孙 韩 艳 等 : 藻 毒 素 MC-LR 促 二 乙 基 亚 硝 胺 诱 发 大 鼠 肝 癌 模 型 建 立 的 方 法 377 DEN( 上 海 梯 希 爱 化 成 工 业 发 展 有 限 公 司 ); GST-Pi 抗 体 ( 武 汉 博 士 德 生 物 工 程 有 限 公 司 ); 辣 根

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1 中 国 细 胞 生 物 学 学 报 Chinese Journal of Cell Biology 2012, 34(4): 技 术 与 方 法 藻 毒 素 MC-LR 促 二 乙 基 亚 硝 胺 诱 发 大 鼠 肝 癌 模 型 建 立 的 方 法 孙 韩 艳 徐 昌 志 汪 宇 李 玉 成 黄 蓓 * ( 安 徽 大 学 生 命 科 学 学 院, 合 肥 ) 摘 要 肝 癌 动 物 模 型 有 助 于 肝 癌 发 病 过 程 中 分 子 机 制 的 研 究 二 乙 基 亚 硝 胺 (DEN) 是 一 种 众 所 周 之 的 化 学 致 癌 剂, 已 被 广 泛 用 于 动 物 肝 癌 模 型 的 建 立 藻 毒 素 MC-LR 是 一 种 由 蓝 藻 产 生 的 环 状 七 肽 毒 素, 其 低 浓 度 的 慢 性 毒 性 具 有 潜 在 的 促 癌 作 用 该 实 验 以 DEN 联 合 不 同 浓 度 的 藻 毒 素 MC-LR 通 过 腹 腔 注 射 共 同 诱 发 大 鼠 肝 癌 模 型 从 形 态 学 病 理 学 角 度 分 别 观 察 大 鼠 肝 脏 外 观 和 肝 细 胞 的 变 化 ; 从 蛋 白 质 水 平 运 用 免 疫 印 迹 法 检 测 谷 胱 甘 肽 -S- 转 移 酶 (GST-Pi) 的 表 达 情 况 结 果 表 明, 模 型 组 中 大 鼠 肝 癌 癌 变 过 程 大 致 经 过 肝 细 胞 损 伤 期 肝 细 胞 增 生 硬 化 期 和 肝 细 胞 癌 变 期 三 个 阶 段 其 中, DEN 联 合 终 浓 度 为 10 µg/kg 的 藻 毒 素 MC-LR 处 理 时 促 癌 效 果 最 佳 该 方 法 可 作 为 一 种 新 型 的 大 鼠 肝 癌 模 型 建 立 方 法 为 今 后 的 研 究 奠 定 基 础 关 键 词 微 囊 藻 毒 素 MC-LR; 肝 癌 模 型 ; 促 癌 作 用 近 年 来, 蓝 藻 水 华 现 象 越 来 越 严 重 虽 然 蓝 藻 本 身 无 危 害 性, 但 它 产 生 的 次 级 代 谢 产 物 藻 毒 素 会 严 重 威 胁 到 人 类 和 动 物 的 健 康 伴 随 着 蓝 藻 水 华 的 频 频 发 生, 很 多 湖 泊 中 都 富 含 大 量 的 藻 毒 素 类 似 的 现 象 不 仅 发 生 在 中 国, 非 洲 和 欧 洲 等 许 多 国 家 都 深 受 其 害 研 究 发 现, 藻 毒 素 至 少 有 60 多 种 异 构 体, 其 中 微 囊 藻 毒 素 -LR(MC- LR) 是 一 种 研 究 最 多 危 害 最 严 重 的 藻 毒 素 [1] 这 类 藻 毒 素 不 仅 具 有 强 烈 的 急 性 毒 性, 在 低 浓 度 的 情 况 下 还 可 以 通 过 慢 性 效 应 诱 发 肿 瘤 的 发 生 [2] 研 究 显 示, MC-LR 是 一 种 环 状 七 肽 毒 素, 其 主 要 靶 器 官 是 肝 脏, 可 从 血 液 中 转 移 到 肝 脏, 主 要 表 现 为 使 肝 脏 充 血 肿 大 甚 至 肝 出 血 和 坏 死, 因 而 日 益 受 到 人 们 的 关 注 [3] 藻 毒 素 本 身 不 能 直 接 诱 发 肝 癌, 而 是 需 要 在 有 启 动 剂 的 情 况 下 促 进 肝 癌 的 发 生 二 乙 基 亚 硝 胺 (DEN) 是 国 际 肿 瘤 研 究 中 心 机 构 确 定 的 致 癌 物 质, 它 可 以 启 动 肝 癌 的 发 生, 利 用 DEN 建 立 的 大 鼠 肝 癌 模 型 可 以 模 拟 人 体 肝 癌 病 变 的 过 程 [4] [5] 赵 金 明 等 曾 用 水 华 蓝 藻 粗 提 物 联 合 DEN 建 立 大 鼠 肝 癌 模 型, 结 果 显 示 实 验 组 动 物 肝 脏 产 生 结 节 性 增 生 灶, 藻 毒 素 单 独 作 