中图分类号:;文献标识码: ;文章篇号: (2004)01-000#-0#
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1 嘌 呤 核 苷 磷 酸 化 酶 不 同 表 达 方 式 对 发 酵 利 巴 韦 林 的 影 响 刘 莉, 李 燕 军, 谢 希 贤, 陈 宁 ( 天 津 科 技 大 学 生 物 工 程 学 院, 天 津 市 氨 基 酸 高 效 绿 色 制 造 工 程 实 验 室, 代 谢 控 制 发 酵 技 术 国 家 地 方 联 合 工 程 实 验 室, 天 津 ) 摘 要 : 嘌 呤 核 苷 磷 酸 化 酶 (PNPase, 由 pupg 基 因 编 码 ) 是 合 成 利 巴 韦 林 的 关 键 酶, 本 研 究 考 察 该 酶 的 质 粒 过 表 达 和 基 因 组 整 合 表 达 对 鸟 苷 生 产 菌 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 (Bacillus amyloliquefaciens)ta208 发 酵 生 产 利 巴 韦 林 的 影 响 以 B. amyloliquefaciens TA208 为 出 发 菌 株, 分 别 利 用 基 因 过 表 达 和 无 标 记 整 合 技 术, 成 功 构 建 了 B. amyloliquefaciens TA2081 和 TA2082 通 过 实 时 定 量 PCR 测 定 这 3 株 菌 pupg 基 因 的 转 录 水 平, 结 果 表 明 与 B. amyloliquefaciens TA208 相 比,TA2081 和 TA2082 的 转 录 水 平 均 有 提 高, 但 TA2081 提 高 的 更 为 显 著 ; 通 过 测 定 PNPase 活 性 发 现,B. amyloliquefaciens TA2081 和 TA2082 的 PNPase 活 力 分 别 为 出 发 菌 株 TA208 的 2 倍 和 1.30 倍 7.5 L 分 批 补 料 发 酵 实 验 表 明, 与 出 发 菌 B. amyloliquefaciens TA208 相 比, 工 程 菌 TA2081 鸟 苷 到 利 巴 韦 林 的 摩 尔 转 化 率 从 20.41% 提 高 到 98.63%,TA2082 的 转 化 率 从 20.41% 提 高 到 40.95% 综 上 所 述, 增 加 pupg 的 表 达 量 能 提 高 利 巴 韦 林 的 产 量, 本 研 究 为 利 巴 韦 林 生 产 菌 的 代 谢 工 程 改 造 提 供 了 理 论 依 据 和 技 术 指 导 关 键 词 : 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 ; 利 巴 韦 林 ; 嘌 呤 核 苷 磷 酸 化 酶 ; 质 粒 过 表 达 ; 基 因 组 整 合 表 达 文 章 篇 号 : (2015) DOI: /j.mfst Effect of Different Expression Approaches of Purine Nucleoside Phosphorylase on Ribavirin Accumulation LIU Li, LI Yan-jun, XIE Xi-xian, CHEN Ning (College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin Engineering Lab of Efficient and Green Amino Acid Manufacture, National and Local United Engineering Lab of Metabolic Control Fermentation Technology, Tianjin , China) Abstract: Purine nucleoside phosphorylase (PNPase, encoded by pupg) is the key enzyme in the synthesis of ribavirin. The effects of pupg overexpression and integrative expression was investigated, on ribavirin production in Bacillus amyloliquefaciens TA208. The overexpression and integrative expression procedures resulted in the successful construction of B. amyloliquefaciens TA2081 and TA2082 strains. Real-time polymerase chain reaction results showed that the transcriptional levels of