肿瘤药学 6 年月第 6 卷第期 Anti-tumor Pharmacy, February 6, Vol. 6, No 达, 分析其与疾病分期化疗疗效及患者预后的关系, 为阐明 PTCL 的免疫逃逸机制提供线

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1 - - 肿瘤药学 6 年月第 6 卷第期 Anti-tumor Pharmacy, February 6, Vol. 6, No. 临床研究 - -L 蛋白在外周 T 细胞淋巴瘤中的表达及其与预后的关系吕学文徐琼陈焕伟* 王博张茜广东省农垦中心医院肿瘤化疗六区广东湛江 5 摘要目的探讨外周 T 细胞淋巴瘤 (peripheral T cell lymphoma, PTCL) 患者肿瘤组织中程序性细胞死亡受体 (programmed cell death-, -) 和程序性细胞死亡受体配体 programmed death ligand, -L) 蛋白的表达情况分析其与患者预后的关系方法采用免疫组化法检测 PTCL 患者肿瘤组织中 - -L 蛋白的表达并分析其表达与患者临床分期疗效及预后之间的关系结果 PTCL 患者肿瘤组织中 - 蛋白的表达阳性率为 5% -L 蛋白的阳性率为 % 炎性淋巴结组织中未见 - -L 表达 - -L 蛋白的表达与患者临床分期正相关 - 蛋白的表达与疗效负相关 - 与 -L 蛋白双阳性的 PTCL 患者生存期明显缩短结论 PTCL 患者淋巴瘤组织中 - 和 -L 蛋白表达阳性率高于炎性淋巴结组织是预后不良的指标关键词外周 T 细胞淋巴瘤 PTCL 程序性细胞死亡受体 - 程序性细胞死亡受体配体预后中图分类号 R. 文献标识码 A 文章编号 doi.969/j.issn The - and -L Protein Expression in Peripheral T cell Lymphoma and Their Correlation with Prognosis LV Xuewen, XU Qiong, CHEN Huanwei*, WANG Bo, ZHANG Qian (Central Hospital of Guangdong Provincial Agricultural Reclamation, Zhanjiang, Guangdong, 5, China) Abstract: Objective To investigate the protein expression of programmed cell death- (-) and programmed death ligand (-L) in the tissues of peripheral T-cell lymphoma (PTCL), and to analyze the relationship between its expression, chemotherapeutic effect and prognosis. Methods The expressions of - and -L protein in tumor tissue of PTCL were detected by immunohistoche mistry. The correlation between the protein expressions, clinical stages and prognosis was evaluated. Results In tumor tissues of PTCL patients, the expression rate of - protein was 5%, while the expression rate of -L was %. In the normal inflammatory lymph nodes, the expression of -L and - were not found. The expressions of - and -L were positively correlated with clinical stages. The expression of - was negatively correlated with curative effect. Survival rate was significantly lower in the patients with -L and - co-expression. Conclusion The expression rates of - and -L protein in lymphoma tissues of PTCL patients were higher than in normal inflammatory lymph nodes, and they may be the potential indicators of poor prognosis. Key words: Peripheral T cell lymphoma (PTCL); -; -L; Prognosis 前言在肿瘤细胞逃逸机体免疫监控过程中发挥重要作用肿瘤通过诱导机体的免疫耐受和抑制抗肿瘤免疫细胞的活性等方式来达到免疫逃逸之目的程序性死亡受体 (programmed cell death-, -) 是免疫球蛋白家族中的负性刺激分子与配体 -L 结合后组成 -/-L 信号通路通过抑制抗原受体的信号抑制 T B 细胞的激活分化和增殖诱导特异性细胞毒性 T 淋巴细胞 cytotoxic lymphocyte, CTL 凋亡在多数血液肿瘤中如急性髓系 / 淋巴细胞白血病 B 细胞淋巴瘤结外 NK/T 细胞淋巴瘤伯基特淋巴瘤中均存在 -/-L 信号通路异常活化, 而外周 T 细胞淋巴瘤目前无有效的治疗方案 CHOP 方案常用于其一线治疗但缓解期短复发快预后不良远期生存率低疗效差的原因可能与 T 淋巴瘤细胞高表达免疫抑制分子逃避机体的杀伤有关本研究拟分析 PTCL 患者淋巴结组织中 - -L 蛋白的表基金项目广东省医学科学技术研究基金项目 B59 作者简介吕学文女博士主治医师研究方向血液肿瘤免疫学 lvxuewen@6.com * 通讯作者陈焕伟男主任医师研究方向血液肿瘤免疫学 chw9cc@6.com

programmed death ligand, -L) 蛋白的表达情况分析其与患者预后的关系方法采用免疫组化法检测 PTCL 患者肿瘤组织中 - -L 蛋白的表达并分析其表达与患者临床分期疗效及预后之间的关系结果 PTCL 患者肿瘤组织中 - 蛋白的表达阳性率为 5% -L 蛋白的阳性率为 % 炎性淋巴结组织中未见 - -L 表达 - -L 蛋白的表达与患者临床分期正相关 -

