加压溶剂提取法从马兜铃中提取马兜铃酸条件的优化

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1 静态加压溶剂提取 -HPLC 法测定马兜铃属植物中的马兜铃酸梁庆优, 郑颖 *, 唐海谊, 李绍平, 王一涛 (. 澳门大学中华医药研究院, 澳门 ;. 澳门理工学院高等卫生学校, 澳门 ) 第一作者简介 : 梁庆优 (98 ), 男, 河北省邯郸市人, 澳门大学中华医药研究院在读硕士研究生, 中药质量控制方向通讯地址 : 澳门大学中华医药研究院, 澳门大学, 澳门特别行政区联系电话 : 传真 : 电子邮件 :[email protected] * 通讯作者及联系地址 : 姓名 : 性别 : 职务 : 郑颖女助理教授, 药剂学博士通讯地址 : 澳门大学中华医药研究院,3 座 30A 室, 澳门大学, 澳门特别行政区联系电话 : 传真 : 电子邮件 : [email protected] 基金項目 : 本研究受澳門科学技术发展基金 ( 资助号 :049/005/A-R) 资助

研究院, 澳门大学, 澳门特别行政区联系电话 : 853-3974690 传真 : 853-884358 电子邮件 :njlqy@63.

2 静态加压溶剂提取 -HPLC 法测定马兜铃属植物中的马兜铃酸梁庆优, 郑颖 *, 唐海谊, 李绍平, 王一涛 (. 澳门大学中华医药研究院, 澳门 ;. 澳门理工学院高等卫生学校, 澳门 ) 摘要 : 目的建立并优化从马兜铃药材中提取马兜铃酸 I 和 II 的静态加压溶剂提取方法, 考察各因素对提取效率的影响, 并测定马兜铃关木通青木香和广防己中两成分的含量方法以马兜铃酸 I 和 II 的含量为指标, 采取单因素考察的方法, 分别优化提取溶剂药材粒径提取温度提取压力提取时间冲洗体积循环数目药材加入量等影响因素结果优化后的条件为 : 甲醇提取, 药材粉末粒径 00~0 目, 提取温度 0, 提取压力 500 psi, 静态提取时间 0 min, 冲洗体积 40%, 个循环, 药材加入量.00 g 结论本法可一次将马兜铃酸 I 和 II 从马兜铃等四种药材中完全提取, 显示了良好的适用性经比较, 该法比传统的超声和索氏提取方法提取效率更高, 节约溶剂, 省时省力 ; 静态加压溶剂法更适合于青木香中马兜铃酸的提取关键词 : 静态加压溶剂提取 ; 高效液相色谱 ; 马兜铃酸 ; 马兜铃 ; 关木通 ; 青木香 ; 广防己 ; 单因素考察 Pressurized Liquid Extraction-HPLC determination of Aristolochic Acids in Aristolochia Plants LIANG Qing-you, ZHENG Ying *,TONG Hoi-yee, LI Shao-ping, WANG Yi-tao (. Institute of Chinese Medical Sciences, University of Macau, Macao SAR, China;. School of Health Sciences, Macao Polytechnic Institute, Macao SAR, China) Abstract: Objective The present study aimed to optimize static pressurized liquid extraction (PLE) method for the extraction of aristolochic acids I & II (AAI & AAII) from Fructus Aristolochiae and study the influences of related factors. Methods The univariate design was introduced. The operational parameters, such as the type of solvent, particle size of the sample powder, extraction temperature, pressure, static time, flush volume, the number of cycles, and the amount of sample were optimized. Results The optimized result employed methanol as extraction solvent, particle size of 00~0 mesh, extraction temperature of 0, extraction pressure of 500 psi, static time of 0 min, flush volume of 40%, cycle and sample amount of.00 g. And the method was applied for four Traditional Chinese Medicines including Fructus Aristolochiae, Caulis Aristolochiae manshuriensis, Radix Aristolochiae, and Radix Arsitolochiae fangchi. Conclusion This method can completely extract AAI & AAII from Fructus Aristolochiae in one extraction. The comparison shows that this static PLE method is better than ultrasonication and soxhlet methods with higher extraction efficiency and less time-consuming. It is also better than the dynamic one in the extraction of AAs from Radix Aristolochiae. Key words: Static Pressurized Liquid Extraction; High Performance Liquid Chromatography; Aristolochic Acid; Fructus Aristolochiae; Caulis Aristolochiae manshuriensis; Radix Aristolochiae; Radix Arsitolochiae fangchi; Univariate Design

