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1 ISSN CN / Q 中国生物化学与分子生物学报 http: / / cjbmb. bjmu. edu. cn Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology 2014 年 8 月 30(8):778 ~ 786 DOI: / j. cnki. cjbmb CHIR 与 FGF8 协同诱导人表皮干细胞牙向分化王冰梅, 刘英, 林程琳, 张彦定, 胡雪峰 ( 福建师范大学生命科学学院, 福建省发育与神经生物学重点实验室, 福州 ) 摘要人表皮干细胞 (human keratinocyte stem cells, hkscs) 可作为上皮源性的成体干细胞应用于牙齿再生, 但是其诱导效率较低. 本研究利用小分子化合物 CHIR 提高 hkscs 的 Wnt / β catenin 信号活性, 再与具有诱导成牙潜能的小鼠牙胚间充质重组, 构建嵌合体, 并移植裸鼠肾囊膜下培养 20 d. 将嵌合体组织切片, 并利用组织染色和免疫组化等方法鉴定牙齿结构. 结果显示, 经 FGF8 诱导处理的 hkscs 与小鼠牙胚间充质构成的嵌合体的成牙率为 27 80%, 其中成釉率仅为 40 00% ; 经 CHIR 诱导处理的 hkscs 与小鼠牙胚间充质构成的嵌合体的成牙率仅为 18 20%, 其中成釉率高达 100% ; 而 CHIR 与 FGF8 协同作用, 则进一步提高嵌合体成牙率至 40 00%, 其中成釉率也达 75 00%. 进一步的研究发现, 经 CHIR 处理后,hKSCs 的 Wnt / β catenin 信号活性明显提高, 同时 FGF8 的表达水平也显著上调. 以上结果表明,CHIR 可通过上调 Wnt / β catenin 信号活性水平, 同时促进 FGF8 表达, 与 FGF8 协同, 高效诱导 hkscs 分化为具有分泌釉质功能的成釉质细胞. 研究结果对利用 hkscs 作为上皮来源的成体细胞应用于人类牙齿再生的研究具有重要意义. 关键词人表皮干细胞 ; 牙齿再生 ;Wnt / β 联蛋白信号通路 ;CHIR 99021; 成纤维生长因子 8 中图分类号 Q813 Induction of Human Keratinocytes into Enamel secreting Ameloblasts through the Synergy of CHIR and FGF8 WANG Bing Mei, LIU Ying, LIN Cheng Lin, ZHANG Yan Ding, HU Xue Feng ( Fujian Key Laboratory of Developmental and Neurobiology, College of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou , Fujian, China) Abstract Human keratinocyte stem cells( hkscs) can be used as epithelial adult stem cells in tooth regeneration. But the tooth formation rate from such cells is relatively low. In this study, hkscs were treated with small molecules CHIR to activate the Wnt / β catenin pathway before the hkscs were recombined with mouse embryonic dental mesenchyme possessing odontogenic potential. Histology and immunohisto chemistry staining were used to detect the chimeric tooth. The results showed that the efficiency of tooth formation(tooth formation rate) of the chimeric tooth treated with FGF8 was 27 80%, and the efficiency of hkscs differentiation into ameloblasts(ameloblasts differentiation rate) was 40 00% among those formed teeth. CHIR could improve the ameloblast differentiation rate to 100%. The synergistic effect of CHIR and FGF8 could increase tooth formation rate to 40 00%, and ameloblast differentiation rate to 75 00%. Further research showed that CHIR could activate the 收稿日期 : ; 接受日期 : 国家自然科学基金青年科学基金 (No ), 教育部博士点基金 (No ), 福建省自然科学基金 ( No. 2011J01146), 福建省教育厅科技项目 (No. JA12081), 福建师范大学优秀青年骨干教师培养基金 (No. fjsdjk ) 联系人 Tel: ; E mail: bioxfh@ fjnu. edu. cn Received: April 25, 2014; Accepted: May 23, 2014 Supported by National Natural Science Foundation of China( No ), Doctoral Program of Higher Education of China( No ), Natural Science Foundation of Fujian Province( No. 2011J01146), Scientific Research Fund of Fujian Provincial Education Department( No. JA12081), Excellent Young Key Teachers Program of Fujian Normal University( No. fjsdjk ) Corresponding author Tel: ; E mail: bioxfh@ fjnu. edu. cn

cells, hkscs) 可作为上皮源性的成体干细胞应用于牙齿再生, 但是其诱导效率较低.