2 肿瘤药学 6 年月第 6 卷第期 Anti-tumor Pharmacy, February 6, Vol. 6, No 达, 分析其与疾病分期化疗疗效及患者预后的关系, 为阐明 PTCL 的免疫逃逸机制提供线索材料与方法. 研究对象收集广东省农垦中心医院年 5 月 ~ 年 6 月经组织形态学和免疫组化确诊的初治 PTCL 患者病理标本例, 均符合 WHO(8 年版 ) 淋巴造血组织肿瘤分类中 PTCL 的诊断标准 [5], 其中男例, 女 9 例, 年龄 6~ 岁, 平均年龄为 (.9± 8.) 岁, 其中期 6 例, 期 6 例, 期 8 例取同期例正常淋巴结炎症组织为对照组, 其中男例, 女 8 例, 年龄 ~6 岁, 平均年龄为 (5.85±6.6) 岁. 试剂和仪器鼠抗人 - 单克隆抗体兔抗人 -L 单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司, 组化 MaxVision 检测试剂盒,DAB 显色试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司. 实验方法收集 PTCL 患者淋巴结的病理标本, 以 % 中性甲醛固定, 石蜡包埋, 切片采用 SP 法进行染色 [6], 步骤如下 : 石蜡切片 μm 厚,6, h 切片脱蜡至水 : 二甲苯 Ⅰ min, 二甲苯 min, 无水乙醇 Ⅰ min, 无水乙醇 min, 9% 乙醇 5 min, 8% 乙醇 5 min,% 乙醇 5 min,pbs 洗次 min 高温高压抗原修复后, 滴加按一定浓度稀释的小鼠抗人一抗 (- -L 均为即用型抗体 ), 以 PBS 代替一抗作空白对照, 常温孵育 h PBS 洗次 5 min, 滴加二抗, 室温孵育 5 min PBS 洗次 5 min DAB 显色 : 蒸馏水.5 ml, 依次滴入显色试剂盒内 A B C 试剂各滴, 充分混匀后滴加显色, 室温下避光显色 ~5 min( 显微镜下控制染色 ), 及时水化终止反应苏木素轻度复染, 自来水返蓝 5 min, 逐级脱水, 透明, 中性树胶封片. 结果判断免疫组化结果的比较均设有已知阳性对照和空白对照 (PBS 代替一抗 ), 阳性表达呈黄色或棕黄色颗粒样分布免疫组化反应阳性细胞判断 :- 阳性着色定位于胞膜,-L 定位于胞浆 -L - 蛋白的表达以细胞膜和胞质中出现明显棕黄色者为阳性, 在高倍镜下随机选择 5 个视野计数阳性细胞数, 每个视野至少计数个细胞参照肿瘤组织中 - -L 表达的计数方法, 结合染色强度和阳性细胞百分比来评定阳性病例 - -L 阳性细胞染色强度分级 : 无着色分, 淡黄色分, 棕黄色分, 棕褐色分 5 个视野阳性细胞平均百分数作为该例阳性细胞百分比, 将其分级 :< % 计分,%~5% 计分,>5% 计分两项结果相乘得 [, 分 > 分为阳性,< 分为阴性 8].5 治疗方法 PTCL 患者均采用标准 CHOP 方案化疗, 天为周期, 化疗 6~8 周期.6 疗效评价及随访根据 WHO 实体瘤疗效评价标准将治疗效果分为完全缓解 () 部分缓解 () 稳定 (SD) 进展 () [9] 6~8 周期治疗结束后进行疗效评价,+ 为有效,SD+ 为无效总生存时间指从确诊至患者死亡或者最后一次随访时间患者治疗结束后年内每个月随访次, 年后每半年随访次, 随访形式为门诊复查和电话随访相结合随访截至年月日, 随访时间为 ~ 年. 统计学分析全部数据均经 SPSS. 统计软件分析, 对计量资料采用构成比和率描述, 分析其关系采用 χ 检验不同病变中蛋白表达差异釆用 χ 检验进行评价, 非正态分布采用中位数及四分位数间距描述单因素分析应用 Kaplan-Meier 法进行生存分析, 并用 Log-rank 进行差异性检验以 P<.5 表示差异有统计学意义结果. PTCL 患者的临床资料及 - -L 蛋白表达情况 PTCL 患者的临床分期化疗疗效生存期及 - -L 蛋白表达的情况见表. PTCL 患者组织中 - 和 -L 蛋白的表达 - -L 的免疫组化结果显示,- 定位于淋巴瘤细胞的胞膜 ;-L 定位于淋巴瘤细胞的胞浆例 PTCL 患者淋巴结组织中 - 阳性率为 5%(/),-L 阳性率为 %(/), 而炎性淋巴结组织中未见 - -L 的表达, 差异有统计学意义 (P<.5), 见图. - -L 蛋白的表达与临床分期的相关性分析例 PTCL 患者中,Ⅰ / 期 6 例, / 期例分析 - -L 蛋白的表达与临床分期的相关性, 显示 - -L 的表达与分期均呈正相关, 差异有统计学意义 (P<.5), 见表. - -L 蛋白的表达与预后的相关性分