用 不 能 诱 导 谷 胱 甘 肽 硫 转 移 酶 (GST-Pi) 蛋 白 质 和 GST-Pi mrna 表 达, 但 能 够 促 进 DEN 诱 导 产 生 的 GST-Pi mrna 及 蛋 白 质 的 表 达, 提 示 藻 毒 素 具 有 促 癌 活 性 但 其 实 验 所 用 的 藻 毒 素 为 从 水 华 水 体 藻 样 中 抽 提 的 初 提 物, 并 没 有 藻 毒 素 纯 度 及 类 别 鉴 定 的 数 据, 而 藻 毒 素 有 60 多 种, 不 同 时 间 地 点 所 收 集 的 水 体 藻 样 品 中 藻 毒 素 的 含 量 及 类 别 是 有 差 异 的, 这 些 都 增 加 了 实 验 结 果 的 不 确 定 性 目 前, 诱 发 大 鼠 肝 癌 的 给 药 途 径 较 多, 主 要 有 经 口 给 药 法 和 注 射 给 药 法 经 口 给 药 法 一 般 又 分 为 口 服 和 灌 胃 两 种 前 者 操 作 简 单, 但 受 大 鼠 饮 水 量 的 影 响, 使 得 诱 癌 剂 的 剂 量 不 能 准 确 控 制 ; 而 后 者 则 可 准 确 控 制 诱 癌 剂 的 剂 量, 不 过 长 期 灌 胃 对 大 鼠 机 体 有 一 定 的 损 害 注 射 法 也 是 一 种 常 用 的 方 法, 可 经 各 种 途 径 注 入 不 同 的 部 位, 其 中 以 腹 腔 注 射 最 为 常 用 [6] 有 [7] 文 献 报 道 指 出, 体 内 诱 癌 实 验 中 藻 毒 素 的 低 浓 度 范 围 不 大 于 20 µg/kg 因 此, 本 实 验 利 用 DEN 分 别 联 合 1, 10, 20 µg/kg 的 藻 毒 素 MC-LR, 通 过 腹 腔 注 射 的 方 法 建 立 大 鼠 肝 癌 模 型, 找 出 了 MC-LR 促 癌 的 最 佳 浓 度 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 Microcystin-LR(Taiwan Algaln Science 公 司 ); 收 稿 日 期 : 接 受 日 期 : 安 徽 省 自 然 科 学 基 金 (No ) 资 助 项 目 * 通 讯 作 者 Tel: , beihuang@163.com

2 孙 韩 艳 等 : 藻 毒 素 MC-LR 促 二 乙 基 亚 硝 胺 诱 发 大 鼠 肝 癌 模 型 建 立 的 方 法 377 DEN( 上 海 梯 希 爱 化 成 工 业 发 展 有 限 公 司 ); GST-Pi 抗 体 ( 武 汉 博 士 德 生 物 工 程 有 限 公 司 ); 辣 根 酶 标 记 山 羊 抗 兔 IgG( 中 山 金 桥 公 司 ); ECL 化 学 发 光 检 测 试 剂 盒 (BestBio 公 司 ) 1.2 实 验 动 物 SPF 级 雄 性 SD 大 鼠, 体 重 (150±5) g, 购 自 安 徽 省 实 验 动 物 中 心 1.3 大 鼠 肝 癌 促 进 模 型 的 构 建 购 买 的 雄 性 SD 大 鼠 给 予 一 周 的 适 应 时 间 后 随 机 分 为 8 组, 每 组 15 只 : (1)DEN 处 理 组 : 腹 腔 注 射 0.25% DEN 溶 液 ( 终 浓 度 为 10 mg/kg); (2)MC-LR 处 理 组 : 腹 腔 注 射 不 同 浓 度 (1, 10, 20 µg/kg) 的 藻 毒 素 MC- LR; (3)DEN+MC-LR 处 理 组 : 腹 腔 注 射 0.25% DEN 溶 液 ( 终 浓 度 为 10 mg/kg) 和 不 同 浓 度 (1, 10, 20 µg/kg) 的 藻 毒 素 MC-LR; (4) 正 常 对 照 组 : 腹 腔 注 射 等 量 生 理 盐 水 以 上 实 验 每 5 天 处 理 一 次, 共 处 理 16 周 在 不 同 时 期, 注 意 观 察 大 鼠 的 食 欲 饮 水 精 神 等 情 况 1.4 HE 病 理 学 检 测 分 别 于 第 4, 8, 12, 16 周 末 处 死 大 鼠, 解 剖 取 肝, 记 录 体 重 肝 重, 并 观 察 肝 脏 的 颜 色 和 质 地, 取 部 分 组 织 经 10% 中 性 甲 醛 固 定 24 h, HE 染 色 后 光 镜 观 察 其 他 组 织 冻 存 于 80 