II 的含量为指标, 采取单因素考察的方法, 分别优化提取溶剂药材粒径提取温度提取压力提取时间冲洗体积循环数目药材加入量等影响因素结果优化后的条件为 : 甲醇提取, 药材粉末粒径 00~0 目, 提取温度 0, 提取压力 500 psi, 静

3 马兜铃为马兜铃科植物北马兜铃 Aristolochia contorta Bge. 或马兜铃 Aristolochia debilis Sieb. et Zucc. 的干燥成熟果实, 具有清肺降气, 止咳平喘和清肠消痔等功效 [] 马兜铃酸是马兜铃属植物中的主要成分之一, 它是 3,4- 次甲二氧基 -0- 硝基 -- 菲酸的衍生物, 其中尤以马兜铃酸 I( 又名马兜铃酸 A, AAI) 和马兜铃酸 II( 又名马兜铃酸 B,AAII)( 图 ) 分布广泛, 含量较高马兜铃酸 (Aristolochic acids, AAs) 具有肾毒性, 还有致癌致突变的作用 [, 3] 国外亦报道了多起马兜铃酸毒副作用的案例 [4], 甚至形成了马兜铃酸肾病 (Aristolochic Acid Nephropathy, AAN) 的概念因此中药材中马兜铃酸的检测应引起我们的重视马兜铃酸 I Aristolochic Acid I 马兜铃酸 II Aristolochic Acid II 图马兜铃酸 I 和 II 的结构式 Fig Chemical structures of AAI & AAII 马兜铃酸的分析方法报道的比较多, 如 TLC [5] LC-ESI-MS [6] UV [7] 和 HPLC-DAD [8] 等, 而提取则通常使用传统方法, 如加热回流 [], 超声和索氏提取 [8~] 方法等鉴于传统方法费时费力, 本文将采用静态加压溶剂提取法对样品进行提取加压溶剂提取 (Pressurized Liquid Extraction, PLE) 是近十几年发展起来的一个新方法, 它利用给提取溶剂施加高压大幅度地提高提取溶剂的沸点以进行高温提取 [], 目前国内报道较少本文选择马兜铃作为受试药材, 以高效液相色谱法定量, 建立并优化提取马兜铃酸的静态加压溶剂提取方法, 并测定几种药材中 AAI 和 AAII 的含量最后与传统提取方法和动态加压溶剂提取方法进行比较. 仪器试药与材料. 实验仪器 :Agilent 00 系列高效液相色谱仪 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA), 含四元泵, 自动进样器和紫外二极管阵列检测器, 数据处理采用 Chemstation 工作站 ASE00 (Accelerated Solvent Extraction 00) 型加压溶剂提取仪 (Dionex, Sunnyvale, CA, USA), 氮气供压 Knifetec 095 药材粉碎机 (Foss Tecator Company, Sweden) Transonic TI-H-5 型超声仪 (Elma, Sweden) 545D 型离心机 (Eppendorf, Barkhausenweg, 339 Hamburg, Germany). 试药与材料 : 马兜铃 (Fructus Aristolochiae) 青木香 (Radix Aristolochiae) 关木通 (Caulis Aristolochiae manshuriensis) 和广防己 (Radix Arsitolochiae fangchi) 购自 3

酸 B,AAII)( 图 ) 分布广泛, 含量较高马兜铃酸 (Aristolochic acids, AAs) 具有肾毒性, 还有致癌致突变的作用 [, 3] 国外亦报道了多起马兜铃酸毒副作用的案例 [4], 甚至形成了马兜铃酸肾病 (Aristolochic Acid Nephropathy,

