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1 ( 第 四 版 ) 中 国 医 科 大 学 生 物 化 学 与 分 子 生 物 学 教 研 室 2008 年 04 月

2 生 物 化 学 实 验 ( 第 四 版 ) 主 编 : 魏 金 荣 副 主 编 : 关 一 夫, 于 爱 鸣 党 员 编 者 ( 按 姓 氏 笔 画 顺 序 ): 毕 强 李 雪 松 刘 素 媛 邢 伟 武 迪 迪 郑 华 川 宗 志 红 宿 文 辉 阎 敬 韩 晓 曦 魏 金 荣 非 党 员 编 者 ( 按 姓 氏 笔 画 顺 序 ): 王 彪 孙 黎 光 安 丽 文 冯 晨 张 天 彪 郝 凤 进 赵 国 杰 袁 莹 中 国 医 科 大 学 生 物 化 学 与 分 子 生 物 学 教 研 室 2008 年 4 月

3 前 言 近 十 年 来, 科 学 技 术 的 迅 猛 发 展, 使 得 生 物 化 学 与 分 子 生 物 学 的 实 验 技 术 和 方 法 层 出 不 穷 日 新 月 异 虽 然 我 们 对 生 物 化 学 与 分 子 生 物 学 实 验 课 教 学 内 容 陆 续 进 行 过 一 些 调 整 和 改 革, 但 仍 显 得 不 能 适 应 现 代 生 物 科 学 发 展 的 需 要 为 此, 为 了 顺 应 学 科 的 发 展, 全 面 提 高 实 验 教 学 水 平 和 质 量, 使 得 学 生 能 够 学 习 和 掌 握 现 代 生 物 学 技 术, 中 国 医 科 大 学 基 础 医 学 院 生 物 化 学 与 分 子 生 物 学 党 支 部 启 动 了 旨 在 进 行 实 验 课 教 学 改 革 的 党 员 工 程 项 目 在 此 次 新 版 实 验 手 册 的 编 写 过 程 中, 我 们 以 具 有 多 年 实 验 课 教 学 经 验 的 党 员 教 师 为 核 心, 首 先 通 过 大 量 的 文 献 调 研, 提 出 初 步 的 改 革 设 想 ; 由 教 研 室 主 任 关 一 夫 教 授 和 教 研 室 副 主 任 于 爱 鸣 教 授 对 改 革 方 案 提 出 修 改 意 见 ; 经 全 体 参 编 人 员 的 认 真 论 证 和 反 复 研 究, 最 后 确 定 了 改 革 方 案 新 的 改 革 方 案 对 实 验 课 教 学 内 容 进 行 了 整 体 规 划 新 版 的 实 验 手 册 保 留 了 原 有 较 为 先 进 的 部 分 实 验 以 及 具 有 参 考 价 值 的 实 验, 增 添 了 部 分 先 进 的 分 子 生 物 学 实 验 和 技 术 较 新 的 实 验, 如 充 实 和 完 善 了 综 合 性 实 验 1- 抗 胰 蛋 白 酶 的 分 离 纯 化, 增 添 了 免 疫 印 迹 RNA 的 制 备 与 分 析 DNA 酶 解 和 DNA 片 段 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 和 PCR 等 先 进 的 分 子 生 物 学 实 验 和 体 现 生 物 化 学 特 点 的 底 物 浓 度 对 酶 活 性 的 影 响 -Km 值 的 测 定 和 抑 制 剂 对 酶 活 性 的 影 响 的 基 本 实 验 为 了 保 证 实 验 的 可 行 性 和 准 确 性, 我 们 对 某 些 实 验 进 行 了 预 实 验 在 新 版 实 验 手 册 的 编 写 过 程 中, 党 员 教 师 承 担 了 新 内 容 的 编 写 和 修 改 的 繁 重 工 作, 同 时 部 分 党 外 的 青 年 骨 干 教 师 积 极 参 与 该 项 活 动, 承 担 了 部 分 文 字 录 入 工 作 在 此 对 关 一 夫 教 授 于 爱 鸣 教 授 的 大 力 支 持 及 部 分 党 外 教 师 的 大 力 帮 助 表 示 感 谢 本 实 验 手 册 难 免 有 不 妥 之 处, 希 望 广 大 师 生 提 出 宝 贵 意 见 编 者 2008 年 4 月 10 日

4 目 录 第 一 部 分 常 用 生 物 化 学 实 验 技 术 及 原 理 一 常 用 生 物 材 料 的 处 理 1 二 比 色 分 析 法 和 分 光 光 度 法 4 ( 一 ) 比 色 分 析 法 的 基 本 原 理 4 ( 二 ) 比 色 分 析 的 测 定 方 法 7 ( 三 ) 常 用 分 光 光 度 计 的 使 用 10 三 电 泳 技 术 12 ( 一 ) 基 本 原 理 12 ( 二 ) 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 16 ( 三 ) 等 电 聚 焦 电 泳 22 四 层 析 法 26 ( 一 ) 层 析 技 术 的 发 展 简 史 及 科 学 意 义 26 ( 二 ) 层 析 技 术 的 基 本 原 理 27 ( 三 ) 层 析 法 分 类 28 ( 四 ) 凝 胶 过 滤 层 析 29 ( 五 ) 离 子 交 换 层 析 32 ( 六 ) 亲 和 层 析 35 第 二 部 分 实 验 一 蛋 白 质 的 测 定 38 实 验 一 微 量 凯 氏 (Kjeldahl) 定 氮 法 38 实 验 二 Folin 酚 试 剂 法 (Lowry 法 ) 40 实 验 三 双 缩 脲 法 (Biuret 法 ) 42 实 验 四 考 马 斯 亮 兰 法 (Bradford 法 ) 43 实 验 五 紫 外 吸 收 法 44 实 验 六 BCA 法 45 二 酶 促 反 应 动 力 学 46 实 验 七 酶 的 特 异 性 激 动 剂 及 抑 制 剂 46 实 验 八 ph 对 酶 活 性 的 影 响 47 实 验 九 底 物 浓 度 对 酶 活 性 的 影 响 50 实 验 十 抑 制 剂 对 酶 活 性 的 影 响 52 实 验 十 一 温 度 对 酶 促 反 应 速 度 的 影 响 54 实 验 十 二 酚 标 准 曲 线 的 绘 制 55 实 验 十 三 尿 淀 粉 酶 活 性 测 定 ( 温 氏 法 ) 55 三 生 物 氧 化 57 实 验 十 四 乳 酸 脱 氢 酶 及 辅 酶 Ⅰ 57 实 验 十 五 琥 珀 酸 脱 氢 酶 59

5 实 验 十 六 细 胞 色 素 氧 化 酶 实 验 59 四 糖 代 谢 60 实 验 十 七 运 动 对 尿 中 乳 酸 含 量 的 影 响 60 实 验 十 八 血 糖 定 量 ( 邻 甲 苯 胺 硼 酸 法 ) 62 实 验 十 九 肝 糖 原 实 验 64 实 验 二 十 尿 糖 定 性 ( 班 氏 法 ) 65 五 脂 类 66 实 验 二 十 一 肝 脂 类 的 提 取 及 薄 层 层 析 66 实 验 二 十 二 血 清 总 胆 固 醇 定 量 67 实 验 二 十 三 尿 中 酮 体 定 性 Lange 法 69 六 蛋 白 代 谢 69 实 验 二 十 四 血 清 蛋 白 的 醋 酸 纤 维 素 膜 电 泳 分 离 及 测 定 69 实 验 二 十 五 血 清 尿 素 氮 定 量 ( 二 乙 酰 一 肟 法 ) 72 实 验 二 十 六 牛 血 清 抗 胰 蛋 白 酶 (α 1 -AT) 的 分 离 及 鉴 定 73 (-) 盐 析 法 74 ( 二 ) 凝 胶 过 滤 法 75 ( 三 ) 纤 维 素 离 子 交 换 层 析 76 ( 四 ) 伴 刀 豆 素 球 蛋 白 琼 脂 糖 亲 和 层 析 77 ( 五 )α 1 -AT 酶 活 力 测 定 78 ( 六 )SDS- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 平 板 电 泳 79 ( 七 ) 总 结 82 实 验 二 十 七 免 疫 印 迹 82 七 核 酸 84 实 验 二 十 八 RNA 的 制 备 与 分 析 84 实 验 二 十 九 从 小 鼠 肝 中 提 取 DNA 87 实 验 三 十 核 酸 的 定 量 测 定 ( 定 磷 法 ) 90 实 验 三 十 一 DNA 的 定 量 测 定 ( 改 良 二 苯 胺 法 ) 92 实 验 三 十 二 DNA 酶 解 和 DNA 片 段 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 94 实 验 三 十 三 PCR 97 八 血 液 生 化 99 实 验 三 十 四 血 清 无 机 磷 定 量 99 附 录 一 缓 冲 液 101 ( 一 ) 一 些 常 用 缓 冲 液 的 化 合 物 的 酸 解 离 常 数 101 ( 二 ) 常 用 缓 冲 液 的 配 制 方 法 102 二 层 析 法 常 用 数 据 表 104 ( 一 ) 葡 聚 糖 凝 胶 的 某 些 技 术 数 据 104 ( 二 ) 琼 脂 糖 凝 胶 的 技 术 数 据 105 ( 三 ) 各 种 凝 胶 所 允 许 最 大 操 作 压 105

6 三 硫 酸 铵 饱 和 度 常 用 表 106 四 离 心 机 转 子 的 转 速 与 相 对 离 心 力 RCF(g) 间 的 换 算 关 系 108

7 第 一 部 分 常 用 生 物 化 学 实 验 技 术 及 原 理 一 常 用 生 物 材 料 的 处 理 1. 血 液 (Blood Blood) (1) 采 血 因 饮 食 及 其 他 生 理 情 况 常 使 血 液 成 分 发 生 变 动, 所 以 一 般 应 在 早 晨 空 腹 或 禁 食 6 小 时 以 上 安 静 条 件 下 采 血 需 用 血 量 较 少 时, 可 由 耳 垂 或 指 尖 采 毛 细 血 管 血 采 血 前 先 用 手 揉 搓 局 部, 使 血 液 循 环 旺 盛, 再 用 70% 酒 精 进 行 局 部 消 毒, 用 刺 血 针 或 注 射 针 头 穿 刺 ( 深 约 2mm), 擦 去 第 一 滴 血, 在 不 加 压 力 下 任 血 液 自 然 流 出, 然 后 使 血 滴 入 小 试 管 静 脉 采 血 通 常 选 用 肘 窝 的 静 脉, 局 部 用 碘 酒 及 70% 酒 精 消 毒, 扎 止 血 带, 用 严 密 消 毒 的 注 射 器 穿 刺 采 血, 然 后 注 入 适 当 的 容 器 中 1 所 用 注 射 器 针 头 及 盛 血 容 器 都 必 须 是 十 分 清 洁 干 燥 的 2 针 头 与 针 管 需 要 连 接 严 密, 在 采 血 过 程 中 不 应 进 入 小 气 泡, 否 则 易 发 生 凝 血 和 溶 血 3 由 注 射 器 注 出 血 液 时, 必 须 拔 掉 针 头, 沿 器 壁 轻 轻 地 注 到 容 器 中, 不 要 有 气 泡, 避 免 强 力 冲 击 (2) 分 离 血 清 把 新 采 的 血 于 试 管 或 离 心 管 中, 倾 斜 放 置, 任 其 自 然 凝 固, 然 后 移 放 冰 箱 或 室 温 放 置 等 待 析 出 血 清 如 急 用 时, 可 在 已 经 完 全 凝 固 ( 约 需 30~45 分 钟 ) 后, 用 细 的 钝 尖 玻 璃 棒 紧 贴 管 壁 把 凝 块 表 面 周 边 粘 附 管 壁 处 轻 轻 剥 开, 然 后 离 心 2000~3000rpm 约 10 分 钟, 移 取 血 清 放 另 外 小 试 管 中 (3) 抗 凝 全 血 及 血 浆 的 制 备 采 血 后 立 即 注 入 盛 有 适 当 的 抗 凝 剂 的 试 管 中, 轻 振 使 抗 凝 剂 溶 解 并 混 匀, 即 可 得 到 不 凝 的 全 血 把 抗 凝 血 液 离 心 (2000~3000rpm 5~10 分 钟 ), 使 有 形 成 分 下 沉, 上 部 即 为 血 浆 用 乳 头 吸 管 注 意 吸 取 血 浆, 移 放 另 外 试 管 中 备 用 生 化 实 验 中 常 用 的 抗 凝 剂 有 :1 草 酸 盐, 用 量 为 2mg/ml 2 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 (Na 2 EDTA),1mg/ml 3 氟 化 钠,10mg/ml, 它 还 有 抑 制 糖 酵 解 作 用 4 肝 素 ( Heparin),0.05 mg/ml 这 些 抗 凝 剂 使 用 固 体 粉 末, 也 可 以 预 先 配 成 一 定 浓 度 的 溶 液, 按 计 算 量 ( 例 如 5ml 血 液 需 要 10% 草 酸 钾 0.1ml) 加 入 试 管 中, 然 后 放 烘 箱 中 于 80 以 下 烘 干, 便 于 使 用 血 液 加 入 抗 凝 剂 后, 要 及 时 轻 轻 摇 动 使 抗 凝 剂 溶 解 并 混 匀, 不 可 强 力 振 荡, 避 免 溶 血 抗 凝 剂 的 药 量 要 适 当, 过 少 不 足 以 抗 凝, 过 多 则 影 响 实 验 又 根 据 实 验 目 的 不 同 要 对 抗 凝 剂 加 以 选 择, 如 用 草 酸 铵 则 不 适 于 氮 定 量 如 血 糖 定 量 可 用 氟 化 钠 以 防 止 糖 的 分 解, 最 好 与 草 酸 盐 并 用 ( 每 ml 血 用 草 酸 盐 2mg+ 氟 化 钠 3~4mg) 肝 素 抗 凝 效 果 好, 适 用 于 各 种 分 析, 但 价 格 较 贵, 一 般 实 验 中 不 必 使 用 (4) 血 液 样 品 的 保 存

8 血 液 成 分 容 易 发 生 变 动, 原 则 上 应 尽 快 进 行 分 析 如 必 需 暂 时 保 存 时, 应 放 入 冰 箱 全 血 最 不 稳 定, 可 做 成 除 蛋 白 滤 液 保 存 血 浆 应 及 时 与 血 细 胞 分 开, 血 清 也 应 与 凝 块 分 开, 单 独 保 存 2. 尿 液 (Urine Urine) (1) 采 尿 尿 液 成 分 及 浓 度 生 理 变 动 较 大 按 实 验 目 的 不 同, 可 用 不 同 的 尿 液 许 多 定 性 实 验 可 用 随 时 采 取 的 一 次 尿 样 清 晨 第 一 次 尿 样, 比 较 稳 定, 便 于 比 较, 也 常 采 用 定 量 实 验 常 需 采 用 全 日 尿 样 全 日 尿 亦 即 由 第 一 天 某 时 开 始 到 第 二 天 同 一 时 间 的 24 小 时 尿, 具 体 采 法 如 下 : 在 第 一 天 晨 6 时 排 尿 一 次 弃 去, 以 后 的 排 尿 全 部 收 集 到 加 有 适 当 防 腐 剂 的 容 器 中, 到 翌 晨 6 时, 不 论 有 无 尿 意, 再 主 动 排 尿 一 次 于 容 器 中 采 尿 中 间 不 可 有 异 物 混 入 采 尿 完 了 后, 把 全 部 尿 液 充 分 混 匀, 量 记 总 体 积 及 其 他 必 要 项 目, 然 后 留 取 其 一 部 分 供 实 验 用 (2) 防 腐 为 防 止 采 尿 过 程 中 及 暂 时 保 存 中 尿 液 成 分 发 生 变 化, 需 要 加 适 当 的 防 腐 剂 选 用 不 影 响 实 验 目 的 的 防 腐 剂 常 用 的 有 甲 苯, 全 日 尿 中 加 2~5ml, 它 成 一 薄 层 盖 在 尿 液 表 面 上, 适 用 于 一 般 测 定 另 外 也 常 用 冰 醋 酸 ( 约 10ml) 浓 盐 酸 ( 约 10ml) 等 3. 组 织 许 多 实 验 中 常 用 肝 脏 或 肌 肉, 主 要 因 为 其 量 多 且 含 酶 类 较 全 组 织 材 料 的 处 理 过 程 中, 最 重 要 的 原 则 是 切 实 注 意 勿 使 待 分 析 物 质 发 生 变 化 或 损 失 (1) 动 物 的 处 理 一 般 常 用 兔 鼠 蛙 等, 可 用 打 击 头 部 使 急 速 死 亡, 鼠 亦 常 用 脱 颈 椎 方 法 致 死, 必 要 时 立 即 断 头 放 血 然 后 迅 速 采 出 所 需 组 织, 放 到 冰 冷 条 件 下, 除 去 其 他 组 织, 洗 去 血 液, 用 滤 纸 吸 干, 称 重 供 用 (2) 匀 浆 的 制 备 进 行 组 织 或 细 胞 内 酶 活 性 的 测 定 或 某 些 成 分 的 定 量 时 多 使 用 组 织 匀 浆 制 备 匀 浆 一 般 常 用 乳 钵 把 组 织 剪 碎, 放 乳 钵 中, 必 要 时 加 少 量 玻 璃 砂, 研 磨, 加 入 一 定 量 液 体 以 做 成 一 定 稀 释 倍 数 的 匀 浆 ( 如 10% 匀 浆, 即 指 匀 浆 中 含 组 织 湿 重 10%) 但 研 磨 中 一 次 加 入 较 多 液 体, 不 便 于 细 研, 可 先 加 少 量, 研 细 后, 最 后 加 入 全 量 研 匀 制 备 匀 浆 并 提 取 组 织 成 分 常 用 的 溶 液 有 生 理 盐 水 缓 冲 液 等 分 析 某 些 细 胞 成 分 时, 使 用 0.15M 的 KCl 或 0.25M 蔗 糖 液 等 有 时 为 使 蛋 白 沉 淀 并 提 取 某 些 成 分, 用 5~10% 三 氯 醋 酸 等 在 分 析 酶 活 性 或 某 些 易 变 物 质 ( 如 ATP 等 ) 或 分 离 细 胞 内 各 组 分 进 行 研 究 时, 特 别 要 注 意 保 持 冰 冷 条 件, 迅 速 处 理 制 备 匀 浆 时, 一 方 面 采 取 冷 却 手 段, 防 止 变 化 ; 另 外 也 可 改 进 方 法 加 速 操 作 为 此, 可 采 用 匀 浆 器 (Homogenizer), 使 用 电 动 匀 浆 器 不 仅 加 快 了 研 磨 速 度, 也 提 高 了 匀 浆 的 均 匀 程 度 4. 沉 淀 的 分 离 (1) 过 滤 一 般 生 化 定 量 实 验 中, 常 用 优 质 滤 纸 和 小 漏 斗 进 行 过 滤 例 如 滤 除 血 清 蛋 白 质 的 沉 淀, 用 其 上 清 液 进 行 各 种 分 析 先 把 适 当 大 小 的 圆 形 滤 纸 进 行 对 折 两 次, 使 所 成 圆 锥 体

9 与 漏 斗 内 壁 全 面 接 触 如 与 漏 斗 角 度 不 适 合 要 调 整 滤 纸 的 圆 锥 角 度, 使 之 与 漏 斗 相 适 应 角 度 合 适 滤 纸 全 面 紧 贴 漏 斗 壁, 中 间 无 气 泡, 使 过 滤 速 度 较 快 向 滤 纸 上 倾 注 液 体, 要 沿 玻 棒 加 于 中 央, 加 液 不 可 过 多, 液 面 应 距 滤 纸 上 缘 2mm 以 上 (2) 离 心 及 离 心 机 离 心 法 是 利 用 离 心 力 将 不 同 质 量 的 物 质 进 行 分 离 离 心 力 与 转 速 ( 每 分 钟 转 数 ) 的 平 方 物 质 质 量 及 旋 转 半 径 成 正 比 电 动 离 心 机 转 速 快 分 离 效 果 高, 可 以 迅 速 地 使 溶 液 中 悬 浮 物 沉 积 下 来, 得 出 上 清 液 及 沉 淀, 供 进 一 步 分 析 液 体 黏 稠 或 过 少, 难 以 过 滤 或 不 适 于 需 时 较 长 的 过 滤 者, 皆 可 离 心 再 有 需 要 反 复 沉 淀 和 洗 涤 以 及 需 要 收 集 量 少 的 沉 淀 进 行 分 析 者, 更 需 要 离 心 此 外 离 心 法 也 用 于 某 些 液 体 的 分 离 离 心 使 用 离 心 机 (Centrifuge) 使 用 离 心 机 时 特 别 要 注 意 对 称 位 置 上 离 心 力 的 平 衡 其 次 注 意 防 止 离 心 过 程 中 离 心 管 的 破 裂 及 保 证 离 心 效 果, 虽 然 转 速 愈 快 时 间 愈 长 则 离 心 作 用 愈 大, 但 这 也 增 加 仪 器 负 担 和 打 坏 离 心 管 的 危 险 一 般 实 验, 常 用 转 速 为 每 分 钟 5000 转 ( 每 分 钟 转 数 round per minute, 常 用 符 号 rpm 表 示 ) 以 下, 大 多 数 情 况 下, 约 2000rpm 5~10 分 钟 即 可 达 到 目 的 某 些 实 验, 按 规 定 的 转 速 及 时 间 作 用, 转 速 不 可 过 高, 时 间 不 可 拖 长 一 般 电 动 离 心 机 的 使 用 方 法 及 注 意 事 项 如 下 : 使 用 方 法 1) 检 查 离 心 管 套 管 : 如 有 玻 璃 碎 片 等 异 物, 必 须 彻 底 清 除 管 底 放 好 适 当 的 棉 花 或 胶 垫 2) 平 衡 对 称 位 置 的 重 量 : 用 称 离 心 管 用 的 天 平, 平 衡 对 称 位 置 上 的 套 管 离 心 管 与 内 容 物 的 总 重 一 侧 放 检 品 管, 向 另 侧 离 心 管 加 水, 达 到 平 衡 为 止 3) 套 管 等 放 入 离 心 机 的 对 称 位 置 后, 离 心 管 不 得 过 高, 否 则 必 须 重 新 处 理 最 后 盖 上 离 心 机 盖 4) 先 将 调 速 旋 钮 转 到 零 位, 然 后 再 正 确 连 接 电 源 ( 注 意 电 压 严 防 接 错 ) 逐 步 转 动 旋 钮, 渐 渐 加 快 转 速, 待 机 钮 指 示 或 转 速 指 示 器 的 标 示 达 到 所 需 转 速 为 止 记 时 间 5) 到 规 定 时 间 时, 逐 渐 地 转 回 旋 钮 到 零 位, 拔 下 电 源 插 销, 等 待 转 动 自 然 停 止, 决 不 可 用 手 强 制 地 使 之 突 然 停 转 然 后 开 盖, 取 出 离 心 管 注 意 事 项 1) 离 心 机 需 放 在 牢 固 平 稳 的 台 面 上, 保 持 水 平 位 置 2) 使 用 离 心 机, 关 键 问 题 是 对 称 位 置 上 的 离 心 力 相 等, 不 仅 对 称 的 要 总 重 相 等, 而 且 重 心 所 在 位 置 也 应 该 对 称, 只 有 这 样 才 能 保 证 仪 器 高 速 正 常 运 行 和 得 到 好 的 离 心 效 果 ; 否 则 在 高 度 旋 转 中 会 产 生 离 心 力 的 很 大 差 别, 发 生 震 动, 影 响 沉 降 效 能, 并 且 容 易 使 离 心 管 破 碎, 甚 至 会 损 伤 仪 器 所 以 保 持 对 称 位 的 平 衡 是 必 须 严 格 遵 守 的 操 作 规 程 所 用 离 心 管 应 当 是 重 量 和 形 状 相 同 的 管 壁 厚 薄 不 规 整 质 量 不 好 的 玻 璃 离 心 管, 在 3000rpm 以 上 时 很 容 易 发 生 打 管 现 象 一 般 使 用 较 低 转 速 时 可 两 侧 都 放 待 离 心 液 体, 为 对 称 位 平 衡 向 较 轻 侧 离 心 管 与 套 管 之 间 加 水 但 使 用 转 速 较 高 时, 应 当 取 前 述 向 另 侧 离 心 管 中 加 水 的 方 法 向 离 心 管 与 套 间 加 水 虽 然 两 侧 可 以 等 重, 但 旋 转 后 两 者 重 心 所 在 位 置 不 同, 即 旋 转 半 径 不 同, 高 速 旋 转 时 仍 会 产 生 离 心 力 的 不 同 等 重 并 不 一 定 离 心 力 相 等, 平 衡 的 原 则 是 要 求 对 称 位 离 心

10 力 相 等 3) 起 动 及 停 车 过 程 都 必 须 是 逐 渐 地, 起 动 过 快 时 可 有 多 余 电 流 变 为 热 能, 有 烧 线 包 危 险, 震 动 也 大, 易 洒 出 液 体 或 打 破 离 心 管 强 制 突 然 停 转, 不 仅 会 有 沉 淀 振 起, 也 会 损 害 仪 器 4) 起 动 时 或 离 心 过 程 中 出 现 异 常 声 响 时, 要 及 时 停 车 进 行 检 查 处 理 5) 注 意 切 勿 使 液 体 流 溅 于 离 心 机 内 侵 蚀 机 体, 机 腔 内 应 干 燥 清 洁, 离 心 管 内 装 液 体 不 可 过 满, 避 免 溅 出 使 用 后 对 离 心 管 套 管 也 要 进 行 检 查 处 理, 套 管 内 应 保 持 清 洁 干 燥, 不 得 留 有 液 体 或 碎 破 片 等 二 比 色 分 析 法 和 分 光 光 度 法 我 们 知 道 许 多 物 质 都 是 具 有 颜 色 的, 当 含 有 这 些 物 质 的 溶 液 浓 度 改 变 时, 溶 液 颜 色 的 深 浅 度 也 就 随 着 改 变 溶 液 越 浓 颜 色 越 深, 溶 液 越 稀 颜 色 越 浅 因 此 可 以 利 用 比 较 颜 色 深 浅 的 方 法 来 确 定 溶 液 中 有 色 物 质 的 含 量, 这 种 方 法 就 称 为 比 色 分 析 法 此 法 可 用 光 电 比 色 计 进 行 测 定, 由 滤 光 板 来 获 得 近 似 的 单 色 光, 滤 光 板 的 波 长 范 围 宽 达 30~50nm 根 据 物 质 对 光 的 吸 收 特 性 和 吸 收 强 度, 对 物 质 进 行 定 性 和 定 量 的 分 析 方 法, 称 为 分 光 光 度 法 (spectrophotometry) 用 紫 外 光 源 测 定 无 色 物 质 的 方 法, 称 为 紫 外 分 光 光 度 法 ; 用 可 见 光 光 源 测 定 有 色 物 质 的 方 法, 称 为 可 见 光 光 度 法 可 用 分 光 度 计 进 行 测 定, 以 棱 镜 或 光 栅 为 分 光 器, 并 用 夹 缝 分 出 很 窄 的 一 条 单 波 长 的 光 这 种 单 色 光 的 波 长 范 围 一 般 都 在 5nm 左 右, 因 而 其 测 定 的 灵 敏 度, 选 择 性 和 准 确 度 都 比 光 电 比 色 法 高 分 光 度 法 和 比 色 分 析 法 都 是 光 吸 收 方 法, 两 者 的 的 主 要 区 别 是 所 用 的 一 起 的 构 造 和 分 析 的 灵 敏 度 准 确 度 以 及 范 围 所 不 同 ( 一 ) 比 色 分 析 法 的 基 本 原 理 1. 单 色 光 与 互 补 色 光 是 一 种 电 磁 波 波 长 范 围 在 400~760nm 的 光 是 人 的 视 觉 所 能 觉 察 的, 故 称 为 可 见 光 波 长 小 于 400nm 的 光 为 紫 外 光 ; 大 于 760nm 的 光 为 红 外 光 我 们 日 常 所 见 到 的 白 光 是 由 不 同 波 长 (400~700nm) 的 电 磁 波 按 一 定 比 例 组 成 的 混 合 光 当 一 束 白 光 经 棱 镜 分 光 后 为 红 橙 黄 绿 青 蓝 紫 七 种 色 光, 这 种 现 象 称 为 色 散 只 具 有 一 种 波 长, 不 能 再 行 分 解 的 色 光 称 作 单 色 光 所 以 白 光 是 由 各 种 不 同 波 长 的 单 色 光, 按 一 定 比 率 混 合 而 成 的 复 合 光 各 种 颜 色 可 见 光 的 近 似 波 长 列 于 表 1 把 两 种 适 当 颜 色 的 光 按 一 定 的 强 度 比 率 混 合, 可 以 成 为 白 光, 这 两 种 色 光 称 为 互 补 色, 如 图 1 所 示, 图 中 处 于 直 线 关 系 的 两 种 色 光 为 互 补 色, 如 黄 光 和 蓝 光 可 混 合 成 白 光 表 1 可 见 光 的 波 长 颜 色 紫 色 蓝 色 青 蓝 青 青 绿 绿 黄 橙 红