ºC 冰 箱 有 待 于 后 续 蛋 白 质 的 检 测 1.5 GST-Pi 蛋 白 免 疫 印 迹 (Western blot) 检 测 取 冻 存 组 织 超 声 裂 解, 4 ºC 条 件 下 r/min 离 心 10 min 后 取 上 清 进 行 Western blot, 检 测 GST-Pi 蛋 白 质 的 表 达 量 1.6 数 据 处 理 与 分 析 图 片 均 用 Photoshop 软 件 进 行 处 理 ; 统 计 学 数 据 采 用 Excel 软 件 进 行 分 析, P<0.05 为 显 著 性 差 异, P<0.01 为 极 显 著 性 差 异 2 结 果 2.1 大 鼠 肝 重 体 重 比 值 (liver body index, LBI) 的 变 化 由 表 1 可 以 看 出, 正 常 对 照 组 和 不 同 浓 度 藻 毒 素 单 独 处 理 组 LBI 在 不 同 时 间 段 变 化 不 大, 而 DEN 单 独 处 理 组 和 DEN 联 合 藻 毒 素 处 理 组 大 鼠 LBI 均 出 现 不 同 程 度 的 增 长 趋 势, 其 中 DEN 联 合 藻 毒 素 MC-LR( 终 浓 度 为 10 µg/kg) 处 理 组 LBI 较 其 他 组 增 长 明 显, 在 不 同 时 期 与 处 理 早 期 相 比, 经 统 计 学 检 验 均 有 极 显 著 性 差 异 (P<0.01), 表 明 藻 毒 素 具 有 明 显 的 促 进 肝 细 胞 增 殖 的 作 用 ( 表 1) 表 1 不 同 处 理 组 在 不 同 时 间 的 大 鼠 LBI 值 Table 1 LBI of rats after different treatments at different time LBI(%) 组 别 4 周 8 周 12 周 16 周 Groups 4 weeks 8 weeks 12 weeks 16 weeks Control 4.07± ± ± ±0.05 DEN(10 mg/kg) 4.35± ± ±0.24* 7.51±0.10** DEN+MC-LR(1 µg/kg) 4.33± ± ± ±0.29** DEN+MC-LR(10 µg/kg) 4.35± ±0.21** 7.21±0.13** 9.09±0.19** DEN+MC-LR(20 µg/kg) 4.31± ±0.19* 6.49±0.03** 7.71±0.08** MC-LR(1 µg/kg) 4.08± ± ± ±0.04 MC-LR(10 µg/kg) 4.09± ± ± ±0.10 MC-LR(20 µg/kg) 4.08± ± ± ±0.07 *P<0.05, **P< 大 鼠 肝 脏 表 观 图 不 同 处 理 组 大 鼠 16 周 后 肝 脏 表 观 差 别 明 显, 其 中 对 照 组 大 鼠 肝 脏 呈 鲜 红 色 表 面 光 滑 边 缘 锐 利 质 地 较 软, 未 见 异 常 ; 而 DEN 处 理 组 大 鼠 肝 表 面 粗 糙 且 无 血 色, 肝 脏 质 地 坚 硬 ; 不 同 浓 度 藻 毒 素 单 独 处 理 组 肝 脏 颜 色 均 呈 暗 红 色, 其 中 终 浓 度 为 10 µg/kg 的 MC-LR 处 理 时 肝 脏 出 现 严 重 肿 大 现 象 ; DEN 联 合 MC-LR 处 理 组 均 出 现 了 大 小 不 一 的 灰 白 色 圆 形 小 结 节 ; 其 中 DEN 联 合 MC-LR( 终 浓 度 为 10 µg/kg) 处 理 组 最 早 成 癌, 结 节 数 目 多, 直 径 多 在 5 mm 左 右 ( 图 1) DEN 联 合 MC-LR( 终 浓 度 为 10 µg/kg) 处 理 组 在 诱 癌 至 4 周 时, 肝 脏 未 见 明 显 异 常, 但 无 血 色 ; 诱 癌 至 8 周 时, 肝 脏 质 地 由 软 变 硬, 表 面 逐 渐 粗 糙 ; 至 12 周 时, 肝 脏 质 地 较 硬, 出 现 典 型 的 肝 硬 化 现 象, 开 始 出

