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殊癸桃元
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1 566 CD5 单抗及 188 Re 亲和素二步法预定位对淋巴瘤 Raji 细胞的放射免疫效应研究放射生物学李贵平郑文莉齐永帅黄宝丹杜丽黄凯张辉摘要目的探讨 CD5 单抗及 188 Re 亲和素 (Avidin) 二步法预定位对人淋巴瘤 Raji 细胞的放射免疫效应方法 188 Re 对 CD5 单抗及 Avidin 的标记采用直接标记法, 采用纸层析法测定标记率及放化纯度分析 188 Re CD5 单抗与 Raji 细胞的体外结合能力, 并进行体外竞争结合实验, 采用 CCK 8 法测定二步法预定位组 188 Re CD5 单抗组 188 Re Avidin 组和组对 Raji 细胞的增殖抑制效应, 计算 Raji 细胞存活率和抑制率结果 188 Re CD5 单抗与 Raji 细胞的特异性结合率为 (70 92 ± 1 91)%, 同时加入 188 Re CD5 单抗和过量的 CD5 单抗, 则细胞结合率平均为 (7 96 ± 0 87)% 二步法预定位组 188 Re CD5 单抗组 188 Re Avidin 组和组对 Raji 细胞的增殖均有抑制作用, 抑制率与放射性活度呈正相关 (r = ~ 0 992,P < 0 05); 在相同放射性活度下, 二步法预定位组在各时间点的抑制作用均高于 188 Re CD5 单抗组 188 Re Avidin 组和组 ( t = ~ ,P < 0 05) 结论 188 Re CD5 单抗可特异性地与 Raji 细胞结合,CD5 单抗及 188 Re Avidin 二步法预定位对人淋巴瘤 Raji 细胞具有明显的抑制作用关键词预定位 ; 亲和素 ; 188 Re; CD5 单抗 ; Raji 细胞系 Effect of the two step pretargeting radioimmunotherapy of CD5 monoclonal antibody and 188 Re Avidin on lymphoma Raji cell line Li Guiping, Zheng Wenli, Qi Yongshuai, Huang Baodan, Du Li, Huang Kai, Zhang Hui. Department of Nuclear Medicine, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou , China Abstract Objective To study the effect of two step pretargeting radioimmunotherapy of CD5 McAb and 188 Re Avidin on lymphoma Raji cell line. Methods The CD5 McAb and Avidin were directly labeled with 188 Re, and the labeling efficiency and radiochemical purity were measured by the paper chromatography. The specific binding test and competition binding test between 188 Re CD5 McAb and Raji cells in vitro were also performed. CCK 8 assay was used to determine the inhibition effect on Raji cell proliferation in the pretargeted group, 188 Re CD5 McAb, 188 Re Avidin and groups, then the cell survival and proliferation