11 波 长 /nm 400~ 450~ 480~ 490~ 500~ 560~ 580~ 600~ 650~ 溶 液 的 颜 色 与 光 的 选 择 性 吸 收 (1) 物 质 对 光 的 选 择 性 吸 收 物 质 的 颜 色, 主 要 取 决 于 它 对 各 种 色 光 的 吸 收 透 过 反 射 的 程 度 由 于 物 质 的 本 性 和 形 态 不 同, 对 光 的 吸 收 透 过 反 射 的 程 度 也 就 不 同, 物 质 因 而 呈 现 不 同 的 颜 色 对 透 明 物 质 而 言, 例 如 溶 液, 物 质 的 颜 色 主 要 取 决 于 该 物 质 对 光 的 吸 收 程 度 有 色 溶 液 对 光 的 吸 收 具 有 选 择 性, 溶 液 中 有 色 质 点 选 择 性 的 吸 收 某 种 颜 色 的 光, 使 该 溶 液 呈 现 该 被 吸 收 光 的 互 补 色 例 如, 白 光 照 射 时, 蓝 色 的 双 缩 脲 试 剂 溶 液 主 要 吸 收 其 中 的 黄 色 光, 而 白 光 中 的 其 他 色 光 都 能 透 过 在 这 些 透 过 光 中, 除 蓝 色 以 外 的 色 光 都 能 两 两 互 补 成 白 色, 所 以 双 缩 脲 溶 液 就 呈 现 为 蓝 色, 即 黄 色 的 互 补 色 由 此 可 见, 有 色 溶 液 的 颜 色 是 被 吸 收 光 颜 色 的 补 色 吸 收 越 多, 则 补 色 的 颜 色 越 深 比 较 溶 液 颜 色 的 深 度, 实 质 上 就 是 比 较 溶 液 对 它 所 吸 收 光 的 吸 收 程 度 (2) 光 吸 收 曲 线 物 质 对 不 同 波 长 光 的 选 择 性 吸 收, 可 以 用 光 吸 收 曲 线 来 描 述 通 常 测 定 同 一 物 质 吸 收 不 同 波 长 光 线 的 吸 光 度 值, 以 波 长 为 横 坐 标, 吸 光 度 为 纵 坐 标 作 图, 所 得 的 曲 线 为 光 吸 收 曲 线, 或 吸 收 光 谱 核 黄 素 的 吸 收 光 谱 如 图 2 所 示, 由 图 可 见, 核 黄 素 对 不 同 波 长 光 线 吸 收 程 度 不 同, 在 可 见 光 中, 选 择 性 地 对 450nm 吸 收 最 多, 称 为 最 大 吸 收 另 外 在 紫 外 部 分 还 有 两 个 吸 收 峰, 分 别 在 260nm 和 370nm 处 各 种 物 质 的 结 构 性 质 不 同, 对 不 同 波 长 的 光 的 吸 收 程 度 也 不 同, 各 有 其 特 异 的 吸 收 曲 线, 这 使 它 可 以 作 为 物 质 定 性 鉴 定 的 基 础, 例 如, 可 测 定 两 处 波 长 的 吸 光 度 值, 用 其 比 值 来 确 认 是 否 是 某 物 质 对 于 同 一 物 质 来 说, 不 同 浓 度 的 溶 液 的 光 吸 收 曲 线 形 状 相 似, 最 大 吸 收 波 长 不 变, 而 且 在 一 定 波 长 处, 吸 光 度 随 溶 液 的 浓 度 的 增 加 而 增 加, 这 个 特 性 可 以 作 为 物 质 定 量 分 析 的 基 础 3. 朗 伯 - 比 尔 定 律 光 密 度 当 一 束 平 行 单 色 光 通 过 溶 液 后, 光 被 溶 液 吸 收 的 程 度 与 溶 液 的 浓 度 以 及 液 层 的 厚 度 有 关 浓 度 越 大, 液 层 越 厚, 则 吸 收 光 约 多, 这 就 是 溶 液 对 光 的 吸 收 规 律, 即 朗 伯 - 比 尔 橙 图 2 黄 红 图 1 白 绿 光 紫 互 补 色 示 意 图 青 蓝 波 长 (n m ) 核 黄 素 的 吸 收 光 谱 青 蓝

12 定 律 其 数 学 表 示 式 的 表 述 如 下 : 如 图 3 所 示, 假 定 一 束 平 行 单 色 光 通 过 溶 液, 设 入 射 光 的 强 度 为 I 0, 溶 液 的 浓 度 为 C, 液 层 的 厚 度 为 L, 透 射 光 强 度 为 I, 则 lg(i 0 /I)=KCL 式 中 lg(i 0 /I) 的 意 义 是 : 当 I=I 0 时,lg(I 0 /I)=0, 表 示 溶 液 完 全 不 吸 收 光 线 ; 当 I<<I 0 时,lg(I 0 /I) 值 很 大, 表 示 溶 液 对 光 线 吸 收 较 多 ; 当 I 0 时,lg(I 0 /I) 值 无 穷 大, 表 示 光 线 几 乎 被 溶 液 完 全 吸 收, 即 溶 液 不 透 光 T=I/I 0 =10 - KCL 所 以,lg(I 0 /I) 表 示 光 线 透 过 溶 液 时 被 吸 收 的 程 度, 一 般 用 吸 光 度 A(Absorbance) 或 消 光 度 E(Extinction) 来 表 示, 习 惯 上 又 称 为 光 密 度 OD 或 D(Optical density) 因 此, 上 式 又 可 写 为 : A=KCL 或 D=KCL 该 式 的 物 理 意 义 是 : 在 一 定 温 度 下, 一 束 平 行 的 单 色 光 通 过 均 匀 的 非 散 射 溶 液 时, 溶 液 对 光 的 吸 收 程 度 与 溶 液 的 浓 度 及 液 层 厚 度 的 乘 积 成 正 比 式 中 K 为 吸 光 系 数, 在 数 值 上 等 于 C 和 L 均 为 1 时 溶 液 在 特 定 波 长 下 所 具 有 的 吸 光 度 在 一 定 温 度 下, 对 于 同 一 物 质 和 一 定 波 长 的 入 射 光 而 言, 它 是 一 个 常 数 当 C 以 mol L -1 为 单 位 时, 吸 光 系 数 称 为 摩 尔 吸 光 系 数, 用 ε 表 示, 其 单 位 是 L mol -1 cm -1 ; 当 C 以 质 量 体 积 浓 度 (g ml -1 ) 表 示 时, 吸 光 系 数 称 为 百 分 吸 光 系 数, 用 E 1% 1cm 表 示, 单 位 是 ml g -1 cm-1 ε 值 越 大, 表 示 有 色 物 质 对 该 波 长 光 的 吸 收 能 力 越 强, 有 色 物 质 的 颜 色 越 深, 测 定 的 灵 敏 度 也 就 越 高 一 般 ε 值 在 10 3 以 上 即 可 进 行 比 色 分 析 比 色 法 中 常 把 I/I 0 称 为 透 光 率, 用 T 表 示, 透 光 率 和 吸 光 度 的 关 系 如 下 : A=lg(I 0 /I)=lg(1/T)=-lgT 需 要 指 出 的 是, 朗 伯 - 比 尔 定 律 不 仅 适 用 于 可 见 光, 也 适 用 于 红 外 光 和 紫 外 光 ; 不 仅 适 用 于 均 匀 非 散 射 的 液 体, 也 适 用 于 固 体 和 气 体 因 此, 它 是 各 类 吸 光 光 度 法 定 量 的 依 据, 用 途 很 广 I 0 图 3 L C 溶 液 的 光 吸 收 示 意 图 I ( 二 ) 比 色 分 析 的 测 定 方 法 1. 待 测 溶 液 浓 度 的 计 算 方 法 利 用 光 电 比 色 计 或 是 分 光 光 度 计 可 以 测 出 溶 液 的 吸 光 度, 依 据 朗 伯 - 比 尔 定 律, 通 过

13 测 得 的 溶 液 吸 光 度, 求 出 待 测 溶 液 浓 度 的 常 用 计 算 方 法 有 如 下 几 种 (1) 标 准 曲 线 法 计 算 待 测 溶 液 的 浓 度 先 配 制 一 系 列 浓 度 由 小 到 大 的 标 准 溶 液, 分 别 测 定 标 准 溶 液 的 吸 光 度 在 标 准 溶 液 一 定 浓 度 的 范 围 内, 溶 液 的 浓 度 与 其 吸 光 度 之 间 呈 直 线 关 系 以 各 管 吸 光 度 为 纵 坐 标, 各 管 的 浓 度 为 横 坐 标 作 图, 得 到 一 条 通 过 原 点 的 直 线, 叫 做 标 准 曲 线 在 制 作 标 准 曲 线 时, 至 少 用 五 种 浓 度 递 增 的 标 准 溶 液, 测 出 的 数 据 至 少 要 有 三 个 落 在 直 线 上, 制 作 的 标 准 曲 线 方 可 使 用 标 准 曲 线 可 在 固 定 仪 器 和 方 法 的 条 件 下 多 次 使 用, 适 合 于 经 常 性 工 作 但 若 仪 器 不 同 或 测 定 方 法 及 条 件 改 变, 测 得 的 标 准 曲 线 不 同 因 此 在 更 换 任 何 测 定 条 件 时 都 需 重 新 绘 制 标 准 曲 线 测 定 待 测 溶 液 时, 操 作 条 件 应 与 测 定 标 准 溶 液 时 相 同 测 出 吸 光 度 后, 从 标 准 曲 线 上 直 接 查 出 待 测 溶 液 的 浓 度 如 图 4 所 示 浓 度 (2) 标 准 管 法 计 算 待 测 溶 液 的 同 样 条 件 下, 同 时 测 得 标 准 液 和 待 测 液 的 吸 光 度, 通 过 比 较 标 准 和 待 测 溶 液 的 吸 光 度, 推 出 待 测 溶 液 浓 度 的 方 法 推 导 过 程 如 下 : 根 据 朗 伯 - 比 尔 定 律 可 知 标 准 溶 液 :As=KsCsLs 待 测 溶 液 :Au=KuCuLu 两 种 溶 液 的 液 层 厚 度 相 同, 所 以 Lu=Ls; 而 且 是 同 一 物 质 的 两 种 不 同 浓 度, 测 定 时 所 用 单 色 光 相 同, 测 定 温 度 也 相 同, 所 以 Ku=Ks 两 式 相 比 得 到 :Au/As=Cu/Cs, 即 Cu=Cs Au/As 上 式 中 Au,As 可 由 光 电 比 色 计 或 分 光 光 度 计 测 出,Cs 为 已 知, 则 待 测 溶 液 的 浓 度 Cu 即 可 以 求 出 (3) 标 准 系 数 法 计 算 待 测 溶 液 的 浓 度 此 法 比 上 述 两 法 简 便, 将 多 次 测 定 标 准 溶 液 的 吸 光 度 计 算 出 平 均 值, 按 下 式 求 出 标 准 系 数 : 标 准 系 数 = 标 准 液 浓 度 / 标 准 液 平 均 吸 光 度 将 用 同 样 方 法 测 出 待 测 溶 液 的 吸 光 度 带 入 下 式 得 到 待 测 液 浓 度 : 待 测 液 浓 度 = 待 测 溶 液 吸 光 度 标 准 系 数 (4) 消 光 系 数 法 计 算 待 测 溶 液 的 浓 度 计 算 公 式 为 : 图 4 标 准 曲 线 ( 浓 度 - 吸 光 度 曲 线 ) C=D/ 在 同 样 条 件 下 测 得 待 测 溶 液 的 吸 光 度, 可 用 上 式 计 算 出 其 浓 度 此 公 式 常 用 于 紫 外 吸 收 法, 如 对 蛋 白 质 溶 液 浓 度 的 测 定, 不 需 显 色, 方 法 简 便 由 于 蛋 白 质 在 波 长 280nm 处 有 最 大 吸 收 峰, 利 用 已 知 蛋 白 质 在 波 长 280nm 处 的 克 分 子 消 光

14 系 数, 再 读 取 待 测 液 蛋 白 质 的 吸 光 度, 即 可 算 出 蛋 白 质 的 浓 度 2. 比 色 分 析 条 件 的 选 择 (1) 波 长 的 选 择 波 长 的 选 择 对 比 色 分 析 的 灵 敏 度, 准 确 度 有 很 大 的 影 响 选 择 波 长 的 原 则 是 : 吸 收 最 大, 干 扰 最 小 因 为 吸 光 度 越 大, 测 定 灵 敏 度 越 高, 准 确 度 也 容 易 提 高 ; 干 扰 越 小, 选 择 性 越 好, 测 定 准 确 度 越 高 如 图 5 所 示, 有 A 和 B 两 种 物 质 存 在,A 物 质 最 大 吸 收 波 长 在 a 处, 但 在 同 样 波 长 下 B 物 质 也 有 吸 收, 对 测 定 有 干 扰, 因 此 选 用 b 处 波 长 比 较 合 适, 此 时 灵 敏 度 虽 有 所 降 低, 但 清 除 了 B 物 质 的 干 扰, 提 高 了 准 确 度 (2) 吸 光 度 的 选 择 溶 液 的 吸 光 度 太 大 或 太 小, 都 会 影 响 测 量 的 准 确 度 在 光 电 比 色 计 或 分 光 光 度 计 的 读 数 盘 上 附 有 相 互 对 应 的 两 种 标 尺 : 一 种 是 等 距 离 标 尺, 为 透 光 率 T, 单 位 为 %, 范 围 是 0 100; 另 一 种 是 不 等 距 离 标 尺, 为 吸 光 度 A, 范 围 是 0 如 图 6 所 示, 在 吸 光 度 较 小 的 一 端,A 值 的 读 数 只 能 准 确 至 1~2 位 有 效 数 字 ; 在 吸 光 度 较 大 的 一 端, 由 于 刻 度 密 集, 读 数 也 只 能 精 确 至 1~2 位 有 效 数 字 ; 而 在 标 尺 中 部, 读 数 可 精 确 至 图 5 物 质 A 和 B 的 吸 收 曲 线 2~3 位 有 效 数 字 因 此, 吸 光 度 在 检 流 计 标 尺 中 部 读 数, 测 定 精 度 较 高, 即 测 量 时 要 求 A 值 范 围 在 0.05~1.0 根 据 A=KCL 关 系 式 可 以 看 出, 调 节 溶 液 浓 度 或 改 变 比 色 杯 厚 度, 都 可 以 改 变 吸 光 度 一 般 采 用 改 变 溶 液 浓 度 的 方 法, 控 制 吸 光 度 在 0.05~1.0 的 范 围 内 (3) 显 色 条 件 与 参 比 溶 液 图 6 吸 光 度 和 透 光 率 的 关 系 待 测 的 无 色 的 溶 液, 往 往 需 要 通 过 显 色 反 应, 生 成 有 色 产 物, 再 进 行 比 色 分 析 首 先, 应 该 选 择 合 适 的 显 色 剂, 使 显 色 反 应 灵 敏 度 高, 选 择 性 好, 产 物 化 学 性 质 稳 定 ; 其 次, 必 须 控 制 显 色 条 件, 包 括 显 色 剂 的 用 量, 溶 液 的 ph 值, 温 度, 反 应 时 间, 杂 质 的 干 扰, 因 为 这 些 因 素 的 变 化 可 以 引 起 能 够 引 起 颜 色 深 度 的 变 化, 从 而 影 响 比 色 测 定 的 准 确 度 此 外, 比 色 分 析 中, 需 要 利 用 空 白 溶 液 调 节 仪 器 的 透 光 率 为 100%, 此 时 的 吸 光 度 为 零 所 谓 空 白 溶 液 是 指, 仅 仅 不 含 待 测 物 质, 而 其 他 溶 剂, 反 应 试 剂, 显 色 条 件, 比 色 条 件 与 被 测 溶 液 完 全 相 同 的 溶 液 利 用 空 白 溶 液, 可 以 消 除 显 色 反 应 中 其 他 有 色 物 质 的 干 扰, 以 及 溶 剂 和 比 色 杯 对 入 射 光 的 影 响 3. 比 色 计 或 分 光 光 度 计 的 工 作 原 理 比 色 计 或 分 光 光 度 计 一 般 包 括 五 大 部 件 ( 图 7)

15 光 源 单 色 光 器 狭 缝 吸 收 杯 检 测 器 系 统 图 7 分 光 光 度 计 的 基 本 结 构 示 意 图 (1) 光 源 在 光 电 比 色 计 和 可 见 光 分 光 光 度 计 中, 采 用 6~12V 的 钨 灯, 其 最 适 宜 的 波 长 范 围 是 360~1000nm, 为 使 光 的 强 度 稳 定, 须 用 稳 压 装 置 来 稳 定 电 压 紫 外 分 光 光 度 计 中, 采 用 氢 弧 灯, 适 宜 波 长 范 围 是 200~320nm (2) 波 长 控 制 器 在 光 电 比 色 计 中 采 用 滤 光 片 作 为 波 长 控 制 器 滤 光 片 是 有 色 玻 璃 片, 其 作 用 是 从 光 源 发 出 的 连 续 光 谱 中 分 出 实 验 所 需 的 某 一 特 定 波 长 范 围 的 光, 即 获 得 适 当 波 长 的 近 似 单 色 光 选 择 滤 光 片 的 原 则 是 滤 光 片 最 易 透 过 的 光, 也 就 是 溶 液 最 易 吸 收 的 光 即 滤 光 片 的 颜 色 与 溶 液 的 颜 色 应 互 为 补 色, 这 是 因 为 有 色 溶 液 对 它 的 互 补 色 光 有 最 大 的 吸 收 分 光 光 度 计 采 用 单 色 器 来 控 制 波 长 它 可 以 把 连 续 波 长 的 光 分 解, 从 中 得 出 任 一 所 需 波 长 的 更 纯 的 单 色 光 单 色 器 包 含 有 狭 缝 调 节 透 镜 系 统 以 及 色 散 元 件 紫 外 分 光 光 度 计 中, 光 学 系 统 中 的 透 镜 棱 镜 由 石 英 制 成, 对 紫 外 光 吸 收 很 少 (3) 吸 收 池 吸 收 池 供 比 色 时 盛 溶 液 用, 它 是 用 无 色 透 明 厚 度 均 匀 的 玻 璃 制 成 的 其 透 光 的 两 面 严 格 平 行 同 一 系 列 的 测 定 中, 所 用 的 比 色 皿 必 须 配 套, 即 同 一 配 套 比 色 皿 盛 有 同 一 溶 液 在 同 一 波 长 时 测 得 的 透 光 率 误 差 不 得 越 过 0.5% 实 验 时 可 根 据 溶 液 的 浓 度 不 同 选 择 cm 不 同 规 格 的 比 色 皿 比 色 皿 要 保 持 清 洁, 透 光 面 要 注 意 保 护, 不 得 用 手 直 接 接 触 或 用 粗 糙 的 滤 纸 擦 拭, 以 免 划 伤 表 面, 影 响 吸 收 程 度 若 外 壁 有 液 珠, 应 用 滤 纸 吸 干 后 再 用 擦 镜 纸 擦 净 紫 外 分 光 光 度 计 的 比 色 皿 为 石 英 比 色 皿, 以 减 少 对 紫 外 光 的 吸 收 (4) 光 电 转 换 器 它 是 将 光 能 转 换 成 电 信 号 的 器 件, 常 用 的 有 光 电 池 和 光 电 管 光 电 池, 常 用 硒 光 电 池, 适 用 于 380~750nm 波 长 范 围 当 光 线 照 射 到 光 电 池 时, 电 子 从 半 导 体 表 面 逸 出 由 于 硒 的 半 导 体 特 性 而 在 电 路 中 产 生 光 电 流 将 光 电 池 与 一 个 灵 敏 检 流 计 相 联, 在 照 射 光 强 度 不 太 大 且 外 电 路 电 阴 很 小 时, 光 电 流 大 小 与 照 射 光 的 强 度 成 正 比 因 此 可 根 据 光 电 流 的 大 小 测 量 透 过 溶 液 的 光 强 度 硒 光 电 池 的 优 点 是 光 电 流 较 大, 可 不 必 经 过 放 大 而 直 接 用 灵 敏 检 流 计 测 量 有 时 当 光 电 池 受 强 光 照 射 或 连 续 使 用 时 间 太 长 时, 容 易 产 生 疲 劳, 这 时 需 使 其 在 暗 的 状 态 下 暂 作 恢 复, 方 可 继 续 使 用 光 电 管, 由 封 装 在 真 空 透 明 管 中 的 一 个 半 圆 柱 型 阴 极 和 一 个 丝 状 阳 极 组 成 阴 极 凹 面 有 光 电 发 射 材 料 层, 被 光 照 射 可 发 电 子 当 两 极 间 加 有 电 压 时, 发 射 出 来 的 电 子 就 流

16 向 阳 极 产 生 光 电 流 发 射 出 的 电 子 数 目 与 射 在 该 表 面 上 光 束 的 强 度 成 正 比 光 电 管 产 生 的 电 流 较 弱, 经 放 大 器 放 大 后 可 由 微 安 电 表 直 接 指 示 出 吸 光 度 或 透 光 率 (5) 检 流 计 用 光 电 池 作 光 电 转 换 器 的 比 色 测 量 仪 器 中, 检 流 计 一 般 采 用 悬 镜 式 光 电 反 射 检 流 计, 其 灵 敏 度 较 高 检 流 计 有 吸 光 度 A 和 百 分 透 光 率 T(%) 两 种 刻 度 标 尺, 可 直 接 读 数 标 尺 上 透 光 率 T 是 等 分 的 而 吸 光 度 A 的 刻 度 是 不 均 匀 的 透 光 率 T 可 用 小 数 或 百 分 率 表 示 对 于 用 光 电 管 作 光 电 转 换 器 的 仪 器, 由 于 加 了 放 大 器, 可 方 便 地 连 接 微 安 电 表 记 录 仪, 数 字 显 示 器 等 指 示 器, 也 可 以 调 节 电 桥 平 衡 的 方 式 读 数 取 数 据 ( 三 ) 常 用 分 光 光 度 计 的 使 用 目 前 实 验 室 常 用 的 分 光 光 度 计 主 要 是 721 型 722 型 和 751 型 分 光 光 度 计 721 和 722 型 为 可 见 光 分 光 光 度 计, 波 长 范 围 在 360~800nm 这 两 型 的 工 作 原 理 基 本 结 果 部 件 性 能 操 作 程 序 等 均 大 致 相 同 其 主 要 区 别 有 两 点 : 一 是 721 型 的 光 学 系 统 中 是 通 过 一 个 色 散 棱 镜 而 获 得 单 色 光, 而 722 型 的 色 散 元 件 是 一 个 光 栅 ; 二 是 721 型 的 读 数 是 根 据 指 针 在 刻 度 表 上 的 位 置 而 得 到 的, 在 一 定 程 度 上 存 在 读 数 误 差, 而 722 型 的 读 数 盘 是 直 接 显 示, 所 以 其 结 果 读 数 更 方 便 更 准 确 751 型 的 波 长 范 围 在 200~1000nm, 可 测 定 各 种 物 质 在 紫 外 可 见 光 及 近 红 外 区 的 吸 收 光 谱 下 面 主 要 介 绍 722S 型 和 751 型 分 光 光 度 计 的 操 作 程 序 及 注 意 事 项 S 2S 型 分 光 光 度 计 的 一 般 操 作 程 序 (1) 开 机 预 热 15 分 钟 以 上 (2) 转 动 波 长 选 择 钮, 选 用 所 需 的 波 长 (3) 将 装 有 空 白 标 准 样 品 的 比 色 杯 放 入 比 色 杯 架, 使 空 白 管 对 准 光 路 (4) 打 开 样 品 室 暗 箱 盖 ( 光 门 自 动 关 闭 ), 按 0%ADJ 键, 即 能 自 动 进 行 机 械 零 点 的 调 整, 数 码 显 示 为 (5) 盖 好 比 色 杯 暗 箱 盖 ( 光 门 自 动 开 启 ), 按 100%ADJ 键, 即 能 自 动 进 行 空 白 零 点 的 调 整, 数 码 显 示 为 100.0( 一 次 如 有 误 差 可 再 按 一 次 ) (6) 按 MODE 键 选 择 吸 光 度 测 定 模 式 (ABS 灯 亮 ), 数 码 显 示 自 动 转 换 为 吸 光 度 值 度 (7) 拉 动 比 色 杯 架 的 拉 杆, 使 测 定 杯 进 入 光 路, 从 数 码 显 示 上 即 可 读 出 样 品 的 吸 光 (8) 比 色 完 毕 后, 关 上 电 源 形 状, 取 出 比 色 杯, 将 比 色 杯 暗 箱 盖 好, 清 洗 比 色 杯 并 晾 干 型 分 光 光 度 计 的 一 般 操 作 程 序 (1) 在 电 源 电 压 与 仪 器 要 求 相 符 时, 接 通 电 源 (2) 选 择 相 应 波 长 的 光 源 灯, 钨 丝 灯 波 长 范 围 是 320~1000nm, 氢 弧 灯 波 长 范 围 是 320nm 以 下 拨 动 电 源 灯 座 把 手, 将 选 用 的 光 源 灯 置 入 光 路 中 根 据 需 要 可 以 在 光 路 中 插 入 滤 光 板, 以 减 少 杂 散 光, 一 般 情 况 下 无 此 必 要

17 (3) 检 查 仪 器 各 种 开 关 和 旋 钮 处 于 关 闭 位 置 时, 打 开 电 源 开 关, 预 热 20 分 钟 左 右 (4) 选 择 适 当 的 比 色 杯, 测 定 波 长 在 350nm 以 上 用 玻 璃 比 色 杯 ; 若 在 350nm 以 下, 用 石 英 比 色 杯 比 色 杯 盛 入 溶 液 后, 放 在 比 色 杯 架 上, 然 后 再 放 入 暗 箱 内, 盖 好 盖 板 此 时 盛 空 白 溶 液 的 比 色 杯 恰 好 处 于 光 路 中 (5) 选 择 适 当 的 光 电 管, 测 定 波 长 范 围 在 200~650nm 内, 用 紫 敏 光 电 管, 应 将 手 柄 推 入 ; 若 在 650~1000nm 范 围 内, 用 红 敏 光 电 管, 应 将 手 柄 拉 出 (6) 将 选 择 开 关 扳 到 校 正 处, 转 动 选 择 波 长 的 旋 钮, 使 波 长 刻 度 对 准 所 需 的 波 长 (7) 调 节 暗 电 流 旋 钮, 使 电 表 指 针 对 准 0 位 置 为 了 得 到 较 高 准 确 度, 每 测 定 一 次 都 应 校 正 暗 电 流 一 次 (8) 调 节 灵 敏 度 旋 钮, 在 正 常 情 况 下, 从 左 面 停 止 位 置 顺 时 针 方 向 旋 转 3~5 圈 (9) 转 动 读 数 电 位 器 旋 钮, 使 刻 度 盘 处 于 透 光 率 100% 位 置 打 开 选 择 开 关 到 1, 拉 开 暗 电 流 闸 门, 使 单 色 光 进 入 光 电 管 (10) 调 节 狭 缝 旋 钮, 使 电 表 指 针 处 于 0 位 置 附 近, 而 后 用 灵 敏 度 旋 钮 细 调, 使 指 针 准 确 的 指 在 0 位 (11) 轻 轻 拉 动 比 色 杯 架 拉 杆, 使 第 一 待 测 溶 液 处 于 光 路 中, 这 时 电 表 指 针 偏 离 0 位 再 转 动 读 数 电 位 器 旋 钮, 重 新 使 电 表 指 针 对 准 0 位, 刻 度 盘 上 的 读 数 即 为 该 待 测 溶 液 的 吸 光 度 接 着 拉 动 拉 杆 使 第 二 第 三 个 比 色 杯 对 准 光 路, 按 相 同 方 法 读 取 吸 光 度 值 (12) 完 成 一 次 测 量 后, 立 即 关 上 暗 电 流 闸 门, 以 保 护 光 电 管 (13) 在 读 数 时, 若 选 择 开 关 处 于 1 的 位 置, 吸 光 度 范 围 从 0, 透 光 率 从 0 100% 当 透 光 率 小 于 10%, 可 选 用 0.1 的 选 择 开 关, 使 获 得 较 精 确 的 数 值, 此 时 读 出 的 透 光 率 数 值 要 除 以 10, 而 相 应 的 吸 光 度 数 值 应 加 上 1.0 (14) 测 定 完 毕, 将 每 个 开 关 旋 钮 操 作 手 柄 等 复 原 或 关 闭 取 出 比 色 杯 洗 净, 自 然 干 燥 3. 操 作 分 光 光 度 计 的 注 意 事 项 (1) 分 光 光 度 计 为 贵 重 的 精 密 仪 器, 要 做 好 防 震 防 潮 防 光 和 防 腐 蚀 的 保 护 工 作 防 震 : 仪 器 应 放 在 固 定 的 平 稳 台 上, 不 要 随 意 搬 动, 使 用 时 要 轻 转 旋 钮, 不 可 用 力 过 猛 损 坏 机 件 ; 防 潮 : 光 电 池 受 潮 后, 灵 敏 度 下 降, 甚 至 失 效, 所 以 光 电 池 附 近 应 放 置 硅 胶, 仪 器 应 放 在 干 燥 的 地 方 ; 防 光 : 光 电 池 平 时 不 应 受 光 照 射, 使 用 时 应 防 止 强 光 照 射, 防 止 长 时 间 连 续 照 射 ; 防 腐 蚀 : 使 用 时 应 防 止 酸 碱 等 物 质 侵 入 机 件 内 部, 盛 装 待 测 液 时, 可 达 到 比 色 杯 高 度 的 3/4 左 右, 不 宜 过 多, 防 止 溶 液 流 出 杯 外, 移 动 比 色 杯 拉 杆 时 要 轻 轻 的 拉 动, 以 防 溶 液 溅 出, 腐 蚀 机 件 (2) 不 可 用 手, 滤 纸 和 毛 刷 等 物 摩 擦 比 色 杯 的 光 滑 面, 用 手 可 拿 比 色 杯 的 磨 面 比 色 杯 用 完 后 立 即 用 蒸 馏 水 洗 净, 干 燥 每 台 分 光 光 度 计 有 四 个 比 色 杯 专 用, 不 可 与 其 他 分 光 光 度 计 的 比 色 杯 互 换 三 电 泳 技 术