2 第 8 期王冰梅等 : CHIR 与 FGF8 协同诱导人表皮干细胞牙向分化 779 Wnt / β catenin signaling for hkscs, and increase protein and mrna levels of FGF8. These results indicated that CHIR could activate the Wnt / β catenin signaling for hkscs and simultaneously enhance FGF8 expression, which increased the induction of hkscs into ameloblasts. This study provides relevant experimental data for tooth regeneration which use hkscs as a source of human epithelial stem cells. Key words human keratinocyte stem cells; tooth regeneration; Wnt / β catenin signaling; CHIR 99021; fibroblast growth factors 8 牙齿发育是由外胚层上皮来源细胞和颅神经嵴间充质来源细胞相互作用的结果, 利用干细胞进行牙齿再生同样需要上皮源性和间充质源性干细胞的参与 [1, 2]. 已有研究表明, 应用于牙齿再生的间充质源性成体干细胞的来源问题在理论上已获得解决 [3 6]. 然而, 寻找适合于人类牙齿再生的上皮源性的成体干细胞仍然是该领域的难题之一. [7] 本室的前期研究证实, 在具有成牙潜能的 E13 5( 胚胎 13 5 d) 小鼠的牙胚间充质诱导下, 上皮源性人表皮干细胞 (human keratinocyte stem cells, hkscs) 能够支持成牙本质细胞和牙本质的正常发育, 同时在成纤维生长因子 8 ( fibroblast growth factors 8,FGF8) 的诱导下,hKSCs 分化为成釉质细胞, 并且分泌有功能的釉质. 但是, 嵌合体的成牙率和成釉率不高. 分析原因与仅用单一 FGF8 成牙信号因子诱导, 将无法实现诱导 hkscs 向成釉质细胞分化的条件, 仍需要其它因子的协同作用. Wnt / β catenin 信号通路在小鼠牙齿发育过程发挥重要的作用 [8 10]. 在小鼠牙上皮过表达 Wnt / β catenin 信号通路, 无论是敲除抑制因子, 例如结肠腺瘤样息肉 ( Adenomatous polyposis coli, Apc), 还是过表达效应因子, 例如 β 联蛋白 (β catenin), 均可引起小鼠口腔的牙齿数目的增多 [10 12]. 由此推论, Wnt / β catenin 信号通路可能是牙上皮发育的关键 [13 16] 开关信号. 另据文献报道显示,FGF8 是 Wnt / β catenin 信号通路的直接下游基因之一. 因此, 本研究利用 CHIR 上调 hkscs 的 Wnt / β catenin 信号活性, 提高其 FGF8 及其它 Wnt / β catenin 信号通路的下游因子的表达, 继而再与具有成牙潜能的牙胚间充质重组成嵌合体, 以探究其诱导 hkscs 分化为成釉质细胞的作用. 1 材料与方法 1 1 材料从医院获取包皮环切手术弃废材料, 患者年龄 5 ~ 12 岁, 无其它疾病感染, 所有标本均得到患者家属知情同意, 按福建师范大学动物伦理委员会的相关规定执行. 10 周龄雌性和 12 周龄雄性昆明小鼠, 及 10 周龄 Blab / c 裸鼠均购于上海斯莱克公司. 人表皮细胞无血清培养基 ( keratinocyte serum free medium, KSFM, GIBCO 公司 ); NaCl KCl Na 2 HPO 4 和 KH 2 PO 4 ( Sigma 公司 );DispaseⅡ 胰蛋白酶和 FGF8 生长因子 (R&D 公司 ); 青霉素 / 链霉素 (Amresco 公司 ); 一抗 CD29 K15 和 K19 ( 鼠抗人,Neomarkers 公司 ); 一抗 K10 K14 K18 和 β 联蛋白 ( 鼠抗人,Santa Cruz 公司 ); 一抗人 MHC 和小鼠 MHC ( BioLegend 公司 ); 一抗 Ameloblastin 和 MMP 20 ( 羊抗人, Santa Cruz 公司 ); 一抗 Anti Active β Catenin ( Millipore 公司 ); 荧光二抗 (Invitrogen 公司 ) DAB 显色液 ( 北京中杉公司 ); 柠檬酸组织抗原修复液 ( 迈新公司 ); CHIR (Selleck 公司 );Trizol(Invitrogen 公司 ); 反转录试剂盒 M MLV RTase cdna Synthesis Kit ( TaKaRa 公司 ); RNase Inhibitor ( Roche 公司 ); DyNAmo colorflash SYBR Green qpcr Kit( Thermo 公司 ); 蛋白质标准分子量 (TaKaRa 公司 ). 1 2 hkscs 的分离和培养将手术切除的小儿包皮在 2 5 U / ml 分散酶 (dispase) 中, 4 消化过夜, 分离表皮层, 再用 0 25% 胰蛋白酶和 EDTA 混合液于 37 消化 15 min, 吹打成单细胞悬液 ; 使用 KSFM 培养液进行培养. 通过提高接种密度, 保持较低 Ca 2 + 浓度等维持表皮干细胞的未分化状态. 待细胞密度达到 70% ~ 80%, 利用 0 05% 胰蛋白酶 / 0 02% EDTA 进行细胞传代. 待细胞密度达到 90% 时, 可获得完整的表皮干细胞膜片. 1 3 hkscs 的鉴定生长曲线测定按以下步骤进行 : 将细胞接种于 96 孔培养板内, 设 5 个平行板, 每板 3 个平行孔,3 次重复实验, 分别于第 d 各取 1 板进行 MTT 实验. 细胞加入 MTT( 终浓度 0 5 g / L),37 继续培养 4 h. 弃上清, 每孔加 200 μl DMSO, 震荡摇匀. 酶联免疫测定仪测定每孔光吸收值 (A 490 ).

This study provides relevant experimental data for tooth regeneration which use hkscs as a source of human epithelial stem cells.