) 岁, 其中期 6 例, 期 6 例, 期 8 例取同期例正常淋巴结炎症组织为对照组, 其中男例, 女 8 例, 年龄 ~6 岁, 平均年龄为 (5.85±6.6) 岁.

3 - 6 - 肿瘤药学 6 年月第 6 卷第期 Anti-tumor Pharmacy, February 6, Vol. 6, No. 表 PTCL患者的临床资料及- -L蛋白表达结果 Tab. Clinical data and the expression of - and -L protein in PTCL patients mark stages curative effect survival months SD IV IV L 表 - -L蛋白的表达与临床分期的相关性分析 Tab. Correlation analysis of -, -L protein expression and clinical indexes stages cases Ⅰ/ 6(%) / (%) - -L positive negative χ 6 P positive negative χ P 意义 -:χ=5., P =.; -L:χ=.5, P =. 提示 - 和 -L 的表达与 PTCL 的预后呈负相关见图 peripheral T cell lymphoma HE no expression of - in lymphadenitis 图 PTCL患者中- -L的表达与预后的生存曲线 Fig. Survival curve of -, -L protein expression and prognosis in PTCL patients 例患者中 - 和 -L 双阳性者例双阴性者 6 例 - 阴性 -L 阳性者例 - 阳性 -L 阴性例其中 - 和 -L 双阳性者期例期 6 例在 -L 阳性病例中 - 阴 positive expression of - in expressin of -L in tumor cell tumor cell membran cytoplasm 图 - -L在外周T细胞淋巴瘤患者中的表达 Fig. Expression of - and -L in PTCL patients ( ) 析例 PTCL 患者的年年 5 年生存率分别为 9% % 5% - 及 -L 阳性患者的生存期均比相应阴性患者明显缩短差异有统计学性患者的生存期较 - 阳性者明显延长见图.6 - -L 蛋白的表达与疗效的相关性分析例 PTCL 患者中 5 例例 SD 例例分析 - -L 蛋白表达与疗效的相关性结果显示 - 蛋白的表达与疗效负相关 (P <.5) 而 -L 蛋白的表达与疗效无相关性 P >.5 见表

Correlation analysis of -, -L protein expression and clinical indexes stages cases Ⅰ/ 6(%) / (%) - -L positive negative χ 6 P positive negative χ P.. 5.9. 意义 -:χ=5., P =.; -L:χ=.5, P =.