18 带 电 质 点 在 电 场 中 向 与 自 身 电 荷 相 反 的 电 极 移 动 的 现 象 称 为 电 泳 (electrophoresis) 蛋 白 质 分 子 为 两 性 电 解 质, 在 不 同 ph 溶 液 中 带 不 同 电 荷, 在 直 流 电 场 中 能 够 泳 动, 这 就 是 蛋 白 质 的 电 泳 现 象 1809 年 俄 国 物 理 学 家 Reǔss(PeЙce) 首 次 发 现 了 电 泳 现 象 他 将 两 根 玻 璃 管 插 入 粘 土 中, 容 器 灌 满 水, 管 底 放 一 层 砂 粒, 然 后 在 玻 璃 管 中 分 别 插 入 一 根 电 极, 并 与 银 - 锌 伏 打 电 池 相 连 当 电 路 接 通 后, 带 负 电 荷 的 粘 土 颗 粒 向 正 极 移 动, 通 过 砂 粒 层 进 入 水 中, 致 使 正 极 管 中 水 逐 渐 混 浊, 负 极 管 中 的 水 仍 是 澄 清 的, 但 体 积 增 加 了 后 来 有 关 电 泳 现 象 的 一 些 数 学 和 物 理 问 题 先 后 得 到 阐 明 1892~1897 年,Picton 和 Linder 首 次 证 明 血 红 蛋 白 等 胶 体 颗 粒 具 有 两 性 解 离 性 质 (amphoteric nature) 接 着,Field 和 Teague 用 琼 脂 作 为 支 持 介 质, 进 行 了 白 喉 毒 素 和 白 喉 抗 毒 素 的 电 泳 研 究 1937 年, 瑞 典 化 学 家 Tiselius 创 造 了 Tiselius 电 泳 仪, 并 建 立 了 研 究 蛋 白 质 的 移 动 界 面 电 泳 方 法, 并 利 用 该 方 法 首 次 成 功 地 将 血 清 蛋 白 质 分 成 几 个 组 分 ( 清 蛋 白 及 α β γ 球 蛋 白 ), 并 因 此 而 于 1948 年 获 得 诺 贝 尔 奖 如 今 各 种 类 型 的 电 泳 技 术, 发 展 十 分 迅 速, 已 广 泛 用 于 生 物 化 学 分 子 生 物 学 医 学 药 学 食 品 农 业 卫 生 及 环 保 等 学 科 中, 成 为 物 质 研 究 种 类 鉴 定 分 离 纯 化 及 纯 度 分 析 等 方 面 极 其 有 效 的 研 究 方 法 电 泳 方 法 很 多, 按 电 泳 的 各 种 原 理 和 性 质 可 将 电 泳 分 为 如 下 三 大 类 : 1. 自 由 电 泳 (free electrophoresis moving boundary electrophoresis) 指 以 溶 液 为 介 质 进 行 的 没 有 固 体 支 持 介 质 的 电 泳, 也 称 移 动 界 面 电 泳 (moving boundary electrophoresis) 2. 区 带 电 泳 (zone electrophoresis) 是 指 有 固 体 支 持 介 质 的 电 泳, 即 在 电 场 作 用 下, 在 某 一 固 体 支 持 介 质 上, 将 一 种 混 合 物 分 离 成 若 干 条 区 带 的 电 泳 过 程 按 支 持 介 质 的 不 同 或 形 状 电 压 及 用 途 的 不 同 还 可 再 被 分 为 五 类 ( 表 2) 区 带 电 泳 由 于 设 备 简 单 样 品 用 量 少 和 耗 时 少 等 优 点 而 成 为 用 途 最 广 泛 的 蛋 白 质 电 泳 分 离 方 法 3. 稳 态 电 泳 (steady state electrophoresis) 也 称 置 换 ( 排 代 ) 电 泳 (displacement electrophoresis), 该 电 泳 特 点 是, 分 子 颗 粒 的 迁 移 在 一 定 的 时 间 内 即 可 达 到 稳 态, 达 到 稳 态 后, 带 的 宽 度 不 随 时 间 而 改 变, 优 点 是 分 辨 率 高, 包 括 等 电 聚 焦 和 等 电 泳 速 电 泳 ( 一 ) 基 本 原 理 在 两 个 平 行 电 极 上 加 一 定 的 电 压 (V), 就 会 在 两 电 极 中 间 产 生 电 场 强 度 (E),L 是 电 极 间 距 离 E=V/L 1 在 溶 液 中, 电 场 对 带 电 分 子 的 作 用 力 (F), 等 于 所 带 净 电 荷 与 电 场 强 度 的 乘 积 : F=QE 2 表 2 区 带 电 泳 的 种 类 分 类 依 据 类 型 支 持 介 质 纸 电 泳 (paper electrophoresis, PE)

19 醋 酸 纤 维 素 电 泳 (cellulose acetate electrophoresis, CAE) 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 (agar gel electrophoresis, AGE) 淀 粉 凝 胶 电 泳 ( starch gel electrophoresis, SGE) 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 (polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) 薄 层 电 泳 (thin layer electrophoresis,tle) 支 持 介 质 形 状 平 板 电 泳 ( block electrophoresis, BE) 柱 电 泳 (column electrophoresis, CE) 电 压 分 离 区 带 形 状 低 压 电 泳 ( low voltage electrophoresis, LVE) 高 压 电 泳 ( high voltage electrophoresis, HVE) 盘 状 电 泳 ( disk electrophoresis, DE) 火 箭 电 泳 (rocket electrophoresis, RE) 分 析 电 泳 (analytical electrophoresis, AE) 用 途 制 备 电 泳 (preparative electrophoresis, PE) 定 量 免 疫 电 泳 (quantitative immunoelectrophoresis, QIE) 上 式 中 Q 是 带 电 分 子 的 净 电 荷,E 是 电 场 强 度 这 个 作 用 力 使 得 带 电 分 子 向 其 电 荷 相 反 的 电 极 方 向 移 动 如 果 是 在 真 空 里, 带 电 质 点 的 移 动 会 很 快, 最 后 撞 到 电 极 上 但 是 在 溶 液 中 的 移 动, 分 子 会 受 到 介 质 粘 滞 力 的 阻 碍 粘 滞 力 (F ) 的 大 小 与 分 子 大 小 形 状 电 泳 介 质 孔 径 大 小 以 及 缓 冲 液 粘 度 等 有 关, 并 与 带 电 分 子 的 移 动 速 度 成 正 比, 对 于 球 状 分 子,F 的 大 小 服 从 Stokes 定 律, 即 : F =6πrηv 3 式 中 F 是 对 球 形 分 子 的 阻 力,r 是 球 形 分 子 的 半 径,η 是 溶 液 粘 度,υ 是 电 泳 速 度 当 带 电 分 子 匀 速 移 动 时 :F=F, QE=6πrηv 4 因 此 电 泳 速 度 v=eq/6πrη 5 电 泳 迁 移 率 M(mobility) 是 指 在 单 位 电 场 强 度 时 带 电 分 子 的 迁 移 速 度 : M=v/E=Q/6πrη 6 这 就 是 迁 移 率 公 式, 由 上 式 可 以 看 出, 迁 移 率 与 带 电 分 子 所 带 净 电 荷 成 正 比, 与 分 子 的 大 小 和 缓 冲 液 的 粘 度 成 反 比 为 便 于 对 各 种 分 子 进 行 比 较, 带 电 质 点 在 电 场 中 的 移 动 速 度 常 用 迁 移 率 M 来 表 示, 在 一 定 的 条 件 下, 对 于 一 定 的 分 子,M 是 一 定 的 因 此 它 是 描 述 物 质 在 电 泳 中 行 为 的 特

20 征 参 数 两 种 类 似 的 物 质 在 具 体 电 泳 时 能 否 分 开, 视 二 者 迁 移 率 的 差 别 迁 移 率 相 近 则 不 易 分 开 ; 迁 移 率 差 别 大, 则 单 位 时 间 内 的 分 离 距 离 也 大 在 电 泳 过 程 中, 带 电 质 点 的 移 动 速 度 v 为 单 位 时 间 t( 通 常 以 秒 计 ) 内 移 动 的 距 离 d ( 以 厘 米 计 ), 即 v=d/t; 同 时, 电 场 强 度 E 为 单 位 距 离 l( 以 厘 米 计 ) 内 的 电 位 差 v( 以 伏 特 计 ), 即 E=v/l, 以 此 代 入 迁 移 率 公 式 6, 则 : M=v/E=dl/vt 可 见, 带 电 质 点 在 电 泳 时 的 移 动 距 离 不 仅 与 该 物 质 迁 移 率 有 关, 还 与 实 验 时 的 条 件 如 电 压 电 泳 时 间 及 电 场 距 离 密 切 相 关, 因 此, 除 了 带 电 质 点 本 身 的 结 构 性 质, 即 质 点 所 带 净 电 荷 的 量 质 点 的 大 小 和 质 点 的 形 状 外, 还 有 许 多 外 界 因 素 可 以 影 响 物 质 电 泳 的 移 动 速 度 与 移 动 距 离 主 要 影 响 因 素 有 以 下 几 方 面 : 1. 电 场 强 度 (electric field intensity) 电 场 强 度 (v/l) 是 每 厘 米 的 电 位 降, 也 称 电 位 梯 度 电 场 强 度 对 泳 动 速 度 起 着 决 定 性 的 作 用, 这 是 因 为 推 动 带 电 质 点 运 动 的 电 场 力 取 决 于 电 场 强 度 电 场 强 度 越 大, 电 泳 速 度 越 快 但 增 大 电 场 强 度 会 引 起 通 过 介 质 的 电 流 强 度 增 大, 而 造 成 电 泳 过 程 产 生 的 热 量 增 大 电 流 在 介 质 中 所 做 的 功 (W) 为 : W=I 2 Rt 上 式 中 :I 为 电 流 强 度,R 为 电 阻,t 为 电 泳 时 间 电 流 所 作 的 功 绝 大 部 分 都 转 换 为 热, 因 而 引 起 介 质 温 度 升 高, 这 会 造 成 很 多 影 响 : 1 样 品 和 缓 冲 离 子 扩 散 速 度 增 加, 引 起 样 品 分 离 带 的 加 宽 ;2 产 生 对 流, 引 起 待 分 离 物 的 混 合 ;3 如 果 样 品 对 热 敏 感, 会 引 起 蛋 白 变 性 ;4 引 起 介 质 粘 度 降 低 电 阻 下 降 等 等 电 泳 中 产 生 的 热 通 常 是 由 中 心 向 外 周 散 发 的, 所 以 介 质 中 心 温 度 一 般 要 高 于 外 周, 尤 其 是 管 状 电 泳, 由 此 引 起 中 央 部 分 介 质 相 对 于 外 周 部 分 粘 度 下 降, 摩 擦 系 数 减 小, 电 泳 迁 移 速 度 增 大, 由 于 中 央 部 分 的 电 泳 速 度 比 边 缘 快, 所 以 电 泳 分 离 带 通 常 呈 弓 型 降 低 电 流 强 度, 可 以 减 小 生 热, 但 会 延 长 电 泳 时 间, 引 起 待 分 离 生 物 大 分 子 扩 散 的 增 加 而 影 响 分 离 效 果 所 以 电 泳 实 验 中 要 选 择 适 当 的 电 场 强 度, 同 时 可 以 适 当 冷 却 降 低 温 度 以 获 得 较 好 的 分 离 效 果 2. 影 响 带 电 质 点 电 荷 量 的 外 界 因 素 带 电 质 点 所 带 净 电 荷 的 量 是 决 定 其 电 泳 速 度 的 另 一 因 素, 它 除 和 质 点 本 身 的 结 构 性 质 有 关 外, 还 受 质 点 周 围 介 质 的 影 响, 其 中 最 重 要 的 是 介 质 的 ph 和 离 子 强 度 : (1) 介 质 的 ph 值 缓 冲 液 的 ph 值 会 影 响 待 分 离 生 物 大 分 子 的 解 离 程 度, 从 而 对 其 带 电 性 质 产 生 影 响, 溶 液 ph 值 距 离 其 等 电 点 愈 远, 其 所 带 净 电 荷 量 就 越 大, 电 泳 的 速 度 也 就 越 大, 尤 其 对 于 蛋 白 质 等 两 性 分 子, 缓 冲 液 ph 还 会 影 响 到 其 电 泳 方 向, 当 缓 冲 液 ph 大 于 蛋 白 质 分 子 的 等 电 点, 蛋 白 质 分 子 带 负 电 荷, 其 电 泳 的 方 向 是 指 向 正 极 因 此, 当 分 离 某 一 为 了 蛋 白 质 混 合 物 时, 应 选 择 一 个 合 适 的 ph, 使 各 种 蛋 白 质 所 带 电 荷 差 异 较 大, 以 利 于 分 离 为 保 持 电 泳 过 程 中 待 分 离 生 物 大 分 子 的 电 荷 以 及 缓 冲 液 ph 值 的 稳 定 性, 必 须 采 用 缓 冲 液 (2) 缓 冲 液 的 离 子 强 度 带 电 质 点 的 电 荷 量 不 仅 受 溶 液 ph 的 影 响, 也 受 到 溶 液 中 各 种 离 子 的 浓 度 和 电 荷 数 ( 即 离 子 的 价 数 ) 的 影 响, 这 种 影 响 通 常 用 离 子 强 度 表 示 离 子 强 度 代 表 所 有 类 型 的 7

21 离 子 所 产 生 的 静 电 力, 也 就 是 全 部 的 离 子 效 应, 它 取 决 于 离 子 电 荷 的 总 数, 而 与 溶 液 中 盐 类 的 性 质 无 关 为 保 持 电 泳 过 程 中 缓 冲 液 ph 值 的 稳 定 性, 通 常 要 保 持 一 定 的 离 子 强 度, 一 般 在 , 离 子 强 度 过 低, 则 缓 冲 能 力 差, 但 如 果 离 子 强 度 过 高, 会 在 待 分 离 分 子 周 围 形 成 较 强 的 带 相 反 电 荷 的 离 子 扩 散 层, 由 于 离 子 扩 散 层 与 待 分 离 分 子 的 移 动 方 向 相 反, 它 们 之 间 产 生 了 静 电 引 力, 因 而 引 起 电 泳 速 度 降 低 另 外 缓 冲 液 的 粘 度 也 会 对 电 泳 速 度 产 生 影 响 溶 液 的 离 子 强 度 可 按 下 式 计 算 : 设 溶 液 中 各 种 离 子 的 浓 度 为 C 1 C 2, 离 子 的 价 数 的 Z 1 Z 2, 则 : 离 子 强 度 I=1/2(C 1 Z 12 +C 2 Z C n Z n2 ) 或 I=1/2 C i Z i 2 3. 电 泳 支 持 物 对 迁 移 率 的 影 响 区 带 电 泳 虽 然 使 用 了 比 较 惰 性 的 材 料 作 为 支 持 物, 但 它 的 结 构 性 质 仍 对 迁 移 率 有 很 大 影 响, 主 要 表 现 在 下 列 三 个 方 面 : (1) 吸 附 作 用 (adsorption): 象 吸 附 层 析 一 样, 有 的 支 持 物 对 样 品 有 滞 留 作 用, 因 而 造 成 脱 尾 现 象, 不 能 形 成 一 条 很 清 晰 的 带, 因 而 降 低 分 辨 力 吸 附 作 用 还 能 降 低 总 的 迁 移 率 纸 的 吸 附 作 用 最 大, 但 是 如 果 使 用 醋 酸 纤 维 膜, 则 可 消 除 这 种 现 象 (2) 电 渗 作 用 (electroendosmosis): 在 电 场 中, 液 体 对 于 固 体 支 持 介 质 的 相 对 移 动, 称 为 电 渗 现 象 由 于 支 持 介 质 表 面 可 能 会 存 在 一 些 带 电 基 团, 如 滤 纸 表 面 通 常 有 一 些 羧 基, 琼 脂 可 能 会 含 有 一 些 硫 酸 基, 而 玻 璃 表 面 通 常 有 Si-OH 基 团 等 等 这 些 基 团 电 离 后 会 使 支 持 介 质 表 面 带 电, 吸 附 一 些 带 相 反 电 荷 的 离 子, 在 电 场 的 作 用 下 向 电 极 方 向 移 动, 形 成 介 质 表 面 溶 液 的 流 动, 这 种 现 象 就 是 电 渗 在 ph 值 高 于 3 时, 玻 璃 表 面 带 负 电, 吸 附 溶 液 中 的 正 电 离 子, 引 起 玻 璃 表 面 附 近 溶 液 层 带 正 电, 在 电 场 的 作 用 下, 向 负 极 迁 移, 带 动 电 极 液 产 生 向 负 极 的 电 渗 流 如 果 电 渗 方 向 与 待 分 离 分 子 电 泳 方 向 相 同, 则 加 快 电 泳 速 度 ; 如 果 相 反, 则 降 低 电 泳 速 度 (3) 分 子 筛 作 用 (molecular sieve effect): 这 是 凝 胶 电 泳 的 一 个 特 性 凝 胶 的 分 子 筛 性 质 有 助 于 大 小 上 有 所 不 同 的 大 的 离 子 化 合 物 的 分 离 琼 脂 淀 粉 和 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 的 分 子 筛 原 理 是, 随 着 凝 胶 中 交 联 度 的 增 加, 孔 径 减 少, 大 分 子 移 动 的 阻 力 逐 渐 增 加 若 使 用 Sephadex 型 的 凝 胶, 情 况 则 正 好 相 反, 它 的 特 性 是 对 小 分 子 迁 移 的 阻 碍 作 用 要 比 大 分 子 来 得 大 ( 二 ) 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 (polyacrylamide gel) 是 一 种 人 工 合 成 的 凝 胶 自 1959 年 年 间, 人 们 利 用 这 种 凝 胶 作 电 泳 支 持 物 分 离 人 血 清 蛋 白 成 功 后, 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 法 (polyacrylamide gel electrophoresis) 为 分 离 蛋 白 质 核 酸 这 些 生 物 大 分 子 化 合 物 提 供 了 极 为 有 力 的 手 段 以 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 为 支 持 物 的 电 泳 具 有 如 下 优 点 : (1) 在 一 定 浓 度 时, 凝 胶 透 明, 有 弹 性, 机 械 性 能 好 (2) 化 学 性 能 稳 定, 与 被 分 离 物 不 起 化 学 反 应, 在 很 多 溶 剂 中 不 溶 (3) 对 ph 和 温 度 变 化 较 稳 定

22 (4) 几 乎 无 吸 附 和 电 渗 作 用, 只 要 Acr 纯 度 高, 操 作 条 件 一 致, 则 样 品 分 离 重 复 性 好 (5) 样 品 不 易 扩 散, 且 用 量 少 (6) 凝 胶 孔 径 可 调 节, 根 据 被 分 离 物 的 分 子 量 选 择 合 适 的 浓 度, 通 过 改 变 单 体 及 交 联 剂 的 浓 度 调 节 凝 胶 的 孔 径 (7) 分 辨 率 高, 尤 其 在 不 连 续 凝 胶 电 泳 中, 集 浓 缩 分 子 筛 和 电 荷 效 应 为 一 体 因 而 较 醋 酸 纤 维 薄 膜 电 泳 琼 脂 糖 电 泳 等 有 更 高 的 分 辨 率 由 于 具 有 这 些 优 点, 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 目 前 已 广 泛 应 用 于 医 学 和 生 物 学 等 各 学 科 领 域 根 据 凝 胶 装 置 形 式, 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 可 分 为 圆 盘 凝 胶 电 泳 和 平 板 电 泳 两 种 圆 盘 电 泳 是 在 直 立 的 玻 璃 管 内 进 行 ; 平 板 电 泳 是 在 两 块 玻 璃 板 间, 将 丙 烯 酰 胺 聚 合 成 方 形 的 薄 板 1. 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 的 制 备 原 理 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 由 单 体 丙 烯 酰 胺 ( 简 称 Acr) 和 甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 ( 简 称 Bis) 通 过 化 学 或 光 催 化 聚 合 而 成, 形 成 三 维 网 状 高 聚 物 单 体 及 聚 合 物 的 化 学 结 构 式 见 图 8 聚 合 过 程 由 自 由 基 催 化 完 成 催 化 聚 合 的 常 用 方 法 有 两 种 : 化 学 聚 合 法 和 光 聚 合 法 化 学 聚 合 以 过 硫 酸 铵 ((NH 4 ) 2 S 2 O 8 ) 为 催 化 剂 在 水 溶 液 中, 过 硫 酸 铵 可 形 成 自 由 基 SO 4-, 后 者 与 丙 烯 酰 胺 单 体 接 触, 将 其 双 键 打 开, 活 化 形 成 自 由 基 丙 烯 酰 胺 这 个 活 化 了 的 自 由 基 丙 烯 酰 胺 再 以 同 样 的 方 式 连 续 与 其 他 丙 烯 酰 胺 分 子 和 甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 分 子 反 应 就 能 聚 合 并 形 成 凝 胶 丙 烯 酰 胺 还 可 用 核 黄 素 催 化 聚 合, 这 是 个 光 激 发 的 催 化 反 应 核 黄 素 在 光 照 下 分 解, 其 黄 素 部 分 被 还 原 成 无 色 型 ; 但 在 有 痕 量 氧 存 在 的 条 件 下, 无 色 型 又 被 氧 化 成 具 有 自 由 基 的 黄 素 这 些 自 由 基 黄 素 与 过 硫 酸 铵 产 生 的 自 由 基 起 同 样 的 作 用, 也 能 使 丙 烯 酰 胺 和 甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 聚 合 形 成 凝 胶 为 加 速 聚 合, 在 制 备 凝 胶 时 还 需 加 用 一 种 脂 肪 族 叔 胺,N,N,N,N - 四 甲 基 乙 二 胺 ( 简 称 TEMED) 作 为 加 速 剂, 其 作 用 原 理 是 因 为 它 在 溶 液 中 也 能 以 自 由 基 形 式 存 在, 可 加 快 过 硫 酸 铵 产 生 自 由 基 结 构 式 为 : H 3 C H 3 C N CH 2 CH 2 N CH 3 CH 3

23 O H 2 C CH C, Acr O O HC NH 2 + H 2 C CH C NH CH 2 NH C CH2 N,N'-, Bis H 2 C CH 2 NH C O CH [CH 2 CH] CH 2 CH [CH 2 CH] CH 2 x C O C O C O NH 2 CH CH 2 NH 2 x C O H 2 C CH [CH 2 CH] CH 2 CH [CH 2 CH] CH 2 x C O C O C O NH CH 2 NH 2 NH 2, PAG x S 2 O 8 2-2SO 4 - SO H 2 C CH H2C CH CONH 2 CONH 2 n CONH 2 CONH 2 CONH 2 H 2 C CH H 2 C CH H 2 C CH 图 8 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 单 体 及 聚 合 物 的 化 学 结 构 式 在 制 备 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 时 应 注 意 : (1)Acr 和 Bis 都 是 神 经 毒 化 合 物, 操 作 时 要 特 别 当 心 (2)TEMED 只 有 当 它 处 于 自 由 碱 基 状 态 下 才 能 发 挥 其 加 速 剂 的 效 能, 所 以 催 化 系 统 需 要 在 碱 性 条 件 下 进 行, 低 ph 时, 常 会 延 迟 聚 合 作 用 (3) 分 子 氧 能 阻 止 链 的 延 长, 妨 碍 聚 合 作 用, 操 作 时 应 尽 量 避 免 溶 液 中 过 量 氧 的 存

24 在 通 常 采 用 的 办 法 是 1 聚 合 前 将 溶 液 抽 气 ;2 聚 合 时, 将 胶 面 封 以 水 层 以 避 免 直 接 与 空 气 接 触 2. 凝 胶 孔 径 的 选 择 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 具 有 三 维 网 状 结 构, 网 状 的 孔 径 主 要 由 两 个 因 素 决 定 : (1) 凝 胶 总 浓 度, 通 常 用 T% 表 示, 即 100 毫 升 凝 胶 溶 液 中 所 含 Acr 和 Bis 的 总 克 数 (2) 交 联 度, 通 常 用 C% 表 示, 即 交 联 剂 Bis 占 单 体 与 交 联 剂 总 量 的 百 分 数 T=a+b/m 100% C=b/(a+b) 100% 式 中 :a= 凝 胶 溶 液 中 所 含 Acr 克 数 b= 凝 胶 溶 液 中 所 含 Bis 克 数 m= 凝 胶 溶 液 中 缓 冲 液 体 积 的 毫 升 数 J.C.Fawcett 等 人 曾 测 定 了 总 浓 度 为 % 的 丙 烯 酰 胺 凝 胶 液 在 六 种 不 同 比 例 的 双 丙 烯 酰 胺 (Bis) 存 在 时 聚 合 后 的 孔 径 大 小, 其 结 果 整 理 如 下 表 : 表 3 双 丙 烯 酰 胺 浓 度 对 平 均 孔 径 的 影 响 丙 烯 酰 胺 总 浓 度 R0.5(Å)( 半 径 ) (%) 1% 5% 15% 25% (Acr+Bis) (Bis 的 浓 度 ) 从 表 中 可 以 看 出 : 1 凝 胶 孔 径 大 小 在 很 大 程 度 上 取 决 于 丙 烯 酰 胺 (Acr) 和 双 丙 烯 酰 胺 (Bis) 二 者 的 总 浓 度 T T 值 越 大, 孔 径 相 应 变 小 2 值 得 注 意 的 是, 当 T 值 不 变 时 Bis 浓 度 在 5% 时 孔 径 最 小, 高 于 或 低 于 5% 时 孔 径 却 相 应 变 大 这 就 可 能 有 这 样 的 现 象 出 现 : 当 Bis 浓 度 在 5% 以 上 或 以 下 时, 尽 管 T 值 大, 但 却 比 T 值 小 而 Bis 浓 度 为 5% 时 的 孔 径 要 大 因 此, 一 般 不 用 改 变 Bis 浓 度 的 办 法 来 控 制 凝 胶 孔 度 ( 通 常 将 它 固 定 在 丙 烯 酰 胺 总 浓 度 T 的 5%), 而 是 通 过 改 变 T 值 来 控 制 孔 径 大 小 凝 胶 孔 径 在 凝 胶 电 泳 中 是 一 个 重 要 的 参 数 要 想 得 到 好 的 分 离 结 果, 选 择 一 定 孔 径 的 凝 胶 是 很 关 键 的 但 遗 憾 的 是 至 今 还 没 有 一 个 普 遍 的 规 律 可 循 分 离 蛋 白 质 的 实 践 证 明, 胶 的 孔 径 大 约 是 蛋 白 质 分 子 平 均 大 小 的 一 半 时 分 析 结 果 较 好 这 是 因 为 在 电 泳 时 凝 胶 孔 扩 大 了, 足 以 使 比 孔 径 大 的 蛋 白 质 通 过 实 用 中 常 按 样 品 的 分 子 量 大 小 来 选 择 适 宜 的 凝 胶 浓 度 如 下 表 : 表 4 不 同 分 子 量 范 围 所 选 用 的 凝 胶 浓 度