pupg of TA2081 and TA2082 increased significantly, but the increment of TA2081 was more obvious. PNPase activity of TA2081 and TA2082 was approximately 2- and 1.30-fold compared to that of the original strain TA208, respectively. Finally, in the 7.5 L fed-batch fermentations, the molar yields of ribavirin from guanosine, by B. amyloliquefaciens TA2081 and TA2082 were 98.63% and 40.95%, respectively, whereas that of TA208 was 20.41%. In summary, the improvement of pupg expression via either plasmid-borne or chromosomal integration approach increased ribavirin production. The results of this study would be useful for development of more efficient ribavirin producers via metabolic engineering. Key words: Bacillus amyloliquefaciens; ribavirin; purine nucleoside phosphorylase; plasmid overexpression; integrative expression 收 稿 日 期 : 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 ( ); 天 津 市 教 委 项 目 ( ) 作 者 简 介 : 刘 莉 (1989-), 女, 硕 士 研 究 生, 研 究 方 向 : 主 要 从 事 核 苷 生 产 菌 定 向 改 造 及 发 酵 过 程 优 化 的 研 究 通 讯 作 者 : 陈 宁 (1963-), 男, 博 士, 教 授, 研 究 方 向 : 主 要 从 事 代 谢 控 制 发 酵 的 研 究 利 巴 韦 林 (Ribavirin) 是 一 种 高 效 广 谱 的 核 苷 类 抗 病 毒 药 物, 被 应 用 于 治 疗 多 种 病 毒 感 染 如 小 铁 腺 病 毒 肺 炎 病 毒 性 肝 炎 呼 吸 道 合 胞 病 毒 感 染 等 [1] 目 前, 利 巴 韦 林 的 生 产 方 式 主 要 有 化 学 合 成 法 酶 法 和 发 酵 法 [2~4] 化 学 合 成 法 是 目 前 工 业 中 采 用 的 方 法, 但 该 法 对 环 境 污 染 严 重, 并 不 是 最 理 想 的 生 产 方 式 酶 法 首 先 利 用 微 生 物 表 达 嘌 呤 核 苷 磷 酸 化 酶, 将 酶 纯 化 63
2 或 利 用 菌 体 细 胞 作 为 酶 原 催 化 嘌 呤 核 苷 生 成 核 糖 -1- 磷 酸, 再 与 前 体 物 1,2,4- 三 氮 唑 -3- 羧 甲 酰 胺 (1,2,4-triazole-3-carboxamide,TCA) 反 应 合 成 利 巴 韦 林 ( 反 应 式 如 图 1) [3] 由 于 使 用 核 苷 和 TCA 双 底 物 为 原 料, 成 本 高, 酶 法 合 成 利 巴 韦 林 不 适 合 大 规 模 生 产 1976 年 Ochiai 等 首 次 提 出 发 酵 法, 该 法 利 用 核 苷 生 产 菌 自 身 产 生 前 体 物 鸟 苷 和 表 达 嘌 呤 核 苷 磷 酸 化 酶, 只 向 培 养 基 中 添 加 TCA, 即 可 实 现 利 巴 韦 林 的 合 成 [4] 由 于 菌 株 自 身 的 嘌 呤 核 苷 磷 酸 化 酶 活 性 低, 利 巴 韦 林 产 量 仅 有 0.28 g/l 然 而, 发 酵 法 较 其 他 两 种 方 法 的 优 势 在 于, 避 免 了 核 苷 的 分 离 和 纯 化 过 程, 具 有 原 料 成 本 低 污 染 少, 工 业 化 潜 力 强 的 优 点 异 性 上 存 在 很 大 差 异 如 枯 草 芽 孢 杆 菌 中 嘌 呤 核 苷 磷 酸 化 酶 以 两 种 形 式 存 在, 分 别 为 pupg 基 因 表 达 的 低 分 子 量 同 源 三 聚 体 和 deod 基 因 表 达 的 高 分 子 量 同 源 六 聚 体 [5] 本 实 验 室 前 期 对 比 研 究 了 多 种 来 源 的 PNPase, 结 果 表 明,pupG 表 达 的 PNPase 对 底 物 鸟 苷 的 转 化 率 最 高, 可 以 达 到 87.62% [6] Bacillus