CRISPR-Cpf1 基因组编辑 使用 Alt-R Crispr-cpf1 系统, 扩充基因组编辑的选项 Alt-R CRISPR-Cpf1 系统为 CRISPR-Cas9 系统不能编辑的区域提供新的 CRISPR 目标位点, 产生含有 5 悬臂的 黏末端 使在生物体内编辑富含 AT 碱基区域的基因组称为可能 与 Cas9 系统相比,Cpf1 允许编辑更多基因组区域 只需要简单地结合 crrna 与 CPF1 蛋白, 不需要 tracrrna 的存在 允许通过电转染将 RNP 有效地传递到细胞内 Alt-R CRISPR-Cpf1 系统 简单的, 分 2 步运送 RNP 编辑复合体 (crrna:cpf1) 进入细胞 图 1. 使用 Alt-R CRISPR-Cpf1 系统通过电穿孔运送 ribonucleoprotein (RNP) CRISPR-Cpf1 基因组编辑方法采用 Cpf1 内切酶产生双链断裂, 形成 5 端突出的黏末端 Cpf1 只需要一个单一的特异针对的 DNA 靶序列的 CRISPR RNA(crRNA)( 图 1) 裂解后,DNA 通过非同源末端连接 (NHEJ) 或同源重组 (HDR)2 种作用进行修复, 形成新的序列 Alt-R CRISPR-Cpf1 试剂为通过这种途径进行基因组编辑的研究者, 提供了经过优化的必要工具 以下是对 CRISPR-Cpf1 和 CRISPR-Cas9 的简要的比较 : CRISPR-Cpf1 相关产品介绍页, 未经许可不得擅自使用 1 / 5
CRISPR 基因组编辑的比较 :Cas9 vs. Cpf1 Cas9 系统 Cpf1 系统 应用 一般的基因组编辑 富含 AT 碱基区域的基因组 对于使用的 CRISPR-Cas9 系统设计空间 有限制的区域 RNP 组件 crrna crrna tracrrna Cas9 endonuclease 天然 : 42 nt Alt-R: 35 36 nt ( 推荐使用 36 nt) crrna Cpf1 endonuclease 天然 : 42 44 nt Alt-R: 40 44 nt ( 推荐使用 41 nt) tracrrna 天然 : 89 nt Alt-R: 67 nt 不需要 CRISPR 酶 Class 2, Cas type II M.W.*: 163,700 g/mol Endonuclease domains: RuvC-like and HNH Class 2, Cas type V M.W.*: 157,900 g/mol Endonuclease domain: RuvC-like only 双链 DNA 裂解 切割位点在前间区序列上游 3 个碱基的位置, 形成 平末端 PAM 位点在基因组编辑过程中经常被破坏 切割位点在前间区序列的 5 端, 形成 5 端突出的黏末端 PAM 位点在基因组编辑后可能会继续存在 PAM 序列 NGG TTTV 建议运送 Alt-R RNP 的方 法 脂质体转染 使用 Alt-R enhancer 的电穿孔 显微注射 使用 Alt-R enhancer 的电穿孔 显微注射 * Alt-R 核酸酶的分子量 N = 任意碱基 ; V = A, C, 或 G 碱基 基因组编辑组件来源于 Acidaminococcus sp. BV3L6 的 CPF1 核酸内切酶和 crrna 能够介导在哺乳动物细胞中的基因组编辑 ( 图 2) Alt-R CRISPR-Cpf1 系统包括 3 个主要组成部分 : 一个优化的 crrna,a.s. Cpf1 核酸内切酶和电穿孔增强剂 而 Cpf1 内切酶作为 RNP 的组成部分一起通过电穿孔运送至细胞内是首选的方法 该 Alt-R CRISPR-Cpf1 crrna 也与任何来源的 A.s. Cpf1 兼容, 包括细胞稳定表达的 A.s. Cpf1 核酸内切酶 CRISPR-Cpf1 相关产品介绍页, 未经许可不得擅自使用 2 / 5