4 肿瘤药学 6 年月第 6 卷第期 Anti-tumor Pharmacy, February 6, Vol. 6, No. - - 细胞的功能抑制细胞免疫和体液免疫, 诱导 CTL 凋亡使肿瘤细胞发生免疫逃逸增殖失控在肺癌卵巢癌乳腺癌直肠癌等均发现 -L 有异常表达并与预后呈负相关阻断此通路后可使 CTL 活性增强应用抗 - 抗体可阻断 - 对 T 细胞的抑制作用激活肿瘤患者体内的杀瘤效应在黑色素瘤非小细胞肺癌肾癌患者中显示了良好的抗瘤效果而 -L 的表达可作为一个潜在疗效的预测标记但还需进一步研究验证近期研究发现在白血病霍奇金淋巴瘤 NK/T 淋巴瘤患者中亦存在 -L 高表图 -L阳性患者中-的表达与预后的生存曲线 Fig. Survival curve of - protein expression and prognosis in -L positive patients 达 -L 在弥漫大 B 细胞淋巴瘤和外周 T 细胞淋巴表 - -L蛋白的表达与疗效的相关性分析泡淋巴瘤中表达较低说明 -L 的表达与淋巴瘤的 Tab. Correlation analysis on expression of -, -L proteins and therapeutic effect 侵袭性相关我们研究发现在炎症性淋巴结组织 effect cases - positive negative χ 5(5%) 5 (5%) (5%) SD (%) 8 -L P.9.5 positive negative χ P.9. 讨论肿瘤免疫治疗的重要目的之一是激活肿瘤特异性 T 细胞的杀伤潜力在肿瘤微环境中存在多种免疫抑制因子可抑制肿瘤特异性 T 细胞的激活近期研究提示肿瘤患者存在多个免疫抑制信号通路的异常活化是导致患者 T 细胞免疫功能抑制的主要原因其中表达于 T 细胞表面的 - 分子和表达与肿瘤细胞表面的 -L 均为免疫负调控因子两者结合后可抑制 T 细胞活化效应, 临床试验显示新型抗 - 或 -L 抗体可以阻断 - 和 -L 的结合而解除肿瘤对 T 细胞的抑制作用从而激活肿瘤患者体内的免疫效应细胞杀瘤效应有关外周 T 细胞淋巴瘤中 T 细胞的免疫抑制状态尚不甚清楚 T 细胞淋巴瘤肿瘤组织中 - -L 蛋白的表达是否存在异常其表达与预后是否有相关性目前相关的文献报道较少因此分析患者肿瘤组织中 - -L 的表达对于指导临床评估免疫缺陷及判断预后具有重要意义目前研究认为 -L 与 - 结合后抑制 T B 瘤中表达较强在惰性淋巴瘤如浆细胞样淋巴瘤滤中未见 - 及 -L 的表达而 PTCL 中 - 及 -L 表达升高其中 - 阳性率为 5% -L 阳性率为 % 说明 PTCL-NOS 也存在 - 及 -L 的表达异常与其在淋巴瘤细胞株中包括弥漫大 B 细胞外周 T 细胞及霍奇金淋巴瘤等的表达报道相一致可能参与肿瘤的免疫逃逸 - 及 -L 阳性有助于淋巴瘤的诊断进一步分析 - 与临床分期的关系发现 - -L 的表达与分期均呈正相关这也与 - 及 -L 蛋白在其他类型淋巴瘤中的表达相符同时 - -L 蛋白的表达与 PTCL 的预后呈负相关 - -L 蛋白均表达的患者预后较差此外 - 的表达与疗效负相关而 -L 的表达与疗效无相关性同时说明 - 的高表达也造成化疗耐药使肿瘤增殖失控近年来靶向抑制 - 和 -L 抗体已经在多种肿瘤中开展了临床试验并取得了一定疗效如应用抗 - 抗体治疗黑色素瘤非小细胞肺癌等患者约 /5 - / 的患者获得客观缓解 5 在血液肿瘤患者中应用 -/-L 抑制剂可启动患者自身免疫系统来识别并杀伤肿瘤细胞清除微小肿瘤残留病灶在复发 / 难治性霍奇金淋巴瘤 HD 患者应用抗 - 抗体治疗后总缓解率为 66% 6 例获得完全缓解其余例获得部分缓解在弥漫大 B 细胞淋巴瘤中应用抗 - 抗体治疗的总反应率为 5% 6 应用抗 - 抗体联合利妥昔单抗治疗复发滤泡淋巴瘤患者客观

的表达可作为一个潜在疗效的预测标记但还需进一步研究验证近期研究发现在白血病霍奇金淋巴瘤 NK/T 淋巴瘤患者中亦存在 -L 高表图 -L阳性患者中-的表达与预后的生存曲线 Fig.