amyloliquefaciens TA208 是 本 实 验 室 通 过 多 级 诱 变 得 到 一 株 具 有 多 种 缺 陷 型 的 鸟 苷 生 产 菌 [7] B. amyloliquefaciens TA208 自 身 pupg 基 因 的 表 达 量 不 高, 不 能 完 全 利 用 其 产 生 的 前 体 物 鸟 苷, 导 致 利 巴 韦 林 的 产 量 低 因 此, 增 加 PNPase 的 表 达 量 可 能 是 提 高 利 巴 韦 林 产 量 的 有 效 手 段 本 研 究 克 隆 了 来 源 于 B. subtilis 168 的 pupg 基 因, 通 过 质 粒 pwb980 过 表 达 和 无 标 记 基 因 组 定 点 整 合 两 种 方 式 来 提 高 PNPase 在 B. amyloliquefaciens TA208 中 的 表 达 量 1 材 料 与 方 法 图 1 酶 法 合 成 利 巴 韦 林 步 骤 Fig.1 Ribavirin synthesis catalyzed by PNPase 不 同 嘌 呤 核 苷 磷 酸 化 酶 在 氨 基 酸 序 列 和 底 物 特 3.2 主 要 菌 株 和 质 粒 本 研 究 所 用 菌 株 和 质 粒 见 表 1 表 1 本 研 究 所 用 菌 株 和 质 粒 Table 1 Strains and plasmids used in this study Strains and plasmids Genotype Source E. coli DH5α F -, φ80d/lacz M15, (laczya-argf)u169, deor, reca1, enda1, hsdr17(r k -, m k + ), phoa, supe44, λ -, thi-1, gyra96, rela1 Lab stock B. subtilis 168 trpc2 Lab stock B. subtilis WB600 trpc2, npre, nprb, apr, epr, mpr, bpr, Em r Lab stock B. amyloliquefaciens TA208 Ade -, 8AG r, MSO r, overproducing guanosine Lab stock B. amyloliquefaciens TA2081 B. amyloliquefaciens TA208 containing plasmid pwb980-pupg This study B. amyloliquefaciens TA2082 B. amyloliquefaciens TA208 npre PP (PP fragment containing P43 promoter, sacb, pupg) This study pwb980 Ori Bacillus, Km r, Ble r, P43 promoter, sacb signal peptide, 3.8 kb Lab stock pwb980-pupg pwb980 containing pupg fragment This study pks1 Temperature-sensitive plasmid vector, 5.1 kb, Em r, Km r Lab stock pksn pks1 containing npre fragment This study pksnpp pksn containing PP fragment This study 1.2 引 物 表 2 为 本 研 究 使 用 的 引 物, 均 由 Primer Premier 5.0 软 件 设 计 1.3 主 要 试 剂 和 仪 器 电 穿 孔 仪,Eppendorf 公 司 ; 实 时 定 量 PCR 仪, ABI 公 司 ; 高 效 液 相 色 谱 Agilent 1200, 美 国 安 捷 伦 ; 7.5 L BioFlo 115 自 动 控 制 发 酵 罐, 美 国 NBS 公 司 限 制 性 内 切 酶,Fermentas 公 司 ;Solution I 连 接 酶, 大 连 宝 生 物 工 程 有 限 公 司 ;TransStart FastPfu DNA Polymerase, 北 京 全 式 金 生 物 技 术 有 限 公 司 ; 质 粒 快 速 提 取 试 剂 盒, 北 京 博 迈 德 生 物 技 术 有 限 公 司 ;PCR 产 物 纯 化 试 剂 盒 和 胶 回 收 试 剂 盒, 北 京 天 恩 泽 基 因 科 技 有 限 公 司 ; 蛋 白 胨 酵 母 粉 为 Oxoid 公 司 产 品 ;1,2,4- 三 氮 唑 -3- 甲 酰 胺 (1,2,4-triazole-3-carboxamide,TCA) 64