图 2 介导 Cpf1 核酸内切酶到目标基因组的 Alt-R CRISPR-Cpf1 系统组件 Alt-R Cpf1 crrna 通过与 Cpf1 内切酶形成一个编辑复合体, 介导目的基因组 DNA 断裂 裂解位点是前间区序列元件 crrna( 粗的绿色线条 ) 特异的 前间区序列元件 crrna 识别与序列为 TTTV 的 PAM 位点相对的 21nt 当裂解发生时,PAM 位点必须出现在原间隔元件的上游 PAM= 前间区序列邻近基序 ;V = A,C 或 G 碱基 IDT Alt-R CRISPR-Cpf1 系统产品的优点 Cpf1 酶的 PAM 位点包括 TTTA,TTTC 和 TTTG 来源于化脓性链球菌 ( S. pyogenes ) 的 Cas9 核酸酶, 可以在多数序列为 NGG 的 PAM 位点将 DNA 裂解到一定程度 与 Cas9 酶不同,A.s. Cpf1 核酸酶针对 Cpf1 的 PAM 序列的裂解效率略低 IDT 的科学家团队发现,PAM 序列为 TTTA,TTTC 和 TTTG 的 crrna, 与 PAM 序列为 TTTT 的 crrna 更有效率 我们建议使用阳性对照 crrna 建立实验体系, 确保你使用的细胞可以通过进行 Cpf1 核酸酶编辑 此外, 我们建议针对目标基因 ( 含有 TTTA, TTTC 和 TTTG 的 PAM 序列 ) 测试 3 个或 3 个以上的 crrna 图 3 使用 TTTA,TTTC 和 TTTG 作为 PAM 位点, 获得最大的 CRISPR-Cpf1 基因组编辑效率如 Alt-R CRISPR-Cpf1 用户指南 RNP electroporation, Amaxa Nucleofector system ( 请见 www.idtdna.com/crispr-cpf1) 描述的那样向 HEK-293 细胞内转染核糖核蛋白 (RNP: 由 Alt-R A.s. Cpf1 Nuclease 2 NLS 和 Alt-R CRISPR-Cpf1 crrna 构成 ) 根据 6 个基因上的 TTTN 位点设计 232 个 Alt-R CRISPR-Cpf1 crrna, 在 48 小时后使用 Alt-R Genome Editing Detection Kit( 包含 T7EI 内切酶检测所需的主要成分 ) CRISPR-Cpf1 相关产品介绍页, 未经许可不得擅自使用 3 / 5
测定编辑效率 PAM= 前间区序列邻近基序 (Cpf1 系统的 PAM 序列是 TTTV, V = A, C, 或 G 碱基 ); N = 任意碱基 CRISPR-Cpf1 系统高效进行基因组编辑需要电穿孔增强剂的参与我们发现部分 Cpf1 PAM 序列不是基因组编辑的活性位点 我们推荐您在感兴趣的区域检测 3 个或更多的 PAM 位点, 同时使用 Alt-R Cpf1 Electroporation Enhancer, 获得有效的基因组编辑结果 电穿孔增强剂是非靶向的载体 DNA, 经过二代测序验证, 没有整合到靶位点 优化的 Cpf1 crrna 改进了基因编辑的效果 crrna 长度的系统变异导致了 Alt-R CRISPR-Cpf1 crrna 的开发, 改进了在哺乳动物细胞中基因编辑的效果 总的来说,crRNA 的 21 个碱基的前间区序列在所有靶位点均提供了最高的编辑效率 ( 图 4) 当前间区序列的碱基数少于 20 个时,On-target 活性会显著的下降 图 4 21mer 的 crrna 提供了优化的 on-target 基因组编辑效率不同长度针对 HPRT 的 crrna 使用 Lipofectamine RNAiMAX reagent (Thermo Fisher) 反向转染到 HEK-293 Cpf1 细胞系中, 这个细胞系稳定表达 Acidaminococcus sp.cpf1 酶 分离基因组 DNA, 使用 Alt-R Genome Editing Detection Kit (T7EI assay) 和 Fragment Analyzer (Advanced Analytical) 测定基因组编辑效率 IDT Alt-R CRISPR-Cpf1 系统相关产品我们建议使用含有 2NLS 的 Alt-R A.s. Cpf1 核酸酶与 Alt-R CRISPR-Cpf1 crrna 结合, 生成核糖核蛋白 (RNP) 编辑复合体 Alt-R Cpf1 电穿孔增强剂是电穿孔中最佳的传递 RNP 进入细胞的关键试剂, 建议所有使用电穿孔转染方法的实验中都使用这种试剂 参看 Alt-R CRISPR-Cpf1 系统使用指南, 指导通过电穿孔将 RNP 传递到目的细胞系 酿脓性链球菌 (S. pyogenes )Cas9, 