3 780 中国生物化学与分子生物学报第 30 卷细胞周期测定按以下步骤进行 : 消化收集对数生长期细胞, 用 PBS 洗涤细胞 2 次, 加入 1 ml 70% 冰乙醇于 4 固定过夜 ; 离心去除乙醇, 再用 PBS 洗涤细胞 2 次 ; 加入 1 ml PI 溶液, 4 避光染色 30 min, 流式细胞仪检测. 细胞免疫组化或免疫荧光检测按以下步骤进行 : 细胞传代时, 在新培养皿中放入灭菌的盖玻片 ; 当细胞爬片至盖玻片面积的 60% ~ 80% 时, 将盖玻片取出, PBS 清洗 2 次 ; 加入预冷 4% PFA 固定 30 min;pbs 清洗 3 次 ;37, 血清封闭 1 h; 加入一抗 ( 按说明书比例稀释 ) 过夜 ;PBS 清洗 2 次 ; 加入二抗 ( 按说明书比例稀释 )37 1 h( 如果非荧光二抗另需加入 DAB 显色液 );PBS 清洗 2 次 ; 封片, 免疫组化采用 Zeiss 显微镜拍照, 免疫荧光采用激光共聚焦显微镜 (Nikon,C1 Si) 拍照. 1 4 CHIR 处理 hkscs 待细胞密度达 70% ~ 80% 时, 更换为不添加生长因子的基础培养液 KSFM, 使其饥饿过夜. 第 2 d 在培养液中添加终浓度分别为和 20 μmol / L CHIR 作用 12 h,dmso(0 μmol / L) 作空白对照 ; 收集细胞, 提取蛋白质和 RNA 进行 Western 印迹和实时 PCR 检测, 获得最适的作用浓度. 设置 0 h 6 h 和 12 h 的时间梯度, 以最适浓度 CHIR 诱导处理 hkscs 不同时间, 收集细胞, 提取 RNA 进行实时 PCR 检测 AXIN2 的 mrna 水平, 获得最适的作用时间. 1 5 实时 PCR 按照 Trizol 试剂说明书提取各组细胞总 RNA, 按反转录试剂盒说明书将 RNA 反转录为 cdna. 按荧光实时定量 PCR 试剂盒说明书准备 20 μl PCR 扩增反应体系 : SYBR Green 10 μl, 上下游引物各 1 μl,cdna 2 μl, 双蒸水 6 μl. AXIN2 上游引物 : 5 TGGCGGCAGCAGAGGCAGTAC 3,AXIN2 下游引物 5 GCGGGCAGACTCAAGGGGTAG 3 ;FGF8 上游引物 :5 CCCCTTCGCAAAGCTCATCGT 3,FGF8 下游引物 5 CCTTGCCTTTGCCGTTGCTCT 3 ; GAPDH 上游引物 : 5 AGGTCGGAGTCAA CGGATTTGG 3, GAPDH 下游引物 : 5 AGGCTGTTGTCATACTTCTC ATGG 3. 在 Applied Biosystems 荧光定量 PCR 仪上反应, 条件为 94 预变性 10 min,94 20 s,56 30 s,68 30 s, 经 40 个循环. 以 GAPDH 作为内参对照基因, 运用 2 - ΔΔCt 法计算目的基因的相对表达量. 1 6 Western 印迹收集并裂解细胞, 离心沉淀后, 提取细胞蛋白质, 以 BCA 法测蛋白质浓度. 制备 8% ~ 15% 分离胶, 进行 SDS PAGE 后, 电转印至 PVDF 膜, 转膜后 5% BSA 封闭 1 h. 加入一抗 ( 兔抗 anti active β catenin 单克隆抗体,1 500) 孵育 4 过夜, 洗膜后用荧光二抗避光孵育 2 h,β 联蛋白抗体 ( ) 同上操作, 作为内参对照. 在凝胶成像系统上观察目的条带, 拍照并分析. 利用目的蛋白与 β 联蛋白灰度值之比计算 β 联蛋白表达量. 1 7 小鼠牙胚间充质的分离嵌合体重组和移植取怀孕第 13 5 d( E13 5) 小鼠, 在解剖镜下用尖镊取下其头部, 然后分离下颌. 将下颌放置于 2 U / ml 分散酶 Ⅱ37 消化 10 min, 吸弃消化液后用 PBS 清洗, 加入含 10% 胎牛血清的 DMEM 终止消化 5 ~ 10 min. 解剖镜下将口腔上皮和牙上皮从下颌表面剥离, 再将磨牙牙胚间充质从下颌弓区域分离出来. 将小鼠牙胚间充质转移到 0 45 μm 的滤膜上 ( 保持牙胚的口腔面向上 ), 同时刮下 hkscs 细胞膜片, 使其平整的覆盖在牙胚间充质上. 将载有重组组织块的滤膜转移到 Trowell 器官培养皿内, 加入含有 10% 胎牛血清的 DMEM, 使 DMEM 淹没重组组织块的 1 / 2, 在 37,CO 2 培养箱内过夜. 第 2 d 将重组组织块植入裸鼠肾囊膜下, 手术缝合后继续培养 20 d. 1 8 组织学染色和免疫组化将在裸鼠肾囊膜下培养 20 d 的重组嵌合体移植块取出, 置于 4% 多聚甲醛固定过夜 ; 在 4 条件下用脱钙液进行脱钙, 脱钙液隔天换液, 直至组织块变软 ; 梯度酒精进行组织块脱水, 无水乙醇脱水 2 次 ;50% 无水乙醇和 50% 二甲苯混合液透明, 二甲苯透明 ; 石蜡包埋 ; 待石蜡凝固后即可进行切片贴片. H. E 染色按以下步骤进行 : 石蜡切片置于二甲苯脱蜡 ; 梯度酒精复水 ; 蒸馏水清洗 ; 苏木精,3 ~ 5 min; 自来水蓝化 ; 单蒸水浸洗 ; 伊红染色 1 min; 梯度酒精脱水 ; 二甲苯透明 ; 中性树胶封片. Azan 染色按以下步骤进行 : 石蜡切片置于二甲苯脱蜡 ; 梯度酒精复水 ; 蒸馏水清洗 ; 苯胺酒精处理 45 min; 酸酒精处理 2 min; 偶氮卡红在 56 染色 60 min; 双蒸水漂洗 ; 苯胺酒精分化, 酸酒精处理 2 min; 磷钨酸处理 3 h; 双蒸水漂洗 ; 苯胺蓝处理 40 min; 双蒸水漂洗 ; 磷钨酸处理 5 min; 双蒸水漂洗 ; 酸水处理 2 min; 脱水透明封片. 切片免疫组化按以下步骤进行 : 石蜡切片置于二甲苯脱蜡, 梯度酒精复水, 水洗 ; 预冷 4% 多聚甲