25 物 质 分 子 量 范 围 适 用 的 凝 胶 浓 度 (%) < 蛋 白 质 > 核 < 酸 (RNA) 常 用 的 所 谓 标 准 胶 是 指 浓 度 为 7.5% 的 凝 胶, 大 多 数 生 物 体 内 的 蛋 白 质 在 此 胶 中 电 泳 都 能 得 到 满 意 的 结 果 当 分 析 一 个 未 知 样 品 时, 常 常 先 用 7.5% 的 标 准 凝 胶 或 用 4~10% 的 梯 度 凝 胶 来 测 试, 选 出 适 宜 的 凝 胶 浓 度 3. 凝 胶 的 机 械 性 能 凝 胶 的 机 械 强 度 和 弹 性 是 很 重 要 的 凝 胶 太 软 不 易 操 作, 凝 胶 太 硬 则 脆 易 折 断 凝 胶 的 机 械 性 能 弹 性 透 明 度 和 粘 着 度 都 取 决 于 凝 胶 总 浓 度 T% 和 Acr 与 Bis 两 者 之 比 ( 即 a :b) 其 中 a :b(w/w) 是 很 关 键 的 当 a :b<10 时, 凝 胶 变 脆, 呈 现 乳 白 色 ;a :b >100 时,5% 凝 胶 呈 现 糊 状, 易 于 断 裂 通 常 要 求 : T 为 2-5% 时 应 使 Acr/Bis=20; T 为 5-10% 时 应 使 Acr/Bis=40; T 为 15-20% 时 应 使 Acr/Bis= ; 即 当 Acr 的 浓 度 增 加 时,Bis 的 浓 度 要 作 适 当 的 降 低 下 面 经 验 公 式 供 参 考 (100ml 溶 液 量 ): 丙 烯 酰 胺 量 ( 克 ) 甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 量 ( 克 )= 常 数 ( 约 1.3) 4.SDS SDS- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 SDS- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 是 最 常 用 的 定 性 分 析 蛋 白 质 的 电 泳 方 法, 特 别 是 用 于 蛋 白 质 纯 度 检 测 和 分 子 量 测 定 如 上 所 述, 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 之 所 以 能 将 不 同 的 大 分 子 化 合 物 分 开, 是 由 于 这 些 分 子 所 带 净 电 荷 的 差 异 和 分 子 大 小 不 同 的 缘 故 但 可 能 有 这 样 的 情 况 : 两 个 分 子 量 不 同 的 蛋 白 质 以 相 同 的 速 度 向 阳 极 移 动 这 可 能 是 由 于 蛋 白 质 分 子 大 小 的 差 别 被 它 们 所 带 净 电 荷 的 差 别 所 补 偿 如 果 能 设 法 将 电 荷 差 异 这 一 因 素 除 去 或 减 小 到 可 以 忽 略 不 计 的 程 度, 那 么 分 子 在 凝 胶 上 迁 移 率 的 大 小 则 完 全 取 决 于 它 的 分 子 量 1967 年 Shapiro 等 人 首 先 试 图 在 十 二 烷 基 硫 酸 钠 存 在 下 分 离 蛋 白 与 质 混 合 物, 结 果 发 现, 当 在 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 系 统 中 加 入 SDS 后, 蛋 白 质 分 子 的 迁 移 率 主 要 取 决 于 它 的 分 子 量, 而 与 所 带 净 电 荷 和 形 状 无 关 并 进 一 步 有 实 验 证 明, 在 一 定 条 件 下, 蛋 白 质 的 迁 移 ; 率 与 蛋 白 质 的 分 子 量 的 对 数 成 比 例, 即 : MW=K(10-bm) lgmw=lgk-bm=k 1 -bm

26 式 中 :MW 为 蛋 白 质 的 分 子 量,K,K 1 为 常 数 ;b 为 斜 率 ;m 为 迁 移 率 据 此,SDS- 凝 胶 电 泳 可 用 来 测 定 蛋 白 质 的 分 子 量 具 体 做 法 是, 先 作 一 个 已 知 蛋 白 质 分 子 量 迁 移 率 与 分 子 量 的 对 数 标 准 曲 线 ( 图 9), 未 知 分 子 量 蛋 白 质 样 品 在 同 样 条 件 下 电 泳, 测 出 其 迁 移 率, 再 从 图 中 求 出 未 知 蛋 白 质 样 品 的 分 子 量 现 在, 经 SDS- 凝 胶 电 泳 研 究 过 的 蛋 白 质 已 有 100 多 种 用 这 种 方 法 测 定 蛋 白 质 的 分 子 量, 简 便 快 速, 只 需 要 简 单 的 设 备 和 微 克 量 的 蛋 白 质 样 品, 测 定 精 确 度 也 较 高 ( 误 差 一 般 在 ±10% 以 内 ) 因 此, 近 几 年 来,SDS- 凝 胶 电 泳 测 定 分 子 量 的 方 法, 已 得 到 非 常 广 泛 的 应 用 和 迅 速 的 发 展 对 数 分 子 量 浓 度 增 加 凝 胶 SDS 作 用 原 理 如 下 : 图 9 SDS 凝 胶 电 泳 的 标 准 曲 线 Rm 表 示 相 对 迁 移 率 SDS 是 十 二 烷 基 硫 酸 钠 (sodium dodecyl sulfate,sds) 的 简 称, 它 是 一 种 阴 离 子 表 面 活 性 剂, 加 入 到 电 泳 系 统 中 能 使 蛋 白 质 的 氢 键 和 疏 水 键 打 开, 并 结 合 到 蛋 白 质 分 子 上 ( 在 一 定 条 件 下, 大 多 数 蛋 白 质 与 SDS 的 结 合 比 为 1.4g SDS/1g 蛋 白 质 ) 由 于 十 二 烷 基 硫 酸 根 CH 3 (CH 2 ) 10 CH 2 -OSO 3 - 带 负 电, 使 各 种 蛋 白 质 -SDS 复 合 物 都 带 上 相 同 密 度 的 负 电 荷, 其 数 量 远 远 超 过 了 蛋 白 质 分 子 原 有 的 电 荷 量, 从 而 掩 盖 了 不 同 种 类 蛋 白 质 间 原 有 的 电 荷 差 别 ( 图 10) 这 样 就 使 电 泳 迁 移 率 只 取 决 于 分 子 大 小 这 一 因 素, 于 是 根 据 标 准 蛋 白 质 分 子 量 的 对 数 和 迁 移 率 所 作 的 标 准 曲 线, 可 求 得 未 知 物 的 分 子 量 SDS 与 蛋 白 质 结 合 后, 还 引 起 了 蛋 白 质 构 象 的 一 系 列 改 变, 其 主 要 表 现 是 :1 各 种 SDS- 蛋 白 质 复 合 物 的 构 象 趋 于 一 致 ;2 使 具 有 四 级 结 构 的 蛋 白 质 拆 成 组 成 它 们 的 亚 单 位 形 式 实 验 证 明, 蛋 白 质 的 SDS 复 合 物 在 水 溶 液 中 均 呈 长 椭 圆 棒 形, 不 同 蛋 白 质 的 SDS 复 合 物 的 短 轴 长 度 都 一 样, 约 为 18Å, 而 长 轴 则 随 蛋 白 质 的 分 子 量 成 正 比 的 变 化 ( 图 10) 这 样 的 蛋 白 质 -SDS 复 合 物, 在 凝 胶 电 泳 中 的 迁 移 率, 不 再 受 蛋 白 质 原 有 电 荷 和 形 状 的 影 响, 而 只 是 椭 圆 棒 长 度, 也 就 是 蛋 白 质 分 子 量 的 函 数 此 外, 由 于 SDS 是 一 种 良 好 的 解 离 剂, 可 促 进 蛋 白 质 溶 解, 因 而 也 适 宜 于 那 些 成 分 复 杂, 溶 解 度 差 的 蛋 白 质 的 分 析 实 践 还 证 明,SDS- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 对 样 品 的 分 辨 力 要 高 得 多 R m

27 作 SDS 凝 胶 电 泳 前, 蛋 白 质 要 作 预 处 理, 使 它 充 分 地 变 性 并 还 原 成 单 一 地 亚 基 结 构 一 般 是 在 1%SDS,5% 巯 基 乙 醇 地 0.01M Tris-HCl 缓 冲 液 中,100 保 温 5 分 钟 巯 基 乙 醇 的 作 用 是 使 蛋 白 质 分 子 中 的 二 硫 键 还 原 图 10 蛋 白 质 的 SDS 复 合 物 SDS 遮 蔽 了 蛋 白 质 分 子 的 原 有 电 荷 近 来 实 验 表 明,SDS- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 在 梯 度 中 比 在 均 匀 凝 胶 中 有 更 好 的 分 辨 力, 可 获 得 更 狭 小 的 分 辨 带 SDS- 凝 胶 电 泳 的 不 足 之 处 是, 样 品 经 SDS 处 理 后, 其 生 物 活 性 完 全 丧 失 该 电 泳 是 在 一 个 不 连 续 的 (discontinuous) 电 泳 系 统 里, 在 直 立 双 玻 璃 板 之 间 进 行, 电 泳 装 置 如 图 11 图 11 SDS- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 装 置 示 意 图 (1) 电 泳 系 统 的 不 连 续 性 : 不 连 续 体 系 由 电 极 缓 冲 液 浓 缩 胶 及 分 离 胶 所 组 成 浓 缩 胶 是 由 过 硫 酸 铵 催 化 聚 合 而 成 的 大 孔 胶, 凝 胶 缓 冲 液 为 ph6.8 的 Tris-HC1 分 离 胶 是 由 过 硫 酸 铵 催 化 聚 合 而 成 的 小 孔 胶, 凝 胶 缓 冲 液 为 ph8.8 Tris-HC1 电 极 缓 冲 液 是 ph8.3 Tris- 甘 氨 酸 缓 冲 液 2 种 孔 径 的 凝 胶 2 种 缓 冲 体 系 3 种 ph 值 使 不 连 续 体 系 形 成 了 凝 胶 孔 径 ph 值 缓 冲 液 离 子 成 分 的 不 连 续 性 (2)SDS- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 过 程 中 的 三 种 效 应 SDS- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 的 分 离 效 果 好, 具 有 很 高 的 分 辨 力, 这 是 因 为 在 SDS- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 过 程 中 的 下 列 三 种 效 应 在 起 作 用 1 样 品 的 浓 缩 效 应 :

28 样 品 在 电 泳 过 程 中 首 先 通 过 浓 缩 胶 而 被 浓 缩 这 是 由 于 在 电 泳 缓 冲 液 中 主 要 存 在 三 种 阴 离 子,Cl - 甘 氨 酸 阴 离 子 以 及 蛋 白 质 -SDS 复 合 物, 在 浓 缩 胶 的 ph 值 下, 甘 氨 酸 只 有 少 量 的 电 离, 所 以 其 电 泳 迁 移 率 最 小, 而 Cl - 的 电 泳 迁 移 率 最 大 在 电 场 的 作 用 下, Cl - 最 初 的 迁 移 速 度 最 快, 这 样 在 Cl - 后 面 形 成 低 离 子 浓 度 区 域, 即 低 电 导 区, 而 低 电 导 区 会 产 生 较 高 的 电 场 强 度, 因 此 Cl - 后 面 的 离 子 在 较 高 的 电 场 强 度 作 用 下 会 加 速 移 动 达 到 稳 定 状 态 后,Cl - 和 甘 氨 酸 之 间 形 成 稳 定 移 动 的 界 面 而 蛋 白 质 -SDS 复 合 物 由 于 相 对 量 较 少, 聚 集 在 甘 氨 酸 和 Cl - 的 界 面 附 近 而 被 浓 缩 成 很 窄 的 区 带 ( 可 以 被 浓 缩 300 倍 ), 所 以 在 浓 缩 胶 中 Cl - 是 快 离 子 ( 前 导 离 子 ), 甘 氨 酸 是 慢 离 子 ( 尾 随 离 子 ) 当 甘 氨 酸 到 达 分 离 胶 后, 由 于 分 离 胶 的 ph 值 ( 通 常 ph=8.8) 较 大, 甘 氨 酸 离 解 度 加 大, 电 泳 迁 移 速 度 变 大 超 过 蛋 白 质 -SDS 复 合 物, 甘 氨 酸 和 Cl - 的 界 面 很 快 超 过 蛋 白 质 -SDS 复 合 物 这 时 蛋 白 质 -SDS 复 合 物 在 分 离 胶 中 以 本 身 的 电 泳 迁 移 速 度 进 行 电 泳, 向 正 极 移 动 2 电 荷 效 应 : 蛋 白 质 混 合 物 在 凝 胶 界 面 被 高 度 浓 缩, 堆 积 成 层, 形 成 一 狭 小 的 高 浓 度 的 蛋 白 区, 但 由 于 每 种 蛋 白 质 分 子 所 载 有 效 电 荷 3 凝 胶 对 分 子 的 筛 选 效 应 : 当 蛋 白 质 通 过 浓 缩 胶 进 入 分 离 胶 时, 由 于 ph 值 和 凝 胶 孔 径 突 然 改 变 ( 选 择 分 离 胶 的 ph 值 为 8.9, 电 泳 时 经 实 际 测 量 为 ph9.5), 使 甘 氨 酸 的 解 离 度 增 大, 它 的 有 效 泳 动 率 也 增 大, 此 时 甘 氨 酸 很 快 就 赶 上 了 并 超 越 了 蛋 白 质 分 子, 因 而 高 电 位 梯 度 消 失, 使 蛋 白 质 样 品 进 入 一 个 均 一 的 电 位 梯 度 和 ph 条 件 的 分 离 胶 中, 分 离 胶 的 孔 径 较 小, 分 子 量 或 构 象 不 同 的 蛋 白 质 通 过 分 离 胶, 受 阻 滞 的 程 度 不 同, 因 此 表 现 出 不 同 的 泳 动 率, 颗 粒 小 的 移 动 快, 颗 粒 大 的 移 动 慢, 此 即 凝 胶 对 分 子 的 筛 选 效 应, 即 分 子 筛 效 应, 即 使 净 电 荷 相 似, 泳 动 率 相 同 的 蛋 白 质 分 子, 也 会 由 于 这 种 筛 选 效 应 在 分 离 胶 中 被 分 开 ( 三 ) 等 电 聚 焦 电 泳 1. 等 电 聚 焦 电 泳 的 基 本 原 理 等 电 聚 焦 电 泳 (isoelectric focusing gel electrophoresis,ife) 是 根 据 蛋 白 质 分 子 的 等 电 点 进 行 分 离 的 一 种 技 术 在 等 电 聚 焦 中, 利 用 两 性 电 解 质 载 体 形 成 一 个 连 续 而 稳 定 的 线 性 ph 梯 度, 使 ph 值 从 正 极 向 负 极 逐 渐 增 加 蛋 白 质 分 子 在 偏 离 其 等 电 点 的 ph 值 位 置 带 有 电 荷, 因 此 在 电 场 中 可 以 移 动 当 蛋 白 质 移 动 到 ph 等 于 pi 区 域 时, 其 净 电 荷 等 于 零, 在 电 场 中 不 再 移 动, 据 此 可 将 不 同 等 电 点 的 蛋 白 质 分 离 ( 图 12) 20 世 纪 70 年 代,Vesterberg 合 成 了 一 些 脂 肪 族 多 氨 基 多 羧 基 酸 的 两 性 电 解 质 它 们 在 ph 3.5 到 ph 10 之 间 可 以 形 成 一 个 平 滑 的 ph 梯 度, 覆 盖 了 大 多 数 蛋 白 质 的 pi 值 后 来,Vesterberg 又 将 ph 范 围 扩 大 至 ph 2.5~11 的 范 围 这 种 两 性 电 解 质 载 体 已 由 瑞 典 LKB 公 司 商 品 化, 其 商 品 名 为 Ampholine 由 于 两 性 电 解 质 的 发 展, 使 等 电 聚 焦 成 为 一 项 广 泛 应 用 的 分 析 和 制 备 技 术 2. 等 电 聚 焦 电 泳 的 优 缺 点 及 其 主 要 用 途 等 电 聚 焦 电 泳 与 常 规 电 泳 比 较 有 很 多 优 点 :

29 (1) 样 品 加 样 位 置 和 体 积 不 受 严 格 限 制, 样 品 可 混 入 胶 中 或 放 在 胶 上 任 何 位 置 ; (2) 分 辨 率 很 高, 可 将 pi 相 差 0.01 的 蛋 白 质 组 分 分 开 ; (3)IFE 电 泳 结 束 就 可 测 定 pi; (4) 分 析 型 电 泳 一 般 可 在 两 小 时 内 完 成, 分 离 速 度 快 ; (5) 经 IFE 分 离 的 蛋 白 质 不 变 性, 可 保 持 原 有 生 物 活 性, 两 性 电 解 质 载 体 经 硫 酸 铵 沉 淀 透 析 分 子 筛 和 电 泳 等 方 法 可 与 蛋 白 质 分 开 IFE 的 缺 点 是 : (1) 许 多 蛋 白 质 在 pi 附 近 可 产 生 沉 淀, 从 而 影 响 分 离 效 果, 可 在 凝 胶 介 质 中 加 入 尿 素 或 非 离 子 去 垢 剂 加 以 解 决 ; (2) 样 品 含 盐 应 尽 量 少, 避 免 高 盐 浓 度 下 高 压 电 泳 时 产 生 大 电 流 而 发 热, 但 无 盐 时, 一 些 蛋 白 质 溶 解 度 太 低, 可 在 样 品 中 适 当 加 两 性 电 解 质 或 甘 氨 酸 来 解 决 ; (3) 两 性 电 解 质 可 与 蛋 白 质 发 生 静 电 作 用, 而 紧 密 结 合 形 成 复 合 物, 这 可 使 蛋 白 质 与 抗 体 的 反 应 性 降 低 或 酶 活 性 降 低, 可 用 高 离 子 强 度 (0.1~0.5 mol/l)ph 值 为 7 的 挥 发 性 缓 冲 液 来 破 坏 其 静 电 作 用 等 电 聚 焦 可 用 于 蛋 白 质 和 两 性 分 子 的 分 离 分 析 及 等 电 点 的 测 定, 也 可 用 于 临 床 疾 病 诊 断 及 法 医 学 鉴 定 下 : 3. 等 电 聚 焦 电 泳 中 的 几 个 基 本 问 题 (1) 两 性 电 介 质 载 体 ph p I 1 p I 2 p I 3 pi 要 求 有 稳 定 的 ph 梯 度, 常 用 载 体 是 由 多 乙 烯 多 胺 和 丙 烯 酸 加 成 反 应 而 得 反 应 式 如 0 蛋 白 质 1 0 蛋 白 质 2 0 蛋 白 质 3 负 极 ( ) 正 极 ( + ) 图 12 等 电 聚 焦 电 泳 原 理 示 意 图 p H 增 加 R 1 -N + H 2 -(CH 2 )-N + H 2 -R 2 + CH 2 =CH-COO 多 乙 烯 多 胺 丙 烯 酸 H 2 O, 70 16~ 20 R 1 -N + H 2 -CH 2 -N + H-R 2 CH 2 -CH-COO 理 想 载 体 应 具 备 以 下 条 件 : 1 足 够 的 缓 冲 容 量, 从 而 不 受 上 样 量 得 影 响 ; 2 等 点 处 足 够 的 均 匀 的 电 导, 从 而 使 各 成 分 有 效 聚 焦 ; 3 分 子 量 小, 便 于 用 透 析 或 凝 胶 过 滤 法 除 去 ; 4 化 学 组 分 与 被 检 物 不 同, 再 280nm 紫 外 吸 收 小 于 0.05, 从 而 不 影 响 分 离 后 蛋 白 的

30 紫 外 设 定 ; 5 不 与 被 分 离 物 反 应 (2)pH 梯 度 的 建 立 两 性 电 解 质 载 体 经 电 场 作 用 可 建 立 从 正 极 到 负 极 ph 值 逐 渐 增 加 的 ph 梯 度, 其 过 程 如 下 : 将 两 性 电 解 质 载 体 溶 液 引 入 电 泳 管, 并 在 电 泳 仪 的 正 极 槽 注 入 稀 酸, 负 极 槽 中 注 入 稀 碱, 电 泳 开 始 前, 电 泳 管 中 各 段 ph 相 同, 为 两 性 电 解 质 载 体 混 合 物 的 平 均 ph(pho), 而 正 极 酸 液 的 ph 很 低 (pha), 负 极 碱 液 的 ph 很 高 (phb), 如 图 13 p H p H b p H o p H p H b p I n 电 泳 前 p H a p I 3 p I 2p p I 1 p H a 电 泳 后 - 电 泳 管 + - 电 泳 管 + 图 13 ph 梯 度 建 立 过 程 示 意 图 电 泳 开 始 后,pI 最 低 的 两 性 电 解 质 载 体 带 负 电 荷, 向 正 极 移 动, 其 中 pi 最 低 者 ph1 移 到 酸 液 面 后 由 于 ph 突 然 下 降, 其 负 电 荷 被 中 和, 因 此 不 能 再 向 前 移 动 ; 类 似 的 pi 值 次 低 者 不 能 超 越 ph1 而 排 在 其 靠 负 极 的 一 侧 ; 以 此 类 推, 经 过 一 定 时 间 后, 从 正 极 到 负 极 排 成 一 个 ph 梯 度 只 要 保 持 电 场 作 用 和 抗 对 流 介 质 防 止 混 合, 那 么 将 形 成 一 个 稳 定 的 连 续 的 线 性 的 ph 梯 度 (3) 抗 对 流 介 质 为 了 保 持 ph 梯 度 和 防 止 已 分 离 样 品 再 混 合, 一 般 常 用 蔗 糖 密 度 梯 度 和 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 溶 液 中 电 泳 多 采 取 蔗 糖 密 度 梯 度 它 不 带 电 荷, 对 蛋 白 质 无 害 而 且 是 液 体 可 以 用 分 部 收 集 器 收 集 但 是 所 用 仪 器 复 杂, 适 用 于 制 备 性 分 离 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 的 电 渗 小,pH 梯 度 漂 移 低, 且 时 间 短, 操 作 简 便 一 般 选 取 5% 的 凝 胶 即 可 4. 试 剂 (1) 等 电 聚 焦 电 泳 凝 胶 制 胶 所 需 试 剂 1 凝 胶 母 液 :24.75% 丙 烯 酰 胺 /0.75% 双 丙 烯 酰 胺 溶 液, 过 滤 后 4 储 存 2 两 性 电 解 质 310% 过 硫 酸 铵 425% 甘 油 5TEMED (2) 等 电 聚 焦 电 泳 凝 胶 制 胶 混 合 液 凝 胶 母 液 2.0 ml,25% 甘 油 2.0 ml,40% 两 性 电 解 质 0.5 ml,h 2 O 5.5 ml,10% 过 硫 酸

31 铵 40 μl,temed 10 μl 5. 等 电 聚 焦 电 泳 的 基 本 操 作 聚 丙 烯 酰 胺 水 平 薄 层 等 电 聚 焦 (horizontal thin layer polyacrylamide, IFE) 是 一 种 常 见 的 分 析 用 等 电 聚 焦 方 法, 具 有 样 品 用 量 少 操 作 简 便 可 同 时 分 析 多 个 样 品 电 泳 时 间 短 及 分 辨 率 高 等 特 点 这 里 以 该 法 为 例 介 绍 Bio-Rad 公 司 的 MoiIII 系 统 ( 图 14) 的 基 本 操 作 过 程 A 图 14 等 电 聚 焦 电 泳 装 置 及 电 泳 结 果 举 例 A: Bio-Rad Model III IEF 电 泳 装 置 B: 电 泳 结 果 举 例 :1 为 等 电 点 标 准 品 ;2-5 为 系 列 稀 释 的 过 氧 化 物 酶 (1) 胶 的 制 备 取 玻 璃 ( mm 2 ) 一 片, 滴 上 双 蒸 水 1 滴, 另 取 一 塑 料 薄 膜 盖 在 玻 璃 片 上, 使 二 者 紧 密 结 合, 排 除 气 泡, 按 仪 器 说 明 将 模 具 安 装 好, 使 玻 璃 板 在 模 具 盒 内 三 面 贴 着 盒 壁, 一 面 敞 开 (2) 加 样 及 电 泳 将 制 备 好 的 凝 胶 面 朝 上, 胶 表 面 覆 盖 带 有 加 样 孔 的 塑 料 薄 膜, 使 胶 与 膜 紧 密 结 合 蛋 白 质 样 品 溶 于 50% 甘 油 中, 每 孔 上 样 量 0.5~2 μl 加 样 5~10 min 后 样 品 进 入 胶 内, 揭 去 塑 料 膜, 用 水 将 电 极 湿 润, 把 加 有 样 品 的 凝 胶 面 朝 下, 再 将 凝 胶 的 两 端 直 接 放 在 石 墨 电 极 上, 盖 好 电 泳 槽 盖, 在 稳 压 条 件 下 聚 焦 :100 V 15 min,200 V 15 min,450 V 60 min, 20 下 进 行 (3) 染 色 和 脱 色 先 将 凝 胶 在 固 定 液 (12% 三 氯 醋 酸 ) 中 浸 泡 24 h( 多 次 更 换 固 定 液, 使 两 性 电 解 质 充 分 洗 去 ), 然 后 在 0.25% 考 马 斯 亮 兰 R-250 染 色 液 中 浸 泡 3~5 h 用 脱 色 液 (27% 乙 醇 7% 醋 酸 ) 使 凝 胶 背 景 颜 色 除 去, 至 蛋 白 带 清 晰 为 止 凝 胶 表 面 用 浸 水 的 多 孔 聚 乙 烯 膜 覆 盖, 除 气 泡 并 保 持 膜 平 整, 室 温 下 干 燥 保 存 6. 等 电 聚 焦 电 泳 的 注 意 事 项 (1) 等 电 聚 焦 电 泳 的 支 持 介 质 为 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶, 用 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 只 可 分 析 分 子 量 小 于 30 万 kda 的 蛋 白 质 在 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 中 添 加 甘 油 可 以 增 加 凝 胶 的 机 械 稳 定 性 和 渗 透 能 力, 减 少 电 泳 时 凝 胶 表 面 的 渗 出 水, 并 可 以 增 加 凝 胶 与 玻 璃 的 粘 着 度 (2) 制 胶 过 程 中, 溶 液 体 积 根 据 凝 胶 的 大 小 按 比 例 增 减, 载 体 两 性 电 解 质 的 量 亦 应 按 凝 胶 的 厚 薄 适 量 增 减, 过 硫 酸 铵 和 TEMED 的 量 视 聚 合 快 慢 增 减 通 常 情 况 下, 凝 胶 B

32 聚 合 应 在 30 min 到 1 h 内 完 成, 过 快 聚 合 表 示 过 硫 酸 铵 和 / 或 TEMED 用 量 过 多, 此 时 凝 胶 太 硬 易 龟 裂, 且 在 电 泳 时 易 烧 胶 聚 合 太 慢, 甚 至 不 聚 合, 则 表 示 聚 合 的 两 种 试 剂 用 量 不 当, 或 凝 胶 系 统 中 的 试 剂 不 纯 或 已 失 效 特 别 要 注 意 过 硫 酸 铵 的 生 产 日 期 (3) 两 性 电 解 质 载 体 有 Ampholine(LKB 公 司 ) Servalyte(Serva 公 司 ) Pharmalyte (Pharmacia 公 司 ) 及 国 产 两 性 电 解 质 载 体 两 性 电 解 质 载 体 选 择 的 主 要 依 据 是 被 测 蛋 白 质 的 等 电 点 范 围 (4) 样 品 要 脱 盐, 否 则 区 带 扭 曲 ; 要 彻 底 溶 解, 未 彻 底 溶 解 的 颗 粒 易 引 起 拖 尾 ; 样 品 溶 液 中 可 加 变 性 剂, 如 尿 素 (6~8 mol/l) 和 去 污 剂 等 加 样 量 取 决 于 样 品 中 蛋 白 质 的 种 类 及 检 测 方 法 的 灵 敏 度 一 般 认 为,0.5~1 mg 蛋 白 /ml 为 宜, 最 适 加 样 体 积 约 10~30 l, 对 不 稳 定 的 样 品 可 进 行 预 电 泳 (5) 电 极 缓 冲 液 应 根 据 两 性 电 解 质 ph 范 围 加 以 选 择, 可 参 见 相 应 产 品 说 明 书 (6) 样 品 可 直 接 加 在 胶 的 顶 部, 亦 可 以 在 胶 聚 合 前 加 到 胶 的 混 合 物 内 一 起 聚 合, 这 需 视 样 品 的 浓 度 及 稳 定 性 而 定 如 果 样 品 比 较 浓, 且 易 失 活, 一 般 在 电 泳 前 加 到 胶 的 顶 部 为 了 不 使 样 品 接 触 电 极 溶 液, 在 加 样 后, 再 将 胶 管 顶 部 充 满 1% 两 性 电 解 质 样 品 也 可 以 经 预 电 泳 后 再 加 入, 这 也 要 看 蛋 白 质 样 品 对 ph 的 敏 感 程 度 四 层 析 法 色 层 分 析 法, 简 称 为 层 析 法 (Chromatography methods), 也 称 色 谱 法, 一 般 指 待 分 离 液 体 ( 流 动 相,mobile phase) 经 过 一 个 固 态 物 质 ( 固 定 相,solid phase; 基 质,matrix) 后 所 发 生 的 组 分 分 布 变 化 混 合 物 中 各 组 分 理 化 性 质 的 差 别 ( 如 分 子 形 状 和 大 小 分 子 极 性 及 分 子 亲 和 力 等 ) 使 它 们 以 不 同 程 度 分 布 在 两 个 相 中, 从 而 以 不 同 速 度 相 对 于 固 相 移 动 而 达 到 分 离 层 析 和 电 泳 同 为 生 物 化 学 中 生 物 大 分 子 的 分 离 纯 化 常 用 的 手 段, 两 者 相 辅 相 成, 各 有 所 长 在 蛋 白 质 大 量 制 备 时, 层 析 比 电 泳 更 有 优 势 ( 一 ) 层 析 技 术 的 发 展 简 史 及 科 学 意 义 层 析 技 术 在 20 世 纪 初 开 始 形 成 1906 年 俄 国 植 物 学 家 M.Tswett 将 绿 叶 的 石 油 醚 提 取 液 与 CaCO 3 细 粉 混 合 时, 发 现 许 多 色 素 被 CaCO 3 吸 附, 后 来 他 将 CaCO 3 装 入 一 个 柱 内, 让 一 定 量 的 绿 叶 石 油 醚 提 取 液 通 过 CaCO 3 填 装 的 柱 子 结 果 将 叶 绿 素 分 成 许 多 不 同 的 色 带, 且 各 色 带 间 是 无 色 的 区 带, 这 也 是 层 析 技 术 亦 称 为 色 谱 的 缘 由 1931 年,R.Kuhu 等 人 利 用 层 析 技 术 成 功 地 将 卵 黄 中 的 叶 黄 素 分 成 黄 体 素 和 玉 米 黄 质 素 两 种 成 分 这 一 创 举 推 动 了 层 析 法 的 发 展 和 应 用 1941 年,A.J.P.Martin 和 R.L.M.Synge 用 硅 胶 装 柱, 使 混 合 液 中 的 氨 基 酸 经 柱 层 析 彼 此 得 到 分 离 层 析 法 与 其 他 经 典 分 离 方 法 ( 蒸 馏 结 晶 和 萃 取 等 ) 相 比 操 作 简 便 分 离 效 率 高, 在 科 学 研 究 医 药 卫 生 环 境 保 护 及 化 工 等 领 域 均 有 广 泛 应 用 层 析 法 不 仅 用 于 一 般 化 合 物 的 定 性 定 量 分 析, 也 广 泛 用 于 生 物 大 分 子 ( 蛋 白 质 酶 核 酸 多 糖 和 多 肽 ) 生 物 初 级 代 谢 产 物 ( 如 氨 基 酸 核 苷 酸 有 机 酸 和 脂 肪 酸 ) 及 次 级 代 谢 产 物 ( 如 糖 苷 色 素 生 物 碱 和 萜 类 等 ) 等 的 分 离 与 纯 化 层 析 是 生 物 工 程 技 术 下 游 加 工 过 程 中 最 主 要 的