3 技术与方法 378 图1 不同处理组大鼠16周时肝脏外观形态变化 Fig.1 Morphological changes of liver in rats treated with DEN and MC-LR at 16th week 现数量不等 大小不一的灰白色圆形病灶, 直径大 见细胞核肿大现象, 胞核比例增大, 核分裂相增多, 结 多在1 mm以下; 至16周时, 肝脏表面粗糙, 出现多个 节内的肝细胞异型增生明显, 并出现多核细胞和巨核 大小不一的灰白色癌结节, 可见出血和坏死, 解剖时 细胞, 具有明显的再生作用; DEN联合MC-LR(终浓度 腹水现象严重(图2) 为20 µg/kg)处理组肝细胞内可见大小不等的脂质空泡, 2.3 肝脏HE病理形态学观察 光镜下观察 16周时大鼠肝脏的组织细胞学变化 肝脂肪变性严重; MC-LR单独处理组肝细胞变化不明 显, 血细胞分散在肝脏内, 但MC-LR(终浓度为10 µg/kg) (图3), 发现正常对照组肝细胞以中央静脉为中心呈 处理组肝细胞体积增大, 胞浆透明 淡染 疏松, 并 放射状排列, 肝小叶结构正常, 无变性和坏死等现象; 有轻微水肿现象 DEN组肝小叶组织结构破坏, 肝细胞索排列紊乱, 炎 DEN联合MC-LR(终浓度为10 µg/kg)处理组大 症细胞侵润现象严重, 并伴有门脉性肝硬化小胆管 鼠肝脏病理学改变大致分为三期: (1)诱癌至4周时 增生现象; DEN联合MC-LR(终浓度为1 µg/kg)处理组 为肝细胞损伤期, 肝小叶结构尚完整, 但细胞排列紊 大鼠肝损伤严重, 大量炎症细胞侵润, 由增生的纤维 乱, 胞浆疏松, 炎症细胞散在性分布于小叶中; (2)诱 组织包裹形成大小相仿的假小叶结构; DEN联合MC- 癌8周至12周时为肝细胞增生 硬化期, 其中, 8周末 LR(终浓度为 10 µg/kg)处理组炎症细胞侵润严重, 可 肝细胞开始变性水肿 体积明显变大 小叶内可 图2 DEN联合MC-LR(10 µg/kg)处理组大鼠肝脏外观形态变化 Fig.2 Morphological changes of liver in rats treated with DEN and 10 µg/kg MC-LR

4 孙韩艳等: 藻毒素MC-LR促二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌模型建立的方法 379 图3 16周时DEN与不同浓度的藻毒素处理的大鼠肝脏病理学变化(200 ) Fig.3 Pathological changes of livers treated with DEN and MC-LR in rats at 16th week(200 ) 见炎症细胞侵润严重, 12周末时肝组织肝硬化小胆 可见多核细胞和巨核细胞(图4) 管增生现象严重, 由纤维组织包绕形成假小叶结构 并出现癌细胞增生现象; (3)16周时为肝细胞癌变期, 2.4 GST-Pi蛋白质表达量检测 GST-Pi是目前公认的反映肝细胞癌前病变的生 细胞核明显增大, 胞核比例增大, 核分裂相增多, 尚 物标志物 利用免疫印迹法检测DEN单独处理组和 图4 DEN与藻毒素MC-LR(终浓度为10 µg/kg)处理不同时期的大鼠肝脏病理学变化(200 ) Fig.4 Pathological changes of livers treated with DEN and 10 µg/kg MC-LR at different time(200 ) DEN联合 MC-LR(终浓度为 10 µg/kg)处理组不同时 期大鼠肝脏中 GST-Pi的表达水平, 发现处理前大鼠 肝组织中GST-Pi不表达, 而DEN联合MC-LR(终浓度 为10 µg/kg)处理组gst-pi在肝细胞损伤期开始表达; 在肝细胞增生期 肝硬化期GST-Pi表达明显增强, 且 随着时间的延长呈递增趋势 ; 肝细胞癌变期 GST-Pi 表达水平与处理前相比增强最多(图5) DEN单独处 理组 GST-Pi表达水平递增趋势变化不明显, 同一时 间段的 GST-Pi表达水平相对于 DEN联合 MC-LR(终 浓度为10 µg/kg)处理组低(图6) 图5 DEN联合10 µg/kg MC-LR处理不同时间GST-Pi蛋白 质的表达变化情况 Fig.5 Expression of GST-Pi protein after treatment with DEN and 10 µg/kg MC-LR at different time