3 为 本 实 验 室 自 制 ; 山 梨 醇 甘 露 醇 购 于 天 津 博 美 科 生 物 技 术 有 限 公 司 ; 其 余 试 剂 均 为 国 产 分 析 纯 产 品 表 2 本 研 究 所 用 引 物 Table 2 Primers used in this study Primers Sequences (5-3 ) Description P1-S GAGAGGATCCCAAGGACAGAATTGAACGC pupg (Xho I) P1-A TGCACTGCAGCATATTTATTCGTACTGAGCG pupg (Pst I) P2-S AGATAAGCTTAGAATGCGAGATTGCTGGTT npre upstream homologous arm (Hind III) P2-A TGAGTCGACATTACGATGTAGGGCCCTTAGAAA CGGCTTCAGGTGAT npre upstream homologous arm (Apa I) P3-S CCCTACATCGTAATGTCGACTTCTTCTGAAAGCGGCAAAT npre downstream homologous arm (Kpn I) P3-A CGATGGTACCTAAAAGTTGATGACGGAGTGAGG npre downstream homologous arm (Sal I) P4-S ACGTGGGCCCAAAGGTGGAGATTTTTTGAGTGA PP fragment (Apa I) P4-A TCGAGTCGACTTCGTTCTTTTTTTACCTCTCG PP fragment (Sal I) DL-S TATGAAGGCTACTCAATGGAGAAAG pupg(rt-qpcr) DL-A GGGTTTGTTCCCATAAAGTTGATA pupg(rt-qpcr) 1.4 培 养 基 (1) 种 子 培 养 基 (g/l): 葡 萄 糖 20, 豆 饼 水 解 液 20, 酵 母 粉 10, 玉 米 浆 30,NaCl 2.5,MgSO 4 7H 2 O 1,KH 2 PO 4 1, 味 精 5,pH 7.0 (2) 发 酵 培 养 基 (g/l): 葡 萄 糖 80, 酵 母 粉 18, 豆 饼 水 解 液 42, 玉 米 浆 23,(NH 4 )SO 4 15,MgSO 4 7H 2 O 8,K 2 HPO 4 2.5, 味 精 15,MnSO ,FeSO , 无 水 CaCl 2 2.5,D- 葡 萄 糖 酸 钠 2,pH 感 受 态 的 制 备 及 转 化 方 法 解 淀 粉 芽 胞 杆 菌 和 枯 草 芽 孢 杆 菌 感 受 态 细 胞 的 制 备 和 转 化 方 法 参 见 文 献 [8], 具 体 转 化 操 作 如 下 : 将 构 建 成 功 的 质 粒 电 转 入 枯 草 芽 孢 杆 菌 株 WB600 进 行 DNA 的 修 饰, 筛 选 得 到 阳 性 转 化 子, 提 取 纯 化 质 粒 后 进 行 解 淀 粉 芽 胞 杆 菌 的 电 转 操 作 其 他 分 子 生 物 学 操 作 参 见 精 编 分 子 生 物 学 实 验 指 南 [9] 1.6 实 时 定 量 PCR 分 析 将 解 淀 粉 芽 胞 杆 菌 (B. amyloliquefaciens)ta208 TA2081 和 TA2082 三 株 菌 接 于 5 ml 摇 管 培 养 至 对 数 期, 按 照 RNA 提 取 试 剂 盒 说 明 书 提 取 总 RNA, 利 用 反 转 录 试 剂 盒 获 得 cdna, 并 以 之 为 模 版 以 B. amyloliquefaciens 的 16S rdna 为 参 比, 进 行 实 时 定 量 PCR, 根 据 2 - CT 法 计 算 相 关 基 因 的 转 录 水 平 1.7 PNPase 活 性 检 测 粗 酶 液 的 制 备 蛋 白 质 定 量 分 析 和 PNPase 活 性 测 定 参 见 文 献 [10] 粗 酶 液 的 制 备 : 将 菌 株 在 M9 培 养 基 中 r/min 过 夜 培 养, 在 4 下 以 5500 r/min 离 心 10 min 后 收 集 菌 体, 用 磷 酸 盐 缓 冲 液 (ph 7.6) 洗 涤 菌 体 两 次 利 用 超 声 破 碎 仪 破 碎 菌 体 制 得 粗 酶 液 蛋 白 浓 度 检 测 : 粗 酶 液 中 蛋 白 浓 度 采 用 BCA 蛋 白 定 量 试 剂 盒 检 测 酶 活 测 定 : 反 应 体 系 为 200 µl, 含 1 mmol/l 肌 苷 25 mmol/l 的 磷 酸 盐 缓 冲 液 (ph 7.6) 和 适 量 的 粗 酶 液, 反 应 液 在 37 下 保 温 3 min, 迅 速 煮 沸 终 止 反 应 催 化 生 成 的 次 黄 嘌 呤 采 用 HPLC 定 量 分 析 PNPase 酶 活 定 义 : 在 上 述 酶 活 测 定 条 件 下,1 min 内 催 化 肌 苷 生 成 1 µmol 次 黄 嘌 呤 所 需 要 的 酶 量 定 义 为 一 个 酶 活 单 位 (U) 根 据 粗 酶 液 蛋 白 浓 度 计 算 PNPase 比 酶 活 为 :1 g 总 蛋 白 所 对 应 的 酶 活 (U/g) 1.8 发 酵 培 养 