4 河北安国美威中药材有限公司, 经本院李绍平博士鉴定分别为北马兜铃 Aristolochia contorta Bge. 的干燥成熟果实马兜铃 Aristolochia debilis Sieb. et Zucc. 的干燥根东北马兜铃 Aristolochia manshuriensis Kom. 的干燥藤茎和广防己 Aristolochia fangchi Y.C.Wu ex L.D. Chou et S.M. Hwang 的干燥根药材于 50 干燥小时后打粉, 过筛备用马兜铃酸对照品购自西格玛公司 (Sigma, St. Louis, MO, USA), 其中含 AAI 7%,AAII 65% 甲醇乙腈冰醋酸乙酸乙酯均为色谱纯, 购自莫克公司 (Merck, Darmstadt, Germany) 纯水采用 Milli Q- Plus 系统制备 (Millipore, Bedford, MA, USA).3 统计处理软件 : 实验中两组比较采用 t- 检验 ; 多组比较采用 F- 检验, 方法为 One-way ANOVA 在 Post Hoc 计算中, 采用 LSD 算法,α 取 0.05 统计软件为 SPSS4.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). 方法与结果. 色谱条件与方法学考察.. 色谱条件 : 本实验使用安捷伦公司生产的 Zorbax SB C-8 色谱柱 (50 mm 4.6 mm,5 μm) 和预柱 (.5 mm 4.6 mm,5 μm),0.0 M 的醋酸水溶液 (A) 和乙腈 (B) 为流动相洗脱条件为 :0~4 min,b% 保持 30%;4~5 min,b% 为 30%~4%;5~50 min,b% 为 4~44%, 最后用 00%B 冲洗 5 min 进样量 0 [8,3] μl, 根据全波长扫描和文献选择 54 nm 作为检测波长流速.0 ml/min, 柱温 5 通过与标准品比较保留时间和紫外吸收光谱的异同来确定样品中待测组分 AAI 和 AAII 的峰位置.. 线性范围最低检测限与最低定量限 : 精密称取 7.3 mg 马兜铃酸混标标准品, 溶于 0 ml 甲醇中, 得标准品储备液, 含 95. μg/ml AAI, μg/ml AAII, 保存于 -0 冰箱中将标准品储备液稀释,AAI 和 AAII 分别取五个浓度进样, 用峰面积对浓度计算标准曲线按信噪比 (S/N) 决定最低检测限 LOD(S/N=3) 和最低定量限 LOQ(S/N=0) 结果见表表 AAI 和 AAII 的回归方程线性范围 LOD 和 LOQ Table The regression equation, linearity range, LOD and LOQ of AAI & AAII 名称回归方程相关系数线性范围 (μg/ml) LOD(ng) LOQ(ng) AAI y = 49.x - 8. r = ~ AAII y = 64.46x r = ~ 精密度与准确度 : 将标准品稀释, 分别在 AAI 和 AAII 的线性范围内取高, 中, 低三个浓度结果日内, 日间精密度 RSD<.5%, 准确度在 95.3%~03.9%(n=3), 表明该色谱条件精密度和准确度良好..4 稳定性重复性与加样回收率 : 取 AAI 和 AAII 的标准品溶液,4 h 内按 0,, 4, 8,, 4h 顺序分别进样 6 次,RSD 均为.7%, 说明 AAI 和 II 的标准品溶液在常温下一天之内稳定性良好分别称取 0.5,.0,.5g 马兜铃样品各三份, 按下文优化好的条件提取并分析后,RSD<% (n=3), 表明该提取分析方法有良好的重复性将高中低三个量的 AAI 和 AAII 标准品分别加入马兜铃样品中, 按上法提取分析, 计算加样回收率, 结果在 94.4%~00.4% 之间,RSD 在 0.45~3.5% 之间 (n=3), 显示整个提取分析方法稳定可靠. 加压溶剂提取各影响因素的考察.. 提取方法 : 本实验将使用单因素考察的方法进行条件优化将受试药材粉碎成适当目数后称取.00 g, 按 : (w/w) 称取硅藻土, 混匀并装入提取罐, 开始优化时, 一般采用预设的条件进行提取, 条件为提取压力 500 psi, 温度 00, 4

Louis, MO, USA), 其中含 AAI 7%,AAII 65% 甲醇乙腈冰醋酸乙酸乙酯均为色谱纯, 购自莫克公司 (Merck, Darmstadt, Germany) 纯水采用 Milli Q- Plus 系统制备 (Millipore, Bedford, MA, USA).