5 380 技 术 与 方 法 图 6 DEN 处 理 不 同 时 间 GST-Pi 蛋 白 质 的 表 达 变 化 Fig.6 Expression of GST-Pi protein after treatment with DEN at different time 3 讨 论 大 鼠 肝 癌 模 型 对 于 研 究 人 类 原 发 性 肝 癌 的 发 生 机 理 是 十 分 有 用 的, 实 验 大 鼠 依 然 是 一 个 研 究 体 内 肝 癌 发 生 最 理 想 的 模 式 动 物 目 前, 有 很 多 化 学 物 质 都 可 以 诱 发 大 鼠 原 发 性 肝 癌 [8] 其 中, 二 乙 基 亚 硝 胺 是 一 种 强 烈 的 化 学 致 癌 物, 对 肝 脏 具 有 特 异 的 亲 和 性, 它 诱 发 的 动 物 原 发 性 肝 癌 的 发 生 过 程 与 人 类 肝 癌 发 生 过 程 相 似 度 很 高, 因 此 DEN 诱 发 的 大 鼠 肝 癌 模 型 被 广 泛 用 于 科 学 研 究 科 学 研 究 已 经 证 实 藻 毒 素 是 一 种 肝 毒 素, 并 且 是 一 种 潜 在 的 促 癌 剂, 高 浓 度 时 可 以 诱 导 细 胞 凋 亡 或 死 亡, 而 低 浓 度 藻 毒 素 的 慢 性 毒 性 能 够 促 进 细 胞 增 殖 和 肝 癌 的 发 生 目 前, 很 多 大 鼠 肝 癌 模 型 的 建 立 是 采 用 DEN 作 为 首 次 启 动 剂 并 使 用 一 次 性 腹 腔 注 射 或 是 慢 性 饮 水 的 方 法, 也 有 采 用 DEN 联 合 初 提 藻 毒 素 的 方 法 共 同 建 立 模 型 的, 但 这 些 方 法 成 模 周 期 较 长 且 充 满 了 不 确 定 性 本 实 验 不 仅 将 DEN 作 为 一 种 启 动 剂, 还 用 DEN 联 合 藻 毒 素 进 行 腹 腔 注 射 建 立 肝 癌 模 型, 从 形 态 学 病 理 学 以 及 蛋 白 质 水 平 来 研 究 藻 毒 素 对 大 鼠 的 促 癌 作 用, 发 现 藻 毒 素 的 促 癌 效 果 具 有 明 显 的 剂 量 效 应 关 系, 并 且 找 出 了 藻 毒 素 促 癌 的 最 佳 剂 量 实 验 结 果 显 示, 16 周 时 正 常 组 和 MC-LR 单 独 处 理 组 大 鼠 无 死 亡 现 象, DEN 单 独 处 理 组 及 DEN 联 合 藻 毒 素 处 理 组 大 鼠 死 亡 率 为 2.5%, 其 中 存 活 大 鼠 的 诱 癌 成 功 率 为 96% 正 常 对 照 组 和 不 同 浓 度 藻 毒 素 单 独 处 理 组 大 鼠 精 神 和 食 欲 较 正 常, 肝 重 体 重 比 值 在 不 同 时 间 段 变 化 不 大 ; 而 DEN 单 独 处 理 组 和 DEN 联 合 藻 毒 素 处 理 组 大 鼠 在 诱 癌 后 期 精 神 萎 靡, 食 欲 不 振, 尿 液 偏 黄, 流 鼻 血 现 象 严 重, 体 重 增 长 较 慢, 肝 重 体 重 比 值 均 出 现 不 同 程 度 的 增 长 趋 势, 其 中 DEN 联 合 藻 毒 素 MC-LR( 终 浓 度 为 10 µg/kg) 处 理 组 大 鼠 腹 水 现 象 严 重, 肝 重 体 重 比 值 较 其 他 组 增 长 明 显 同 时 病 理 学 结 果 显 示 DEN 联 合 藻 毒 素 MC-LR( 终 浓 度 为 10 µg/kg) 处 理 组 相 对 DEN 单 独 处 理 组 和 DEN 联 合 其 它 浓 度 藻 毒 素 处 理 组 在 同 [9] 一 时 间 段 的 促 癌 效 果 更 明 显 有 文 献 报 道, DEN 单 独 促 癌 7 周 时 出 现 肝 损 伤 现 象, 到 25 周 时 为 肝 硬 化 期, 30 周 时 才 形 成 肝 癌 而 本 实 验 中 肝 癌 发 生 的 不 同 阶 段 均 缩 短 了 时 间, 在 12 周 时 就 进 入 了 肝 硬 化 期, 16 周 时 癌 症 形 成 而 藻 毒 素 单 独 处 理 组 大 鼠 肝 脏 较 正 常 对 照 组 颜 色 较 深, 血 管 丰 富, 只 出 现 轻 微 水 肿 现 象, 并 不 能 诱 发 肝 癌, 说 明 藻 毒 素 单 独 作 用 不 能 启 动 肝 癌 的 发 生, 但 是 在 低 浓 度 的 情 况 下 能 促 进 启 动 后 的 肝 癌 发 生 有 趣 的 是, DEN 联 合 