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1 投稿類別 : 健康與護理類 篇名 : 以內皮細胞 EA.hy926 血管新生模式篩選具影響的中草藥 作者 : 薛恩慈 麗山高中 高二 4 班鄭詠云 麗山高中 高二 4 班陳亭伊 麗山高中 高二 3 班 指導老師 : 張素卿老師

2 壹 前言 一 動機 在台灣癌症已經連續第 31 年蟬聯十大死因之首, 雖然癌症並非沒有解決方法但副作用極 高, 中草藥比起一般現有的癌症治療藥劑而言相對的副作用較少, 然而民間傳說可以抗癌的中 草藥卻沒有一個明確科學研究去確認它的效果, 因此我們便對中草藥的效用產生了極大興趣 癌症常伴隨腫瘤而生, 而腫瘤生長需要血管新生以提供養分, 若沒有血管新生, 腫瘤大小會被限制在 2~3mm, 維持在休眠狀態 ( 吳宜鴻,2011 林忠義,2001), 所以我們想探討中草藥與血管新生的關係 發炎因子也被指出可以促進血管新生作用 ( 趙葳,2011), 故我們選擇傳說具有抗發炎和抗癌效果的藥材進行研究 由於中草藥成分過於複雜而難以掌握它的效果, 為了減少實驗上的變因, 我們使用科學中藥, 分別為白花蛇舌草 苦參 黃連解毒湯 紫蘇葉和山豆根 ( 路淑怡,2008) 在培養常用於血管新生研究中的內皮細胞 ( 由衛生福利部國家中醫藥研究所提供 ), 細胞繼代至一定的數量後, 以 Mrtrigel tube formation model 評估五種中草藥在不同濃度下, 對內皮細胞分裂及構成網狀構造能力的影響 二 研究目的 ( 一 ) 不同濃度的中草藥對內皮細胞 EA.hy926 生長形態的改變 ( 二 ) 分析內皮細胞在不同濃度的中草藥影響下, 血管總面積 總長度 分支點和分支數目 ( 三 ) 評估五種中草藥對內皮細胞的影響 1

3 貳 正文 一 研究過程與方法 圖一 實驗流程圖 ( 一 ) 中草藥及配製 1. 白花蛇舌草 Hedyotis diffusa ( 本報告簡稱 :HD) 能治咽喉腫痛 腸炎 癌腫等症狀, 在肝細胞中具有抗氧化作用 ( 林孟儀,2011) 2. 苦參 Sophora flavescens ( 本報告簡稱 :SF) 功用清熱燥濕 利尿和抗菌, 又能治療瘡腫, 且具有抗腫瘤作用 ( 蔡青芩,2007) 3. 黃連解毒湯 Huanglienjiedu decoction ( 本報告簡稱 :HL) 成分為黃連 黃岑 黃柏 山梔子, 能治療肝炎 腎炎 乳腺炎 肺炎等症, 與抗發炎能力和降低白血球在發炎組織浸潤有關 ( 吳宜鴻, 2011) 4. 紫蘇葉 Perilla frutescens ( 本報告簡稱 :PF) 具有抑制大腸癌及肺癌細胞生長的作用 (Kwak Y, Ju J.,2015), 也有良好的對抗發炎因子釋放的效果 (Urushima H1, Nishimura J, Mizushima T, Hayashi N, Maeda K,2015) 5. 山豆根 Vietnamese sophora ( 本報告簡稱 :VS) 具有抗癌, 及防止潰傷等功用 ( 陳政廷,1988) 2

4 每 ml 蒸餾水加入 10 mg 藥粉 ( 震盪 過濾 ), 以 RPMI 為溶劑, 序列稀釋 (serial dilution) 配成濃度為 µg/ml 的溶液 圖二 中藥配置 ( 二 )Matrigel 製備 & 加藥將 Matrigel 平坦地均勻分布在每一孔中, 等待 30 分鐘讓其凝固後便可加入配好的細胞液, 讓每一孔皆有相同的細胞數 ( ), 最後再依照順序加入濃度 µg/ml 的白花蛇舌草 苦參 黃連解毒湯 紫蘇葉 山豆根溶液各 100µl, 並在控制組的孔各加入 100µl RPMI 提供細胞適當的生長環境 ( 三 ) 拍照和分析 : 1 拍照 : 細胞培養 24 小時後, 用五倍的物鏡觀察並開啟軟體 Tsview 在電腦上觀看及 時影像再用攝影設備拍攝一孔中之細胞生長情形 2 分析: 以 Angiogenesis Image Analyzer Ver.2 軟體分析, 分析完後將數值 (AREA 內皮細胞總面積 LENGTH 內皮細胞總長度 PATH 分支數和 JOINT 分支點 ) 做成表格, 再藉由表格繪製趨勢圖, 由趨勢圖之函數公式, 算出藥品可以抑制 50% 之 AREA 時之濃度, 即為 IC50 最後再利用 Excel 進行 T TEST 檢測 3