细胞免疫组化或免疫荧光检测按以下步骤进行 : 细胞传代时, 在新培养皿中放入灭菌的盖玻片 ; 当细胞爬片至盖玻片面积的 60% ~ 80% 时, 将盖玻片取出, PBS 清洗 2 次 ; 加入预冷 4% PFA 固定 30 min;pbs 清洗 3 次 ;37, 血清封闭 1

4 第８期王冰梅等ＣＨＩＲ９９０２１与ＦＧＦ８协同诱导人表皮干细胞牙向分化７８１醛固定２０ｍｉｎ吸弃多聚甲醛室温ＰＢＳ漂洗３次ＣＯ２培养箱培养第２ｄ呈２３个细胞克隆第４ｄ过氧化物酶ＰＢＳ漂洗３次每次５ｍｉｎ血清室温封１３ｄ细胞密度约９０Ｆｉｇ１当细胞继续培养每次５ｍｉｎ３过氧化氢孵育１０ｍｉｎ以阻断内源性呈４５个细胞克隆第６８ｄ细胞逐渐增多第１１闭１ｈ滴加稀释浓度适宜的一抗４过夜ＰＢＳ漂时呈现层叠状生长目前培养的表皮细胞至少可光孵育１ｈＰＢＳ避光漂洗３次每次５ｍｉｎＤＡＢ显化不大呈铺路石状生长Ｐ６Ｐ７代个别细胞变大洗３次每次５ｍｉｎ滴加稀释浓度适宜二抗３７避色双蒸水漂洗脱水透明封片１９统计学处理采用ＳＰＳＳ１３０软件进行统计学分析各项数据以Ｍｅａｎ ± ＳＤ表示利用单因素重复测量方差分传代９次其中Ｐ０Ｐ５代ｐａｓｓａｇｅＰ细胞形态变有部分细胞核出现空泡Ｐ９代以后的细胞生长速度相对缓慢形态变化较大本文采用Ｐ２Ｐ４代细胞作为实验材料在表皮细胞接种第１９ｄ利用ＭＴＴ法检测并析以Ｐ００５和Ｐ００１为差异有统计学显绘制生长曲线Ｆｉｇ１Ｂ表皮细胞的对数生长期为２结果算倍增时间ＰＤＴ为５２５９ｈ著性意义２１ｈｋｓｃｓ的形态学观察及鉴定分离获得的表皮细胞贴壁生长在显微镜下呈铺路石状的形态具有形成克隆的能力３７５第５７ｄ按照公式ＰＴＤｔｌｇ２ｌｇｎｔｌｇｎ０计表皮细胞经ＰＩ单染后利用流式细胞仪检测细胞周期结果显示约８０细胞处于Ｇ０Ｇ１期表明大部分细胞处于静止期仅有少数细胞处于ＤＮＡ合成期表明所分离的表皮细胞具有干细胞的特性Ｆｉｇ１ＭｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｈｋｓｃｓＡＭｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓｃｕｌｔｕｒｅｄｆｏｒ２４６８ａｎｄ１１ｄａｙｓＳｃａｌｅｂａｒ１００ μｍＢＴｈｅｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅｏｆｃｕｌｔｕｒｅｄｈｕｍａｎｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓａｎａｌｙｚｅｄｗｉｔｈＭＴＴＡＣＴｈｅｃｅｌｌｃｙｃｌｅｏｆｃｕｌｔｕｒｅｄｈｕｍａｎｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙＦＣＭａｆｔｅｒＰＩｓｔａｉｎｉｎｇ

封片１９统计学处理采用ＳＰＳＳ１３０软件进行统计学分析各项数据以Ｍｅａｎ ± ＳＤ表示利用单因素重复测量方差分传代９次其中Ｐ０Ｐ５代ｐａｓｓａｇｅＰ细胞形态变有部分细胞核出现空泡Ｐ９代以后的细胞生长速度相对缓慢形态变化较大本文采用Ｐ２Ｐ４代细胞作为实验材料在表皮细胞接种第１９ｄ利用ＭＴＴ法检测并析以Ｐ００５