20 µg/kg MC-LR 处 理 组 与 DEN 联 合 10 µg/kg MC-LR 处 理 组 相 比, 后 者 促 癌 效 果 更 明 显, 这 可 能 是 由 于 20 µg/kg MC-LR 处 于 促 细 胞 生 长 和 促 细 胞 凋 亡 的 过 渡 阶 段, 其 具 体 机 制 有 待 进 一 步 的 研 究 谷 胱 甘 肽 硫 转 移 酶 是 反 映 肝 癌 前 期 病 变 的 一 个 标 志 物, 在 正 常 大 鼠 肝 组 织 中 几 乎 不 表 达, 但 在 化 学 物 质 诱 导 肝 癌 发 生 发 展 的 早 期 可 被 迅 速 激 活 出 现 持 续 性 高 表 达 本 实 验 的 免 疫 印 迹 检 测 结 果 显 示, GST-Pi 的 表 达 随 处 理 时 间 延 长 呈 递 增 趋 势 正 常 组 织 中 GST-Pi 不 表 达, 而 DEN 联 合 藻 毒 素 MC-LR( 终 浓 度 为 10 µg/kg) 处 理 组 GST-Pi 在 4 周 时 开 始 表 达, 但 表 达 量 很 少 ; 此 后, GST-Pi 的 表 达 随 时 间 明 显 增 强 ; 至 16 周 时 GST-Pi 表 达 量 与 处 理 前 相 比 最 高, 这 与 形 态 学 和 病 理 学 上 的 三 个 阶 段 结 果 一 致 可 以 看 出, 与 使 用 DEN 单 独 造 模 相 比, DEN 联 合 10 µg/kg MC-LR 处 理 组 在 同 一 时 间 段 的 GST-Pi 的 表 达 增 幅 较 快 因 此, DEN 联 合 藻 毒 素 MC-LR( 终 浓 度 为 10 µg/kg) 诱 发 肝 癌 模 型 的 时 间 比 DEN 单 独 诱 发 肝 癌 的 时 间 更 短 且 效 果 更 显 著, 是 一 种 研 究 人 体 肝 癌 的 理 想 模 型 参 考 文 献 (References) 1 Qin W, Xu L, Zhang X, Wang Y, Meng X, Miao A, et al. Endoplasmic reticulum stress in murine liver and kidney exposed to microcystin-lr. Toxicon 2010; 56(8): Ueno Y, Nagata S, Tsutsumi T, Hasegawa A, Watanabe MF, Park HD, et al. Detection of microcystin, a blue-green algal hepatotoxin, in drinking water sampled in Haimen and Fusui, endemic areas of primary liver cancer in China, by highly sensitive immunoassay. Carcinogenesis 1996; 17(6): 闫 海, 潘 纲, 张 明 明. 微 囊 藻 毒 素 研 究 进 展. 生 态 学 报 2002; 22(11): 李 笑 岩, 白 成 勇, 刘 同 慎, 韩 玉 贞, 刘 利 德. 二 乙 基 亚 硝 胺 诱 发 大 鼠 肝 癌 模 型 的 建 立 及 病 理 学 改 变. 滨 州 医 学 院 学 报 2007;

6 孙 韩 艳 等 : 藻 毒 素 MC-LR 促 二 乙 基 亚 硝 胺 诱 发 大 鼠 肝 癌 模 型 建 立 的 方 法 (6): 赵 金 明, 蒋 颂 辉, 朱 惠 刚. 藻 毒 素 对 实 验 性 大 鼠 肝 癌 的 促 进 作 用. 中 国 公 共 卫 生 2003; 19(6): 张 海 波. 诱 发 性 大 鼠 肝 癌 模 型 的 研 究 现 状 与 评 价. 医 学 综 述 2002; 8(6): Gehringer MM. Microcystin-LR and okadaic acid-induced cellular effects: A dualistic response. FEBS Lett 2004; 557(1/2/3): Leenders MW, Nijkamp MW, Borel Rinkes IH. Mouse models in liver cancer research: A review of current literature. World J Gastroenterol 2008; 14(45): 周 峥 珍, 章 宗 籍, 钱 忠 义, 张 华 献, 申 丽 娟, 谢 桂 先. DEN 诱 发 大 鼠 肝 癌 模 型 的 实 验 病 理 研 究. 