5 提取温度 5 min, 置换体积 40%, 个循环, 药材粉末粒径 00~0 目 (0.5~0.54 mm), 甲醇提取以后有关参数则使用优化的条件优化时, 只改变待考察的条件, 其它条件不变提取完毕后, 将提取液转移至 5 ml 容量瓶中用甲醇定容, 过 0.45 μm 微孔滤膜后进样.. 提取溶剂的影响 : 对提取溶剂的优化结果如表所示本实验分别选择纯水 50% 水 +50% 甲醇纯甲醇 50% 甲醇 +50% 乙酸乙酯四种不同极性的提取溶剂进行了实验虽然 ( 水 + 甲醇 ) 混合溶剂提取效率最高, 但是从操作的简便性和定量的准确性的角度来考虑, 最终选择纯甲醇作为提取溶剂表提取溶剂优化结果 ( 单位 :mg/g) Table Optimization results of extraction solvent (unit: mg/g) 纯水水 + 甲醇纯甲醇甲醇 + 乙酸乙酯 AAI ± ± ± ±0.03 AAII 0.70± ± ± ±0.005 (n=3,rsd<3%,p<0.05)..3 药材粒径的影响 : 对药材粒径的优化结果如表 3 所示由表可见, 随着药材粒径的减小, 提取效率越来越高, 但是由于 00~0 目和 0~40 目的提取效率之间没有显著性差异, 故最终 00~0 目最为药材粒径表 3 药材粒径优化结果 ( 单位 :mg/g) Table 3 Optimization results of particle size (unit: mg/g) 40~60 目 60~80 目 80~00 目 00~0 目 0~40 目 AAI ± ± ± ± ±0.06 AAII ± ± ± ± ± (n=3,rsd<3%,p<0.05)..4 提取温度的影响 : 对提取温度的优化结果如表 4 所示与药材粒径的优化相似, 由于 0 和 40 之间的提取效率没有显著性差异, 故最终选择 0 最为提取温度表 4 提取温度优化结果 ( 单位 :mg/g) Table 4 Optimization results of extraction temperature (unit: mg/g) AAI ± ± ± ±0.056 AAII 0.± ± ± ±0.004 (n=3,rsd<3%,p<0.05)..5 提取压力的影响 : 对提取压力的优化结果如表 5 所示甲醇在 0 沸腾时的饱和蒸汽压约为 6 个大气压, 约合 90 psi, 因实验点均高于此值, 故选择符合提取要求由于 500 psi 时的提取效率显著高于其它三者, 故最终选择该压力最为提取压力表 5 提取压力优化结果 ( 单位 :mg/g) Table 5 Optimization results of extraction pressure (unit: mg/g) 500 psi 000 psi 500 psi 000 psi AAI 0.799± ± ± ± AAII 0.36± ± ± ±0.004 (n=3,rsd<3%,p<0.05)..6 其它影响因素与最终优化结果 : 本实验还考察了其它因素的影响, 比如静态提取时间冲洗体积 ( 指每次提取后用新鲜溶剂置换出的提取罐中提取液的比例 ) 循环次数, 样品加入量等, 一般前三者对提取没有显著性影响 (P>0.05) 虽然有些因素如样品加入量等影响较大 (P<0.05), 但综合考虑提取效率和实验条件, 最终确定的条件为 : 甲醇提取, 药材粉末 00~0 目 (0.5~0.54 mm).00 5