33 纯 化 技 术 近 年 来, 由 于 各 种 固 定 相 种 类 的 不 断 改 进 更 新, 使 分 离 效 率 越 来 越 高 ; 层 析 检 测 系 统 如 紫 外 分 光 光 度 法 荧 光 法 电 化 学 法 等 也 日 趋 准 确 快 速, 使 层 析 技 术 迅 速 发 展, 逐 渐 完 善 特 别 是 大 型 专 用 自 动 化 仪 器 和 分 析 系 统 的 出 现, 使 层 析 在 分 离 效 率 自 动 化 程 度 和 应 用 范 围 上 都 远 远 超 过 经 典 层 析 法 电 子 计 算 机 技 术 的 发 展 使 层 析 技 术 向 智 能 化 发 展, 智 能 化 色 谱 仪 具 有 推 荐 实 验 条 件 实 验 方 法 优 化 实 验 条 件 和 解 析 试 验 结 果 之 功 能 层 析 法 已 成 为 生 化 各 领 域 的 基 本 技 术, 是 当 今 生 物 物 质 分 离 纯 化 的 最 有 效 的 手 段 之 一 ( 二 ) 层 析 技 术 的 基 本 原 理 1941 年 Martin 和 Synge 根 据 氨 基 酸 在 水 与 氯 仿 两 相 中 分 配 系 数 的 不 同 而 建 立 分 配 层 析 技 术 时 提 出 了 液 - 液 分 配 层 析 的 塔 板 (plate) 理 论 该 理 论 的 第 一 个 概 念 是, 认 为 混 合 物 中 各 组 分 的 物 理 性 质 不 同, 当 这 些 物 质 处 于 互 相 接 触 的 两 相 之 中 时, 不 同 物 质 在 两 相 中 的 分 布 会 不 同 例 如 在 液 - 液 分 配 层 析 柱 上 的 某 一 段, 将 A B 两 种 物 质 溶 解 于 一 定 量 的 S 溶 液 中 ( 作 为 固 定 相 ), 然 后 加 入 一 定 量 的 M 溶 液 ( 为 流 动 相 ) A B 两 种 物 质 即 进 入 固 定 相 又 进 入 流 动 相, 在 固 定 相 中 分 子 受 阻 不 能 前 进, 而 在 流 动 相 中 的 分 子 以 流 动 相 的 速 度 沿 柱 前 进 在 层 析 分 离 过 程 中, 流 动 相 起 运 载 作 用, 固 定 相 起 阻 滞 作 用,AB 两 种 物 质 根 据 其 在 不 同 相 中 的 分 配 系 数 进 行 分 配 分 配 系 数 可 以 用 K 表 示 : K = 溶 质 在 固 定 相 中 的 浓 度 / 溶 质 在 流 动 相 中 的 浓 度 = C S / C M K 值 大 表 示 物 质 在 柱 中 牢 固 地 吸 附 在 固 定 相 中, 在 固 定 相 中 停 留 的 时 间 长, 而 在 流 动 相 中 迁 移 的 速 度 慢, 溶 质 出 现 在 流 动 相 中 较 晚 相 反 K 值 小, 溶 质 出 现 在 洗 脱 液 中 较 早 由 于 混 合 物 中 各 组 分 的 K 值 的 差 异 性, 即 可 使 各 组 分 分 离 在 不 同 的 层 析 技 术 中, K 值 的 含 义 不 同, 在 吸 附 层 析 中,K 为 吸 收 平 衡 系 数, 分 配 层 析 中 K 为 分 配 系 数, 离 子 交 换 层 析 中,K 为 交 换 系 数, 在 亲 和 层 析 中 为 亲 和 常 数 塔 板 理 论 的 第 二 个 概 念 是, 层 析 分 离 的 分 配 原 理 与 分 馏 塔 分 离 挥 发 性 混 合 物 的 原 理 相 似, 层 析 柱 的 分 离 结 果 与 柱 的 效 率 有 关 柱 效 可 用 理 论 塔 板 数 (number of theoretical plate) 的 多 少 来 表 示, 即 将 一 根 层 析 柱 看 成 是 由 许 多 塔 板 叠 加 构 成 的 在 每 一 个 塔 板 内, 样 品 混 合 物 将 在 流 动 相 和 固 定 相 间 达 到 平 衡, 经 多 次 平 衡 后, 相 当 于 一 系 列 分 液 漏 斗 的 液 - 液 萃 取 过 程 如 图 15 所 示, 当 流 动 相 M 与 固 定 相 S 接 触 时,A B 两 种 溶 质 按 各 自 的 分 配 系 数 进 行 分 配 如 A 物 质 的 K=9, 而 B 物 质 的 K=1, 则 溶 质 A 有 十 分 之 一 流 入 流 动 相, 溶 质 B 有 十 分 之 五 流 入 流 动 相 流 动 相 继 续 向 下 移 动, 流 动 相 2(M2) 与 固 定 相 2(S2) 接 触 ; 固 定 相 第 一 段 (S1) 则 又 接 触 没 有 溶 质 的 流 动 相 M2, 溶 质 继 续 在 两 相 中 进 行 分 配 如 此 逐 渐 下 移, 经 多 次 分 配 后,A 物 质 主 要 分 布 在 M3 M4 层,B 物 质 主 要 停 留 在 M2 M3 层, 两 种 物 质 经 多 次 反 复 分 配 后, 分 配 系 数 不 同 的 物 质 就 被 分 离 Martin 和 Synge 计 算 了 硅 酸 柱 的 理 论 塔 板 数,1cm 的 层 析 柱 最 少 有 50 个 理 论 塔 板, 即 在 一 根 20cm 的 层 析 柱 上 最 少 可 进 行 次 分 配, 可 将 分 配 系 数 不 同 的 物 质 分 离 开 来 最 好 的 分 馏 柱 才 有 20 个 塔 板, 可 见 层 析 柱 分 离 效 率 是 非 常 高 的

34 S M 流 动 相 M4 M3 M2 M1 S1 S2 S3 S4 A 物 质 B 物 质 固 定 相 A 0.9 B A B A B A 0.03 B A B 图 15 塔 板 理 论 示 意 图 A: 物 质 分 配 系 数 9 B: 物 质 分 配 系 数 1 ( 三 ) 层 析 法 分 类 1. 根 据 分 离 原 理 分 类 (1) 吸 附 层 析 : 用 吸 附 剂 作 为 支 持 物, 一 种 吸 附 剂 对 不 同 的 物 质 有 不 同 的 吸 附 能 力 在 洗 脱 过 程 中, 不 同 物 质 在 柱 上 的 迁 移 速 度 不 同, 在 最 后 完 全 被 分 离 Tswet 实 验 即 属 于 吸 附 层 析 (2) 分 配 层 析 : 它 是 根 据 在 一 个 不 同 组 分 同 时 存 在 的 溶 剂 系 统 中, 不 同 物 质 的 分 配 系 数 不 同 而 设 计 的 一 种 层 析 方 法, 如 Martin 等 人 的 实 验, 所 用 支 持 物 是 硅 胶, 固 定 相 是 水, 流 动 相 是 氯 仿 由 于 不 同 氨 基 酸 在 水 - 氯 仿 溶 剂 系 统 中 的 分 配 系 数 不 同, 在 洗 脱 过 程 中, 不 同 氨 基 酸 在 分 配 层 析 柱 中 迁 移 的 速 度 不 同, 最 后 分 离 之 (3) 离 子 交 换 层 析 : 用 离 子 交 换 剂 作 为 支 持 物, 或 固 定 相, 在 离 子 交 换 剂 上 含 有 许 多 可 解 离 的 基 团, 这 些 离 子 交 换 剂 可 以 与 溶 液 中 的 离 子 进 行 交 换 离 子 交 换 的 原 理 是 基 于 溶 液 中 分 子 所 带 电 荷 不 同 而 进 行 分 离 的 一 种 技 术 (4) 凝 胶 层 析 : 用 一 种 具 有 一 定 孔 径 大 小 凝 胶 颗 粒 作 为 支 持 物 的 层 析 法, 分 子 大 小 不 同 的 物 质 随 洗 脱 液 流 过 柱 床 时, 分 子 量 大 于 凝 胶 孔 径 的 物 质 不 能 进 入 胶 中 而 首 先 被 洗 脱 ; 分 子 量 小 的 进 入 胶 中, 流 程 长 而 后 被 洗 脱 因 此 这 是 一 种 根 据 分 子 量 大 小 不 同 进 行 分 离 的 方 法 (5) 亲 和 层 析 : 这 是 专 门 用 于 分 离 生 物 大 分 子 的 层 析 法 它 是 利 用 一 种 特 殊 吸 附 剂 作 固 定 相, 根 据 溶 液 中 生 物 分 子 化 学 结 构 与 功 能 的 不 同 进 行 选 择 性 的 ( 专 一 性 ) 及 可 逆 性 吸 附, 通 过 适 当 方 法 进 行 解 吸 附 实 际 也 是 一 种 吸 附 层 析 2. 根 据 流 动 相 的 不 同 分 类 (1) 液 相 层 析 : 流 动 相 为 液 体 的 层 析 称 为 液 相 层 析

35 (2) 气 相 色 谱 或 气 相 层 析 : 流 动 相 为 气 体 的 层 析 称 为 气 相 层 析 或 气 相 色 谱 此 外, 根 据 支 持 物 的 装 填 方 法 不 同 分 类, 支 持 物 装 在 管 中 成 柱, 称 柱 层 析 ; 支 持 物 在 玻 璃 板 上 铺 成 薄 层 的, 称 薄 层 层 析 ( 四 ) 凝 胶 过 滤 层 析 凝 胶 过 滤 层 析 (gel filtration chromatography) 又 称 为 凝 胶 排 阻 分 子 筛 等, 是 一 项 快 速 简 单 并 被 广 泛 应 用 的 蛋 白 质 分 离 技 术 1. 凝 胶 过 滤 层 析 的 基 本 原 理 该 方 法 的 依 据 是, 多 孔 的 载 体 对 不 同 大 小 不 同 形 状 的 分 子 的 排 阻 能 力 不 同, 从 而 将 混 合 物 中 各 个 组 分 分 离 开 凝 胶 过 滤 层 析 是 将 具 有 三 维 空 间 结 构 的 多 孔 网 状 物 质 装 填 到 玻 璃 管 中, 制 成 层 析 柱 由 于 混 合 物 中 分 子 的 大 小 和 形 状 各 异, 在 洗 柱 过 程 中, 分 子 量 大 的 物 质 由 于 直 径 较 大, 不 能 进 入 凝 胶 颗 粒 的 微 孔, 小 分 子 蛋 白 质 则 可 以 进 入 凝 胶 颗 粒 的 内 部 微 孔 因 此 在 洗 脱 液 向 下 流 动 时, 分 子 量 最 大 的 蛋 白 质 最 先 到 达 柱 底 流 出, 洗 脱 体 积 最 小 ; 中 等 大 小 的 蛋 白 质 能 够 进 入 颗 粒 较 大 的 微 孔, 流 出 较 慢 ; 分 子 量 最 小 的 蛋 白 质 可 以 进 入 较 小 的 微 孔 内, 流 出 更 慢, 最 后 到 达 柱 底, 即 需 要 的 洗 脱 体 积 最 大 ( 见 图 16) 小 分 子 大 分 子 凝 胶 A B C D 图 16 凝 胶 过 滤 层 析 原 理 示 意 图 一 般 用 溶 质 分 子 在 移 动 相 和 固 定 相 之 间 的 分 配 系 数 K d (distribution coefficient) 来 表 示 凝 胶 过 滤 的 特 点 : K d = (Ve-Vo) / Vi 式 中 Ve 代 表 某 一 成 分 从 进 入 凝 胶 柱 床 开 始 至 完 全 被 洗 脱 下 来 时 所 需 洗 脱 液 的 体 积 ; Vo 是 层 析 柱 内 凝 胶 颗 粒 间 空 隙 的 总 体 积,Vi 为 层 析 柱 内 凝 胶 颗 粒 微 孔 的 总 容 积 蛋 白 质 在 凝 胶 过 滤 层 析 中 的 行 为 还 取 决 于 分 子 的 形 状, 因 此 一 般 只 适 合 球 状 蛋 白 质 的 分 离 2. 常 用 凝 胶 过 滤 层 析 介 质

36 目 前 常 用 的 凝 胶 见 表 5, 其 中 :(1) 葡 聚 糖 凝 胶 (Sephadex) 是 以 葡 聚 糖 为 基 本 骨 架 含 大 量 羟 基 的 亲 水 凝 胶 它 不 溶 于 弱 酸 碱 盐 有 机 溶 剂 及 水, 但 在 强 酸 中, 凝 胶 的 糖 苷 键 易 被 水 解 ;(2) 交 联 丙 烯 基 葡 聚 糖 凝 胶 (Sephacryl) 是 由 丙 烯 基 葡 聚 糖 与 N - 亚 甲 基 双 丙 烯 酰 胺 共 价 交 联 制 备 的 刚 性 凝 胶 它 在 所 有 溶 剂 中 都 不 溶 解, 有 较 好 的 刚 性, 可 用 于 较 高 的 流 速, 回 收 率 也 较 高, 因 此 被 广 泛 应 用 于 蛋 白 质 的 分 离 ;(3) 交 联 琼 脂 糖 凝 胶 Sepharose Cl-6B 的 化 学 物 理 稳 定 性 好 于 琼 脂 糖, 并 有 较 好 的 刚 性, 可 被 高 压 消 毒, 也 可 耐 受 变 性 剂 其 网 孔 较 大, 因 此 适 用 于 大 分 子 蛋 白 质 DNA RNA 及 病 毒 的 分 离 此 外 还 有 在 Sephadex 或 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 (Bio-Gel P) 上 连 接 某 种 离 子 交 换 基 团 后 形 成 的 凝 胶 离 子 交 换 剂, 这 种 凝 胶 既 有 离 子 交 换 剂 性 质 又 有 分 子 筛 效 应 表 5 常 用 凝 胶 过 滤 层 析 介 质 介 质 颗 粒 大 小 (µm) 球 状 蛋 白 分 离 范 围 (kda) Sephadex G 25 20~80 1~5 Sephadex G 50 20~80 1.5~30 Sephadex G ~120 4~150 Sephadex G ~120 5~600 Sephacryl S-200 超 细 40~105 5~250 Sephacryl S-300 超 细 40 ~105 10~1500 Sepharose 6 B 40~210 10~4000 Sepharose 4 B 40~ ~ Sepharose 2 B 40~ ~ Sepharose CL-6 B 40~210 10~ 凝 胶 过 滤 层 析 的 用 途 及 缺 点 该 方 法 在 蛋 白 质 分 离 中 可 以 用 于 :(1) 依 据 分 子 量 大 小 进 行 的 蛋 白 质 的 纯 化 ;(2) 蛋 白 质 纯 化 过 程 中 或 纯 化 后 的 脱 盐, 与 透 析 法 比 较, 凝 胶 过 滤 层 析 除 盐 速 度 快, 不 影 响 生 物 大 分 子 的 活 性 葡 聚 糖 凝 胶 G-25 因 流 动 阻 力 较 小 交 联 度 合 适, 常 用 于 蛋 白 质 溶 液 的 脱 盐 ;(3) 蛋 白 质 分 子 量 的 测 定 ;(4) 研 究 蛋 白 质 二 聚 体 或 寡 聚 体 的 存 在 凝 胶 过 滤 层 析 多 用 于 样 品 纯 化 的 最 后 阶 段, 或 者 两 个 衔 接 步 骤 之 间 的 脱 盐 处 理 但 不 能 一 概 而 论, 如 纯 化 一 个 分 子 量 较 大 的 蛋 白 质, 第 一 步 就 可 用 凝 胶 过 滤, 即 选 用 合 适 的 柱 填 料, 使 目 的 蛋 白 质 出 现 在 收 集 液 的 最 前 面, 而 其 余 的 小 分 子 蛋 白 质 则 保 留 在 柱 内 这 样 就 可 将 目 的 蛋 白 质 与 其 他 蛋 白 质 分 离 开 另 外, 若 先 采 用 了 离 子 交 换 层 析 技 术, 下 一 步 即 应 采 用 凝 胶 过 滤 层 析, 原 因 是 二 者 分 离 原 理 上 的 ( 前 者 依 据 电 荷 性 质, 后 者 是 根 据 分 子 量 大 小 ) 而 互 补 因 此 凝 胶 过 滤 可 用 于 蛋 白 质 纯 化 中 的 任 何 阶 段 凝 胶 过 滤 层 析 最 大 的 缺 点 是, 在 层 析 过 程 中 样 品 会 发 生 数 倍 稀 释, 因 而 不 利 于 得 到 高 浓 度 的 纯 品, 并 且 增 加 了 样 品 的 损 失 由 于 上 样 量 又 不 能 太 大, 因 此 在 该 层 析 中, 样 品 浓 度 应 越 大 越 好

37 4. 凝 胶 过 滤 层 析 的 基 本 操 作 (1) 层 析 柱 的 制 备 根 据 蛋 白 质 的 分 子 量 选 择 具 有 相 应 分 离 范 围 的 凝 胶 对 于 未 知 蛋 白, 应 选 用 宽 范 围 的 凝 胶 脱 盐 时 应 选 用 Sephadex G -50 或 G -25; 而 对 于 小 分 子 量 多 肽 物 质 (1~5 kda), 脱 盐 则 应 选 用 Sephadex G -10 或 Sephadex G -15 凝 胶 过 滤 层 析 柱 的 长 与 直 径 的 比 例 应 为 50~100:1 商 品 凝 胶 有 的 是 脱 水 干 粉, 使 用 前 应 用 水 溶 胀 一 般 情 况 下,1 份 凝 胶 加 10 份 水, 自 然 溶 胀 至 少 需 24 h 溶 胀 后, 将 上 清 中 细 小 的 凝 胶 碎 块 弃 除, 重 新 搅 拌 悬 起, 待 凝 胶 沉 淀 后, 再 次 弃 去 凝 胶 碎 块, 重 复 数 次, 直 到 液 相 澄 清 为 止 为 加 速 溶 胀, 可 将 凝 胶 煮 沸 1 h, 该 法 同 时 具 有 灭 菌 的 作 用 装 柱 时 柱 体 要 垂 直 首 先 在 柱 内 加 入 水 或 缓 冲 液, 然 后 沿 层 析 柱 一 侧 将 悬 浮 于 缓 冲 液 中 的 凝 胶 浆 ( 凝 胶 : 缓 冲 液 =3:1) 缓 慢 并 连 续 地 一 次 性 注 入 柱 内 装 柱 过 程 中, 要 避 免 柱 内 缓 冲 液 流 干, 注 意 保 持 柱 内 凝 胶 均 匀 无 气 泡, 无 裂 缝 亦 可 用 2 ml 蓝 色 葡 聚 糖 溶 液 检 查 柱 体 的 均 匀 性 如 柱 体 均 匀, 可 见 蓝 色 区 带 均 匀 平 稳 地 通 过 凝 胶, 不 留 任 何 条 纹 要 保 持 凝 胶 和 缓 冲 液 温 度 一 致, 以 防 止 气 泡 产 生 (2) 样 品 上 柱 凝 胶 过 滤 层 析 对 样 品 体 积 有 严 格 的 要 求 样 品 体 积 不 应 超 过 柱 床 体 积 的 1~5 %, 如 超 过 5 %, 则 会 导 致 分 离 效 率 降 低, 低 于 1 % 则 分 离 效 率 也 不 会 提 高 所 以 蛋 白 质 样 品 应 尽 可 能 浓 缩 至 10~20 mg/ml 样 品 本 身 对 洗 脱 液 的 相 对 粘 度 不 能 超 过 2 样 品 粘 度 过 高, 会 使 层 析 区 带 不 稳 定, 或 流 速 不 规 律, 区 带 变 宽 或 扭 曲 上 样 前 样 品 应 经 0.2 m 孔 径 滤 膜 过 滤 或 g 离 心 5 min, 去 除 残 渣, 加 样 时 避 免 破 坏 柱 床 表 面, 保 持 其 表 面 均 匀 平 整 (3) 样 品 的 洗 脱 洗 脱 缓 冲 液 应 保 证 蛋 白 质 的 活 性 并 防 止 其 与 其 它 蛋 白 质 之 间 或 与 凝 胶 之 间 的 相 互 作 用 一 般 需 要 用 具 有 一 定 离 子 强 度 的 盐 溶 液 Sephadex 和 Sepharose CL 凝 胶 层 析 所 用 的 洗 脱 液 的 离 子 强 度 至 少 应 为 0.02 mol/l;sephacryl 凝 胶 以 0.05 mol/l 为 宜 有 时 洗 脱 溶 液 的 离 子 强 度 可 达 0.2 mol/l, 使 蛋 白 质 与 凝 胶 介 质 充 分 分 开 在 凝 胶 过 滤 层 析 中 缓 冲 液 成 分 全 程 不 变 在 凝 胶 过 滤 层 析 过 程 中, 洗 脱 速 度 要 恒 定 流 速 不 应 过 高, 低 流 速 可 提 高 分 辨 率 可 以 用 恒 流 泵 控 制 流 速 (4) 目 的 蛋 白 的 回 收 和 鉴 定 凝 胶 过 滤 层 析 中, 目 的 蛋 白 的 回 收 和 鉴 定 方 法 与 离 子 交 换 层 析 相 同 (5) 层 析 柱 的 再 生 与 保 存 洗 脱 完 成 后, 继 续 用 5 倍 柱 床 体 积 缓 冲 液 洗 涤 柱 体, 即 可 使 凝 胶 再 生 也 可 用 0.2 mol/l NaOH 或 1 mol/l NaCl 或 非 离 子 型 去 垢 剂 0.2~1% 的 NP-40 去 除 吸 附 过 紧 的 杂 质, 再 用 双 蒸 水 充 分 洗 脱 除 去 离 子, 加 0.02% NaN 3 ( 抑 菌 剂 ) 保 存 也 可 在 20 % 乙 醇 中 保 存 ( 如 Sephacryl HR 或 Sepharose CL 等 ) ( 五 ) 离 子 交 换 层 析

38 1. 离 子 交 换 层 析 技 术 的 基 本 原 理 离 子 交 换 层 析 (ion exchange chromatography) 利 用 物 质 的 电 荷 与 层 析 载 体 ( 离 子 交 换 剂 ) 电 荷 之 间 的 相 互 作 用 达 到 分 离 纯 化 的 目 的, 属 于 吸 附 层 析 离 子 交 换 层 析 所 用 的 固 相 基 质 被 称 为 离 子 交 换 剂 ( 表 6) 离 子 交 换 剂 是 由 不 溶 于 水 的 具 有 网 状 结 构 的 高 分 子 聚 合 物 骨 架 组 成 这 种 不 溶 性 骨 架 有 树 脂 纤 维 素 葡 聚 糖 凝 胶 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 和 琼 脂 糖 凝 胶 等 不 同 种 类 这 些 骨 架 在 交 换 过 程 中 不 发 生 任 何 反 应 在 网 状 结 构 的 骨 架 上, 有 许 多 共 价 结 合 的 带 电 基 团 侧 链, 若 带 有 正 电 基 团, 则 可 与 带 负 电 的 离 子 相 结 合, 称 为 阴 离 子 交 换 剂 ; 若 带 有 负 电 基 团, 即 可 与 带 正 电 荷 的 离 子 相 结 合, 称 为 阳 离 子 交 换 剂 表 6 蛋 白 质 分 离 常 用 的 离 子 交 换 剂 类 型 离 子 交 换 基 团 基 架 举 例 阳 离 子 交 换 剂 磺 酸 基 交 联 琼 脂 糖 Sp-sepharose 羧 甲 基 交 联 琼 脂 糖 交 联 葡 聚 糖 纤 维 素 CM-sepharose CM-sephadex CM-52 阴 离 子 交 换 剂 季 铵 盐 交 联 琼 脂 糖 Q-sepharose 二 乙 氨 基 乙 基 交 联 琼 脂 糖 交 联 葡 聚 糖 纤 维 素 DEAE-sepharose DEAE-sephadex DE-52 A25 离 子 交 换 层 析 分 离 蛋 白 质 最 重 要 的 依 据 是 其 带 电 荷 状 态 当 溶 液 ph 值 高 于 目 的 蛋 白 质 等 电 点 时, 蛋 白 质 携 带 净 负 电 荷, 可 与 阴 离 子 交 换 剂 结 合 ; 如 ph 值 低 于 等 电 点, 蛋 白 质 携 带 净 正 电 荷, 可 与 阳 离 子 交 换 剂 结 合 ( 图 17) 完 成 结 合 以 后, 通 过 改 变 流 动 相 的 离 子 强 度 或 ph 值 即 可 以 将 结 合 的 目 的 蛋 白 洗 脱 下 来 在 离 子 交 换 层 析 过 程 中, 被 分 离 的 物 质 与 离 子 交 换 剂 之 间 的 作 用 力 不 是 单 一 的 作 用 力, 它 是 离 子 交 换 离 子 亲 和 力 吸 附 和 扩 散 等 多 种 物 理 化 学 因 素 的 综 合 作 用 但 最 主 要 是 基 于 交 换 剂 与 预 分 离 物 质 间 的 静 电 引 力 和 范 德 华 力