5 ７８２中国生物化学与分子生物学报第３０卷Ｆｉｇ１Ｃ面标志分子ＣＤ２９Ｋ１４Ｋ１５Ｋ１９呈阳性表达Ｋ１０示Ｐ２Ｐ代４细胞表面标志物的表达基本一致主常弱结果证明本实验系统分离的细胞具有表皮干同时细胞经免疫荧光和免疫组化检测结果显要在细胞质表达Ｆｉｇ２显示Ｐ３代表皮细胞的表是终末分化细胞的标志分子所分离细胞的表达非细胞的特性Ｆｉｇ２ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｕｒｆａｃｅｍａｒｋｅｒｏｆｈｋｓｃｓＴｈｅｃｕｌｔｕｒｅｄｈｕｍａｎｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓｓｔａｉｎｅｄｓｔｒｏｎｇｌｙｐｏｓｉｔｉｖｅｆｏｒＣＤ２９Ｋ１５Ｋ１４ａｎｄｗｅａｋｌｙｆｏｒＫ１０ｂｙｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＴｈｅｃｕｌｔｕｒｅｄｈｕｍａｎｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓｓｔａｉｎｅｄｓｔｒｏｎｇｌｙｐｏｓｉｔｉｖｅｆｏｒＫ１９ｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｓｃｏｍｐａｒｅｄｔｏＰＢＳｃｏｎｔｒｏｌＳｃａｌｅｂａｒ５０ μｍ２２ＣＨＩＲ９９０２１增强ｈｋｓｃｓ的Ｗｎｔ β ｃａｔｅｎｉｎ２３ＣＨＩＲ９９０２１和ＦＧＦ８协同诱导ｈｋｓｃｓ牙向信号活性分化２０ μｍｏｌＬ分别处理ｈｋｓｃｓ１２ｈ对照组细胞用Ｅ１３５小鼠牙胚间充质重组构建成嵌合体该牙胚ｃａｔｅｎｉｎ和ｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ检测下游靶基因ＡＸＩＮ２鼠肾囊下培养作为实验组Ｉ本室前期研究已证用ＣＨＩＲ９９０２１小分子化合物２５１０ＤＭＳＯ处理１２ｈＷｅｓｔｅｒｎ印迹检测 β 联蛋白 β 的ｍｒｎａ表达结果显示实验组的表达量与对照组相比均有显著提高其中５ μｍｏｌＬ组的 β ｃａｔｅｎｉｎ和ＡＸＩＮ２的ｍｒｎａ表达量最高Ｆｉｇ３ＡＢ１０ μｍｏｌＬ和２０ μｍｏｌＬＣＨＩＲ９９０２１组的表达量均有所下降因此选用５ μｍｏｌＬＣＨＩＲ９９０２１处理ｈｋｓｃｓ样本分别被处理０３６和１２ｈｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ检测下游靶基因ＡＸＩＮ２的ｍｒｎａ表达结果显示实验组ＡＸＩＮ２表达量与对照组相比均有显著提高其中作用６ｈ的实验组ＡＸＩＮ２表达量最高作用１２ｈ的实验组ＡＸＩＮ２表达量有所下降Ｆｉｇ３ＣＤ因此将５ μｍｏｌＬＣＨＩＲ９９０２１作用６ｈ作为诱导ｈｋｓｃｓ增强Ｗｎｔ β ｃａｔｅｎｉｎ信号活性的最佳组合用５ μｍｏｌＬＣＨＩＲ９９０２１处理ｈｋｓｃｓ６ｈ再与间充质具有诱导牙齿发育能力将嵌合体移植至裸明ＦＧＦ８具有诱导人表皮干细胞向成釉质细胞分化的潜能因此在嵌合体中加入吸附ＦＧＦ８生长因子的琼脂糖珠作为阳性对照组用ＤＭＳＯ处理ｈｋｓｃｓ并用吸附ＢＳＡ琼脂糖珠的嵌合体作为阴性对照组移植２０ｄ后实验组Ｉ和阳性对照组的嵌合体形成乳白色的钙化组织可分离出牙齿样的结构Ｆｉｇ４Ａ嵌合体经固定包埋切片后用ＨＥ和ＡＺＡＮ染色结果显示嵌合体形成牙齿而且成釉质细胞拉长并分泌牙釉质即具有完整的牙冠结构包括成釉质细胞牙釉质牙本质和成牙本质细胞Ｆｉｇ４ＢＤ阴性对照组嵌合体具有牙本质和成牙本质细胞但成釉细胞未拉长牙釉质未形成更有部分组织结构出现纤维囊化和骨质结构Ｆｉｇ４Ｇ

ｓｔａｉｎｅｄｓｔｒｏｎｇｌｙｐｏｓｉｔｉｖｅｆｏｒＫ１９ｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｓｃｏｍｐａｒｅｄｔｏＰＢＳｃｏｎｔｒｏｌＳｃａｌｅｂａｒ５０ μｍ２２ＣＨＩＲ９９０２１增强ｈｋｓｃｓ的Ｗｎｔ β ｃａｔｅｎｉｎ２３ＣＨＩＲ９９０２１和ＦＧＦ８协同诱导ｈｋｓｃｓ牙向信号活性分化２０ μｍｏｌＬ分别