昆 明 医 学 院 学 报 2005; 26(3): An Established Method of Diethylnitrosamine-induced Hepatocellular Carcinomas Rats Model Promoted by Microcystins-LR Sun Hanyan, Xu Changzhi, Wang Yu, Li Yucheng, Huang Bei* (School of Life Science, Anhui University, Hefei , China) Abstract Animal models of hepatocellular carcinomas can be helpful to understand the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of hepatocellular carcinomas. Diethylnitrosamine (DEN) is a well known potent hepatocarcinogenic agent and is usually used to induce liver cancer in animal models. Microcystin-LR (MC- LR) is a cyclic heptapeptide toxin produced by cyanobacteria. MC-LR has the proficiency of cancer promotion by its chronic efficiency on human at low concentrations. In our study, hepatocellular carcinomas model of rats were induced by DEN and different concentrations of MC-LR through intraperitoneal injection. A series of changes in rat livers were observed with morphological and pathological techniques. At the same time, the expression levels of GST-Pi were detected by Western blot. The results showed that the procession of hepato-carcinogenesis in these models included three stages-hepatic toxic lesion: hepatic proliferation, hepatic cirrhosis and hepatic carcinogenesis. Particularly, the efficiency of tumor promotion with DEN and 10 µg/kg MC-LR was better than other groups. We have found a new way to establish hepatocellular carcinomas model in rats. Key words microcystins-lr; hepatocellular carcinomas models; tumor promotion Received: December 20, 2011 Accepted: January 19, 2012 This work was supported by the Natural Science Foundation of Anhui Province (No ) *Corresponding author. Tel: , beihuang@163.com

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