浙江理工大学学报 ( 自然科学版 ), 第 39 卷, 第 3 期,2018 年 5 月 JournalofZhejiangSciGTechUniversity (NaturalSciences) Vol.39,No.3,May2018 DOI:10.3969/j.issn.1673G3851(n).2018.03.015 维生素 C 对内皮细胞和平滑肌细胞增殖的影响 郝亚, 白雪, 阮世超, 庄青叶, 陈岑 ( 浙江理工大学生命科学学院, 杭州 310018) 摘 要 : 药物洗脱支架 (DrugGelutingstent,DES) 释放抗增殖的药物来抑制平滑肌细胞 (Smooth musclecels, SMCs) 增殖, 阻止内膜增生. 但这些药物不可避免地会延迟内皮化, 因此有必要寻找合适的药物选择性的抑制 SMC 增殖, 同时促进内皮细胞 (Endothelialcels,ECs) 增殖. 维生素 C(LGascorbicacid,LGAA) 是一种用于口服或是直接加入细胞培养的药物, 因此实验中在培养过夜的 EC 和 SMC 细胞中加入浓度为 300μg/mL 的 LGAA 浓度为 100μg/mL 的雷帕霉素 (Sirolimus,SIR) 高糖培养基 (Dulbecco smodifiedeaglemedium,dmem) 杜氏磷酸缓冲液 (Dulbecco s phosphatebuferedsaline,dpbs) 和乙醇各 100μL, 培养 7d 观察, 结果表明 :SIR 能够抑制 EC 增殖, 而 LGAA 能够显著促进 EC 的增殖, 同时也能够抑制 SMC 的生长 ; 在培养过夜的 EC 和 SMC 细胞中加入 100μL 不同浓度的 LGAA(1 100 300 500μg/mL 和 1000μg/mL), 培养 7d 后,1 100μg/mL 和 300μg/mL 的 LGAA 有利于 EC 增殖, 而 500μg/mL 和 1000μg/mL 的 LGAA 会抑制 EC 增殖, 并且 300μg/mL 和 500μg/mL 的 LGAA 可以显著抑制 SMC 增殖. 由此表明维生素 C 可以成为潜在的用于药物洗脱支架的药物. 关键词 : 药物洗脱支架 ; 内皮细胞 ; 平滑肌细胞 ; 维生素 C; 雷帕霉素中图分类号 :Q28 文献标志码 :A 文章编号 :1673G3851 (2018)05G0352G05 0 引言每年有数百万患者植入心血管支架, 但心血管支架的主要问题之一是人造材料与血液接触有形成血栓或血块的趋势, 血栓阻碍血液流向心脏或其他重要器官, 可能具有致命的后果, 因此, 心血管支架 [1G2] 的内皮化对预防血栓的形成至关重要. 正常和健康的内皮细胞 (Endothelialcels,ECs) 通过释放前列环素和一氧化氮来防止血栓形成, 前列环素和一氧化氮可以阻止血栓形成的关键步骤是抑制血小板粘附 聚集和活化, 并且内皮细胞表面含有血栓调节蛋白, 该蛋白在为这些细胞提供抗凝血过程中起 [3G4] 着至关重要的作用. 尽管过去已经研发多种材料来改善血管支架的血液相容性, 但是内皮化仍然被认为是长期避免血栓形成的最佳方法. 目前可用的药物洗脱支架 (DrugGelutingstent, DES) 通过释放抗增殖药物如雷帕霉素 (Sirolimus, SIR) 和紫杉醇 (Paclitaxel,PAT) 来治疗内膜增生 [5]. 内膜增生是在植入支架期间发生动脉损伤的 伤口愈合反应, 内膜增生发生的主要原因是平滑肌 细胞 (Smoothmusclecels,SMCs) 的生长和迁移导 致管腔内的细胞外基质沉积阻塞动脉 [6G7]. 支架释 放的抗增殖药物能够抑制 SMC 的生长来控制内膜 增生, 但这些药物同时也会抑制 EC 生长 [8]. 药物 洗脱支架的受损或延迟内皮化被认为是晚期支架血 栓形成的主要原因, 严重的并发症可能导致心脏病 发作或死亡 [9G10].PAT 血管支架表现出显著的延 迟内皮化, 这可能会导致晚期血栓的形成 [11]. 因 此, 有必要寻找一种既能抑制 SMC 生长又能促进 EC 生长的药物. 维生素 C(LGascorbicacid,LGAA) 是一种用于口服给药或者直接添加到细胞培养中的 药物, 相关研究发现 LGAA 在调节炎症反应中发挥 作用, 同时也对 EC 有一定的保护作用 [12G14]. 本文研究的长期目标是从 DES 释放 LGAA 来改 收稿日期 :2017-9-30 网络出版日期 :2017-12-29 基金项目 : 国家自然科学基金项目 (51502265); 浙江省自然科学基金项目 (LQ16E020006) 作者简介 : 郝 亚 (1993-), 女, 甘肃酒泉人, 硕士研究生, 主要从事生物材料方面的研究. 通信作者 : 陈 岑,EGmail:chencen313@gmail.com