6 第 8 期王冰梅等 : CHIR 与 FGF8 协同诱导人表皮干细胞牙向分化 783 Fig. 3 Activity analysis of Wnt / β catenin signals induced by CHIR in hkscs ( A, B) Western blot analysis showed expression of β catenin in hkscs. Data were expressed as mean ± SD of three experiments. ( B) Quantitative analysis of protein expression by gray scale scanning of( A) by software Image J. ( C, D) Real time PCR analysis showed the dose dependent ( C) and time dependent ( D) increase of target gene AXIN2 in Wnt / β catenin signaling pathway at indicated CHIR concentrations. Data are shown as mean ± SD of three experiments. P < 0 05, P < 0 01 as compared to control group H). 为了进一步鉴定嵌合体的成釉质细胞和牙釉质, 本研究利用免疫组织化学方法, 分别检测嵌合体牙齿中釉原蛋白 ( ameloblastin) 和基质金属蛋白酶 20(MMP 20)(Fig. 4E,F). 根据鉴定结果, 将嵌合体中具有牙本质和成牙本质细胞的 2 种组织结构视为成牙, 计算成牙率 ; 在成牙组织中,hKSCs 能分化形成成釉质细胞并分泌 [7, 釉质的视为成釉, 计算成釉率 17]. 在阴性对照组, 嵌合体的成牙率为 15 00% (3 / 20), 成釉率为 0% (0 / 3); 阳性对照组的结果显示, 嵌合体的成牙率为 27 78% (5 / 18), 成釉率 40 00% (2 / 5); 实验组 I 的结果表明, 用 CHIR 诱导处理的 hkscs 与 E13 5 小鼠牙胚间充质重组, 嵌合体的成牙率 18 20% (2 / 11), 成釉率为 100% (2 / 2) ( Table 1). 实验组 I 与阴性对照组相比, 成釉率提高了 100% ; 实验组 I 与阳性对照组相比, 成釉率提高了 60 00%. 但是, 成牙率与阴性对照相比, 仅提高了 3 20%, 与阳性对照组相比, 成牙率反而降低. 自 3 个实验组的组织切片中发现, 实验组 I 的嵌合体具有牙本质成牙本质细胞牙釉质和成釉质细胞 4 种组织结构, 即完整的牙冠. 其嵌合体的成牙率 40 00% (4 / 10), 成釉率 75 00% (3 / 4) ( Table 1). 实验组 II 的成牙率比单独用 CHIR 处理的嵌合体 ( 实验组 I), 成牙率提高了 21 80% ; 比单独添加 FGF8 生长因子的嵌合体 ( 阳性对照组 ), 成牙率提高了 12 22%, 成釉率提高了 35 00%. 结果表明, 与阴性对照组相比,CHIR 与 FGF8 协同作用提高了嵌合体成牙效率以及 hkscs 向成釉质细胞分化的效率. 2 4 CHIR 通过上调 FGF8 诱导 hkscs 牙向分化 hkscs 加入 5 μmol / L CHIR 处理 6 h 后, 利用 Western 印迹检测 BMP4 SHH 和 FGF8 的蛋白质表达情况, 与加入 DMSO 处理的对照组相比,BMP4 和 SHH 的总体水平无显著变化, 而 FGF8 的表达量显著增加 ( P < 0 01, Fig. 5A B). 利用 real time PCR 进一步检测 FGF8 的 mrna 的表达水平. 实验组与对照组相比,FGF8 的 mrna 表达量显著增加 (P < 0 01, Fig. 5C), 与 Western 印迹结果一致. 结果显示, 添加 CHIR 能激活 hkscs 对 FGF8 的表达. 由此初步推测,CHIR 能增强 Wnt / β catenin 的活性, 并通过上调 FGF8 的表达进而提高诱导 hkscs 向成釉质细胞分化的效率.

Data were expressed as mean ± SD of three experiments. ( B) Quantitative analysis of protein expression by gray scale scanning of( A) by software Image J.

7 ７８４第３０卷中国生物化学与分子生物学报Ｆｉｇ４ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｈｋｓｃｓｉｎｔｏｅｎａｍｅｌｓｅｃｒｅｔｉｎｇａｍｅｌｏｂｌａｓｔｓｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆＣＨＩＲ９９０２１ａｎｄＦＧＦ８ＡＷｈｏｌｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｃｈｉｍｅｒｉｃｔｏｏｔｈＢＨＥｓｔａｉｎｅｄｓｅｃｔｉｏｎｏｆｃｈｉｍｅｒｉｃｔｏｏｔｈＣＨｉｇｅｒｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＢｓｈｏｗｉｎｇａｍｅｌｏｂｌａｓｔｓｏｄｏｎｔｏｂｌａｓｔｓａｎｄｄｅｎｔａｌｐｕｌｐｃｅｌｌｓＤＡＺＡＮｓｔａｉｎｅｄｓｅｃｔｉｏｎｏｆｃｈｉｍｅｒｉｃｔｏｏｔｈｓｈｏｗｉｎｇｅｌｏｎｇａｔｅｄａｍｅｌｏｂｌａｓｔｓａｒｒｏｗｉｎｉｎｓｅｒｔａｎｄｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｅｎａｍｅｌａｎｄｄｅｎｔｉｎＥＦＩｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇｏｆｈｕｍａｎＡｍｅｌｏｂｌａｓｔｉｎａｎｄＭＭＰ２０ｉｎｔｈｅａｍｅｌｏｂｌａｓｔｓａｎｄｅｎａｍｅｌｏｆＣｈｉｍｅｒｉｃｔｏｏｔｈＧＦｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｋｅｒａｔｉｎｉｚｅｄｃｙｓｔｉｎａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＨＦｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｔｉｓｓｕｅｓｉｎａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａａｍｅｌｏｂｌａｓｔｄｄｅｎｔｉｎｅｅｎａｍｅｌｏｏｄｏｎｔｏｂｌａｓｔｓｐｐｕｌｐＳｃａｌｅｂａｒ１００ μｍＴａｂｌｅ１ＴｈｅｓｕｃｃｅｓｓｒａｔｅｏｆｔｏｏｔｈｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓＮｏＳａｍｐｌｅｎｕｍｂｅｒＮｕｍｂｅｒｏｆｔｏｏｔｈｆｏｒｍａｔｉｏｎＲａｔｅｏｆｔｏｏｔｈｆｏｒｍａｔｉｏｎＮｕｍｂｅｒｏｆａｍｅｌｏｂｌａｓｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎＲａｔｅｏｆａｍｅｌｏｂｌａｓｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ１２０３１５００００３１１２１８２０２１００２４１８１０５４２７７８４０００２３４０００７５００ＣＨＩＲ９９０２１ＦＧＦ８Ｎｏ１ＮｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｈｋｓｃｓＢＳＡＭｅｓＮｏ２ＰｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｈｋｓｃｓＦＧＦ８ＭｅｓＮｏ３ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐＩｈｋｓｃｓＣＨＩＲ９９０２１ＭｅｓＮｏ４ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐＩＩｈｋｓｃｓＣＨＩＲ９９０２１ＦＧＦ８ＭｅｓＭｅｓＭｅｓｅｎｃｈｙｍｅＦｉｇ５ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＦＧＦ８ＢＭＰ４ａｎｄＳＨＨｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｉｎｔｈｅｈｋｓｃｓｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆＣＨＩＲ９９０２１ＡＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＦＧＦ８ＢＭＰ４ａｎｄＳＨＨｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇｗｉｔｈｔｒｅａｔｅｄ５ μｍｏｌＬＣＨＩＲ９９０２１ｏｎｈｋｓｃｓｆｏｒ６ｈｏｕｒｓＢＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙｇｒａｙｓｃａｌｅｓｃａｎｎｉｎｇｉｎＡｂｙｓｏｆｔｗａｒｅＩｍａｇｅＪＣＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓｏｆＦＧＦ８ｉｎｈｋｓｃｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ５ μｍｏｌＬＣＨＩＲ９９０２１ＴｈｅｒｅｌａｔｉｖｅａｃｔｉｎｌｅｖｅｌｓｉｎｅａｃｈｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｅｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｓＳＰＤａｔａｒｅｐｒｅｓｅｎｔｍｅａｎ ± ＳＤｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｔｈｒｅｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓＰ００５Ｐ００１ａｓｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｃｏｎｔｒｏｌ０ μｍｏｌＬＤＭＳＯ