摇 瓶 培 养 : 将 B. amyloliquefaciens TA208 TA2081 和 TA2082 菌 株 经 斜 面 活 化 后 接 种 于 装 液 量 为 30 ml 的 种 子 培 养 基 中 (500 ml 摇 瓶 ),36 培 养 10 h 后 以 10% 接 种 量 接 种 于 30 ml 发 酵 培 养 基 中 (500 ml 摇 瓶 ), 每 组 3 个 平 行 36 培 养, 发 酵 周 期 为 60 h, 期 间 补 加 葡 萄 糖 每 12 h 添 加 20 g TCA, 共 添 加 3 次 7.5 L 发 酵 罐 培 养 : 将 菌 株 经 斜 面 活 化 后 接 种 于 装 液 量 为 100 ml 的 种 子 培 养 基 中 (1 L 摇 瓶 ), 共 4 瓶 36 培 养 10 h 后 将 种 子 培 养 基 按 10% 接 入 7.5 L 发 酵 罐 中 ( 装 液 量 为 4 L) 发 酵 过 程 中 通 过 自 动 流 加 氨 水 控 制 ph 在 7.0 左 右, 培 养 温 度 为 36 当 培 养 基 中 葡 萄 糖 浓 度 降 至 2% 时, 以 设 定 脉 冲 速 度 (5 g/l/h) 将 65
4 葡 萄 糖 溶 液 流 加 至 培 养 基 中, 以 维 持 葡 萄 糖 的 浓 度 在 肽 的 pupg 片 段, 命 名 该 片 段 为 PP 经 限 制 性 内 切 酶 2~3% TCA 添 加 方 式 同 摇 瓶 培 养 Sal I 和 Apa I 双 酶 切 片 段 PP 和 质 粒 pksn, 二 者 切 胶 1.9 分 析 方 法 回 收 后 通 过 Solution I 连 接, 构 建 好 整 合 质 粒 pksnpp 重 叠 片 段 中 npre 基 因 作 为 基 因 组 整 合 的 位 点, 发 酵 过 程 中, 取 适 量 发 酵 液 稀 释 后 用 紫 外 分 光 光 通 过 双 交 换 的 方 式 将 片 段 PP 整 合 到 基 因 组 上, 即 将 度 计 测 定 600 nm 处 的 吸 光 度 值 取 10 ml 发 酵 液, 带 有 强 启 动 子 P43 和 sacb 信 号 肽 的 pupg 插 入 基 因 组, r/min 离 心 10 min, 用 蒸 馏 水 洗 涤 菌 体 3 次, 置 最 终 获 得 整 合 工 程 菌 B. amyloliquefaciens TA2082 构 于 真 空 干 燥 箱 中 80 干 燥 至 恒 重, 用 分 析 天 平 称 重 建 步 骤 如 图 2 所 示 葡 萄 糖 浓 度 采 用 SBA-40C 生 物 传 感 仪 测 定 取 适 量 发 酵 液 离 心, 用 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 上 清 液 中 的 利 巴 韦 林, 色 谱 分 离 条 件 : 采 用 离 子 柱 Accurasil C18, 以 4% 乙 腈 为 流 动 相, 流 速 为 1 ml/min, 柱 温 为 18.5, 检 测 波 长 为 207 nm; 另 取 适 量 发 酵 液 煮 沸, 离 心 后 取 上 清, 用 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 鸟 苷, 色 谱 分 离 条 件 : 采 用 离 子 柱 Accurasil C18, 以 10% 乙 腈 为 流 动 相, 流 速 为 1 ml/min, 柱 温 为 30, 检 测 波 长 为 254 nm 1.10 计 算 方 法 菌 体 生 物 量 以 干 重 (DCW) 表 示 :1 OD 600 nm =0.245 g/l 干 菌 体 鸟 苷 到 利 巴 韦 林 的 摩 尔 转 化 率 (%)=[ 产 物 利 巴 韦 林 (mmol/l)]/[ 产 物 利 巴 韦 林 (mmol/l)+ 剩 余 鸟 苷 (mmol/l)] 100% 2 结 果 与 讨 论 2.1 过 表 达 重 组 菌 的 构 建 以 pwb980 质 粒 为 基 本 骨 架, 构 建 过 表 达 质 粒 pwb980-pupg 以 B. subtilis 168 的 基 因 组 为 模 版, 用 引 物 P1-S/P1-A 扩 增 pupg 基 因 基 因 pupg 和 表 达 载 体 pwb980 分 别 经 限 制 性 内 切 酶 Xho I 和 Pst I 双 酶 切, 切 胶 回 收 目 的 片 段 和 载 体, 通 过 Solution I 连 接 将 构 建 好 的 质 粒 通 过 电 转 方 式 导 入 B. amyloliquefaciens TA208 中, 获 得 过 表 达 pupg 的 工 程 菌 B. amyloliquefaciens TA 整 合 重 组 菌 的 构 建 以 温 敏 质 粒 pks1 为 基 本 构 架 构 建 整 合 质 粒 pksnpp 以 B. amyloliquefaciens TA208 的 基 因 组 为 模 版, 