第 3 期郝亚等 : 维生素 C 对内皮细胞和平滑肌细胞增殖的影响 353 善支架的内皮化, 防止晚期血栓形成以及抑制 SMC 生长, 从而防止新生内膜增生. 作为实现这一研究目 标的第一步, 本文进行四组体外细胞培养实验, 以验 证与其他常用于心血管支架的药物 (SIR) 相比,LGAA 可以促进 EC 生长的同时抑制 SMC 的生长. 1 材料和方法 1.1 材料 大鼠主动脉平滑肌细胞 内皮祖细胞 ( 中国科学 院上海科学院 ), 胎牛血清和胰酶消化液 ( 美国 Gibco 公司 ), 高糖 DMEM 培养基 ( 美国 Hyclone 公司 ), MTT 维生素 C 和雷帕霉素 ( 美国 sigmagaldrich 公司 ),DMSO 和 live/dead 染液 ( 美国 ThermoFisher 公司 ). 所用试剂均为分析纯. 1.2 溶液配制 MTT(5mg/mL): 称取 500mgMTT, 溶于 100mL PBS 中, 磁力搅拌器搅拌至溶解,4 避光保存. LGAA 母液 : 称取 20 mglgaa, 溶于 1 ml 杜 氏磷酸缓冲液 (Dulbecco s phosphate bufered saline,dpbs) 中,4 避光保存. SIR 母液 : 称取 20 mgsir, 溶于 1 ml 无水乙醇中,4 保存. 1.3 LGAA 和 SIR 对两种细胞增殖作用的研究将 LGAA 母液用高糖培养基 (Dulbecco smodified eaglemedium,dmem) 稀释至 300μg/mL,SIR 母液用 DMEM 培养基稀释至 100μg/mL. 取对数生 长期的 EC 和 SMC 细胞均以 1.5 10 4 个 /ml 的浓 度 100μL 接种于 96 孔板中,37 二氧化碳培养箱 培养过夜, 分别加入 100μL LGAA SIR DMEM 0.5% DPBS 和 0.5% 乙醇溶液.1 3 5d 和 7d( 每隔 1d 换一次液 ) 观察细胞生长形态, 再加入 10μL MTT 溶液, 放置细胞培养箱培养 4h 后, 吸净孔板中的细胞培养基, 每孔加入 150μLDMSO, 放在摇床 上 10min, 转速为 120r/min. 用酶标仪在 490nm 处 测量吸光值. 计算细胞存活率, 利用 Sigmaplot 软 件进行统计学分析. 1.4 不同的 LGAA 浓度对两种细胞增殖作用的研究 将 LGAA 母液用 DMEM 培养基稀释至 1 100 300 500μg/mL 和 1000μg/mL. 取 100μL 对数生长期 浓度为 1.5 10 4 个 /ml 的 EC 和 SMC 细胞 接种于 96 孔板中,37 二氧化碳培养箱培养过夜, 分别加入 1 100 300 500μg/mL 和 1000μg/mL 的 LGAA 溶液和 DMEM,DPBS 溶液各 100μL. 分别在 1 3 5d 和 7d( 每隔 1d 换一次液 ) 观察细胞生长 形态, 加入 10μL MTT 溶液, 再放置细胞培养箱培养 4h 后, 吸净孔板中的细胞培养基, 每孔加入 150μL DMSO, 放在摇床上 10 min, 转速为 120r/min. 用酶标仪在 490nm 处测量吸光值. 计算细胞存活 率, 利用 Sigmaplot 软件进行统计学分析. 1.5 live/dead 荧光染色观察细胞形态 1.5.1 LGAA 和 SIR 对两种细胞增殖作用的影响 将 LGAA 母液用 DMEM 培养基稀释至 300μg/mL, SIR 母液用 DMEM 培养基稀释至 100μg/mL. 取对数生长期的 EC 和 SMC 细胞以 1.5 10 4 个 /ml 的浓度 500μL 接种于 24 孔板中,37 二氧化碳培 养箱培养过夜, 分别加入 LGAA,SIR,DMEM,0.5% DPBS,0.5% 乙醇溶液. 在 1 3 5d 和 7d( 每隔 1d 换一次液 ), 加入 live/dead 荧光染料, 室温避光染色 30min, 在倒置荧光显微镜下观察, 并拍照记录. 1.5.2 不同的 LGAA 浓度对两种细胞增殖作用的影响 将 LGAA 母液用 DMEM 培养基稀释至 1 100 300 500μg/mL 和 1000μg/mL. 取对数生长期的细 胞 EC 和 SMC 均以 1.5 10 4 个 /ml 的浓度 500μL 接种于 24 孔板中,37 二氧化碳培养箱培养过夜, 分 别加入 1 100 300 500μg/mL 和 1000μg/mL 的 LGAA 溶液 DMEM 和 DPBS 溶液. 在 1 3 5d 和 7d( 每隔 1d 换一次液 ), 加入 live/dead 荧光染料, 室温避光染色 30min, 在倒置荧光显微镜下观察, 并拍照记录. 在实验 1.3 和 1.5.1 中, 将不同的药物加入 EC 和 SMC 细胞中, 由于 0.5% 乙醇 ( 溶于 SIR) 或是 0.5% DPBS( 溶于 LGAA) 都溶于培养基, 因此以上实验设有 3 个对照组, 对照组 1 为 DMEM 并且不 加药和任何溶剂 ( 乙醇溶液或是 DPBS), 对照组 2 为 0.5% DPBS 溶于 DMEM( 不加 LGAA), 对照组 3 为 0.5% 乙醇溶于 DMEM( 不加 SIR). 