. 提取溶剂的影响 : 对提取溶剂的优化结果如表所示本实验分别选择纯水 50% 水 +50% 甲醇纯甲醇 50% 甲醇 +50% 乙酸乙酯四种不同极性的提取溶剂进行了实验虽然 ( 水 + 甲醇 ) 混合溶剂提取效率最高, 但是从操作的简便性和定量

6 g, 提取压力 500 psi, 提取温度 0, 静态提取时间 0 min, 冲洗体积 40%, 循环次..7 提取完全性 : 提取的完全性是检验一个提取方法好坏的主要指标之一 PLE 提取的完全性常用回收率来表示 [3], 定义为在对同一份样品用同一种方法连续的几次提取中, 第一次提取出的待测成分的量与连续几次提取出的待测成分的总量之比, 即 A Recovery = 00% n Ai i= 其中,Recovery 指回收率,A 指提取出的待测成分的量 (mg),i 指提取次数 ( 通常到待测成分不再被检出为止 ) 在使用优化条件从马兜铃中提取马兜铃酸时,AAI 和 AAII 的回收率分别为 95.40% 和 97.94% ( 表 6), 表明本法对马兜铃酸 I 和 II 的提取较为完全..8 本提取方法的适用性 : 为了考察本 PLE 提取方法对其它药材中同类成分的提取效率, 本实验亦对关木通青木香和广防己进行了加压溶剂提取, 对马兜铃酸 I 和 II 的提取回收率做了考察, 使用外标法.. 项下的标准曲线计算药材中的马兜铃酸含量, 结果见表 6 结合马兜铃的回收率可见, 该法对不同药材 ( 来自不同植物或不同药用部位 ) 一次提取的回收率都在 95% 以上, 显示了良好的适用性, 这提示该法具有推广价值现把四种药材中马兜铃酸 I 和 II 的含量列表如下, 如表 7 所示表 6 关木通青木香广防己和马兜铃的 PLE 提取回收率 (n=3) Table 6 The PLE recovery of Caulis Aristolochiae manshuriensis, Radix Aristolochiae, Radix Arsitolochiae fangchi and Fructus Aristolochiae. (n=3) 药材名称药用部位待测成分回收率 (%) 第一次提取第二次提取第三次提取关木通藤茎 AAI 99.5± ± ±0.0 AAII 98.96±3.6.04±0.3 青木香根 AAI 98.84±.40.6±0.5 AAII 98.3±.46.87±0.38 广防己根 AAI 98.86±.33.4±0.80 AAII 马兜铃果实 AAI 97.94±.6.06±0.74 AAII 95.40± ±0.74 表 7 关木通青木香广防己和马兜铃中马兜铃酸 I 和 II 的含量 ( 单位 mg/g,n=3) Table 7 The contents of AAI & AAII in Caulis Aristolochiae manshuriensis, Radix Aristolochiae, Radix Arsitolochiae fangchi and Fructus Aristolochiae. (unit: mg/g,n=3) 关木通青木香广防己马兜铃 AAI.7307± ± ± ±0.08 AAII 0.687± ± ±0.004 各药材的色谱图如图所示 : 6

分的总量之比, 即 A Recovery = 00% n Ai i= 其中,Recovery 指回收率,A 指提取出的待测成分的量 (mg),i 指提取次数 ( 通常到待测成分不再被检出为止 ) 在使用优化条件从马兜铃中提取马兜铃酸时,AAI 和 AAII 的回收率分别为 95.