39 图 17 离 子 交 换 层 析 原 理 a. 样 品 全 部 交 换 并 吸 附 到 树 脂 上 ;b. 负 电 荷 较 少 的 分 子 用 较 稀 的 Cl - 或 其 他 负 离 子 溶 液 洗 脱 ;c. 电 荷 多 的 分 子 随 Cl - 浓 度 增 加 依 次 洗 脱 ;d. 洗 脱 图 2. 离 子 交 换 层 析 技 术 的 基 本 操 作 离 子 交 换 层 析 的 基 本 步 骤 有 样 品 准 备 层 析 柱 准 备 样 品 上 样 目 的 蛋 白 洗 脱 回 收 检 测 和 分 离 柱 的 再 生 等 六 个 步 骤 (1) 样 品 准 备 用 于 离 子 交 换 层 析 的 样 品 必 须 完 全 溶 解 在 适 当 离 子 强 度 和 ph 值 的 缓 冲 液 中 组 织 和 细 胞 裂 解 液 可 以 直 接 用 缓 冲 液 稀 释 如 果 是 硫 酸 铵 沉 淀 后 的 溶 液 则 需 要 通 过 适 当 缓 冲 液 透 析 后 方 可 以 进 行 分 离 (2) 离 子 交 换 剂 和 层 析 柱 的 准 备 首 先 要 根 据 待 纯 化 的 目 的 蛋 白 的 已 知 性 质 选 择 适 合 的 离 子 交 换 剂 一 般 来 说, 尽 可 能 选 择 能 使 待 纯 化 的 目 的 蛋 白 与 离 子 交 换 剂 结 合 的 条 件 由 于 样 品 的 洗 脱 体 积 可 以 较 小, 在 分 离 的 同 时 还 可 以 达 到 对 目 的 蛋 白 进 行 浓 缩 的 目 的 如 果 缺 乏 对 目 的 蛋 白 性 质 的 了 解, 可 以 先 做 小 规 模 的 预 实 验 确 定 分 离 条 件 离 子 交 换 剂 在 使 用 前 要 进 行 预 处 理 1) 纤 维 素 离 子 交 换 剂 的 预 处 理 10.5 mol/l NaOH 浸 泡 30 min;2 蒸 馏 水 洗 至 ph 8.0;30.5 mol/l HCl 浸 泡 30 min; 4 蒸 馏 水 洗 至 中 性 ph 8.0;50.5 mol/l NaOH 浸 30 min;6 蒸 馏 水 洗 至 ph 8.0;7 用 上 样 缓 冲 液 平 衡 2) 各 种 葡 聚 糖 离 子 交 换 剂 的 预 处 理 1Sephadex 用 前 在 上 样 缓 冲 液 中 室 温 浸 泡 1 天 ;2DEAE-Sephadex Cl-6B 使 用 前 用 1~2 mol/l NaCl 浸 泡, 然 后 用 上 样 缓 冲 液 平 衡 ;3DEAE-Sephacel 是 在 24% 乙 醇 中 提 供, 用 前 要 用 起 始 缓 冲 液 充 分 洗 涤 离 子 交 换 层 析 一 般 采 用 粗 短 柱 离 子 交 换 层 析 柱 的 柱 床 体 积 应 根 据 样 品 的 体 积 纯 度 含 量 以 及 离 子 交 换 剂 的 交 换 量 (capacity) 而 定 一 般 以 加 入 样 品 体 积 的 2~5 倍 为 宜, 过 少 则 会 因 交 换 量 饱 和 而 导 致 样 品 流 出, 过 多 则 会 增 加 从 吸 附 位 置 到 收 集 位 置 的 流 程 距 离, 增 加 样 品 扩 散, 在 洗 脱 时 也 会 造 成 样 品 的 稀 释 在 样 品 蛋 白 含 量 低 离 子 交 换 剂 交 换 容 量 大 的 情 况 下, 样 品 的 体 积 可 以 大 大 超 过 上 述 比 例 3. 样 品 分 离

40 上 样 量 的 多 少 与 目 的 蛋 白 的 性 质 浓 度 及 交 换 剂 的 亲 和 力 有 关 在 样 品 分 离 过 程 中, 应 注 意 :1 样 品 中 目 的 蛋 白 浓 度 最 好 低 于 10 mg/ml, 如 目 的 蛋 白 浓 度 过 大, 局 部 会 产 生 NaCl 浓 度 波 动 或 ph 值 变 得 过 高 或 过 低, 使 目 的 蛋 白 丢 失 ;2 溶 解 蛋 白 质 样 品 的 缓 冲 液 的 离 子 强 度 最 好 低 于 50 mmol/l, 否 则 会 影 响 目 的 蛋 白 的 结 合 ;3 上 样 速 度 不 要 过 快, 要 让 样 品 与 离 子 交 换 剂 充 分 接 触 ;4 上 样 缓 冲 液 的 ph 值 应 该 合 适 4. 目 的 蛋 白 的 洗 脱 样 品 上 样 完 成 以 后, 首 先 要 用 足 够 量 的 上 样 缓 冲 液 洗 去 未 吸 附 的 组 分 ( 一 般 应 在 10 倍 柱 床 体 积 以 上 ) 将 结 合 的 目 的 蛋 白 从 离 子 交 换 柱 上 洗 脱 下 来 的 方 法 有 两 种 : 一 种 是 改 变 洗 脱 液 的 离 子 强 度 ; 另 一 种 是 改 变 洗 脱 液 的 ph 值 两 种 方 式 均 可 以 使 蛋 白 质 与 离 子 交 换 剂 的 结 合 能 力 下 降, 从 而 被 置 换 到 洗 脱 缓 冲 液 中 在 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 中, 主 要 是 采 取 改 变 离 子 强 度 的 方 法 洗 脱 过 程 中, 缓 冲 液 的 离 子 强 度 的 变 化 应 该 是 从 低 到 高, 低 离 子 强 度 时, 首 先 洗 下 来 的 可 能 是 杂 质, 到 达 一 定 离 子 强 度 时, 目 的 蛋 白 才 被 洗 脱, 这 样 可 以 增 加 目 的 蛋 白 的 纯 度 采 用 ph 值 变 化 时, 也 应 该 从 小 的 改 变 开 始, 逐 步 增 大 洗 脱 过 程 中 改 变 缓 冲 液 的 方 式 有 两 种 一 种 是 梯 度 洗 脱 (gradient elution), 洗 脱 液 的 离 子 强 度 或 ph 值 的 改 变 是 逐 步 的 例 如, 在 梯 度 混 合 器 的 帮 助 下, 可 以 在 洗 脱 过 程 中, 将 NaCl 浓 度 从 0.02 mol/l 逐 渐 增 加 到 1.0 mol/l, 呈 一 种 连 续 线 性 梯 度, 目 的 蛋 白 在 一 定 浓 度 范 围 内 被 洗 脱 ; 另 一 种 方 式 是 分 步 洗 脱 (stepwise elution), 即 用 间 断 地 递 增 的 不 同 离 子 强 度 缓 冲 液 分 次 进 行 洗 脱 例 如, 用 NaCl 浓 度 分 别 为 mol/l 的 缓 冲 液 先 后 洗 柱, 目 的 蛋 白 在 相 应 的 缓 冲 液 中 被 洗 脱 梯 度 洗 脱 时, 离 子 强 度 的 上 限 要 足 够 高, 以 保 证 即 使 吸 附 再 紧 密 的 目 的 蛋 白 组 分 也 可 以 被 洗 脱 下 来 ; 梯 度 的 斜 度 要 比 较 平 缓, 保 证 各 个 洗 脱 峰 能 有 效 分 离 ; 要 保 证 足 够 的 洗 脱 体 积, 使 分 离 峰 不 至 于 太 靠 近 线 性 梯 度 洗 脱 比 分 步 洗 脱 具 有 更 好 的 分 离 洗 脱 效 果, 目 的 蛋 白 的 纯 度 更 高, 但 是 洗 脱 过 程 需 要 梯 度 混 合 器, 操 作 也 较 分 步 法 烦 琐 分 步 洗 脱 操 作 简 便 省 时, 但 是 分 离 效 率 不 如 线 性 梯 度 洗 脱, 而 且 必 须 事 先 了 解 目 的 蛋 白 质 在 离 子 交 换 剂 上 的 层 析 行 为 可 以 先 用 线 性 梯 度 洗 脱 做 预 实 验 后, 选 择 出 合 适 的 分 步 洗 脱 的 离 子 强 度 洗 脱 速 度 不 宜 过 快 或 过 慢, 在 总 体 积 是 500~2000 ml 时, 应 以 5~10 ml/min 为 宜 5. 洗 脱 液 的 鉴 定 和 回 收 洗 脱 液 需 要 分 部 回 收, 常 用 分 部 收 集 器 收 集, 没 有 分 部 收 集 器 时, 也 可 以 手 动 收 集 在 总 体 积 是 500~2 000 ml 时, 以 每 管 收 集 5 ml 为 宜 洗 脱 液 中 的 蛋 白 成 分 常 用 280 nm 紫 外 吸 收 法 监 测, 在 自 动 化 仪 器 中, 洗 脱 液 自 柱 底 流 出 后 先 进 入 紫 外 分 光 光 度 检 测 器, 记 录 下 光 密 度 值 后 再 进 入 分 部 收 集 器 分 装 到 各 管 内, 从 记 录 上 可 以 查 出 蛋 白 洗 脱 峰 所 在 的 收 集 管 如 没 有 自 动 检 测 仪, 则 需 要 在 收 集 后 逐 管 分 别 测 定 洗 脱 液 中 目 的 蛋 白 所 在 的 位 置 需 要 进 一 步 用 相 应 的 活 性 测 定 或 其 它 特 异 方 法 确 定 目 的 蛋 白 的 纯 度 可 以 用 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 等 电 聚 焦 或 免 疫 电 泳 等 方 法 确 认, 然 后 决 定 是 否 进 行 进 一 步 的 纯 化 6. 离 子 交 换 剂 的 再 生 与 储 存

41 以 Sephadex Sepharose 和 Sephacryl 等 为 基 质 的 离 子 交 换 剂 可 以 用 1~2 mol/l NaCl 溶 液 洗 涤 才 可 再 用 如 有 脂 类 等 物 质 的 污 染 则 需 碱 溶 液 (0.1 mol/l NaOH) 或 非 离 子 去 垢 剂 (0.1 mol/l) 洗 涤 阴 离 子 交 换 剂 储 存 在 % 洗 必 泰 缓 冲 液 中, 阳 离 子 交 换 剂 储 存 在 0.005% 硫 柳 汞 缓 冲 液 中 ( 六 ) 亲 和 层 析 亲 和 层 析 (affinity chromatography) 是 蛋 白 质 分 离 纯 化 的 最 有 效 方 法 之 一, 个 别 情 况 下 甚 至 可 以 仅 用 一 步 纯 化 即 可 达 到 目 的 1. 亲 和 层 析 的 基 本 原 理 和 用 途 亲 和 层 析 是 利 用 生 物 分 子 与 固 相 介 质 中 的 配 基 发 生 特 异 性 可 逆 结 合 而 形 成 的 层 析 分 离 技 术 亲 和 层 析 也 属 于 分 配 层 析, 不 过, 这 种 分 配 具 有 高 度 的 特 异 性 许 多 成 分 都 可 以 作 为 亲 和 层 析 技 术 中 使 用 的 配 基, 如 酶 的 底 物 或 抑 制 剂 抗 原 或 抗 体 激 素 或 受 体 维 生 素 凝 集 素 和 核 酸 等 等 理 论 上 讲, 只 要 一 种 分 子 能 特 异 而 可 逆 的 与 目 的 蛋 白 结 合, 且 能 够 通 过 适 宜 的 方 法 被 固 定 在 固 相 介 质 上 就 可 以 用 于 目 的 蛋 白 的 亲 和 层 析 分 离 含 有 目 的 蛋 白 的 流 动 相 通 过 固 定 相 后, 混 合 物 中 只 有 那 些 能 与 配 基 特 异 性 结 合 的 目 的 蛋 白 被 吸 附, 不 能 结 合 的 杂 质 分 子 直 接 流 出 改 变 洗 脱 溶 液 可 使 与 配 基 结 合 的 物 质 解 吸 下 来 ( 图 18) 亲 和 层 析 的 最 大 特 点 载 体 配 基 是, 特 异 性 强 简 便 和 高 效, 杂 质 能 在 温 和 条 件 下 操 作, 对 含 亲 和 层 析 量 少 又 不 稳 定 的 活 性 物 质 更 为 有 效 另 外 亲 和 层 析 过 亲 和 物 程 能 使 样 品 浓 缩, 还 可 以 从 洗 涤 样 品 中 除 去 大 量 杂 质, 从 而 得 到 高 产 率 的 纯 化 产 物, 因 洗 脱 再 生 此 被 广 泛 应 用 于 蛋 白 质 酶 及 重 组 蛋 白 质 等 的 分 离 纯 化 中 亲 和 层 析 也 具 有 局 限 性 由 于 不 是 任 何 生 物 物 质 之 间 都 具 有 特 异 性 亲 和 力, 图 18 亲 和 层 析 的 工 作 原 理 示 意 图 也 并 不 是 任 何 生 物 物 质 都 具 有 特 定 配 基, 因 此 亲 和 层 析 有 一 定 的 局 限 性 此 外, 相 对 于 离 子 交 换 层 析 和 凝 胶 过 滤 层 析, 亲 和 层 析 的 成 本 一 般 较 高 2. 亲 和 层 析 用 固 相 配 基 的 制 备 琼 脂 糖 凝 胶 (sepha- rose) 和 交 联 琼 脂 糖 凝 胶 (sepharose Cl-4B 6B) 是 目 前 公 认 的 理 想 的 固 相 载 体 它 们 的 物 理 硬 度 适 当, 化 学 性 质 稳 定, 疏 水 性 好, 非 特 异 性 吸 附 低, 凝 胶 孔 径 大 且 均 一, 化 学 功 能 基 团 多, 易 于 配 基 的 结 合 将 亲 和 配 基 与 固 相 载 体 共 价 偶 联 的 方 法 取 决 于 配 基 的 性 质 目 前 亲 和 层 析 所 用 的 固

42 定 化 配 基 有 近 200 种, 尤 其 是 免 疫 亲 和 层 析 凝 集 素 亲 和 层 析 染 料 亲 和 层 析 及 金 属 螯 合 层 析 等 建 议 除 非 是 用 于 工 业 化 生 产, 在 实 验 研 究 中 只 要 有 商 品 化 的 配 基 可 以 利 用, 就 应 该 尽 可 能 选 择 直 接 从 商 家 购 买 如 无 条 件 购 买, 再 按 需 要 自 行 制 备 配 基 与 固 相 载 体 共 价 偶 联 可 以 选 用 表 7 中 的 相 应 试 剂 目 前 已 经 有 各 种 商 品 化 的 用 化 学 偶 联 剂 处 理 过 ( 活 化 ) 的 固 相 载 体 出 售, 应 该 尽 可 能 使 用 商 品 活 化 介 质 自 行 制 备 一 方 面 质 量 不 稳 定, 另 外 所 用 化 学 偶 联 剂 往 往 毒 性 较 大, 操 作 烦 琐 本 章 限 于 篇 幅, 不 介 绍 配 基 与 固 相 载 体 偶 联 的 具 体 操 作, 如 需 要, 可 以 查 询 相 关 实 验 参 考 书 表 7 亲 和 层 析 偶 联 试 剂 配 基 基 团 氨 基 羧 基 偶 联 试 剂 溴 化 氰 戊 二 醛 羟 基 琥 珀 酰 胺 碳 二 亚 胺 碳 二 亚 胺 1,6- 二 氨 基 己 烷 3. 亲 和 层 析 的 基 本 操 作 (1) 层 析 柱 的 准 备 根 据 固 相 配 基 的 吸 附 能 力 和 样 品 中 目 的 蛋 白 的 含 量 计 算 装 柱 体 积 量, 一 般 用 量 应 是 计 算 用 量 的 2~3 倍 例 如, 如 果 每 毫 升 用 于 谷 胱 甘 肽 S- 转 移 酶 (GST) 亲 和 层 析 纯 化 的 还 原 型 谷 胱 甘 肽 偶 联 的 琼 脂 糖 凝 胶 可 以 结 合 10 mg 的 GST 蛋 白, 若 要 纯 化 5 mg 目 的 蛋 白, 则 用 1 ml 还 原 型 谷 胱 甘 肽 偶 联 的 琼 脂 糖 凝 胶 装 柱 即 可 如 果 固 相 配 基 是 已 经 溶 胀 过 的 凝 胶 悬 液, 则 直 接 用 水 和 起 始 缓 冲 液 洗 涤 平 衡 即 可 使 用 如 果 是 冻 干 状 态, 则 需 先 在 过 量 低 浓 度 磷 酸 缓 冲 液 (0.1 mol/l ph 7.0) 中 溶 胀, 然 后 用 水 洗 涤, 再 用 上 样 缓 冲 液 平 衡 亲 和 层 析 柱 的 装 柱 方 法 与 离 子 交 换 层 析 法 相 同 (2) 样 品 上 样 用 于 亲 和 层 析 的 样 品 应 处 于 完 全 溶 解 状 态 上 样 蛋 白 一 般 是 溶 在 含 有 0.15 mol/l NaCl 的 磷 酸 缓 冲 液 或 0.1~0.2 mol/l Tris 缓 冲 液 ( 样 品 缓 冲 液 ) 中 这 样 的 缓 冲 液 可 减 少 配 基 与 蛋 白 质 之 间 的 非 特 异 性 结 合 为 了 增 加 蛋 白 质 与 配 基 的 结 合, 上 样 时 应 用 较 慢 的 流 速, 上 样 可 以 循 环 重 复 几 次, 也 可 用 亲 和 层 析 介 质 与 样 品 混 合, 在 4 下 搅 拌 过 夜, 促 进 蛋 白 质 与 介 质 的 结 合, 然 后 再 装 柱 (3) 目 的 蛋 白 的 洗 脱 和 回 收 进 行 目 的 蛋 白 洗 脱 之 前, 要 用 至 少 10 倍 柱 床 体 积 的 样 品 缓 冲 液 洗 涤 柱, 去 除 未 结 合 的 杂 质, 一 般 以 流 出 液 的 A 280 值 达 到 基 线 为 佳, 流 速 为 1 ml/min 亲 和 层 析 技 术 中, 目 的 蛋 白 的 洗 脱 可 以 分 为 特 异 性 洗 脱 和 非 特 异 性 洗 脱 两 大 类 前 者 是 洗 脱 液 中 含 有 与 目 的 蛋 白 竞 争 结 合 载 体 配 基 的 底 物, 例 如, 结 合 于 谷 胱 甘 肽 偶 联 的 琼 脂 糖 珠 的 GST 蛋 白 可 以 用 谷 胱 甘 肽 竞 争 使 GST 蛋 白 被 洗 脱 后 者 是 通 过 改 变 盐 浓 度 ph 温 度 或 使 用 非 离 子 去 垢 剂 等, 使 目 的 蛋 白 与 配 基 的 结 合 能 力 下 降, 从 而 洗 脱 出 目 的 蛋 白 这 种 洗 脱 方 式 的 具 体 操 作 与 离 子 交 换 层 析 法 类 似 不 过, 离 子 交 换 层 析 中 较 少 利 用 ph 变 化 来 进 行 目 的 蛋 白 的 洗 脱, 而 亲 和 层 析, 尤 其 是 利 用 抗 原 做 配 基 时, 往 往 需 要 利 用 酸 性 缓 冲 液 ( 最 常 用 的 是 ph 2.5 的 甘 氨 酸 - 盐 酸 缓 冲 液 ) 方 可 以 洗 脱 目 的 抗 体 在 这 种

43 情 况 下, 需 要 以 最 快 的 速 度 用 碱 性 溶 液 ( 如 1 mol/l 的 Tris base) 使 洗 脱 液 的 ph 值 回 到 中 性, 以 防 止 目 的 蛋 白 的 变 性 失 活 一 般 应 该 在 实 验 前 做 好 对 洗 脱 液 进 行 中 和 的 预 实 验, 明 确 在 一 定 体 积 的 洗 脱 液 中 加 入 多 少 体 积 的 中 和 用 溶 液, 以 便 在 收 集 洗 脱 液 后 迅 速 加 入 (4) 亲 和 层 析 柱 的 再 生 和 保 存 亲 和 层 析 载 体 一 般 价 格 较 昂 贵, 使 用 完 毕 后 应 该 仔 细 洗 涤 再 生 后 按 照 说 明 保 存, 以 备 再 次 使 用 柱 的 洗 涤 可 以 用 高 浓 度 的 特 异 性 洗 脱 液, 也 可 以 用 高 浓 度 的 非 特 异 性 洗 脱 液, 如 0.5~1.0 mol/l NaCl 但 是 盐 浓 度 不 宜 过 高, 因 其 可 能 改 变 蛋 白 质 的 构 象 破 坏 配 基 或 改 变 它 的 活 度 及 改 变 配 基 对 样 品 的 结 合 能 力 等 洗 涤 过 的 亲 和 层 析 柱 储 存 在 8 以 下, 应 防 止 凝 胶 冻 结 可 加 抑 菌 剂, 如 0.5% 醋 酸 洗 必 泰 或 0.05% 苯 甲 醇 在 应 用 前, 应 充 分 洗 除 抗 菌 剂 例 : 亲 和 层 析 法 纯 化 兔 IgG 实 验 1 在 层 析 玻 璃 柱 内 加 入 protein A-agarose 1 ml; 2 用 5 ml ph 7.0 的 磷 酸 盐 缓 冲 液 (PBS) 洗 涤 平 衡 ; 3 将 兔 血 清 2 ml 用 PBS 1:1 稀 释 后 加 到 亲 和 柱 内, 流 出, 重 复 1 次 ; 4 用 5 ml PBS 流 入 洗 涤 柱 床, 重 复 1 次 ; 55 ml 0.1 mol/l 的 ph 2.5 的 甘 氨 酸 - 盐 酸 缓 冲 液 洗 脱 ; 6 按 每 管 0.5 ml 收 集 洗 脱 液, 管 内 预 先 加 入 50 l 1 mol/ltris base 溶 液 ; 7 用 紫 外 吸 收 法 测 定 每 管 的 蛋 白 含 量 ; 8 将 含 有 抗 体 的 样 品 标 明 含 量, 加 入 NaN 3 至 0.02%,4 保 存 ; 9 将 protein A-agarose 柱 洗 涤 后 备 用

44 第 二 部 分 实 验 一 蛋 白 质 的 测 定 蛋 白 质 含 量 测 定 法, 是 生 物 化 学 研 究 中 最 常 用 最 基 本 的 分 析 方 法 之 一 目 前 常 用 的 有 四 种 方 法 定 氮 法, 双 缩 尿 法 (Biuret 法 ) Folin- 酚 试 剂 法 (Lowry 法 ) 和 紫 外 吸 收 法 近 十 年 普 遍 使 用 一 种 新 的 测 定 法 考 马 斯 亮 蓝 法 (Bradford 法 ) Bradford 法 和 Lowry 法 灵 敏 度 最 高, 比 紫 外 吸 收 法 灵 敏 10~20 倍, 比 Biuret 法 灵 敏 100 倍 以 上 定 氮 法 虽 然 比 较 复 杂, 但 较 准 确, 往 往 以 定 氮 法 测 定 的 蛋 白 质 作 为 其 他 方 法 的 标 准 蛋 白 质 值 得 注 意 的 是, 这 些 方 法 并 不 能 在 任 何 条 件 下 适 用 于 任 何 形 式 的 蛋 白 质, 因 为 一 种 蛋 白 质 溶 液 用 这 些 方 法 测 定, 有 可 能 得 出 四 种 不 同 的 结 果 每 种 测 定 法 都 不 是 完 美 无 缺 的, 都 有 其 优 缺 点 在 选 择 方 法 时 应 考 虑 :1 实 验 对 测 定 所 要 求 的 灵 敏 度 和 精 确 度 ;2 蛋 白 质 的 性 质 ;3 溶 液 中 存 在 的 干 扰 物 质 ;4 测 定 所 要 花 费 的 时 间 考 马 斯 亮 蓝 法 (Bradford 法 ), 由 于 其 突 出 的 优 点, 目 前 得 到 广 泛 的 应 用 本 实 验 的 目 的 是 学 会 各 种 蛋 白 质 含 量 的 测 定 方 法 了 解 各 种 测 定 方 法 的 基 本 原 理 和 优 缺 点 实 验 一 微 量 凯 氏 (Kjeldahl) 定 氮 法 Determination of Nitrogen by Kjeldahl Method 原 理 含 氮 有 机 物 样 品 与 浓 硫 酸 共 热, 即 分 解 产 生 氨 ( 消 化 ), 氨 又 与 硫 酸 作 用, 变 成 硫 酸 氨 后 者 经 强 碱 分 解 释 放 出 氨, 借 助 蒸 汽 将 氨 蒸 至 于 酸 液 中, 根 据 此 酸 液 被 中 和 的 程 度 可 计 算 出 样 品 中 的 氮 含 量 若 以 甘 氨 酸 为 例, 其 反 应 式 如 下 : NH 2 -CH 2 COOH + 3H 2 SO 4 = 2CO 2 + 3SO 2 +4H 2 O +NH 3 2NH 3 + H 2 SO 4 = (NH 4 ) 2 SO 4 (NH 4 ) 2 SO 4 + 2NaOH = 2H 2 O +Na 2 SO 4 + 2NH 3 蛋 白 质 为 含 氮 的 化 合 物 因 此, 可 利 用 此 法 测 定 蛋 白 质 的 含 量 试 剂 与 仪 器 1. 试 剂 (1) 硫 酸 铜 (CuSO 4 5H 2 O) (2) 硫 酸 ( 密 度 为 g/l)

45 (3) 硼 酸 溶 液 (20 g/l) (4) 氢 氧 化 钠 溶 液 (400 g/l) (5)0.01 mol/l 盐 酸 标 准 滴 定 溶 液 (6) 混 合 指 示 试 剂 :0.1% 甲 基 红 乙 醇 溶 液 1 份, 与 0.1% 溴 甲 酚 绿 乙 醇 溶 液 5 份 临 用 时 混 合 (7) 血 浆 2. 仪 器 微 量 定 氮 蒸 馏 装 置 如 图 19 所 示 图 1 9 微 量 凯 氏 定 氮 装 置 1. 电 炉 ; 2. 水 蒸 气 发 生 器 (2L 平 底 烧 瓶 ) ; 3. 螺 旋 夹 a; 4. 小 漏 斗 及 棒 状 玻 璃 塞 ( 样 品 入 口 处 ) ; 5. 反 应 室 ; 6. 反 应 室 外 层 ; 7. 橡 皮 管 及 螺 旋 夹 b; 8. 冷 凝 管 ; 9. 蒸 馏 液 接 收 瓶 步 骤 1. 样 品 消 化 (1) 取 血 清 或 血 浆 1ml, 以 0.9% NaCl 溶 液 稀 释 至 50ml( 稀 释 50 倍 ) (2) 取 稀 释 后 的 血 清 10ml 移 入 干 燥 的 100mL 凯 氏 烧 瓶 中, 加 入 50% 硫 酸 10ml, 稍 摇 匀 后 瓶 口 放 一 小 漏 斗, 将 瓶 以 45 0 角 斜 支 于 有 小 孔 的 石 棉 网 上, 使 用 电 炉, 在 通 风 橱 中 加 热 消 化 (3) 开 始 时 用 低 温 加 热, 待 内 容 物 全 部 炭 化, 泡 沫 停 止 后, 再 升 高 温 度 保 持 微 沸, 消 化 至 液 体 无 色 透 明 后, 取 下 放 冷, 小 心 加 80ml 蒸 流 水, 混 匀 定 容 至 100 刻 度, 即 为 消 化 液 2. 量 取 硼 酸 试 剂 20mL 于 三 角 瓶 中, 加 入 混 合 指 示 剂 2~3 滴, 并 使 冷 凝 管 的 下 端 插 入 硼 酸 液 面 下, 在 螺 旋 夹 a 关 闭, 螺 旋 夹 b 开 启 的 状 态 下, 准 确 吸 取 10.0mL 样 品 消 化 液, 由 小 漏 斗 流 入 反 应 室, 并 以 10mL 蒸 馏 水 洗 涤 进 样 口 流 入 反 应 室, 棒 状 玻 塞 塞 紧 使 10mL 氢 氧 化 钠 溶 液 倒 入 小 玻 杯, 提 起 玻 塞 使 其 缓 缓 流 入 反 应 室, 用 少 量 水 冲 洗 立 即 将 玻 塞 盖 坚, 并 加 水 于 小 玻 杯 以 防 漏 气, 开 启 螺 旋 夹 a, 关 闭 螺 旋 夹 b, 开 始 蒸 馏 通 入 蒸 汽 蒸 腾 10min 后, 移 动 接 收 瓶, 液 面 离 开 凝 管 下 端, 再 蒸 馏 2min 然 后 用 少 量 水 冲 洗 冷 凝 管 下 端 外 部, 取 下 三 角 瓶, 准 备 滴 定 3. 样 品 滴 定 : 以 0.01mol/L 盐 酸 标 准 溶 液 滴 定 至 灰 色 为 终 点 4. 数 据 记 录 项 目 第 一 次 第 二 次 第 三 次