在实验 1.4 和 1.5.2 中, 将不同剂量的 LGAA 加入细胞 EC 和 SMC, 由于 LGAA 溶于 DPBS, 因此 以上实验设有 2 个对照组, 对照组 1 为 DMEM 并 且不加药和任何溶剂 ( 乙醇溶液或是 DPBS), 对照 组 2 为 10% DPBS 溶于 DMEM( 不加 LGAA). 2 实验结果与分析 2.1 LGAA 和 SIR 对内皮细胞增殖作用的影响 用 MTT 法检测 EC 细胞在加入不同药物处理后 的活性, 结果如图 1 所示. 在第 1d,3 个对照组和 LG AA 没有明显的差异, 而 SIR 与对照组或是 LGAA 相比, 只有较少的细胞数量. 在第 3d,LGAA 相比于第 1d 细胞有一定增殖趋势, 但与对照组相比略低 ; 而 SIR 与第 1d 相比, 细胞数量没有明显的增殖, 第 5d 和第 7d 可以看到相似的规律. 以上结果表明,LG
354 浙江理工大学学报 2018 年第 39 卷 AA 有促进 EC 增殖的能力, 而 SIR 能够抑制 EC 的增殖. 采用 live/dead 荧光染色观察细胞形态及数 量, 结果如图 2 所示, 结果表明, 与 3 个对照组和 LG AA 相比, 随着天数的增加,SIR 的细胞数量无明显的增长, 而 LGAA 细胞数量有一个稳定的增长, 但与对 照组相比略低, 这与图 1 所述的 MTT 检测结果一致. 图 1 LGAA 和 SIR 对 EC 细胞增殖作用的影响 2.2 不同的 LGAA 浓度对内皮细胞的增殖影响 EC 细胞中加入不同浓度 LGAA 的 MTT 检测结果如图 3 所示, 在第 1d,500μg/mL 的 LGAA 和 对照组与其他浓度组有明显的差异. 第 3d 时, 除了 500μg/mL 和 1000μg/mL, 对照组和其他浓度组都有明显的增长, 第 5d 有相似的增长趋势. 在第 7d, 1 100 300μg/mL 的 LGAA 与其他浓度组及对照组相比, 达到最高的细胞增殖量,1000μg/mL 的 LGAA 细胞 增殖量最少. 以上结果表明,1 100 300μg/mL 的 LG AA 有利于 EC 增殖, 而 500μg/mL 和 1000μg/mL 的 LGAA 会抑制 EC 细胞增殖.live/dead 荧光染色的结果如图 4, 与两个对照组相比, 随着天数的增加,1 100μg/mL 和 300μg/mL 的 LGAA 处理 EC 细胞保持较高的增殖水平, 而 500μg/mL 和 1000μg/mL 的 LGAA 的细胞增殖量不高, 这与所述的 MTT 结果一致. 图 2 LGAA 和 SIR 对 EC 细胞增殖作用的 live/dead 荧光染色 图 3 不同浓度的 LGAA 对 EC 细胞增殖作用的影响 图 4 不同浓度的 LGAA 对 EC 细胞增殖作用的 live/dead 荧光染色 2.3 LGAA 和 SIR 对平滑肌细胞增殖作用的影响用 MTT 法检测 SMC 细胞在加入不同药物之后的活性的结果如图 5 所示. 在第 1d,LGAA 和 SIR 处理细胞数目明显低于对照组 ; 第 3d, 加入 LGAA 和 SIR 后 SMC 细胞有微量的增长, 与对照组相比较仍 旧很低, 同时 LGAA 和 SIR 之间没有明显的差异. 第 5d 和第 7d 有相似的趋势. 因此 LGAA 可以显著的抑制 SMC 的增殖, 尽管抑制效果稍低于 SIR.live/ dead 荧光染色的结果如图 6, 与 3 个对照组相比, 随着天数的增加,SIR 和 LGAA 组的细胞数量极少, 并
第 3 期郝亚等 : 维生素 C 对内皮细胞和平滑肌细胞增殖的影响 355 且没有明显的增长, 这与所述 MTT 结果一致. 如图 7 所示. 第 1d, 与对照组相比较而言,300μg/mL 和 500μg/mL 的 LGAA 显示较低的增殖量,1μg/mL 和 100μg/mL 与对照组相比无明显差异. 第 3d, 300μg/mL 和 500μg/mL 的 LGAA 和对照组相比依旧显示较低水平的增殖量, 而 1000μg/mL 的 LG AA 与第 1d 相比增殖量显著下降. 第 5d 和第 7d 有显示相似的规律. 同时, 笔者采用 live/dead 荧光 染色观察细胞形态及数量, 结果如图 8 所示, 结果表 明, 与 2 个对照组相比,1 100μg/mL 和 1000μg/mL 的 LGAA 随着天数的增加细胞数量也在不断增加, 而 300μg/mL 和 500μg/mL 的 LGAA 细胞增殖量较 图 5 LGAA 和 SIR 对 SMC 细胞增殖作用的影响 低. 这与上述的 MTT 检测结果一致,300μg/mL 和 500μg/mL 的 LGAA 与其他浓度组及对照组相比能够显著抑制 SMC 增殖. 