inhibition rate were calculated. Results The specific cell binding rate of 188 Re CD5 McAb with Raji cells was (70 92 ± 1 91) %, in the competition group, the binging rate of 188 Re CD5 McAb with Raji cells was only(7 96 ± 0 87)%. The Raji cells proliferation was inhibited in all groups with 188 Re radiolabel, and the inhibition rate was positively correlated with the radioactivity dose (r = , P < 0 05). However, at the same dose, the inhibition effect in the group of two step pretargeting at each time point were all stronger than those of 188 Re CD5 McAb, 188 Re Avidin and alone (t = ,P < 0 05). But there was no significantly statistical difference in the inhibitory effect between the groups of 188 Re Avidin and ( P > 0 05 ). Conclusions It is confirmed that 188 Re CD5 McAb could be specifically bound to Raji cells, and the two step pretargeting of CD5 McAb and 188 Re Avidin has obvious inhibitory effect on the Raji cell proliferation. Key words Pretargeting technique; Avidin; 188 Re; CD5 McAb; Raji cell line CD5 抗原是一种白细胞共同抗原, 广泛分布 DOI: / cma. j. issn 基金项目 : 广东省自然科学基金 ( S ); 广东省科技计划项目 (2012B ) 作者单位 : 广州, 南方医科大学南方医院核医学科 ( 李贵平齐永帅黄宝丹杜丽黄凯张辉 ); 佛山市第二人民医院超声科 ( 郑文莉 ) 于髓系和淋巴系前体细胞及淋巴结中的成熟细胞表面, 在 90% 以上的急性髓细胞白血病大多数急性淋巴细胞白血病与淋巴瘤患者中亦有所表达, 选择抗 CD5 单抗可以用于急性髓细胞白血病急性淋巴细胞白血病及淋巴瘤的治疗 [1 3] 近年来, 随着对 CD5 抗原的结构功能及与疾病的关系研究

CD5 单抗组 188 Re Avidin 组和组对 Raji 细胞的增殖抑制效应, 计算 Raji 细胞存活率和抑制率结果 188 Re CD5 单抗与 Raji 细胞的特异性结合率为 (70 92 ± 1 91)%, 同时加入 188 Re CD5 单抗和过量的 CD5 单抗, 则细胞结合率平

2 567 的深入,CD5 抗原在血液恶性肿瘤的诊断与治疗中的应用越来越受到重视, 对抗 CD5 抗体特性的深入研究有望为血液系统恶性肿瘤提供新的治疗手段 [ 6] 而 188 Re(E βmax = 2 12 MeV E γ = 155 kev T 1 / 2 = 17 0 h) 是近年出现的一种较理想的放射性核素,β 射线能量较高, 对肿瘤细胞有较强的杀伤力, 而 γ 射线又可用于显像, 便于临床上估算吸收剂量和进行药代动力学研究, 可以同时进行显像与治疗 [7 9] 本研究根据国内外研究现状, 选择广谱表达的 CD5 抗原作为靶点, 采用亲和素生物素系统预定位技术 [10 11], 将 188 Re 标记到 CD5 单抗及亲和素上, 建立二步预定位方法, 研究二步法预定位及 188 Re CD5 单抗对 CD5 高表达的 Raji 细胞系的靶向结合性及抗肿瘤作用, 并对两者的抗肿瘤效应进行比较, 探讨二步法预定位靶向治疗淋巴瘤的可行性材料与方法 1. 