7 mau A min mau B min mau C min 7

8 mau D min mau E min 图标准品和四种药材加压溶剂提取的色谱图 A: 马兜铃酸标准品 ;B: 马兜铃 ;C: 关木通 ;D: 青木香 ;E: 广防己峰的编号及名称 : 马兜铃酸 II; 马兜铃酸 I Fig HPLC diagram of AA standards and the four plants. A. AA standards; B. Fructus Aristolochiae; C. Caulis Aristolochiae manshuriensis; D. Radix Arsitolochiae; E. Radix Arsitolochiae fangchi. Peaks:. Aristolochic acid II;. Aristolohchic acid I..3 与其它方法的比较 [8].3. 超声提取方法 : 根据张翠英等人的超声提取方法, 本实验作适当修正后, 确定样品超声处理方法如下 : 将马兜铃药材粉碎后称取.00 g, 装入 50 ml 具塞锥形瓶中, 精密加入 0.00 ml 甲醇, 超声提取 5 min, 超声功率.8 kw 超声完毕冷却后补重, 取适量溶液离心 (5400 r/min, 5 min), 过 0.45 μm 微孔滤膜后进样 [0].3. 索氏提取方法 : 依据张兰桐等人的报道, 并结合实验时的实际情况, 确定样品的索氏提取方法如下 : 将马兜铃药材粉碎后称取.00 g, 装入索氏提取仪 8

Radix Arsitolochiae fangchi. Peaks:. Aristolochic acid II;. Aristolohchic acid I..3 与其它方法的比较 [8].3. 超声提取方法 : 根据张翠英等人的超声提取方法, 本实验作适当修正后, 确定样品超声处理方法如下 : 将马兜铃药材粉碎后称取.

9 中, 用 80 ml 甲醇加热回流 5 h 提取完毕后, 将提取液定容至 00 ml, 过 0.45 μm 微孔滤膜后进样.3.3 与传统提取方法的对比 : 结果如表 8 所示可以看出, 三种方法中, 加压溶剂提取的效率显著高于其他两种传统方法 (P<0.05) 而且加压溶剂提取耗时短, 有机溶剂用量少表 8 加压溶剂提取与传统提取方法的对比 (n=3) 方法名称提取时间一次操作时间消耗的溶剂提取效率 (mg/g) (min) (h) (ml) AAI AAII 加压提取 ± ±0.004 超声提取 ± ± 索氏提取 ± ± 讨论通过上面的讨论, 可以看出提取溶剂药材粒径提取温度和提取压力等因素是影响 PLE 提取的主要参数提取溶剂是加压溶剂提取中的关键性因素 [4] 因马兜铃酸带有一个羧基, 具有一定极性, 故当使用极性较小的乙酸乙酯进行提取时, 效率较低甲醇的溶解性较好, 是常用溶剂, 又因其极性较强, 故对马兜铃酸有较好的提取能力水对马兜铃酸的提取也较好, 可能是因为水和甲醇的极性都与马兜铃酸相近的缘故另一方面, 由于水对药材基质有溶胀作用 [5], 故水的加入对于提取有利, 这也可能是水与甲醇的溶剂组合在实验中提取效率最高的原因之一药材粉末的目数, 即粒度分布同样是影响提取效率的一个重要因素通常药材粉末越细, 提取效率越高因为一方面当药材粒径减小时药材的比表面积增大, 与溶剂接触更加充分 ; 另一方面药材中的成分从基质扩散到表面的时间更短, 因此一般来讲粒径的减小可以大幅度提高提取效率 [5] 温度是 PLE 提取中最关键的参数之一一方面温度提高了溶质的溶解平衡, 即提高了溶解度, 另一方面也大大加快了溶质的传质过程, 也就是提高了扩散速率 PLE 正是使提取溶剂获得了远高于正常沸点的高温, 才获得了相当高的提取效率但是待测成分在提取温度下的稳定性是一个需要考虑的问题, 在本实验中, 有报道表明马兜铃酸在高温 (0 ) 下稳定 [6], 所以本法温度适合压力在本文中也有显著性影响在加压溶剂提取中施加高压是为了保证溶剂在高温下仍旧可以保持液态, 同时, 高压还有助于溶剂进入药材基质内部, 打断被提取成分与基质之间的作用力, 从而提高提取效率除了以上参数以外, 提取方式也是一个需要注意的因素 Eng-Shi Ong 等人 [6] 用自行组装的动态加压溶剂提取设备对青木香中马兜铃酸 I 和 II 的提取条件进行了优化但该法的提取时间需 5~0 min, 且为非自动化, 操作相对复杂, 故本实验中静态提取的方法优势较明显当然由于动静态提取都在进一步发展中, 孰优孰劣还需深入研究 4. 结论在静态加压溶剂提取条件下, 提取溶剂种类药材粒径提取温度提取压力药材加入量对马兜铃酸 I 和 II 的提取效率影响显著, 而提取时间冲洗体积和循环次数的影响较小与传统的超声和索氏提取对比后,PLE 方法显示了更高的提取效率, 且操作简便, 耗时短, 重现性好, 采用优化的方法一次可将不同药材中的马兜铃酸提取完全, 表明它不仅适用于马兜铃药材的提取, 对于其它含马 9