是最具潜力的切割 NGG PAM 位点的核酸酶, 而一些使用 A.s. Cpf1 核酸酶测试中显示 TTTV 位点没有被裂解 我们建议使用阳性对照 crrna( 见下面建议的序列 ), 以确认您的细胞可以被 Cpf1 编辑 此外, 我们建议针对每个靶基因测试 3 个或更多的 crrna CRISPR-Cpf1 crrna: 客户设定的 crrna 将与 PAM 序列 (TTTV 位点 ) 相对的 DNA 链上的 21 24 个碱基结合 规格为 2nmle 和 10nmol 两种 包装在平板 (96 孔或 384 孔 ) 上的 crrna 需 24 个起订 CRISPR-Cpf1 相关产品介绍页, 未经许可不得擅自使用 4 / 5
Cpf1 Electroporation Enhancer: 通过电穿孔有效传递 Cpf1 核糖核蛋白 (RNP) 进入细胞所需的纯化的载体 DNA, 专为避免人类 老鼠和老鼠基因组的同源性而进行了设计 规格为 2nmle 和 10nmol 两种 Cpf1 Nuclease: 重组的 sp. BV3L6 Cpf1 核酸酶, 是从进行过密码子优化的表达 Cpf1 的 E.coli 菌株中提取的 包括 1 个 N- 末端核定位序列 (NLS), 3 个 N- 末端 FLAG tag,1 个 C- 末端 NLS, 和 1 个 C- 末端 6-His tag 规格为 100μg 和 500μg 两种 (100μg Cpf1 核酸酶 = 633 pmol) Controls: Positive control crrnas: 阳性对照 crrnas 可以用来表明在你的实验中发生了 Cpf1 编辑, 这可能对你优化 RNP 转运条件或决你实验中遇到的问题十分有用 IDT 的科学家设计和测试了针对 HPRT 基因的阳性对照 crrnas Human HPRT1, Cpf1 Positive Control crrna: GGTTAAAGATGGTTAAATGAT Mouse Hprt, Cpf1 Positive Control crrna: GGATGTTAAGAGTCCCTATCT Rat Hprt1, Cpf1 Positive Control crrna: ACCGCCCCCCCCATACCCCAA Negative controls: 阴性对照 crrnas 是表明转染的 RNP 复合物对可观察的表征不起作用 转染这些阴性对照样品后, 用实验的引物和循环条件进行扩增, 使用基因组编辑检测试剂盒产品 ( 即 T7EI 酶法 ) 检测扩增产物, 结果应该只有到全长产物 注意, 这个结果不能排除实验中脱靶的作用 IDT 的科学家设计和测试了阴性对照 crrnas, 确认其在人类 小鼠和大鼠的基因组中不会针对任何目标 Cpf1 Negative Control crrna #1: CGTTAATCGCGTATAATACGG Cpf1 Negative Control crrna #2: CATATTGCGCGTATAGTCGCG Cpf1 Negative Control crrna #3: GGCGCGTATAGTCGCGCGTAT CRISPR control PCR primers (HPRT): 这些 PCR 混合引物, 可以与 Alt-R Genome Editing Detection Kit 一起用来检测编辑是否发生或评估转染阳性对照 crrnas Cpf1 的样本中编辑效率 针对 HPRT 基因的正向和反向引物包装在一个管中, 方便使用 Alt-R HPRT PCR Primer Mix, Human, 2 nmol Alt-R HPRT PCR Primer Mix, Mouse, 2 nmol Alt-R HPRT PCR Primer Mix, Rat, 2 nmol 北京 : 北京市海淀区马连洼北路亿城国际中心 407 室 (100094) 电话 :010-8289 9503, 8289 9283 传真 :010-8289 0976 邮箱 :info@bio-med.com.cn 上海办事处 : 上海市徐汇区漕溪北路 18 号上实大厦 13E1(200032) 电话 :021-6441 0562 传真 :021-6469 3820 CRISPR-Cpf1 相关产品介绍页, 未经许可不得擅自使用 5 / 5