主要材料及仪器 : 抗人 CD5 单抗购于生工生物工程 ( 上海 ) 有限公司 ; 亲和素 ( Avidin) 生物素活化酯 HABA / Avidin 试剂 CCK 8 试剂 DMSO 购于美国 Sigma 公司 ; RPMI 160 培养基胎牛血清 0 25% 胰蛋白酶青链霉素双抗购于美国 GIBCO 公司 ; 丙酮购于广东光华化学厂有限公司 ; 2 巯基乙醇购于美国 Amresco 公司 ( 广州市达晖生物技术有限公司分装 ); 氯化亚锡 ( SnCl 2 ) 购于广东光华科技股份有限公司 ; 葡庚糖酸钠及牛血清白蛋白购于上海伯奥生物科技有限公司 ;SN 682 型放射免疫 γ 计数器购于上海核福光电仪器有限公司 ; 紫外分光光度计购于上海光谱仪器有限公司 ;M5 多功能酶标仪购于美国 Molecular Devices 公司 2. 细胞培养 :B 细胞淋巴瘤 Raji 细胞系由南方医科大学南方医院血液科提供采用悬浮细胞培养法培养, 用含 10% 胎牛血清的 RPMI 160 培养基培养, 在 37 5% CO 2 和 95% 相对湿度的孵箱内孵育, 每 2 天传代 1 次在细胞对数生长期进行实验 3. CD5 单抗的生物素化及活性测定 : 将 CD5 单抗与生物素活化酯的摩尔比为 1 30 ~ 1 50 取样, 生物素活化酯 / 二甲基亚砜 ( DMSO) 溶液滴加至 CD5 单抗的碳酸氢钠溶液中, 室温振荡反应 1 h, 取一定量生物素化 CD5 抗体反应液于 PD 10 柱中, 离心纯化, 离心半径 10 cm,2 000 r / min, 离心 5 min; 采用 ELISA 法鉴定生物素化活性 ; 采用 HABA / Avidin 试剂进行 CD5 单抗生物素化程度测定. CD5 单抗及 Avidin 的 188 Re 标记方法和鉴定 : 按文献 [5] 方法,CD5 单抗及 Avidin 的还原采用 2 ME 法, 188 Re 的还原采用氯化亚锡法, 分别将上述两种还原溶液混合均匀, 室温反应 2 h 纸层析法测定其标记率, 固定相为新华 1 号滤纸, 展开剂为混合物溶液 ( 氨水乙醇水 = 1 2 5) 和生理盐水 Re CD5 单抗与 Raji 细胞的体外结合实验及竞争结合抑制实验 : 待细胞增殖至对数生长期, 以 RPMI 160 培养基重悬, 制成细胞数分别为和的细胞悬液将不同浓度的细胞分别加入离心管, 每个浓度 3 管, 各管再加入 20 μl(7 10 Bq) 标记物在 37 细胞培养箱中温育 1 h, 分别测各管总放射性计数 ( T ); 离心 5 min, 离心半径 10 cm, r / min, 后去上清液, 用 PBS (0 01 mol / L, ph 7 ) 洗涤 2 次, 再测量结合在细胞上的放射性计数 (B) 并计算其结合率同时做竞争结合实验, 在各管细胞中先加入 50 μg 未标记的 CD5 单抗, 然后再加入 20 μl 的标记物, 余步骤同前, 测量结合在细胞上的放射性计数 (B) 并计算其结合率 6. 体外培养 Raji 细胞增殖抑制试验 : 体外培养 Raji 细胞的增殖抑制效应采用 CCK 8 测定法进行评估, 设置个实验组 : 二步法预定位组 188 Re Avidin 组 188 Re CD5 单抗组和组将 Raji 细胞浓度调整为 10 / 孔, 接种于 96 孔板, 37 培养箱孵育 1 h 后, 各组分别相应加入和 Bq 5 种剂量的放射性药物, 每个剂量设 3 个复孔, 以未加药 ( 只有细胞和培养液 ) 为对照组, 并设空白调零组 ( 只加药和培养液, 没有细胞 ), 于细胞孵育一定时间后取出 96 孔板, 再加入 10 μl CCK 8 继续孵育 1 ~ 2 h 后, 用酶标仪检测 50 nm 波长吸光度计算 Raji 细胞存活率和抑制率 7. 统计学处理 : 数据用 `x ± s 表示采用 SPSS 13 0 统计软件分析采用单因素方差分析和独立样本 t 检验分析数据 ; 相关性检验采用 Pearson 积差相关 P < 0 05 为差异有统计学意义结 1. CD5 单抗的生物素化程度及活性的测定 : ELISA 法测定生物素化 CD5 单抗 ( 鼠源性 ) 的免疫果