图 6 LGAA 和 SIR 对 SMC 细胞增殖作用的 live/dead 荧光染色 2.4 不同浓度 LGAA 对平滑肌细胞增殖作用的影响 SMC 细胞中加入不同浓度 LGAA 的 MTT 结果 图 7 不同浓度的 LGAA 对 SMC 细胞增殖作用的影响 图 8 不同浓度的 LGAA 对 SMC 细胞增殖作用的 live/dead 荧光染色 3 结论 本文通过比较在相同条件下 LGAA 和 SIR 对 EC 和 SMC 的影响, 发现 SIR 能够抑制 EC 增殖, 而 LGAA 可以促进 EC 增殖的同时抑制 SMC 增殖. 不同浓度 LGAA 对 EC 和 SMC 的研究表明 1 100 300μg/mL 的 LGAA 有利于 EC 增殖, 而 500μg/mL 和 1000μg/mL 的 LGAA 会抑制 EC 增殖 ;300μg/mL 和 500μg/mL 的 LGAA 可以显著抑制 SMC 增殖. 因此本文表明 LGAA 的作用效果优于 SIR, 可以成为潜在的应用于药物洗脱支架的药物. 参考文献 : [1]LiG,YangP,QinW,etal.Theefectofcoimmobilizing heparinandfibronectinontitaniumonhemocompatibility andendothelialization[j].biomaterials,2011,32(21):
356 浙江理工大学学报 2018 年第 39 卷 4691G4703. [2]LiJ,ZhangK,YangP,etal.Humanvascularendothelial celmorphologyandfunctionalcytokinesecretioninfluenced by diferent size of HA microgpatern on titanium substrate[j].coloidsand Surfaces B:Biointerfaces, 2013,110:199G207. [3] 刘涛.Ti 表面固定层粘连蛋白 / 肝素 /SDFG1α 以构建抗 凝及诱导内皮再生微环境的研究 [D]. 成都 : 西南交通大 学,2014. [4 ] Morser J. Thrombomodulin links coagulation to inflammationandimmunity[j].currentdrug Targets, 2012,13(3):421G431. [5]CaiY,Nagel D J,Zhou Q,etal.Role ofcampg phosphodiesterase 1C signaling in regulating growth factorreceptorstability,vascularsmooth musclecel growth, migration, and neointimal hyperplasia[j]. CirculationResearch,2015,116:1120G1132. [6]ThiruppathiE,ManiG.VitaminGCdeliveryfrom CoCr aloy surfaces using polymergfree and polymergbased platforms for cardiovascular stent applications[j]. Langmuir,2014,30(21):6237G6249. [7]ChenC,YaoC,YangJ,etal.Biomimeticapatiteformed oncobaltgchromiumaloy:apolymergfreecarierfordrug elutingstent[j].coloidsand Surfaces B:Biointerfaces, 2017,151:156G164. [8]Hu T,YangJ,CuiK,etal.ControledslowGrelease druggeluting stents for the prevention of coronary restenosis:recent progress and future prospects[j]. ACS Applied Materials & Interfaces,2015,7 (22): 11695G11712. [9]LiangC,HuY,WangH,etal.Biomimeticcardiovascular stentsforinvivoregendothelialization[j].biomaterials, 2016,103:170G182. [10]LeeJ M,Choe W S,Kim B K,etal.Comparisonof endothelializationandneointimalformationwithstents coated with antibodies against CD34 and vascular endothelialgcadherin[j].biomaterials,2012,33(35): 8917G8927. [11]YangZ,Tu Q,WangJ,etal.Theroleofheparin bindingsurfacesin the direction ofendothelialand smooth