5 - 8 - 肿瘤药学 6 年月第 6 卷第期 Anti-tumor Pharmacy, February 6, Vol. 6, No. 缓解率达 66% 无免疫相关不良事件或 / 级治疗相关事件说明抗 - 抗体可能成为一种有效的免疫治疗手段综上所述我们发现 PTCL 中存在 - -L 蛋 9 白表达异常并与临床分期预后相关提示 PTCL 存在肿瘤微环境的免疫异常可能有利于抗 - 抗体治疗深入研究深入研究 -/-L 信号通路将为通过提高患者自身的免疫系统治愈 T 细胞淋巴瘤提供可能参考文献 (References) Yan YZ, Na K, Wei XD, et al. Research progress on the mechanism of tumor immune escape J. Fudan Univ J Med Sci,, (5): 6-6. 阎永贞, 那可, 魏晓东, 等. 肿瘤免疫逃逸机制的研究进展 J. 复旦学报: 医学版,, (5): 6-6. Sheppard KA, Fitz LJ, Lee JM, et al. - inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP /CD zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta J. FEBS Lett,, 5 (- ): -. Ma W, Luo DZ, Chen Y, et al. Expression and clinical significance of -L and - in non-small cell lung cancer J. J Pract Med,, (9): Geng WP, Xu M, Wang YQ, et al. Expression and significance of co-stimulatory molecules -L, -L and B -H in human cervical cancer J. J Chongqing Med Univ,, 6(): 86-. 耿卫朴, 徐曼, 王渝琦,等.共刺激分子-L -L和B -H 在人子宫颈癌的表达及意义 J. 重庆医科大学学报,, 6(): Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, et al. WHO classification of tumours of haemtopoietic and lymphoid tissues S. International Agency for Research on Cancer, 8, Wu BQ, Liu YF. Immunohistochemistry for Diagnostic Pathology [M]. Beijing: Beijing Science and Technology Press,. [吴秉铨, 刘彦仿. 免疫组织化学病理诊断[M]. 北京: 北京科学技术出版社,.] Yamamoto R, Nishikori M, Kitawaki T, et al. --- ligand interaction contributes to immunosuppressive microenvironment of Hodgkin lymphoma J. Blood, 8, (6): -. doi:.8/blood Iwamura K, Kato T, Miyahara Y, et al. sirna-mediated silencing of - ligands enhances tumor-specific hu- 5 6 man T-cell effector functions J. Gene Ther,, (): doi:. 8/gt..85. Cheson BD, Pfistner B, Juweid ME, et al. Revised response criteria for malignant lymphoma J.,5: Topalian SL, Hodi FS, Brahmer JR, et al. Safety, activity, and immune correlates of anti-- antibody in cancer J. N Engl J Med,, 66(6): - 5. doi:.56/ NEJMoa69. Sznol M, Chen L. Antagonist antibodies to - and B -H (-L) in the treatment of advanced human cancer J. Clin Cancer Res,, (5): -. doi:.58/ 8-.C--6. Simeone E, Ascierto PA. Immunomodulating antibodies in the treatment of metastatic melanoma: the experience with antictla-, anti-cd, and anti- J. J Immunotoxicol,, 9( ): -. doi:. /5 69X Li Y, Wang J, Ke XY. Expression of -L in lymphoma and its effect on lymphoma proliferation and chemotherapy resistance J. J Exper Hematol,, (): 66-. [李义, 王晶, 克晓燕. -L在淋巴瘤中的表达及其对淋巴瘤增殖和化疗抵抗的初步研究 J. 中国实验血液学杂志,, (): 66-.] Han LJ, Li RP, Chen XF, et al. The expression and clinical significance of B family molecules and their receptor -I in human NK/T-cell lymphoma J. Chin J Clin Oncol,, (6): 6-6. [韩丽娟, 李汝平, 陈新峰, 等. B 家族及其受体-在人NK/T细胞淋巴瘤中的表达及临床意义 J. 中国肿瘤临床,, (6): 6-6.] Brahmer JR, Tykodi SS, Chow LQ, et al. Safety and activity of anti--l antibody in patients with advanced cancer J. N Engl J Med,, 66(6): doi:.56/ NEJMoa69. Armand P, Nagler A, Weller EA, et al. Disabling immune tolerance by programmed death- blockade with pidilizumab after autologous hematopoietic stem-cell transplantation for diffuse large B-cell lymphoma: results of an international phase II trial J. J Clin Oncol,, ( ): 9-6. doi:./jco Westin JR, Chu F, Zhang M, et al. Safety and activity of blockade by pidilizumab in combination with rituximab in patients with relapsed follicular lymphoma: a single group, open-label, phase trial J. Lancet Oncol,, 5(): 69-. doi:.6/s - 5( ) 收稿日期 5--5 校稿王娟李征

(References) Yan YZ, Na K, Wei XD, et al. Research progress on the mechanism of tumor immune escape J. Fudan Univ J Med Sci,, (5): 6-6. 阎永贞, 那可, 魏晓东, 等. 肿瘤免疫逃逸机制的研究进展 J. 复旦学报: 医学版,, (5): 6-6.

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