分 别 用 引 物 P2-S/P2-A 和 P3-S/P3-A 扩 增 基 因 npre 上 下 游 同 源 臂 采 用 重 叠 PCR 的 方 法 扩 增 重 叠 片 段 npre, 使 用 限 制 性 内 切 酶 Hind III 和 Kpn I 双 酶 切 npre 和 质 粒 pks1, 二 者 切 胶 回 收 后 通 过 Solution I 连 接, 获 得 质 粒 pksn 再 以 质 粒 pwb980-pupg 为 模 版, 用 P4-S/P4-A 引 物 扩 增 带 有 强 启 动 子 P43 及 sacb 信 号 图 2 无 标 记 基 因 整 合 流 程 Fig.2 Marker-less gene integration strategy 2.3 pupg 基 因 的 转 录 分 析 嘌 呤 核 苷 磷 酸 化 酶 PNPase 对 利 巴 韦 林 积 累 起 着 至 关 重 要 的 作 用, 其 mrna 含 量 可 反 映 编 码 基 因 pupg 的 转 录 水 平 本 研 究 对 三 株 菌 的 pupg 转 录 水 平 进 行 了 RT-qPCR 分 析, 结 果 发 现,B. amyloliquefaciens TA2081 的 pupg 转 录 水 平 是 出 发 菌 TA208 的 32 倍, TA2082 的 pupg 转 录 水 平 是 TA208 的 4 倍 分 析 结 果 见 表 3 表 3 RT-qPCR 检 测 pupg 基 因 相 对 表 达 水 平 Table 3 Reverse transcriptase quantitative PCR analysis of pupg gene expression levels during exponential phase Strains pupg gene relative expression B. amyloliquefaciens TA ±0.11 B. amyloliquefaciens TA ±2.34 B. amyloliquefaciens TA ± PNPase 活 性 分 析 PNPase 是 发 酵 法 合 成 利 巴 韦 林 的 关 键 限 速 酶, 催 化 鸟 苷 或 肌 苷 生 成 核 糖 -1- 磷 酸, 核 糖 -1- 磷 酸 再 在 该 酶 的 作 用 下 结 合 底 物 TCA 生 成 利 巴 韦 林, 其 酶 活 性 的 高 低 直 接 影 响 利 巴 韦 林 的 合 成 量 酶 活 性 分 析 ( 图 3) 表 明 过 表 达 pupg 使 工 程 菌 B. amyloliquefaciens TA2081 的 PNPase 活 力 达 到 U/g, 是 出 发 菌 株 TA208 的 2 倍 刘 逸 寒 等 利 用 质 粒 pwb980, 实 现 了 66
5 在 B. subtilis DB403 中 高 效 表 达 异 源 中 温 α- 淀 粉 酶, 酶 活 达 到 770 U/mL [11] 说 明 pwb980 为 优 秀 的 异 源 蛋 白 表 达 载 体 然 而, 微 生 物 细 胞 携 带 的 外 源 基 因 表 达 质 粒 具 有 潜 在 的 不 稳 定 性, 且 抗 性 筛 选 标 记 的 残 留 会 影 响 菌 株 的 安 全 性 和 进 一 步 遗 传 操 作 因 此, 本 研 究 后 期 利 用 温 敏 质 粒 pks1 将 带 有 P43 启 动 子 和 sacb 信 号 肽 的 pupg 基 因 整 合 到 B. amyloliquefaciens TA208 因 组 上, 增 加 了 pupg 的 转 录 水 平, 提 高 了 PNPase 的 活 力 工 程 菌 B. amyloliquefaciens TA2082 的 PNPase g/l, 结 合 转 录 和 酶 活 分 析 发 现 其 原 因 是 TA208 自 身 pupg 表 达 水 平 低, 导 致 PNPase 活 性 低, 鸟 苷 到 利 巴 韦 林 的 摩 尔 转 化 率 只 有 10.54% 与 之 相 比, 质 粒 表 达 的 工 程 菌 TA2081 利 巴 韦 林 产 量 提 高 了 7 倍, 前 体 物 鸟 苷 几 乎 没 有 剩 余, 鸟 苷 到 利 巴 韦 林 的 摩 尔 转 化 率 达 到 了 99% 工 程 菌 TA2082 利 巴 韦 林 的 产 量 比 出 发 菌 株 提 高 了 58.30%, 鸟 苷 仍 有 大 部 分 剩 余, 转 化 率 只 有 16.30%, 说 明 整 合 工 程 菌 PNPase 活 力 不 足 以 将 前 体 物 鸟 苷 全 部 转 化 活 力 达 到 U/g, 仅 为 出 发 菌 株 TA208 的 1.30 倍, 说 明 表 达 体 系 有 待 进 一 步 优 化, 来 获 得 更 高 的 PNPase 表 达 量 2.5 利 巴 韦 林 发 酵 为 了 研 究 嘌 呤 核 苷 磷 酸 化 酶 的 不 同 表 达 方 式 ( 质 粒 过 表 达 和 基 因 组 整 合 过 