5 二 效果評估 苦參在低濃度時從生長形態來看, 在管狀的形成 內皮細胞的分布面積 長度 分支數 分支點皆可發現其不完整 ( 圖三 ), 因此我們認為苦參有較為顯著的效果 而紫蘇葉的 AREA LENGTH JOINT PATH 雖然相較於苦參略高 ( 圖四 ), 但還是有類似的抑制效果 故從苦參的 IC50 可推論出在低濃度時較具有抑制血管新生之能力 ( 表一 ) 白花蛇舌草 黃連解毒湯及山豆根由四個參數算出的 IC50 差值大 ( 表一 ), 但還是有 呈現相同的趨勢 AREA 與 LENGTH 可以代表內皮細胞的分裂數目,JOINT 與 PATH 和 管狀形態有關, 那目前研究的這些差異真正的原因有待進一步研究才可釐清 以成人 ( 體重 65 公斤, 血液佔體重的 1/13, 即 5 公斤 ) 來算, 並用 AREA 的 IC50 來計算, 假設所有藥物分子均勻分布於循環系統中, 白花蛇舌草的 IC50 相當於在循環系統中需存在約 公克 苦參約是 公克 黃連解毒湯則約為 公克 紫蘇葉約為 公克 山豆根需要約 公克的量便能達到抑制百分之五十內皮細胞生長的效果 考量到藥物的生體利用率以及肝臟細胞混和氧化酶系統作用之影響, 上述五種藥皆具有非常好的效果 的區位 因此在未來, 我們期待可以釐清參與其作用之相關訊息傳導路徑與其實質上影響 圖三 EA.hy926 細胞培養 24 小時之生長型態 4

6 圖四 AREA LENGTH JOINT PATH 的長條圖 在與控制組比較後, 可看出每種 藥品在低濃度時數值具有較顯著的抑制效果 圖五 HD 相對於控制組的百分比趨勢圖 圖六 SF 相對於控制組的百分比趨勢圖 5

7 圖七 HL 相對於控制組的百分比趨勢圖 圖八 PF 相對於控制組的百分比趨勢圖 圖九 VS 相對於控制組的百分比趨勢圖 表一 IC50 之比較 苦參的各數值與控制組對比後百分比達 50 時, 其 IC50 數值較小, 較具有抑制效果 6

8 三 血管新生之於癌症 以內皮細胞 EA.hy926 血管新生模式篩選具影響的中草藥 以抗血管新生 (anti- angiogenesis) 為治療手法有些好處, 因為血管新生通常是很少發生的, 因此其副作用會比一般治療少很多 ; 用藥目標為正常細胞的內皮細胞, 其變異性較腫瘤細胞低, 抗藥性的產生也會較少 ; 微血管的內皮細胞提供的養分足以供給數以萬計的腫瘤細胞, 因此一旦阻斷了血管新生, 便可抑制這些腫瘤細胞 雖然已使副作用大幅降低, 但它還是有選擇性低的問題, 有些生理上的血管新生作用仍會受到抑制, 如女性的月經週期 懷孕 分娩及傷口癒合的情況皆會受到嚴重影響, 所以抗血管增生治療須有靶位定向的作用, 將目標鎖定在受腫瘤誘導之血管內皮細胞, 而這也是以後研究的方向 ( 施富元,2003) 若能確定哪些中草藥確實能對內皮組織細胞 EA.hy926 在血管新生上產生實質上的影響, 那麼篩選出的這些中草藥便有可能會對癌細胞的增生造成抑制的效果 那我們篩選出的中草藥對腫瘤的影響可分為三類 : 抑制生長 促進生長及不會產生影響 血管新生不僅能在癌症治療上有所應用, 促進血管新生或抑制血管新生在未來的研究方向上都具有潛力 以促進血管新生為例說明, 當血管新生的速率增加時, 對腫瘤與癌症而言, 就能從周圍較大的血管誘導其開始分枝 長出新的小血管, 並連接到腫瘤部位以達到所需的血液供應, 使腫瘤與癌細胞快速增生 對老人退化性黃斑病變也有極大的影響, 因老化而使得血液供給漸漸供給不足之際, 黃斑區的細胞將不斷地進行血管新生, 大量的血管將充斥堆積在黃斑區, 使得視力對焦開始失敗而導致視力模糊 之後, 由於大量血管生長穿透眼球最內層的玻璃膜, 嚴重時將導致眼睛失明 對糖尿病所造成的軟組織膿傷 缺血性壞死骨髓炎 壞死性筋膜炎導致的截肢, 可能以促進血管新生的方式使壞死部分的血管再次新生血管, 並修復, 就可能以血管新生的方式促進傷部血管修復以避免截肢的命運 由此可見, 血管新生不管是抑制或是促進皆有其好處 ( 林忠義,2001) 因此我們在這方面便能進行深入的探討以及研究, 在未來可以把這些中藥材用於癌細胞株的藥物測試中, 去探討中藥材在動物實驗中是否可以抑制癌細胞於體內的擴散, 在臨床研究上可以人類癌細胞株進行測試, 如此將會對醫學研究會有更進一步的貢獻 本研究以初步篩選中草藥對血管新生有影響者 如果發現確實影響則可供往後研究者繼續其藥理的探究 7