的 CD5 抗原作为靶点, 采用亲和素生物素系统预定位技术 [10 11], 将 188 Re 标记到 CD5 单抗及亲和素上, 建立二步预定位方法, 研究二步法预定位及 188 Re CD5 单抗对 CD5 高表达的 Raji 细胞系的靶向结合性及抗肿瘤作用, 并对两

3 568 活性平均为 (90 57 ± 8 13) % ; 采用 HABA / Avidin 试剂测定, 平均每个 CD5 单抗分子可结合 0 个生物素分子 Re 标记 CD5 单抗及 Avidin 的标记率测定 : 经多次标记实验得出, 在最佳标记条件下, 188 Re CD5 单抗标记率平均为 (82 52 ± 2 92)%, 188 Re Avidin 标记率平均为 (80 83 ± 3 8)%, 经 PD 10 柱纯化后, 二者放化纯度均 > 90%, 二者放射性比活度平均为 (2 06 ± 0 07)TBq / mmol Re CD5 单抗与 Raji 细胞的体外结合实验和竞争结合抑制实验 : 188 Re CD5 单抗与 Raji 细胞的总结合率平均为 (78 88 ± 1 62)%, 表明 CD5 单抗经 188 Re 标记后仍保持着较好的免疫活性在竞争结合抑制实验中, 同时加入标记物和过量的 CD5 单抗, 细胞结合率平均仅为 (7 96 ± 0 87)%, 而未加入过量的 CD5 单抗, 其细胞结合率平均为 (70 92 ± 1 91)%, 表明标记的 CD5 单抗与 Raji 细胞的结合可被未标记的 CD5 单抗竞争性抑制, 提示标记 CD5 单抗与 Raji 细胞的结合具有特异性 ( 表 1). 188 Re 标记物不同处理组对体外培养的 Raji 细胞增殖抑制作用 : 采用 CCK 8 测定 Raji 细胞增殖抑制实验结果如表 2 所示二步法预定位组 188 Re CD5 单抗组 188 Re Avidin 组和组对 Raji 细胞的增殖均有抑制作用, 其抑制率与放射性活度呈正相关关系 ( r = , P < 0 05); 在相同的放射性活度下, 二步法预定位组抑制作用均强于 188 Re CD5 组 Re Avidin 组和 ReO - 组 ( t = ~ ,P < 0 05); 而 188 Re Avidin 组和组的抑制作用差异无统计学意义 (P > 0 05) 讨血液系统恶性肿瘤, 包括急性白血病慢性白血病恶性淋巴瘤等, 是严重威胁人类健康和生命的疾病, 而传统的放化疗并不能彻底治愈血液系统恶性肿瘤以及延长患者的生存时间和降低其死亡率 [12] 而基于单克隆抗体的放射免疫靶向治疗则具有靶向性强特异性高和不良反应小等特点, 将显著提高对血液系统恶性肿瘤的治愈率, 极大地改善患者的生活质量 [3,6] 目前已经用于临床的有放射性标记抗 CD20 单抗 [13], 还有许多正在进行 Ⅰ [1] 期 Ⅱ 期临床试验 Pagel 等比较了抗 CD20 单抗和抗 CD5 单抗在小鼠 B 系淋巴瘤的放射免疫治疗中的疗效, 同量放射性标记的抗 CD5 单抗在肿瘤组织中的吸收量是抗 CD20 单抗的 1 2 ~ 1 倍, 肿瘤组织和正常组织的吸收比较, 抗 CD5 单抗为 1 5 1( 血液 ) ~ 20 1( 小肠 ), 抗 CD20 单抗为 0 1 ( 血液 ) ~ 9 8 1( 小肠 ) CD5 抗原在白细胞表面广泛表达, 而在其他实体组织细胞上不表达, 具有良好的靶向性 188 Re 具有良好的核物理与生物学行为, 研究表明, 高铼酸盐在各脏器吸收较少并很快地通过尿排泄, 在人体内的生物半衰期 < 10 h, 不会对人体造成严重的辐射损伤, 有可能在肿瘤的治疗方面起到很好的作用 [9] 本研究将具有广谱抗肿瘤特性的 CD5 单抗作为放射性核素的靶向载体, 选用诊治兼用的放射性核素 