46 样 品 消 化 液 5. 结 果 计 算 (V1 V 2) c X F 100 m 式 中 :X 样 品 蛋 白 质 含 量 (g/100g); V 1 样 品 滴 定 消 耗 盐 酸 标 准 溶 液 体 积 (ml); V 2 空 白 滴 定 消 耗 盐 酸 标 准 溶 液 体 积 (ml); c 盐 酸 标 准 滴 定 溶 液 浓 度 (mol/l); ml 盐 酸 [ c(hcl) 1.000mol/L] 标 准 滴 定 溶 液 相 当 的 氮 的 质 量 (g); m 样 品 的 质 量 (g); F 蛋 白 质 的 系 数 6. 注 意 事 项 及 说 明 (1) 本 法 也 适 用 于 半 固 体 试 样 以 及 液 体 样 品 检 测 半 固 体 试 样 一 般 取 样 范 围 为 2.00g~5.00g; 液 体 样 品 取 样 10.0mL~25.0mL( 约 相 当 氮 30mg~40mg) 若 检 测 液 体 样 品, 结 果 以 g/100ml 表 示 (2) 消 化 时, 若 样 品 含 糖 高 或 含 脂 及 较 多 时, 注 意 控 制 加 热 温 度, 以 免 大 量 泡 沫 喷 出 凯 氏 烧 瓶, 造 成 样 品 损 失 可 加 入 少 量 辛 醇 或 液 体 石 蜡, 或 硅 消 泡 剂 减 少 泡 沫 产 生 (3) 消 化 时 应 注 意 旋 转 凯 氏 烧 瓶, 将 附 在 瓶 壁 上 的 碳 粒 冲 下, 对 样 品 彻 底 消 化 若 样 品 不 易 消 化 至 澄 清 透 明, 可 将 凯 氏 烧 瓶 中 溶 液 冷 却, 加 入 数 滴 过 氧 化 氢 后, 再 继 续 加 热 消 化 至 完 全 (4) 硼 酸 吸 收 液 的 温 度 不 应 超 过 40, 否 则 氨 吸 收 减 弱, 造 成 检 测 结 果 偏 低 可 把 接 收 瓶 置 于 冷 水 浴 中 (ml) 滴 定 消 耗 盐 酸 标 准 溶 液 (ml) 滴 定 消 耗 盐 酸 标 准 溶 液 (ml) (5) 在 重 复 性 条 件 下 获 得 两 次 独 立 测 定 结 果 的 绝 对 差 值 不 得 超 过 算 术 平 均 值 的 10% 实 验 二 Folin 酚 试 剂 法 (Lowry 法 ) Folin Method 原 理 在 碱 性 条 件 下, 蛋 白 质 中 的 肽 键 与 铜 结 合 生 成 复 合 物 Folin 酚 试 剂 中 的 磷 钼 酸 盐 磷 钨 酸 盐 被 蛋 白 质 中 的 酪 氨 酸 和 苯 丙 氨 酸 残 基 还 原, 产 生 深 兰 色 ( 钼 兰 和 钨 兰 的 混 合 物 ) 酚 试 剂 法 是 最 灵 敏 的 方 法 之 一 此 法 可 检 测 的 最 低 蛋 白 质 量 达 5mg 通 常 测 定 范 围 是 20~250mg 试 剂 与 器 材

47 1. 试 剂 (1) 碱 性 铜 液 A 液 : 碳 酸 钠 2 克 溶 于 0.1N 的 氢 氧 化 钠 100 毫 升 B 液 : 硫 酸 铜 0.5 克 溶 于 10 毫 升 水 中, 再 称 取 酒 石 酸 钾 钠 2 克 溶 于 80 毫 升 水 中, 溶 后 将 两 液 混 合, 加 水 至 100 毫 升 待 用 时, 分 别 取 A 液 50 毫 升,B 液 1 毫 升 混 合 (2) 酚 试 剂 在 2 升 磨 口 回 流 瓶 中, 加 入 100 克 钨 酸 钠 ( Na 2 W 0 O 4 2H 2 O ), 25 克 钼 酸 钠 (Na 2 MoO 5 2H 2 O) 溶 于 700 毫 升 蒸 馏 水 中, 再 加 50 毫 升 85% 磷 酸,100 毫 升 浓 盐 酸, 充 分 混 合, 接 上 回 流 管, 以 小 火 回 流 10 小 时, 回 流 结 束 时, 加 入 150 克 硫 酸 锂 (Li 2 SO 4 H 2 O), 50 毫 升 蒸 馏 水 及 数 滴 液 体 溴, 开 口 继 续 沸 腾 15 分 钟, 以 便 驱 除 过 量 的 溴 冷 却 后 溶 液 呈 黄 色 或 金 黄 色 ( 如 仍 呈 绿 色, 须 再 重 复 滴 加 液 体 溴 的 步 骤 ), 稀 释 至 1 升, 过 滤, 滤 液 置 于 棕 色 试 剂 瓶 中 保 存 使 用 时 用 标 准 NaOH 滴 定, 酚 酞 作 指 示 剂, 然 后 适 当 稀 释, 约 加 水 1 倍, 使 最 终 的 酸 浓 度 为 1N 左 右 (3) 标 准 蛋 白 质 溶 液 用 标 准 的 结 晶 牛 血 清 清 蛋 白 (BSA) 或 标 准 酪 蛋 白, 配 制 成 10mg/ml 的 标 准 蛋 白 溶 液, 可 用 BSA 浓 度 1mg/ml 的 A280 为 0.66 来 校 正 其 纯 度 如 有 需 要 的 话, 标 准 蛋 白 质 还 可 预 先 用 微 量 凯 氏 定 氮 法 测 定 蛋 白 氮 含 量, 计 算 出 其 纯 度, 再 根 据 其 纯 度, 称 量 配 制 成 标 准 蛋 白 质 溶 液 牛 血 清 清 蛋 白 用 H 2 O 或 0.9%NaCl 配 制, 酪 蛋 白 用 0.05N NaOH 配 制 2. 器 材 可 见 光 分 光 光 度 计 旋 涡 混 合 器 秒 表 试 管 操 作 1. 标 准 曲 线 的 制 备 取 12 支 试 管 分 两 组, 按 下 列 表 加 入 试 剂 (ml) 管 号 % 标 准 BSA % NaCl 碱 性 铜 液 摇 匀, 放 置 20 分 钟 酚 试 剂 待 试 剂 加 完 后 充 分 混 匀, 放 置 30 分 钟, 以 未 加 蛋 白 质 溶 液 的 第 一 支 试 管 作 为 空 白 对 照 液 在 650nm 处 进 行 比 色 测 定, 记 录 光 密 度 值 取 两 组 测 定 的 平 均 值, 以 蛋 白 质 的 含 量 为 横 座 标, 光 吸 收 值 为 纵 座 标 绘 制 标 准 曲 线 2. 样 品 的 测 定

48 取 2~3 个 试 管, 用 上 述 同 样 的 方 法, 测 定 未 知 样 品 的 光 密 度 值, 然 后 在 标 准 曲 线 上 查 找 未 知 样 品 的 蛋 白 质 浓 度 注 意 1. 各 项 操 作 必 须 精 确 控 制 时 间 2. 样 品 浓 度 不 要 超 过 10mg/ml 实 验 三 双 缩 脲 法 (Biuret 法 ) Biuret Method 原 理 两 个 分 子 脲 经 180 左 右 加 热, 放 出 一 个 分 子 氨 后 得 到 的 产 物 在 强 碱 性 溶 液 中, 双 缩 脲 与 CuSO 4 形 成 紫 色 络 合 物, 称 为 双 缩 脲 反 应 凡 具 有 两 个 酰 胺 基 或 两 个 直 接 连 接 的 肽 键, 或 能 过 一 个 中 间 碳 原 子 相 连 的 肽 键, 这 类 化 合 物 都 有 双 缩 脲 反 应 紫 色 络 合 物 颜 色 的 深 浅 与 蛋 白 质 浓 度 成 正 比, 而 与 蛋 白 质 分 子 量 及 氨 基 酸 成 分 无 关, 故 可 用 来 测 定 蛋 白 质 含 量 测 定 范 围 为 1~10mg 蛋 白 质 试 剂 与 器 材 1. 试 剂 : (1) 标 准 蛋 白 质 溶 液 : 准 确 称 取 结 晶 的 牛 血 清 清 蛋 白 (BSA)0.7 克, 用 0.9%NaCl 溶 解 成 10ml, 其 浓 度 为 7% 用 时 新 配 (2) 双 缩 脲 试 剂 : 称 以 1.50 克 硫 酸 铜 (CuSO 4 5H 2 O) 和 6.0 克 酒 石 酸 钾 钠 (KNaC 4 H 4 O 6 4H 2 O), 用 500 毫 升 水 溶 解, 在 搅 拌 下 加 入 300 毫 升 10% NaOH 溶 液, 用 水 稀 释 到 1 升, 贮 存 于 塑 料 瓶 中 ( 或 内 壁 涂 以 石 蜡 的 瓶 中 ) 此 试 剂 可 长 期 保 存 若 贮 存 瓶 中 有 黑 色 沉 淀 出 现, 则 需 要 重 新 配 制 2. 器 材 : 可 见 光 分 光 光 度 计 试 管 旋 涡 混 合 器 等 操 作 取 3 支 干 净 试 管, 按 下 表 加 入 试 剂 : 管 号 1 2 3

49 标 准 血 清 待 测 血 清 % NaCl 双 缩 脲 试 剂 待 试 剂 加 完 后 混 匀, 放 置 30 分 钟, 然 后, 以 第 三 管 为 空 白, 用 520nm 波 长 比 色, 记 录 光 密 度 值 按 标 准 管 法 测 定 计 算 待 测 血 清 的 浓 度 注 : 本 法 操 作 简 单, 试 剂 稳 定 实 验 四 考 马 斯 亮 兰 法 (Bradford 法 ) Coomassie Method 原 理 考 马 斯 亮 兰 G-250 染 料, 在 酸 性 溶 液 中 与 蛋 白 质 结 合, 使 染 料 的 最 大 吸 收 峰 的 位 置, 由 465nm 变 为 595nm, 溶 液 的 颜 色 也 由 棕 黑 色 变 为 兰 色 染 料 主 要 是 与 蛋 白 质 中 的 碱 性 氨 基 酸 ( 特 别 是 精 氨 酸 ) 和 芳 香 族 氨 基 酸 残 基 相 结 合 在 595nm 下, 吸 光 度 值 与 蛋 白 质 浓 度 成 正 比 试 剂 与 器 材 1. 试 剂 (1) 标 准 蛋 白 质 溶 液 牛 血 清 清 蛋 白 (BSA), 用 0.9%NaCl 配 制 成 1.0mg/ml 和 0.1mg/ml 的 标 准 蛋 白 质 溶 液 (2) 考 马 斯 亮 兰 G-250 染 料 试 剂 称 100mg 考 马 斯 亮 兰 G-250, 溶 于 50ml 95% 的 乙 醇 后, 再 加 入 120ml 85% 的 磷 酸, 用 水 稀 释 至 1 升 2. 器 材 : (1) 可 见 光 分 光 光 度 计 (2) 旋 涡 混 合 器 (3) 试 管 操 作 1. 标 准 曲 线 的 制 备 : 取 12 支 试 管 分 两 组, 按 下 列 表 加 入 试 剂 (ml) 管 号 % 标 准 BSA

50 0.9% NaCl 染 料 待 试 剂 混 匀 后, 静 置 3 分 钟, 以 未 加 蛋 白 质 溶 液 的 第 一 支 试 管 作 为 空 白 对 照 液 在 595nm 处 进 行 比 色 测 定, 记 录 光 密 度 值 取 两 组 测 定 的 平 均 值, 以 蛋 白 质 的 含 量 为 横 座 标, 光 吸 收 值 为 纵 座 标 绘 制 标 准 曲 线 2. 样 品 的 测 定 取 2~3 个 试 管, 用 上 述 同 样 的 方 法, 测 定 未 知 样 品 的 光 密 度 值, 然 后 在 标 准 曲 线 上 查 找 未 知 样 品 的 蛋 白 质 浓 度 未 知 蛋 白 浓 度 (g/ml)= 稀 释 样 品 浓 度 稀 释 倍 数 注 意 1. 各 项 操 作 必 须 精 确 控 制 时 间 2. 样 品 蛋 白 含 量 应 在 10~100μg/ml 之 间 实 验 五 紫 外 吸 收 法 Ultraviolet Absorption Method 原 理 蛋 白 质 分 子 中, 酪 氨 酸 苯 丙 氨 酸 和 色 氨 酸 残 基 的 苯 环 含 有 共 轭 双 键, 使 蛋 白 质 具 有 吸 收 紫 外 光 的 性 质 吸 收 高 峰 在 280nm 处, 其 吸 光 度 ( 即 光 密 度 值 ) 与 蛋 白 质 含 量 成 正 比 可 作 为 蛋 白 质 的 定 量 测 定 试 剂 及 仪 器 1. 试 剂 (1) 标 准 蛋 白 质 溶 液 牛 血 清 清 蛋 白 (BSA), 用 0.9%NaCl 配 制 成 1.0mg/ml 和 0.1mg/ml 的 标 准 蛋 白 质 溶 液 (2)0.9%NaCl (3) 待 测 样 品 操 作 1. 标 准 曲 线 的 制 作 : 取 8 支 试 管, 按 下 表 加 入 试 剂 (ml) 管 号 % 标 准 BSA % NaCl 混 匀 后, 选 择 波 长, 用 1cm 石 英 皿, 以 第 一 支 试 管 作 为 空 白 对 照 液 记 录 各 管 光 密 度 值 以 蛋 白 质 的 含 量 为 横 座 标, 光 吸 收 值 为 纵 座 标 绘 制 标 准 曲 线 2. 样 品 的 测 定 取 2~3 个 试 管, 用 上 述 同 样 的 方 法, 测 定 未 知 样 品 的 光 密 度 值, 然 后 在 标 准 曲 线 上

51 查 找 未 知 样 品 的 蛋 白 质 浓 度 实 验 六 BCA 法 Bicinconinic Acid Method 原 理 Bicinconinic acid(bca) 法 是 近 来 广 为 应 用 的 蛋 白 定 量 方 法 其 原 理 与 Lowery 法 蛋 白 定 量 相 似, 即 在 碱 性 环 境 下 蛋 白 质 与 Cu 2+ 络 合 并 将 Cu 2+ 还 原 成 Cu + BCA 与 Cu + 结 合 形 成 稳 定 的 紫 蓝 色 复 合 物, 在 562 nm 有 高 的 光 吸 收 值 并 与 蛋 白 质 浓 度 成 正 比, 据 此 可 测 定 蛋 白 质 浓 度 试 剂 及 器 材 1. 试 剂 (1) 试 剂 A:1%BCA 二 钠 盐,2% 无 水 碳 酸 钠,0.16% 酒 石 酸 钠,0.4% 氢 氧 化 钠, 0.95% 碳 酸 氢 钠,H 混 合 调 ph 值 至 (2) 试 剂 B:4% 硫 酸 铜 (3)CA 工 作 液 : 试 剂 A 100ml + 试 剂 B 2ml 混 合 (4) 蛋 白 质 标 准 液 : 用 结 晶 牛 血 清 白 蛋 白 根 据 其 纯 度 用 生 理 盐 水 配 制 成 1.5mg/ml 的 蛋 白 质 2. 仪 器 (1)722 型 分 光 光 度 计 k9 U [0 (2) 恒 温 水 浴 箱 (3) 试 管 % S0 y 1 \) }9 v 操 作 1. 标 准 曲 线 的 绘 制 : 取 试 管 七 支 编 号, 按 下 表 操 作! 管 号 空 白 管 测 定 管 蛋 白 质 标 准 液 (μl) 双 蒸 水 (μl) 待 测 样 品 (μl) 100 BCA 工 作 液 (ml) 绘 制 标 准 曲 线 以 测 定 管 吸 光 度 值, 在 标 准 曲 线 上 查 找 出 待 测 血 清 中 蛋 白 质 浓 度 (g/l) 注 1. 操 作 简 单, 快 速,45 分 钟 内 完 成 测 定, 比 经 典 的 Lowary 法 快 4 倍 且 更 加 方 便 ; 2.BCA 试 剂 的 蛋 白 质 测 定 范 围 是 μg/ml, 微 量 BCA 测 定 范 围 在 μg/ml ;

52 二 酶 促 反 应 动 力 学 实 验 七 酶 的 特 异 性 激 动 剂 及 抑 制 剂 Specificity, Activator and inhibitor of Enzyme 原 理 酶 对 其 底 物 有 严 格 的 选 择 性, 即 酶 的 特 异 性 影 响 酶 作 用 的 因 素 很 多, 其 中 凡 能 降 低 酶 活 性 的 物 质 称 为 酶 的 抑 制 剂, 凡 能 增 强 酶 活 性 的 物 质 称 为 酶 的 激 动 剂 本 实 验 以 唾 液 淀 粉 酶 (1 ) 为 例, 于 淀 粉 液 和 蔗 糖 液 中, 各 加 唾 液 并 保 温 后, 检 查 它 们 是 否 被 水 解, 以 证 明 该 酶 的 特 异 性 因 为 淀 粉 和 蔗 糖 皆 无 还 原 性, 如 被 水 解 皆 可 产 生 还 原 性 糖, 所 以 可 利 用 糖 的 还 原 反 应 进 行 测 定 本 实 验 中 采 用 班 氏 定 性 反 应 另 外 使 各 管 淀 粉 和 唾 液 浓 度 以 及 温 度 作 用 时 间 等 条 件 皆 相 同, 只 是 分 别 加 氯 化 物 或 酮 盐 的 管 和 未 加 者 对 比 观 察 结 果, 判 定 它 们 对 此 酶 活 性 有 何 影 响 检 查 淀 粉 被 水 解 的 情 况, 可 用 还 原 反 应, 也 可 利 用 碘 反 应 因 为 对 碘 反 应, 淀 粉 呈 蓝 色, 而 其 水 解 产 物 大 分 子 糊 精 呈 紫 色 ( 紫 色 糊 精 ); 其 次 的 糊 精 呈 红 色 ( 红 色 糊 精 ); 至 于 小 分 子 糊 精 ( 无 色 糊 精 ) 及 麦 芽 糖 则 为 无 色 所 以 碘 瓜 的 色 调 可 反 映 淀 粉 被 水 解 的 程 度, 也 表 明 酶 活 性 的 大 小 试 剂 1.1% 淀 粉 液 : 可 溶 性 淀 粉 1g, 加 水 约 60ml, 徐 徐 加 热 煮 沸, 使 完 全 溶 解, 溶 液 变 成 透 明 后, 补 水 成 100ml, 混 匀 此 试 剂 不 耐 久, 但 保 存 于 冷 处, 数 日 内 溶 液 澄 清 未 出 现 混 浊 者 可 用 2.1% 氯 化 钠 液 3.0.2% 硫 酸 铜 液 4.1% 蔗 糖 液 : 需 要 较 纯 无 还 原 性 者 5. 稀 碘 液 : 碘 化 钾 0.4g 加 水 数 ml, 摇 动 促 使 溶 解 后, 再 加 碘 0.2g, 援 使 之 溶 解, 加 水 成 100ml, 混 匀 6. 班 氏 糖 定 性 试 剂 ( 见 实 验 二 十 ) 操 作 1. 采 唾 液 : 漱 口 后, 用 干 净 容 器 采 取 自 然 分 泌 的 唾 液 0.5~1ml, 加 蒸 馏 水 稀 释 10~20 倍, 混 匀 必 要 时 用 脱 脂 棉 过 滤 2. 取 中 试 管 5 支, 标 记 管 号, 分 别 加 液 如 下 表 : 管 号 试 剂 1 ( 2) 1% 淀 粉 液 1ml + H 2 O 5 滴 2 1% 淀 粉 液 1ml + H 2 O 5 滴

53 3 1% 淀 粉 液 1ml + 1%NaCl 5 滴 4 1% 淀 粉 液 1ml + 0.2%CuSO 4 5 滴 5 1% 蔗 糖 液 1ml + H 2 O 5 滴 3. 各 加 稀 释 的 唾 液 0.5ml, 充 分 混 匀 4. 立 即 用 乳 头 吸 管 由 第 1 管 取 出 1 滴 放 到 点 滴 盘 凹 内 ( 或 白 瓷 板 上 ), 加 稀 碘 液 1 滴, 混 匀, 观 察 其 所 呈 色 调 以 后 每 隔 一 定 时 间 (1 分 或 数 分 钟 ), 再 重 取 出 1 滴 做 碘 反 应 (3 ) 连 续 观 察 了 解 管 内 淀 粉 水 解 情 况, 到 已 成 红 色 时, 向 2~5 管 各 加 稀 碘 液 1~2 滴, 混 匀, 记 录 各 管 色 调 5. 向 2~5 管 各 加 班 氏 试 剂 2ml, 混 匀, 放 沸 水 浴 中 煮 沸 约 5 分 钟, 取 出 观 察 结 果 6. 分 别 把 3~5 管 与 2 管 结 果 进 行 对 比 分 析, 做 出 总 结 注 (1) 唾 液 淀 粉 酶 属 于 型 淀 粉 酶, 最 适 ph6.9, 氯 离 子 有 激 活 作 用 (2) 本 实 验 中 设 置 了 相 同 的 1 和 2 两 管 做 为 对 照 管 第 1 管 为 了 用 于 随 时 取 出 做 碘 反 应, 以 了 解 淀 粉 水 解 进 行 情 况 掌 握 此 管 达 到 尚 有 红 色 糊 精 存 在 的 程 度, 同 时 向 2~5 管 加 碘, 便 于 对 比 判 定 结 果 (3) 唾 液 含 酶 浓 度 生 理 变 动 较 大, 实 验 中 间 隔 时 间 要 根 据 具 体 情 况 灵 活 掌 握, 反 应 快 者, 要 抓 紧 时 机, 间 隔 要 小 ; 如 果 反 应 缓 慢, 则 需 要 间 隔 时 间 稍 长 些, 或 者 同 时 把 各 管 放 到 37~40 水 浴 中, 以 加 快 进 程 (4) 凡 关 于 酶 类 实 验 中, 要 特 别 注 意 器 材 的 干 净, 试 药 宜 较 纯, 避 免 有 抑 制 因 素 及 杂 质 干 扰 实 验 结 果 思 考 题 1. 为 什 么 要 在 对 照 管 呈 红 色 时, 向 各 管 加 碘? 2. 联 系 实 验 复 习 讨 论 酶 的 特 异 性 激 动 剂 及 抑 制 剂 抑 制 酶 活 性 的 因 素 主 要 有 哪 些? 实 验 八 ph 对 酶 活 性 的 影 响 Influence of ph on Enzyme Activity 原 理 一 定 条 件 下 酶 促 反 应 速 度 的 快 慢 代 表 着 酶 活 性 的 大 小 为 观 察 ph 对 酶 活 性 的 影 响, 可 使 各 管 除 ph 不 同 外, 其 他 条 件 ( 底 物 浓 度 酶 浓 度 温 度 作 用 时 间 等 ) 相 同, 测 定 底 物 的 减 少 量 或 产 物 的 生 成 量 进 行 对 比 判 定 唾 液 淀 粉 酶 催 化 淀 粉 水 解 产 生 麦 芽 糖 麦 芽 糖 的 测 定 可 利 用 其 还 原 性 本 实 验 中, 加 过 量 的 一 定 量 的 碘 和 适 量 的 碱 液, 则 一 部 分 碘 用 于 氧 化 麦 芽 糖 R-CHO + I 2 麦 芽 糖 + 2NaOH RCOOH + 2NaI + H 2 O 麦 芽 糖 酸

54 剩 余 的 碘 量, 可 用 硫 代 硫 酸 钠 滴 定 测 知 I 2 + 2Na 2 S 2 O 3 2NaI + Na 2 S 4 O 6 四 磺 酸 钠 滴 定 中 用 淀 粉 做 指 示 剂, 蓝 色 消 失 为 终 末 点 所 加 碘 与 剩 余 碘 量 的 差 值, 即 为 与 麦 芽 糖 反 应 的 碘 量, 此 值 大 小 代 表 着 麦 芽 糖 的 多 少, 也 反 映 着 酶 活 性 的 大 小 试 剂 1.1 % 淀 粉 液 2. 配 制 0.2mol/L KH 2 PO 4 缓 冲 液 及 0.2mol/L Na 2 HPO 4 缓 冲 液 适 量, 分 别 放 置 将 上 缓 冲 液 稀 释 3 倍 (0.067mol/L) 按 附 录 配 制 不 同 ph(4.9,6.9,8.7) 缓 冲 液 3.0.4N NaOH 液 4.1N H 2 SO 4 液 N 碘 液 (1)0.2N 碘 液 配 制 :KI 4.0g 溶 于 50ml 水 中, 加 碘 25.2g, 摇 溶 后, 补 水 成 1L 混 匀 放 置 过 夜 棕 色 瓶 暗 处 保 存 (2)0.01N 碘 液 配 制 : 取 (1) 液 稀 释 20 倍 后 用 标 定 过 的 0.01N Na 2 S 2 O 3 液 标 定 校 正, 放 棕 色 瓶 待 用, 最 好 现 用 现 配 N Na 2 S 2 O 3 液 : 配 成 约 0.1N 液 保 存, 用 碘 酸 钾 标 定, 用 时 准 确 稀 释 成 0.01N Na 2 S 2 O 3 液 (1) (1)0.1N Na 2 S 2 O 3 液 的 配 制 :Na 2 S 2 O 3 5H 2 O 25g, 加 无 CO 2 水 溶 成 约 1L, 此 液 约 为 0.1N, 需 要 标 定 (2)0.1N Na 2 S 2 O 3 液 标 定 法 : 取 0.10N KIO 3 液 (3.567g/L ( 2) )10.0ml, 或 精 确 称 取 KIO g, 加 水 约 10ml 溶 解 之 再 加 10%KI 15ml, 混 匀, 加 盖, 放 置 3 分 钟 以 上, 加 水 稀 释 成 约 100ml, 然 后 用 约 0.1N Na 2 S 2 O 3 液 滴 定 到 碘 色 很 浅 时, 加 1% 淀 粉 液 1ml, 继 续 滴 至 蓝 色 恰 已 消 失,1~2 分 钟 内 不 再 显 色 为 终 末 点 计 算 出 确 切 的 当 量 浓 度, 或 调 整 成 为 0.10N 液 (3)0.01N Na 2 S 2 O 3 液 : 把 0.10N Na 2 S 2 O 3 液 用 无 CO 2 水 准 确 稀 释 10 倍 即 可 如 果 原 液 不 是 0.10N 而 是 N 时, 也 可 如 下 法 稀 释 : 即 先 取 此 液 10.0ml, 加 水 稀 释 成 100.0ml, 然 后 再 补 加 水 1.2ml, 混 匀 即 可 操 作 1. 采 唾 液 : 漱 口, 采 集 自 然 分 泌 的 唾 液, 用 蒸 馏 水 稀 释 10~20 倍, 混 匀, 用 小 漏 斗 通 过 脱 脂 棉 过 滤 2. 取 4 支 试 管, 标 记 管 号, 各 加 液 如 下 表, 混 匀, 放 37~40 水 浴 中 数 分 钟 管 号 稀 释 唾 液 缓 冲 液 ml ph ml ml ph ml ml ph ml

55 4 0.25ml ph ml 3. 按 管 号 顺 序, 间 隔 一 定 时 间 ( 例 如 1 分 钟 ) 逐 次 各 加 预 先 温 浴 过 的 1% 淀 粉 液 1.0ml, 每 加 完 1 管 立 即 摇 匀 并 放 回 水 浴 中, 计 时 4. 由 第 一 管 隔 一 定 时 间 取 出 1 滴 做 碘 反 应 ( 要 领 同 实 验 七 操 作 4), 连 续 观 察 水 解 进 程, 到 红 色 刚 变 浅 时, 按 原 顺 序 和 时 间 间 隔 准 时 取 出 各 管, 每 取 出 1 管 立 即 加 入 0.4N NaOH 液 0.5ml, 混 匀 5. 向 2~4 管 各 加 0.01N 碘 液 1.0ml, 混 匀, 室 温 放 置 约 5 分 钟 6. 每 管 在 滴 定 前 加 1N H 2 SO 4 液 0.5ml, 轻 摇 混 匀, 放 置 约 1 分 钟 以 后, 用 0.01N Na 2 S 2 O 3 液 进 行 滴 定, 颜 色 较 浅 时, 可 再 加 淀 粉 液 1 滴, 混 匀, 细 心 地 继 续 滴 定 每 加 1 滴 或 半 滴 后, 要 切 实 混 匀, 切 勿 滴 过, 到 蓝 色 恰 已 消 失 为 止, 记 录 消 耗 ml 数 7. 计 算 2~4 管 原 加 碘 量 与 剩 余 碘 量 ( 可 用 相 当 于 0.01N Na 2 S 2 O 3 液 的 ml 数 表 示 ) 的 差 值 对 比 分 析 结 果 可 以 此 差 值 为 纵 座 标, 以 ph 值 为 横 座 标, 作 图, 便 于 对 比 分 析 注 (1) 普 通 蒸 馏 水 中 溶 有 较 多 的 CO 2, 可 与 Na 2 S 2 O 3 发 生 下 列 反 应, 影 响 本 试 剂 的 氧 化 还 原 当 量 浓 度 2H 2 CO 2 + Na 2 S 2 O 3 = 2NaHCO 3 + H 2 S 2 O 3 H 2 S 2 O 3 = H 2 SO 3 + S 1 分 子 Na 2 S 2 O 3 可 生 出 1 分 子 H 2 SO 3, 而 H 2 S 2 O 3 更 多 消 耗 碘 故 应 用 无 CO 2 水 配 制 本 试 剂 H 2 SO 3 + I 2 + H 2 O = 2HI + H 2 SO 4 2Na 2 S 2 O 3 + I 2 = Na 2 S 4 O 6 + 2NaI 无 CO 2 水 : 可 把 蒸 馏 水 加 热 煮 沸 15~30 分 钟 驱 除 CO 2 后, 使 迅 速 冷 却, 即 时 使 用 放 置 过 程 中 可 由 空 气 溶 入 CO 2, 为 防 止 吸 CO 2 可 使 用 插 有 碱 石 灰 (Sodalime) 管 的 瓶 塞 如 果 使 用 稍 含 CO 2 的 蒸 馏 水 配 制 时, 需 要 盛 在 棕 色 瓶 中 放 置 一 周, 以 待 其 力 价 稳 定 后, 取 其 上 清 再 标 定 后 使 用 (2)KIO 3 的 氧 化 还 原 当 量 : KIO 3 + 5KI + 6HCl = 6KCl + 3H 2 O + 3I 2 KIO 3 分 子 量 为 214.0, 其 克 当 量 为 214.0/6=35.67g 思 考 题 1. 本 实 验 中 第 1 管 起 什 么 作 用? 为 什 么 要 在 它 刚 到 浅 红 时 停 止 各 管 反 应? 2. 为 什 么 要 控 制 各 管 的 温 度 和 时 间 相 同, 在 实 验 中 具 体 是 怎 样 掌 握 的? 3. 为 什 么 要 加 1NH 2 SO 4 液? 加 它 前 后 试 管 内 部 发 生 了 什 么 变 化? 要 注 意 什 么 问 题? 实 验 九 底 物 浓 度 对 酶 活 性 的 影 响 碱 性 磷 酸 酶 Km 值 的 测 定 Influence of Substrate Concentration on Enzyme Activity