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8 第 8 期王冰梅等 : CHIR 与 FGF8 协同诱导人表皮干细胞牙向分化讨论人类牙齿再生是一项极具应用前景市场价值和社会效益的研究工作. 寻找适合于人类牙齿再生的上皮源性的成体干细胞仍然是该领域的难题之一. 其中很重要的原因之一是牙齿萌发后, 成釉质细胞即凋亡而不复存在 [18]. 因此, 必须用其它器官的上皮源性的成体干细胞作为牙上皮细胞的替代物. 由于表皮干细胞来源于外胚层, 是具有较强可 [7] 塑性的成体干细胞, 同时本室的前期研究发现, 在小鼠牙胚间充质的支持下,FGF8 生长因子可将 hkscs 诱导分化为成釉质细胞, 相关数据已发表在 Developmental Biology. 但是其嵌合体成牙效率较低. 本文期望在原有工作基础上, 进一步提高诱导 hkscs 牙向分化的效率. Wnt( wingless type MMTV integration site) 信号通路是进化过程中高度保守的信号通路, 其经典信号通路在小鼠牙齿发育过程发挥重要作用 [8 10]. 如在小鼠牙上皮过表达 Wnt / β catenin 信号通路, 无论是敲除抑制因子 ( 例如 Apc) 还是过表达效应因子 ( 例如 β catenin), 均可引起小鼠口腔牙齿数目的增多 [10 12]. 由此推论,Wnt / β catenin 信号通路可能是牙上皮发育的关键开关信号通路, 对干细胞的牙向 [19] 分化具有促进作用. 本室的研究还发现, 在人牙齿早期发育过程中,Wnt / β catenin 信号通路的相关因子, 如 β catenin Sostdc1(Wise) 等基因在牙上皮具有强烈的表达. 因此, 本研究通过增强 hkscs 的 Wnt / β catenin 信号通路, 探讨其对牙向分化效率的影响. CHIR 是 1 种小分子化合物. 已有研究证明, 它能通过有效地抑制 GSK3β 活性, 避免 β 联蛋白 (β catenin) 被 GSK 3β 磷酸化, 增加胞内游离 β catenin. 随后, 积累的 β catenin 转位到细胞核内, 并在 TCF / LEF ( T cell factor / lymphoid enhancer factor) 转录因子的相互作用下激活下游靶基因转录, 此过程模仿 Wnt / β catenin 信号通路 [20 22]. 本文结果显示,CHIR 确实可增强 hkscs 的 Wnt / β catenin 信号活性. 将该处理的 hkscs 与具有诱导成牙潜能的小鼠牙胚间充质重组嵌合体, 与阴性对照组相比, 成釉率提高了 100%. 结果表明, 通过 CHIR 增强 hkscs 的 Wnt / β catenin 信号通路可提高 hkscs 向成釉质细胞分化效率, 提示 Wnt / β catenin 信号通路是 hkscs 嵌合体中成釉质细胞发育分化的关键信号通路. 综合本研究结果与上述相关文献提示,Wnt / β catenin 信号通路在牙上皮分化过程具有重要调控作用. 本文在利用 CHIR 处理 hkscs 的基础上, 继续将 FGF8 生长因子 ( 前期研究已经证明其在 hkscs 牙向分化中具有重要作用 ) 加入嵌合体中, 使 hkscs 向成釉质细胞分化的效率进一步提高. 同时本文证实,CHIR 能够提高 hkscs 的 FGF8 表达水平. 结果提示,Wnt / β catenin 与 FGF8 在诱导人表皮干细胞牙向分化过程中具有重要作用. 研究结果为利用 hkscs 作为上皮来源细胞应用于人类牙齿再生的研究提供相关的实验数据, 为理解成釉细胞分化的分子调控机制奠定基础, 同时对干细胞在组织工程领域中的应用研究也有普遍的意义. 参考文献 (References) [ 1 ] Yen A H, Sharpe P T. Regeneration of teeth using stem cell based tissue engineering [ J]. Expert Opin Biol Ther, 2006, 6 (1): 9 16 [ 2 ] Duailibi S E, Duailibi M T, Vacanti J P, et al. Prospects for tooth regeneration [ J]. Periodontology, 2000, 2006, 41 ( 1 ): [ 3 ] Sunil P, Manikandhan R, Muthu M, et al. Stem cell therapy in oral and maxillofacial region: An overview [ J]. J Oral Maxillofac Pathol, 2012, 16(1): [ 4 ] Sonoyama W, Liu Y, Fang D, et al. Mesenchymal stem cell mediated functional tooth regeneration in swine [ J]. PLoS One, 2006, 1: e79 [ 5 ] Ohazama A, Modino S A, Miletich I, et al. Stem cell based tissue engineering of murine teeth [ J]. J Dent Res, 2004, 83 (7): [ 6 ] Gronthos S, Mankani M, Brahim J, et al. Postnatal human dental pulp stem cells( DPSCs) in vitro and in vivo [ J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000, 97(25): [ 7 ] Wang B, Li L, Du S, et al. Induction of human keratinocytes into enamel secreting ameloblasts [ J]. Dev Biol, 2010, 344 (2): [ 8 ] Liu F, Millar S E. Wnt / beta catenin signaling in oral tissue development and disease [J]. J Dent Res, 2010, 89(4): [ 9 ] Liu F, Chu E Y, Watt B, et al. Wnt / beta catenin signaling directs multiple stages of tooth morphogenesis [ J]. Dev Biol, 2008, 313(1): [10] Jarvinen E, Salazar Ciudad I, Birchmeier W, et al. Continuous tooth generation in mouse is induced by activated epithelial Wnt / beta catenin signaling [ J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, 103(49): [11] Kuraguchi M, Wang X P, Bronson R T, et al. Adenomatous polyposis coli( APC) is required for normal development of skin and thymus [J]. PLoS Genet, 2006, 2(9): e146