188 Re 对其进行标记, 制备具有特异性靶向作用的放射免疫药物, 为进一步提高放射免疫治疗药物的疗效, 又将亲和素生物素系统的预定位技术应用于单抗的放免治疗中, 利用亲和素生物素高度特异性结合能力及信号放大作用, 以及 188 Re 优良的核素性质可把药物的不良反应降低到最低水平, 而且论表 Re CD5 单抗与不同细胞数 Raji 细胞的体外竞争结合率比较 (%, x ± s) 组别样本数未加 CD5 单抗组 ± ± ± ± ± 2 26 加过量 CD5 单抗组 ± 0 90 a 8 15 ± 1 05 a 6 51 ± 1 02 a 6 52 ± 0 6 a 7 5 ± 1 75 a 注 : a 与未加 CD5 单抗组比较,t = ,P < 0 05 表 Re 标记物不同处理组在不同放射性活度下对体外培养 Raji 细胞的抑制率 (%, x ± s) 组别样本数 18 5 kbq 7 kbq 185 kbq 370 kbq 555 kbq 二步法预定位组 ± ± ± ± ± Re CD5 单抗组 ± 0 07 a ± 0 17 b ± 0 09 c 28 9 ± 0 15 d 33 0 ± 0 15 e 188 Re Avidin 组 3 8 ± 0 12 a 8 51 ± 0 10 b 16 7 ± 0 12 c ± 0 10 d 2 78 ± 0 11 e 组 ± 0 10 a 9 76 ± 0 1 b ± 0 1 c ± 0 12 d ± 0 08 e 注 : 与同一活度二步法预定位组比较, a t = ,P < 0 05; b t = ,P < 0 05; c t = ,P < 0 05; d t = ,P < 0 05; e t = ,P < 0 05

90%, 二者放射性比活度平均为 (2 06 ± 0 07)TBq / mmol 3.

4 569 基于 CD5 单抗的靶向放射免疫药物的研究国内外报道较少 [15 16] 预定位的概念是针对放射性核素标记抗体类药物而言的, 其原理是将抗肿瘤抗体与放射性核素分开给药, 延长抗体在肿瘤细胞上的滞留时间, 使肿瘤结合与未结合抗体之比达最大值 [11 12,15], 预定位技术的优点是增加了放射性药物在肿瘤组织的浓聚, 提高了药物的有效性并减少了不良反应与传统的放射性核素标记单抗相比, 预定位技术显示了更好的治疗效果, 显著地提高了肿瘤组织中的放射性剂量 [15] 为此, 本研究选择 CD5 高表达的 Raji 细胞系, 利用体外细胞培养技术检测 188 Re CD5 单抗的靶向结合性及二步法预定位体外抗肿瘤作用 188 Re CD5 单抗与 Raji 细胞的体外竞争结合实验表明 :CD5 单抗经 188 Re 标记后仍保持着较好的免疫结合活性, 且可被未标记的 CD5 单抗竞争性抑制, 表明 188 Re 标记的 CD5 单抗可特异性地结合 Raji 细胞, 即对淋巴瘤 Raji 细胞具有靶向性目前, 研究抗肿瘤药物对体外培养的肿瘤细胞抑制作用的常用方法是 MTT 法其原理为活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使黄色可溶的 MTT 还原为难溶性的蓝紫色的甲臜 ( formazam) 结晶, 而死细胞没有此功能这种结晶物能溶解于二甲亚砜 (DMSO) 中, 并能用酶联免疫检测仪测定溶液在 90 nm 处的吸光度, 这个吸光度值在一定范围内和细胞数量成正比而本实验采用的 CCK 8 试剂盒, 是一种基于 WST 8 的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒 WST 8 是一种类似于 MTT 的化合物, 在电子耦合试剂 1 Methoxy PMS 存在的情况下, 可以被还原生成橙黄色水溶性的甲臜细胞增殖越多越快, 则颜色越深 ; 细胞毒性越大, 则颜色越浅对于同样的细胞, 颜色的深浅和细胞数目呈线性关系本试剂盒与传统的 MTT 法相比具有明显的优势 :1CCK 8 法是一种灵敏度高操作简便使用安全的细胞增殖与毒性检测方法 ;2CCK 8 法对细胞无毒, 可以多次测定选取最佳测定时间, 