musclecelfateandregendothelialization[j]. Biomaterials,2012,33(28):6615G6625. [12]FarbsteinD,KozakGBlicksteinA,LevyAP.Antioxidant vitaminsand their usein preventing cardiovascular disease[j].molecules,2010,15(11):8098g8110. [13]MagginiS,MaldonadoP,Cardim P,etal.Vitamins C,D andzinc:synergisticrolesinimmunefunction andinfections[j].vitamins Minerals,2017,6(167): 2376G1318. [14]AshorA W,SiervoM,LaraJ,etal.Efectofvitamin CandvitaminEsupplementationonendothelialfunction:a systematic review and metaganalysis of randomised controledtrials[j].britishjournalofnutrition,2015, 113(8):1182G1194. EfectsofvitaminConproliferationofendothelial celsandsmoothmusclecels HAOYa,BAIXue,RUANShichao,ZHUANGQingye,CHENCen (ColegeofLifeScience,ZhejiangSciGTechUniversity,Hangzhou310018,China) Abstract:DrugGelutingstents (DES)releaseantiGproliferationdrugstoinhibittheproliferationof smoothmusclecels (SMCs)and preventintimalhyperplasia.however,thesedrugsinevitably delay endothelialization.therefore,itis necessarytofindthesuitable drugs which selectivelyinhibitthe proliferationofsmcandpromotetheproliferationofendothelialcels(ecs).vitaminc (LGascorbicacid [LGAA])isakindofdrugfororaladministrationordirectlyaddedintocelculture.Therefore,inthis experiment,ecandsmccelsculturedovernightwereaddedto100μl LGAA(300μg/mL),100μL Sirolimus(SIR)(100μg/mL),100μLdulbecco s modifiedeagle medium (DMEM),100μLdulbecco s phosphatebuferedsaline (DPBS)and100μLethanolculturedfor7days.ItwasfoundthatSIRcould inhibittheproliferationofec,whilelgaacouldsignificantlypromotetheproliferationofecandalso inhibitthegrowthofsmc.afteraddingdiferentconcentrationsof100μloflgaa(1,100,300,500μg/ml and1000μg/ml)inovernightculturedecandsmccelsfor7days.thelgaadosagestudydemonstrated thatlgaa withtheconcentrationsof1μg/ml,100μg/mland300μg/mlcouldencourageecproliferation, whilelgaa withtheconcentrationsof500μg/mland1000μg/mlcouldinhibitecproliferation.atthe sametime,lgaa withtheconcentrationsof300 μg/mland500 μg/mlcouldsignificantlyinhibitsmc proliferation.thus,thisstudy demonstratesthatvitamin C can beapotentialdrugfordruggeluting stents. Keywords:drugGelutingstents;endothelialcels;smoothmusclecels;vitaminC;sirolimus ( 责任编辑 : 唐志荣 )