 检验医学 王艳海 段宝生 巴特尔 等 鄂尔多斯地区蒙古族人群耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因分型 D 检验医学 倪语星 关注分子技术在临床微生物检验中的应用 D 检验医学 姚冬婷 应春妹 郑冰 微卫星多态性和多位点序列分析技术在光滑念珠菌基因分型中的应用评估 D 检验医学 ;< ; $ & ( ; 1 ) ") *!!+ )2 +4) + 1" 5 ) ) ) +") +24 * 52+ 2!!1 21" 1 *4 " D D% " ( + + 潘伟光 李一凡 钟海萍 等 产超广谱 内酰胺酶大肠埃希菌多位点序列分型研究 D 中国感染与化疗杂志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收稿日期 本文编辑 姜 敏