与 MTT 方法相比线性范围更宽, 灵敏度更高 ;3CCK 8 溶液不需配制, 可以直接加入到细胞样品中, 即开即用, 比 MTT 更加稳定, 实验结果重复性好 ;MTT 实验生成的 formazam 不是水溶性的, 需要使用 DMSO 等有机溶剂溶解 ; 而本方法产生的 formazam 是水溶性的, 不仅省去了溶解步骤, 更因此减少了该操作步骤带来的误差基于上述原因, 本实验中采用 CCK 8 法研究种 188 Re 标记物对体外培养的 Raji 细胞的抑制作用, 结果表明二步法预定位组 188 Re CD5 单抗组 188 Re Avidin 组和组对 Raji 细胞的增殖均有不同程度的抑制作用, 其抑制率与放射性活度呈正相关关系 ; 在放射性活度相等的情况下, 二步法预定位组在各时间点抑制作用均明显高于 188 Re CD5 单抗组 188 Re Avidin 组和组 ; 而 188 Re Avidin 组和组相比, 抑制作用差异无统计学意义实验结果表明, 二步法预定位可以增强放射性核素对 Raji 细胞的杀伤与抑制作用其原因可能与 CD5 单抗的特异性结合作用预定位方式充分保留了生物素化 CD5 单抗的免疫结合活性以及放射性核素标记的亲和素可在肿瘤细胞内尽可能多的集聚, 从而提高了杀伤 Raji 细胞的放射效应 [17] 因此,CD5 单抗介导的 188 Re Avidin 的二步法预定位对 Raji 细胞的杀伤作用应高于 188 Re CD5 单抗, 本实验结果也证实了这一点而 188 Re Avidin 和因均不能与 Raji 细胞发生特异性结合, 当吸去药物时, 其杀伤作用也随之停止, 因而抑癌作用较弱总之, 本研究结果证实二步法预定位对体外培养肿瘤细胞增殖的抑制效应方面取得了初步的成功, 但考虑到体外细胞试验与荷瘤动物模型不完全相同, 仍需在荷瘤小鼠动物模型中实施二步法预定位放免治疗的研究, 以验证二步法预定位体内抗肿瘤作用的有效性参考文献 [ 1 ] Ratei R, Sperling C, Karawajew L, et al. Immunophenotype and clinical characteristics of CD5 negative and CD5 positive childhood acute lymphoblastic leukemia [ J ]. 1998, 77(3): Ann Hematol, [ 2 ] 郑文莉, 李贵平. 亲和素生物素系统预定位放免治疗白血病的研究 [J]. 放射免疫学杂志, 2013, 26(): [ 3 ] 汪兵, 李贵平. 放射性核素标记单克隆抗体靶向治疗血液系统恶性肿瘤 [J]. 放射免疫学杂志, 2011, 2(2): [ ] 李贵平, 汪兵, 黄宝丹, 等. CD5 单抗介导的淋巴瘤荷瘤裸鼠三步法预定位放免显像 [ J]. 中山大学学报 ( 医学科学版 ), 201, 35(1): [ 5 ] 郑文莉, 李贵平, 黄宝丹, 等. 188 Re 直接法标记 CD5 单抗及其体内生物分布研究 [ J]. 中华临床医师杂志 ( 电子版 ), 2013, 7(18): [ 6 ] Pagel JM, Matthews DC, Kenoyer A, et al. Pretargeted radioimmunotherapy using anti CD5 monoclonal antibodies to deliver radiation to murine hematolymphoid tissues and human myeloid leukemia[ J]. Cancer Res, 2009, 69(1): ( 下转第 57 页 )

的放射性剂量 [15] 为此, 本研究选择 CD5 高表达的 Raji 细胞系, 利用体外细胞培养技术检测 188 Re CD5 单抗的靶向结合性及二步法预定位体外抗肿瘤作用 188 Re CD5 单抗与 Raji 细胞的体外竞争结合实验表明 :CD5 单抗经 188

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