由于表皮干细胞来源于外胚层, 是具有较强可 [7] 塑性的成体干细胞, 同时本室的前期研究发现, 在小鼠牙胚间充质的支持下,FGF8 生长因子可将 hkscs 诱导分化为成釉质细胞, 相关数据已发表在 Developmental Biology.

9 786 中国生物化学与分子生物学报第 30 卷 [12] Wang X P, O'connell D J, Lund J J, et al. Apc inhibition of Wnt signaling regulates supernumerary tooth formation during embryogenesis and throughout adulthood [ J ]. Development, 2009, 136(11): [13] Pispa J, Mustonen T, Mikkola M L, et al. Tooth patterning and enamel formation can be manipulated by misexpression of TNF receptor Edar [J]. Dev Dyn, 2004, 231(2): [14] Liu W, Selever J, Lu M F, et al. Genetic dissection of Pitx2 in craniofacial development uncovers new functions in branchial arch morphogenesis, late aspects of tooth morphogenesis and cell migration [ J]. Development, 2003, 130(25): [15] Sun Y, Teng I, Huo R, et al. Asymmetric requirement of surface epithelial beta catenin during the upper and lower jaw development [ J]. Dev Dyn, 2012, 241(4): [16] Yokoyama H, Maruoka T, Ochi H, et al. Different requirement for Wnt / beta catenin signaling in limb regeneration of larval and adult Xenopus [J]. PLoS One, 2011, 6(7): e21721 [17] 胡雪峰, 许姗, 林鑫,et al. 体外培养的人牙胚上皮细胞的成釉分化 [J]. 中国生物化学与分子生物学报 ( Hu X F, Xu S, Lin X, et al. Ameloblastic differentiation of cultured human dental epithelial cells [J]. Chin J Biochem Mol Biol), 2014, 30 (1): [18] Abiko Y, Nishimura M, Arai J, et al. Apoptosis in the reduced enamel epithelium just after tooth emergence in rats [ J]. Med Electron Microsc, 1996, 29(2):84 89 [19] Wang B, Li H, Liu Y, et al. Expression patterns of WNT / beta CATENIN signaling molecules during human tooth development [J]. J Mol Histol, 2014,Mar 20, [Epub ahead of print]: doi: / s [20] Wehrli M, Dougan S T, Caldwell K, et al. arrow encodes an LDL receptor related protein essential for Wingless signalling [ J]. Nature, 2000, 407(6803): [21] Zhang H, Yu C, Dai J, et al. Parathyroid hormone related protein inhibits DKK1 expression through c Jun mediated inhibition of beta catenin activation of the DKK1 promoter in prostate cancer [ J]. Oncogene, 2014, 33(19): [22] Bennett C N, Ross S E, Longo K A, et al. Regulation of Wnt signaling during adipogenesis [ J]. J Biol Chem, 2002, 277 (34):

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第期王兴涛等猪流行性乙型脑炎病毒种猪精液分离株的鉴定及进化分析病料毒株及细胞试剂引物设计提取及基因克隆及测序

第期王兴涛等猪流行性乙型脑炎病毒种猪精液分离株的鉴定及进化分析病料毒株及细胞试剂引物设计提取及基因克隆及测序河南农业科学王兴涛罗俊滕蔓樊剑鸣鄂巍禹斌刘力张改平利用技术对河南省某规模化猪场乙脑疑似病例的种猪精液进行分析从部分样本中扩增出与流行性乙型脑炎病毒基因和基因具有高度同源性的预期产物在日龄乳鼠脑内接种种猪