9 參 結論從生長型態與長條圖中可以看出, 五種中草藥大致都在濃度為 0.001µg/ml 時, 抑制 EA.hy926 效果最佳 而從 IC50 的數值比較上來看, 苦參以 AREA 為參數的 IC50 約為 µg/ml, 此為五種中草藥中最具效果的, 白花蛇舌草 黃連解毒湯 紫蘇葉 山豆根雖然在 IC50 的數值上不如苦參的低, 但在與控制組對比後, 仍有達顯著差異, 因此五種中草藥皆有抑制內皮細胞的效果 不只是中草藥有減少副作用的效果, 以血管新生為治療手段也有較少的副作用, 因其不常發生於成熟個體, 因此較不會影響正常細胞的生存, 並且內皮細胞比起癌細胞較不會發生變異, 抗血管新生的治療也較不易失效 血管新生也不只應用在治療腫瘤上, 疾病如老年性黃斑部病變 ( 血管不正常新生爆裂後的疤痕導致失明 ) 糖尿病導致的截肢 ( 因血管無法新生造成 ) ( 林忠義,2001) 等等, 都具有發展潛力 在為來的研究, 因中草藥含多種成分, 如能進一步鑑定其對血管新生影響的有效成分, 將可得到最佳利用 8

10 肆 引註資料 1. 方剛 (2007), 人類癌症基因體以驗證探討抗癌中草藥子計畫四 中草藥調節血管新生基因 癌細胞轉移 侵潤基因對抗肝癌機制探討 中醫藥年報第一期第四冊 2. 吳宜鴻 (2011), 黃連解毒湯及黃連素的抗發炎機轉 : 抑制脂多糖引起血管內皮細胞在活體及細胞實驗中與白血球結合能力及血管細胞黏附分子的表現 長庚大學臨床醫學研究所博士論文 3. 林孟儀 (2011), 白花蛇舌草對乙醯胺酚誘發小鼠肝損傷之抗氧化及護肝作用 輔仁大學營養科學系碩士論文 4. 林忠義 (2001), 肝細胞蛋白活化酵素 C 與血管內皮生長因子基因表現的關聯性及臨床意義 中國醫藥學院醫學研究所碩士論文 5. 施富元 (2003), 探討四種血管內皮新生因子亞型在非小細胞肺癌血管新生的角色 國立中興大學分子生物學研究所碩士論文 6. 陳志明博士分子醫學研究團隊 (2013), 何謂血管新生 ( 血管生成 ) 陳志明博士分子醫學研究室文章 7. 陳政廷 (1988), 山豆根的成分研究 國立成功大學化學研究所碩士論文 8. 路淑怡 (2008), 以肝癌細胞為模式篩選具有調節血管新生相關因子的中草藥 國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文 9. 趙葳 (2011),Inotilone 在體內和體外抗癌細胞轉移的效果及機制探討 中國醫藥大學藥學院中國藥學暨中藥資源學系碩士論文 10. 蔡青芩 (2007), 苦參對藥物代謝酶之誘導及其與茶鹼之藥物交互作用 國立台東大學生命科學所碩士論文 11. Chih-Yu Chen(2008), Hepatoprotective Effect of Herbal Comples on Liver Damage Induced by Carbon Tetrachloride in Rats & Effects of the Ethanolic Extract of the Fermentation Product of Agaricus blazei on Hepatocellular Carcinoma (Hep3B Cells)-implanted in Nude Mice. Graduate Institude of Food Science and Technology College of Bio-Resources and Agriculture Nationla Taiwan University Master Thesis. 9

11 12. KIMIO TAKEUCHI, MITSURU NAKAZAWA, AND YUICHI EBINA(2011),Effects of Trehalose on VEGF-Stimulated Angiogenesis and Myofibroblast Proliferation:Implications for Glaucoma Filtration Surgery.The department of Ophthalmology,Hirosaki University Graduate School of Medicine,Aomori,Japan. 13. Kwak Y, Ju J. (2015)Inhibitory activities of Perilla frutescens britton leaf extract against the growth, migration, and adhesion of human cancer cells. Nutr Res Pract. 14. MARTIN J, SIEMERINK, INGEBORG KLAASSEN, et al(2012),endothelial Tip Cells in Ocular Angiogenesis:Potential Target for Anti-Angiogenesis Therapy.Journal of Histochemistry&Cytochemistry 15. Urushima H1, Nishimura J, Mizushima T, Hayashi N, Maeda K, Ito T. (2015) Perilla frutescens extract ameliorates DSS-induced colitis by suppressing proinflammatory cytokines and inducing antiinflammatory cytokines. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 16. WEIWEI CAI, YUE LI, QINGQING YI, et al(2014),total saponins from Albizia julibrissin inhibit vascular endothelial growth factor-mediated angiogenesis in vitro and in vivo.molecular Medicine Reports. 10

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