004 超声提取 5 0 0.597±0.0055 0.094±0.0004 索氏提取 300 6 80 0.64±0.06 0.065±0.005 3.

10 兜铃酸的药材中马兜铃酸类物质的提取也有很好的适用性与动态加压溶剂提取的对比显示静态提取的方法耗时短, 操作简便, 因此在马兜铃酸的提取中更具优势致谢本文作者感谢博士生杨丰庆高建莉和李鹏对本研究的宝贵指导, 感谢实验室技术员黎畅明对本实验的大力支持, 感谢梁雪丹同学的重要帮助参考文献 [] Ch P( 中国药典 )[S]. Vol I [] Tong Y Q,Hou H M,Piao Z X,et al. The mechanism of aristolochic acid nephropathy [J]. International Journal of Urology and Nephrology( 国际泌尿系统杂志 ),006,6():7-73. [3] Arlt VM,Stiborova M, Schmeiser HH. Aristolochic acid as a probable human cancer hazard in herbal remedies: a review [J]. Mutagenesis,00, 7(4): [4] Vanherweghem JL,Depierreux M,Tielemans C,et al. Rapidly progressive interstitial renal fibrosis in young women: association with slimming regimen including Chinese herbs [J]. Lancet,993,34: [5] Jean-Robert loset, Guy Emmanuel Raoelison, Kurt Hostettmann. An LC/DAD-UV/MS method for the rapid detection of Aristolochic Acid in plant preparations [J]. Planta Med,00,68: [6] Shun-An Chan,Ming-Jyh Chen,Tsung-Yun Liu,et al. Determination of aristolochic acids in medicinal plant and herbal product by liquid chromatography-electrospray-ion trap mass spectrometry [J]. Talanta,003, 60: [7] Li L,Wang Z M,Gao H M,et al. Determination of total aristolochic acid in traditional Chinese medicines containing aristolochic acid by ultraviolet spectrophotometry [J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae( 中国实验方剂学杂志 ),006,():-3. [8] Zhang C Y,Wang X,Shang M Y,et al. Simultaneous determination of five aristolochic acids and two aristololactams in Aristolochia plants by highperformance liquid chromatography [J]. Biomed. Chromatogr,006,0: [9] Jiang X,Wang Z M,You L S,et al. Determination of aristolochic acid A in Radix Aristolochiae and Herba Asari by RP-HPLC [J]. China Journal of Chinese Materia Medica( 中国中药杂志 ),004,9(5): [0] Zhang L T,Cui X H,Yuan Z F,et al. RP-HPLC assay of aristolochic acid A in Chinese traditional Medicine materials and their compound preparations [J]. Chin J Pharm Anal( 药物分析杂志 ),003,3(3):5-8. [] Zhao N,Lai J F,Bi K S. Determination of aristolochic acid A in Radix Aristolochiae by RP-HPLC [J]. Journal of Shengyang 0

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说明为了反映教运行的基本状态, 为校和院制定相关政策和进行教建设与改革提供据依据, 校从程资源 ( 开类别开量规模 ) 教师结构程考核等维度, 对 2015 年春季期教运行基内部资料东北师范大教运行基本状态据报告 2015 年春季期教务处 2015 年 10 月 27 日说明为了反映教运行的基本状态, 为校和院制定相关政策和进行教建设与改革提供据依据, 校从程资源 ( 开类别开量规模 ) 教师结构程考核等维度,