表 达 ) 对 利 巴 韦 林 积 累 的 影 响, 本 研 究 进 行 了 利 巴 韦 林 摇 瓶 发 酵 和 7.5 L 发 酵 罐 分 批 补 料 发 酵, 分 别 比 较 了 三 株 菌 的 生 长 情 况 耗 糖 速 率 利 巴 韦 林 积 累 量 以 及 鸟 苷 剩 余 量 表 4 为 利 巴 韦 林 摇 瓶 发 酵 60 h 后 的 发 酵 参 数 由 结 果 可 知, 出 发 图 3 三 株 菌 的 PNPase 活 性 比 较 Fig.3 Comparison of PNPase activities of three strains 菌 B. amyloliquefaciens TA208 利 巴 韦 林 产 量 仅 为 1.32 表 4 三 株 菌 的 摇 瓶 发 酵 参 数 比 较 Table 4 Comparison of parameters of three strains in shake flask fermentation Strains DCW/(g/L) Glucose consumption/(g/l) C(ribavirin)/(g/L) C(guanosine)/(g/L) B. amyloliquefaciens TA ± ± ± ±0.20 B. amyloliquefaciens TA ± ± ± ±0.25 B. amyloliquefaciens TA ± ± ± ± L 发 酵 罐 分 批 发 酵 结 果 表 明 ( 图 4), 工 程 菌 B. amyloliquefaciens TA2081 生 长 较 出 发 菌 TA208 缓 慢, 可 能 是 附 加 质 粒 增 加 了 菌 体 的 生 长 负 担, 导 致 其 生 长 受 到 影 响 而 在 摇 瓶 发 酵 中, 出 发 菌 TA208 反 而 生 长 慢, 可 能 是 由 于 其 PNPase 活 性 低, 不 能 完 全 利 用 前 体 物 TCA,TCA 的 局 部 积 累 对 菌 体 生 长 造 成 一 定 毒 害 作 用 ; 在 发 酵 罐 中 可 能 由 于 搅 拌 均 匀 而 未 表 现 出 该 特 性 出 发 菌 TA208 是 鸟 苷 生 产 菌, 发 酵 40 h 后 鸟 苷 积 累 量 为 9.07 g/l, 由 于 自 身 的 PNPase 活 力 低, 鸟 苷 到 利 巴 韦 林 的 摩 尔 转 化 率 只 有 20.41% 工 程 菌 TA2081 由 于 过 表 达 pupg 基 因 增 加 了 PNPase 活 性, 发 酵 过 程 中 鸟 苷 几 乎 全 部 转 化 为 利 巴 韦 林, 转 化 率 高 达 98.63%, 利 巴 韦 林 产 量 为 g/l 枯 草 芽 孢 杆 菌 在 表 达 外 源 蛋 白 的 同 时 也 会 向 胞 外 分 泌 大 量 蛋 白 酶, 使 外 源 蛋 白 无 法 稳 定 存 在, 这 也 是 枯 草 芽 孢 杆 菌 作 为 宿 主 菌 的 瓶 颈 之 一 选 择 B. amyloliquefaciens TA208 的 npre 基 因 ( 编 码 中 性 蛋 白 酶 ) 作 为 pupg 整 合 位 点, 试 图 同 时 敲 除 npre 来 减 少 蛋 白 酶 对 PNPase 的 降 解 有 研 究 报 道,nprE 基 因 的 敲 除 不 影 响 枯 草 芽 孢 杆 菌 的 生 长 [12] 从 图 4 可 以 看 出, 工 程 菌 B. amyloliquefaciens TA2082 发 酵 前 期 生 长 速 率 与 出 发 菌 TA208 基 本 一 致, 发 酵 40 h 后,TA2082 的 生 长 逐 渐 放 缓 生 物 量 趋 于 稳 定, 而 TA208 则 保 持 恒 定 的 速 率 生 长, 最 终 获 得 了 较 高 的 生 物 量 发 酵 前 期 工 程 菌 TA2082 耗 糖 速 率 略 高 于 出 发 菌, 发 酵 中 后 期 二 者 葡 萄 糖 消 耗 速 率 相 差 不 大 由 于 工 程 菌 TA2082 在 基 因 组 上 增 加 了 一 个 pupg 的 拷 贝,PNPase 的 酶 活 提 高, 发 酵 结 束 时 鸟 苷 积 累 量 为 6.02 g/l, 鸟 苷 到 利 巴 韦 林 的 摩 尔 转 化 率 为 40.95%; 而 与 之 相 比,TA208 在 发 酵 结 束 时 有 9.04 g/l 鸟 苷 积 累, 鸟 苷 转 化 率 只 有 20.41% 工 程 菌 TA2082 利 巴 韦 林 产 量 为 3.60 g/l, 比 出 发 菌 TA208 高 出 80% 有 趣 的 是,TA208 在 发 酵 40 h 后 利 巴 韦 林 的 浓 度 开 始 下 降, 推 测 原 因 可 能 是 由 于 PNPase 活 力 下 降, 导 致 生 成 的 利 巴 韦 林 发 生 逆 反 应 分 解 为 核 糖 -1- 磷 酸, 而 核 糖 -1- 磷 酸 作 为 碳 源 加 速 了 67
6 菌 体 的 生 长 3 结 论 3.1 枯 草 芽 孢 杆 菌 属 是 优 秀 的 外 源 表 达 系 统, 无 明 显 密 码 子 偏 爱 性, 无 致 病 性, 具 有 分 泌 外 源 蛋 白 的 功 能, 并 且 表 达 的 蛋 白 多 具 有 生 物 活 性, 纯 化 方 便 本 研 究 中, 利 用 高 效 表 达 载 体 pwb980 过 表 达 嘌 呤 核 苷 磷 酸 化 酶, 实 现 了 一 步 法 生 产 利 巴 韦 林 从 酶 活 性 上 分 析, B. amyloliquefaciens TA2081 较 原 菌 PNPase 酶 活 提 高 了 2 倍 经 7.5 L 发 酵 罐 优 化, 利 巴 韦 林 产 量 较 出 发 菌 B. amyloliquefaciens TA208 提 高 了 5.76 倍, 鸟 苷 转 化 为 利 巴 韦 林 的 转 化 率 提 高 了 78.22% 可 见, 利 用 高 拷 贝 质 粒 增 加 pupg 的 拷 贝 数, 进 而 增 加 酶 的 表 达 量, 能 够 有 效 提 高 利 巴 韦 林 的 产 量 然 而,pWB980 这 类 表 达 质 粒 靠 滚 环 方 式 复 制, 复 制 过 程 中 会 产 生 大 量 单 链 DNA, 使 得 质 粒 不 稳 定, 在 无 选 择 压 力 下 很 容 易 丢 失 ; 高 拷 贝 质 粒 的 复 制 和 维 持 将 消 耗 过 多 能 量, 导 致 宿 主 菌 生 长 缓 慢 [13] 因 此, 工 程 菌 B. amyloliquefaciens TA2081 实 际 上 并 不 是 最 适 合 生 产 利 巴 韦 林 的 菌 株 3.2 本 研 究 进 一 步 对 工 程 菌 B. amyloliquefaciens TA208 进 行 改 造, 通 过 无 痕 基 因 整 合 技 术 构 建 出 B. amyloliquefaciens TA2082, 它 较 原 菌 酶 活 提 高 了 1.30 倍, 产 量 提 高 了 1.80 倍, 鸟 苷 转 化 为 利 巴 韦 林 的 转 化 率 提 高 了 20.54% 然 而,B. amyloliquefaciens TA2082 较 TA2081 利 巴 韦 林 积 累 低, 鸟 苷 剩 余 量 高, 说 明 pupg 基 因 的 拷 贝 数 还 是 不 够 的 但 是, 将 pupg 基 因 整 合 到 基 因 组 解 决 了 发 酵 后 期 质 粒 不 稳 定 的 问 题 因 此 在 本 研 究 基 础 上, 下 一 步 继 续 将 pupg 基 因 多 拷 贝 整 合 入 宿 主 菌 基 因 组 中, 获 得 高 效 稳 定 的 表 达, 为 实 现 利 巴 韦 林 的 发 酵 法 大 规 模 生 产 奠 定 基 础 参 考 文 献 [1] Bausch D G, Hadi C M, Khan S H, et al. Review of the literature and proposed guidelines for the use of oral ribavirin as postexposure prophylaxis for Lassa fever [J]. Clinical Infectious Diseases, 2010, 51(12): [2] Crotty S, Maag D, Arnold J J, et al. The broad-spectrum antiviral ribonucleoside ribavirin is an RNA virus mutagen [J]. Nature Medicine, 2000, 6(12): 图 4 嘌 呤 核 苷 磷 酸 化 酶 不 同 表 达 方 式 对 菌 体 生 长 耗 糖 利 巴 韦 林 产 量 和 鸟 苷 积 累 量 的 影 响 Fig. 4 Effects of different ways of PNPase expression on cell growth, glucose consumption, ribavirin production and guanosine accumulation 注 :1: B. amyloliquefaciens TA208; 2: B. amyloliquefaciens TA2081; 3: B. amyloliquefaciens TA2082 [3] 邱 蔚 然, 唐 洁 宇, 高 嫒, 等. 由 鸟 苷 经 酶 法 生 产 利 巴 韦 林 [J]. 中 国 医 药 工 业 杂 志,1997,28(1):14-17 QIU Wei-ran, TANG Jie-yu, GAO Yuan, et al. Enzymatic production of ribavirin from guanosine [J]. Chinese Journal of Pharmaceuticals, 1997, 28(1):
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