56 原 理 当 环 境 温 度 ph 和 酶 浓 度 等 条 件 一 定 时, 底 物 浓 度 对 酶 促 反 应 速 度 作 图 为 矩 形 双 曲 线 当 V=1/2 Vm 时 的 底 物 浓 度 即 为 Km( 见 左 下 图 ) 但 是 在 一 般 情 况 下, 根 据 实 验 结 果 绘 制 成 的 上 述 矩 形 双 曲 线, 难 以 精 确 求 得 Km 值 林 一 贝 (Lineweaver Burk) 氏 作 图 法 取 米 氏 方 程 的 倒 数 式 1 K = m V V m [S] Vm 以 1/V 对 1/[S] 作 图 得 一 直 线, 即 可 方 便 而 准 确 地 求 得 Km 值 和 Vm 直 线 斜 率 =Km/Vm, 直 线 在 横 轴 上 的 截 矩 为 -1/Km, 在 纵 轴 上 的 截 矩 为 1/Vm( 见 右 下 图 ) 本 实 验 以 碱 性 磷 酸 酶 为 例, 采 用 磷 酸 苯 二 钠 法 测 定 碱 性 磷 酸 酶 (AKP) 的 活 性 磷 酸 苯 二 钠 被 AKP 水 解 后, 生 成 游 离 酚 和 磷 酸, 酚 在 碱 性 溶 液 中 与 4- 氨 基 安 替 比 林 作 用, 经 铁 氰 化 钾 氧 化 生 成 红 色 的 醌 类 衍 生 物, 红 色 的 深 浅 可 反 应 酶 活 力 的 高 低 测 定 不 同 底 物 浓 度 对 酶 活 性 的 影 响, 按 双 倒 数 方 程 式 作 图, 计 算 碱 性 磷 酸 酶 的 Km 值 O O P ONa + H 2 O OH + Na2 HPO 4 ONa C 6 H 5 C 6 H 5 OH + CH 3 N N C O K 3 Fe(CN) 6 CH 3 N N C O CH 3 C C NH 2 CH 3 C C N O O 4- 试 剂

57 1.0.01mol/L 底 物 液 ( 可 使 用 一 周 ): 磷 酸 苯 二 钠.2H 2 O 1.27g 加 水 至 500ml, 棕 色 瓶 保 存 2.0.1mol/L 碳 酸 盐 (Na 2 CO 3 -NaHCO 3 ) 缓 冲 液,pH10.0(37 ):Na 2 CO g, NaHCO g 溶 于 适 量 蒸 馏 水 中 并 定 容 至 1000ml 3. 酶 液 : 称 纯 制 AKP 2mg, 用 ph 8.8Tris 缓 冲 液 配 成 50ml, 冰 箱 保 存 4.pH8.8 Tris 缓 冲 液 :Tris 1.21g, 醋 酸 镁 2.15g( 醋 酸 镁.4H 2 O), 加 水 约 800ml 溶 解 后 用 1% 醋 酸 调 节 至 ph8.8, 定 容 至 1000ml, 冰 箱 保 存 5. 酚 标 准 液 (0.1mg/ml) (1) 称 取 重 结 晶 ( 或 AR) 酚 1.5g, 溶 于 0.1N 盐 酸 至 1000ml, 为 储 存 液 (2) 标 定 : 取 25ml 储 存 液, 加 50ml0.1N NaOH, 于 碘 量 瓶 中 加 热 至 65, 再 加 入 0.1mol/L 碘 液 25ml, 加 盖 放 置 30 分 钟 后 加 入 浓 盐 酸 5ml, 再 加 入 0.1% 淀 粉 液 ( 新 配 ) 作 为 指 示 剂, 用 0.1mol/L 标 准 硫 代 硫 酸 钠 液 滴 定 滴 定 反 应 如 下 : 3I 2 + C 6 H 5 OH C 6 H 2 I 3 (OH) + 3HI I 2 + 2Na 2 S 2 O 3 2NaI + Na 2 S 4 O 6 根 据 反 应,3 分 子 碘 (M.W 254) 与 1 分 子 酚 (M.W 94) 起 作 用, 因 此 每 毫 升 0.1N 碘 溶 液 ( 含 碘 12.7mg) 相 当 于 酚 的 毫 克 数 应 为 : 设 25ml 0.1mol/L 碘 液 与 25ml 酚 液 作 用 后 剩 余 的 碘 消 耗 0.1mol/L 硫 代 硫 酸 钠 液 X 毫 升, 则 25ml 酚 溶 液 中 所 含 的 酚 量 为 :(25-X) 1.567mg (3) 使 用 时 用 蒸 馏 水 稀 释 至 0.1mg/ml, 即 为 酚 标 准 应 用 液 6. 碱 性 溶 液 :NaOH 4g,NaHCO 3 8.4g, 用 适 量 蒸 馏 水 溶 解 后 定 容 至 1000ml 7.0.3% 4- 氨 基 安 替 比 林 : 称 取 3g 4- 氨 基 安 替 比 林, 溶 于 1000ml 蒸 馏 水 中, 棕 色 瓶 保 存 8.0.5% 铁 氰 化 钾 : 称 取 5g 铁 氰 化 钾 用 适 量 蒸 馏 水 溶 解 后 定 容 至 1000ml, 棕 色 瓶 保 存 操 作 1. 测 定 不 同 底 物 浓 度 下 的 酶 活 性 (1) 取 干 净 试 管 10 支, 编 号, 按 下 表 操 作 : 管 号 M 底 物 液 M 碳 酸 盐 缓 冲 液 蒸 馏 水 水 浴 5 分 钟 酶 液

58 酚 标 准 液 0.1mg/ml 底 物 浓 度 mm/l 各 管 加 入 酶 液 后 立 即 混 匀 计 时,37 水 浴 保 温 15 分 钟 从 加 入 酶 液 起 计 时 至 下 一 步 加 入 碱 性 溶 液 停 止 反 应, 各 管 反 应 时 间 应 准 确 一 致 (2) 保 温 结 束 后 立 即 加 入 碱 性 溶 液 1.0ml 以 终 止 反 应 (3) 各 管 中 再 分 别 加 入 0.3% 4 氨 基 安 替 比 林 1.0ml 及 0.5% 铁 氰 化 钾 2.0ml, 充 分 混 匀, 室 温 放 置 10 分 钟, 以 第 7 管 为 空 白 管, 在 波 长 510nm 处 比 色, 读 取 各 管 光 密 度 值 2. 作 图 (1) 计 算 酶 活 性 单 位 :37 保 温 15 分 钟 产 生 1mg 酚 为 1 个 酶 活 性 单 位, 故 : OD 1 15 = OD 0.1 (2) 以 酶 活 性 单 位 代 表 各 管 中 该 酶 的 反 应 速 度 (V) 为 纵 坐 标, 以 底 物 浓 度 [S] 为 横 坐 标 作 图, 观 察 曲 线 的 形 状 (3) 以 酶 活 性 单 位 ( 反 应 速 度 V) 的 倒 数 1/V 为 纵 坐 标, 以 底 物 浓 度 [S] 的 倒 数 1/[S] 为 横 坐 标, 在 坐 标 纸 上 描 点 并 连 接 成 线, 求 出 该 酶 的 Km 值 实 验 十 抑 制 剂 对 酶 活 性 的 影 响 Effect of Inhibitor on Enzyme Activity 原 理 凡 能 使 酶 的 活 性 下 降 而 不 引 起 酶 蛋 白 变 性 的 物 质 称 为 酶 的 抑 制 剂 抑 制 剂 对 酶 的 抑 制 作 用 大 致 分 为 可 逆 性 抑 制 和 不 可 逆 性 抑 制 两 大 类 可 逆 性 抑 制 又 分 为 竞 争 性 抑 制 和 非 竞 争 性 抑 制 等 竞 争 性 抑 制 剂 一 般 是 与 酶 的 底 物 的 化 学 结 构 相 似 的 物 质, 可 与 酶 的 活 性 中 心 结 合, 从 而 使 酶 与 其 底 物 结 合 的 比 例 减 少, 降 低 酶 促 反 应 速 度, 当 加 大 底 物 浓 度 时, 可 逆 转 其 抑 制 在 有 竞 争 性 抑 制 剂 存 在 时, 以 1/V 对 1/[s] 作 图 可 得 左 下 图 在 有 非 竞 争 性 抑 制 剂 存 在 时, 以 1/V 对 1/[s] 作 图 可 得 右 下 图

59 从 图 可 见, 竞 争 性 抑 制 剂 的 作 用 特 点 是 使 酶 的 Km 值 增 大, 但 对 酶 促 反 应 的 最 大 速 度 Vm 无 影 响 而 非 竞 争 性 抑 制 剂 的 作 用 特 点 是 使 酶 的 Vm 变 小,Km 值 不 变 本 实 验 观 察 无 机 磷 酸 盐 对 碱 性 磷 酸 酶 的 抑 制 作 用 试 剂 mol/L Na 2 HPO 4 :Na 2 HPO 4.12H 2 O 7.16g 加 水 至 500ml 2. 其 余 试 剂 同 前 操 作 1. 测 定 不 同 底 物 浓 度 下 的 酶 活 性 (1) 取 干 净 试 管 10 支, 编 号, 按 下 表 正 确 操 作 : 管 号 M 底 物 液 mol/L Na 2 HPO M 碳 酸 盐 缓 冲 液 蒸 馏 水 水 浴 5 分 钟 酶 液 酚 标 准 液 0.1mg/ml 0.1 底 物 浓 度 mm/l 各 管 加 入 酶 液 后 立 即 混 匀 计 时,37 水 浴 保 温 15 分 钟 从 加 入 酶 液 起 计 时 至 下 一 步 加 入 碱 性 溶 液 停 止 反 应, 各 管 反 应 时 间 应 准 确 一 致 (2) 保 温 结 束 后 立 即 加 入 碱 性 溶 液 1.0ml 以 终 止 反 应 (3) 各 管 中 再 分 别 加 入 0.3% 4- 氨 基 安 替 比 林 1.0ml 及 0.5% 铁 氰 化 钾 2.0ml, 充 分 混 匀, 室 温 放 置 10 分 钟, 以 第 7 管 为 空 白 管, 在 波 长 510nm 处 比 色, 读 取 各 管 光 密

60 度 值 2. 作 图 (1) 计 算 酶 活 性 单 位 (2) 按 双 倒 数 方 程 式 作 图, 计 算 碱 性 磷 酸 酶 的 Km 值 和 Vm, 与 无 抑 制 剂 存 在 时 的 Km 值 和 Vm 相 比 较, 判 断 该 抑 制 剂 属 于 何 种 类 型 实 验 十 一 温 度 对 酶 促 反 应 速 度 的 影 响 Effect of Temperature on the Velocity of Enzyme Reactions 原 理 本 实 验 观 察 温 度 对 酶 促 反 应 速 度 的 影 响, 除 温 度 不 同 外, 其 他 条 件 ( 底 物 浓 度, 酶 浓 度 ph 等 ) 相 同, 测 定 磷 酸 苯 二 钠 在 碱 性 磷 酸 酶 催 化 下 所 生 成 的 酚 量, 以 反 映 酶 促 反 应 速 度 的 大 小 试 剂 1.0.1mol/L 碳 酸 盐 缓 冲 液,pH10(37 ): 取 无 水 碳 酸 钠 6.63g, 碳 酸 氢 钠 3.36g, 加 水 溶 解 并 稀 释 至 1000ml 2. 其 他 试 剂 同 前 面 实 验 操 作 1. 取 试 管 6 支, 编 号, 按 下 表 操 作 : 管 号 试 剂 0.1mol/L ph10 碳 酸 盐 缓 冲 液 (ml) mol/L 磷 酸 苯 二 钠 (ml) 预 温 温 度 时 间 5 分 钟 冰 水 室 温 酶 液 (ml) ph8.8tris 缓 冲 液 0.1 混 匀 后 置 各 温 度 保 温 15 分 钟 冰 水 室 温 2. 各 管 保 温 结 束 后, 立 即 加 入 碱 性 溶 液 1.0ml, 以 终 止 反 应 3. 各 管 再 分 别 加 入 0.3%4- 氨 基 安 替 比 林 1.0ml,0.5% 铁 氰 化 钾 2.0ml, 充 分 混 匀, 室 温 放 置 10 分 钟, 以 第 6 管 为 空 白 调 零 点, 于 510nm 波 长 处 比 色, 测 定 各 管 光 密 度 值 4. 用 各 光 密 度 值 在 标 准 曲 线 上 查 得 释 出 的 酚 量 ( 酚 标 准 曲 线 的 绘 制 见 实 验 十 二 ), 计 算 各 管 酶 活 性, 并 以 其 为 纵 座 标, 以 各 管 温 度 为 横 座 标, 绘 出 曲 线, 求 在 该 实 验 条 件 下, 碱 性 磷 酸 酶 的 最 适 温 度 实 验 十 二 酚 标 准 曲 线 的 绘 制

61 Construction of Phenol Standard Curve 原 理 配 制 一 系 列 已 知 浓 度 的 酚 溶 液, 用 上 述 方 法 呈 色 后, 测 定 各 个 光 密 度 值 以 光 密 度 值 为 纵 座 标, 酚 含 量 为 横 座 标, 绘 制 曲 线, 即 为 酚 的 标 准 曲 线 试 剂 1. 标 准 酚 溶 液 : 将 结 晶 酚 减 压 蒸 馏 制 备 高 纯 度 的 结 晶 酚, 称 取 100mg, 加 水 溶 解 并 稀 释 至 1000ml, 制 成 0.1mg/ml 的 标 准 酚 溶 液 2. 碱 性 溶 液 : 取 0.5N NaOH 及 0.5mol/L NaHCO 3 各 20ml, 混 合 后 加 水 至 100ml 3.0.3%4- 氨 基 安 替 比 林 溶 液 : 称 取 3g 4- 氨 基 安 替 比 林, 溶 解 并 稀 释 至 1000ml 于 棕 色 瓶 中 冰 箱 内 保 存 4.0.5% 铁 氰 化 钾 溶 液 : 称 取 5g 铁 氰 化 钾 和 15g 硼 酸, 各 溶 成 400ml 后 混 合, 稀 释 至 1000ml 于 棕 色 瓶 中 暗 处 保 存 操 作 1. 取 试 管 6 支, 编 号, 按 下 表 操 作 : 管 号 试 剂 标 准 酚 溶 液 (ml) 蒸 馏 水 (ml) 在 37 水 浴 中 保 温 5 分 钟 3. 各 管 内 分 别 加 入 碱 性 溶 液 1.0ml,0.3%4- 氨 基 安 替 比 林 1.0ml,0.5% 铁 氰 化 钾 2.0ml 4. 混 匀 后 室 温 放 置 10 分 钟, 以 第 1 管 调 零 点,510nm 波 长 比 色, 以 光 密 度 值 为 纵 座 标, 以 各 管 酚 含 量 ( 分 别 为 g) 为 横 座 标, 绘 制 标 准 曲 线 5. 将 实 验 测 得 的 光 密 度 值, 从 标 准 曲 线 上 查 得 生 成 的 酚 量 ( g), 即 表 示 酶 活 性 的 大 小 本 实 验 规 定, 在 37 下 保 温 15 分 钟, 产 生 1mg 酚 量 者 为 1 个 酶 活 性 单 位 100ml = ( μg) = ( mg) 实 验 十 三 尿 淀 粉 酶 活 性 测 定 ( 温 氏 法 ) Estimation of Urinary Amylase Activity 原 理 用 逐 次 稀 释 法 做 成 不 同 稀 释 度 的 尿 液, 加 等 量 的 淀 粉 液 保 温 分 钟, 然 后, 加 碘 液, 根 据 淀 粉 的 碘 反 应 结 果 ( 有 淀 粉 呈 蓝 色, 淀 粉 被 分 解 则 为 紫 红 或 无 色 ) 找 出 淀 粉 已 被 完 全 水 解 的 尿 的 稀 释 度 最 大 的 检 品 管, 由 它 计 算 出 尿 中 酶 活 性 单 位 (1 )

62 本 实 验 法 中 淀 粉 酶 活 性 的 表 示 方 法 是, 测 定 液 1ml 中 所 含 酶 在 分 钟 内, 能 分 解 0.1% 淀 粉 液 1ml 时 为 1 单 位 试 剂 1. 生 理 盐 水 2.0.1% 淀 粉 液 : 可 溶 性 淀 粉 0.1g, 加 少 量 水 混 匀, 再 加 热 水 约 60ml, 混 匀, 煮 沸 片 刻, 使 成 澄 清 透 明, 放 冷, 补 水 成 100ml, 混 匀 3. 碘 液 : 碘 化 钾 0.3g, 溶 于 数 ml 水 中, 再 加 碘 0.1g 摇 动 使 之 溶 解 后, 再 加 水 成 30ml, 混 匀 放 棕 色 瓶 中 操 作 1. 试 管 10 支, 标 号 各 加 生 理 盐 水 0.5ml 2. 用 刻 度 到 头 的 1ml ( 2) 刻 度 吸 管 吸 取 尿 液 0.5ml, 加 到 第 1 管 中, 然 后 把 该 管 液 体 (3) 吸 入 再 吹 出, 反 复 2~3 次, 以 使 之 混 匀 然 后 准 确 吸 取 0.5ml 移 加 到 第 2 管 中, 用 同 样 方 法 混 匀 3. 用 同 一 吸 管 以 同 样 方 法 逐 管 向 下 稀 释 如 此 继 续 到 第 9 管, 混 匀 后 由 之 吸 出 1ml 弃 去 第 10 管 仍 为 盐 水, 为 对 照 用 4. 准 备 好 45 水 浴 5. 由 第 10 管 开 始 顺 次 向 前, 各 加 0.1% 淀 粉 液 0.1ml 立 即 把 各 管 内 充 分 混 匀, 同 时 放 到 45 水 浴 中, 记 时 6. 保 温 15 分 钟, 准 时 取 出, 立 即 浸 冷 水 中 使 之 冷 却 7. 各 加 碘 液 1 滴, 混 匀 观 察 各 管 色 调 8. 判 定 结 果 : 找 出 不 显 蓝 色 ( 即 已 无 淀 粉 ) 的 稀 释 度 最 大 的 管, 以 该 管 的 尿 液 鯬 倍 数 乘 2 即 为 所 测 尿 液 的 淀 粉 酶 活 性 单 位 数 意 义 (4) 1. 正 常 尿 中 含 有 少 量 淀 粉 酶 本 实 验 主 要 用 于 急 性 胰 腺 炎 的 辅 助 诊 断, 采 用 临 时 一 次 尿 样 进 行 测 定 正 常 范 围 是 8~64 单 位 2. 急 性 胰 腺 炎 时 显 著 升 高 总 胆 管 或 胰 管 阻 塞 胰 腺 外 伤 腮 腺 炎 等 也 升 高 严 重 肾 功 障 碍 时 可 减 低 注 (1) 淀 粉 酶 活 性 测 定 尚 有 多 种 新 法, 但 本 法 简 单, 容 易 掌 握, 也 适 用 于 测 定 血 清 等 淀 粉 酶 活 性, 正 常 血 清 淀 粉 酶 活 性 为 8~32 单 位 注 意 因 测 定 方 法 不 同, 酶 活 性 单 位 的 表 示 方 法 也 不 同 临 床 上 也 把 淀 粉 酶 活 性 单 位 称 为 淀 粉 酶 指 数 淀 粉 酶 活 性 单 位 也 常 用 符 号 d 表 示, 并 附 记 实 验 条 件 ( 温 度 和 保 温 时 间 ), 如 d 45 /15 =32 淀 粉 酶 的 英 文 名 为 Amylase 或 Diatase,d 为 后 者 字 头 (2) 也 可 用 刻 度 到 头 的 2ml 刻 度 吸 管, 用 其 下 段 (3) 每 管 吹 吸 过 程 中, 不 仅 使 试 管 内 液 体 混 匀, 也 要 注 意 把 吸 管 内 壁 所 附 液 体 洗 下, 不 要 使 吸 管 上 部 管 壁 留 下 一 些 液 体 隔 几 个 管 后 才 被 洗 下, 而 造 成 误 差 如 果 是 用 口 吹 吸 时, 注 意 切 不 可 有 唾 液 流 进 吸 管 内 (4) 体 液 中 的 淀 粉 酶 主 要 来 自 胰 腺 及 唾 液 腺, 为 型, 分 子 量 约 , 可 通 过 肾

63 脏 滤 出 思 考 题 1. 本 实 验 操 作 1 中 为 什 么 用 生 理 盐 水? 可 否 用 蒸 馏 水 代 替? 2. 本 实 验 操 作 5 中 为 什 么 采 取 的 顺 序 不 是 从 第 1 管 开 始, 而 是 从 第 10 管 开 始 由 后 向 前? 三 生 物 氧 化 实 验 十 四 乳 酸 脱 氢 酶 及 辅 酶 Ⅰ Lactate Dehydrogenase and CoenzymeⅠ 原 理 乳 酸 脱 氢 酶 由 其 酶 蛋 白 和 辅 酶 Ⅰ 组 成 两 者 单 独 存 在 时, 无 催 化 活 性, 必 须 共 同 存 在 组 成 全 酶 才 起 作 用 辅 酶 Ⅰ(CoⅠ) 也 叫 做 尼 克 酰 胺 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸 (NAD) 乳 酸 脱 氢 酶 在 各 种 组 织 细 胞 广 泛 存 在, 它 可 逆 地 催 化 乳 酸 脱 氢 成 为 丙 酮 酸 或 丙 酮 酸 接 受 氢 生 成 乳 酸, 在 代 谢 中 有 重 要 意 义 反 应 中 辅 酶 起 传 递 作 用 乳 酸 脱 氢 酶 属 于 不 需 氧 脱 氢 酶, 不 能 直 接 递 氢 给 氧, 反 应 中 间 生 成 的 还 原 型 辅 酶 Ⅰ 可 与 其 他 酶 蛋 白 结 合, 进 而 供 氢 给 其 他 代 谢 物, 也 可 递 氢 给 黄 酶 递 氢 体, 相 继 在 细 胞 色 素 体 系 作 用 下 传 递 给 氢, 与 此 过 程 中 同 时 发 生 氧 化 磷 酸 化 生 成 ATP 供 能, 这 种 由 辅 酶 Ⅰ 或 辅 酶 Ⅰ 连 接 的 经 黄 酶 细 胞 色 素 体 系 递 氢 给 氧 的 过 程 是 体 内 生 物 氧 化 中 最 重 要 的 一 种 类 型 本 试 验 以 乳 酸 脱 氢 酶 为 例 进 行 观 察, 以 加 深 了 解 本 试 验 以 乳 酸 为 基 质 酶 制 剂 用 新 鲜 的 动 物 肌 肉 的 粗 提 取 液, 分 别 制 成 酶 蛋 白 部 分 ( 用 白 陶 土 吸 附 除 去 辅 酶 Ⅰ) 和 辅 酶 部 分 ( 加 热 破 坏 酶 蛋 白 ), 以 观 察 两 者 单 独 作 用 及 其 共 同 作 用 作 为 受 氢 体, 实 验 中 为 便 于 观 察 利 用 了 甲 烯 兰 ( 即 美 兰 ) 已 知 甲 烯 兰 能 由 还 原 型 黄 酶 接 受 氢 而 由 蓝 色 变 为 无 色 所 以, 在 本 实 验 中 可 根 据 溶 液 蓝 色 的 消 退 判 断 乳 酸 脱 氢 反 应 的 发 生 I 2H ( ) I 2H ( ) 因 甲 烯 白 容 易 被 空 气 氧 化 又 成 为 甲 烯 兰, 所 以 实 验 后 段 即 保 温 及 观 察 退 色 时 不 宜 振 荡 又 实 验 中 加 氰 化 物 以 固 定 反 应 所 生 成 丙 酮 酸 时 不 发 生 逆 反 应, 促 使 反 应 正 向 进 行, 以 利 观 察 N N +2H Cl - 2H (H 3 C) 2 N S N(CH 3 ) 2 (H 3 C) 2 N S N(CH 3 ) 2 + HCl

64 材 料 及 试 剂 1. 玻 璃 砂 : 充 分 洗 净 2.0.9% NaCl 液 3. 白 陶 土 : 用 于 吸 附 除 去 肌 肉 提 取 液 中 的 辅 酶 Ⅰ 4. 除 去 辅 酶 Ⅰ 的 肌 肉 提 取 液 : 新 鲜 动 物 肌 肉 ( 如 蛙 肌 ) 约 2.5g, 剪 碎 放 乳 钵 中 加 玻 璃 砂 约 0.5 g, 再 加 白 陶 土 0.5 g 及 0.9% NaCl 3ml, 研 细 成 粥 状 再 用 0.9% NaCl 3ml 把 钵 体 内 容 洗 入 离 心 管 中,1500~2000rmp 离 心 5 分 钟, 倾 上 清 于 另 一 试 管 中 备 用 此 液 最 好 在 低 温 下 迅 速 制 备, 即 时 使 用 此 肌 肉 提 取 液 中 含 有 脱 氢 酶 的 酶 蛋 白, 但 无 辅 酶, 另 外 还 含 有 各 种 黄 酶 及 其 他 酶 类 5. 辅 酶 Ⅰ 提 取 液 : 新 鲜 蛙 肌 5g 剪 碎, 加 到 沸 腾 的 8ml H 2 O 中, 继 续 煮 沸 约 5 分 钟, 此 过 程 可 盖 以 小 漏 斗 防 止 水 分 过 分 蒸 发, 稍 冷 后 倾 入 乳 钵 中 研 细, 移 入 离 心 管 中 离 心 5 分 钟, 取 上 清 备 用 6.0.5%KCN 液 有 剧 毒! 注 意 使 用 及 管 理 7.5% 乳 酸 钠 液 : 无 乳 酸 钠 时 也 可 用 乳 酸 制 备 即 取 纯 乳 酸 5ml, 加 水 约 70ml, 加 10N NaOH 调 到 ph7, 再 加 水 到 100ml % 甲 烯 兰 ( 又 名 美 兰 或 亚 甲 兰 ) 液 操 作 1. 分 别 制 备 酶 蛋 白 及 辅 酶 提 取 液 ( 见 上 述 试 剂 第 4 5 项 ) 2. 取 中 试 管 四 支, 标 清 管 号, 分 别 加 液 如 表 ( 加 液 量 为 滴 数, 都 用 10 滴 或 0.5ml) 3. 充 分 混 匀 后, 不 再 振 荡, 静 置 试 管 架 上, 或 同 时 放 到 37~40 水 浴 中, 随 时 对 比 观 察 并 记 录 退 色 情 况, 分 析 其 结 果 试 管 号 % 乳 酸 钠 液 酶 蛋 白 提 取 液 辅 酶 Ⅰ 提 取 液 蒸 馏 水 %KCN % 甲 烯 兰 液 注 乳 酸 脱 氢 酶 生 成 的 丙 酮 酸 与 KCN 结 合, 而 不 发 生 其 逆 反 应 CH 3 CHOH COOH - 2H + 2H CH 3 CO COOH + KCN NC CH 3 C OH COOK

65 乳 酸 丙 酮 酸 氰 醇 丙 酸 钾 思 考 题 已 经 退 色 的 管, 经 过 对 比 观 察 并 已 做 记 录 后, 可 振 荡 片 刻, 观 察 出 现 什 么 变 化? 然 后 再 放 置 一 段 时 间 观 察 有 无 变 化? 解 释 这 些 现 象 说 明 什 么 问 题? 实 验 十 五 琥 珀 酸 脱 氢 酶 Experiment of Succinate Dehydrogenase 实 验 内 容 通 过 设 计 实 验 观 察 肌 肉 琥 珀 酸 脱 氢 作 用, 并 结 合 试 验 观 察 竞 争 性 抑 制 作 用 实 验 条 件 1. 利 用 除 去 辅 酶 Ⅰ 的 肌 肉 提 取 液, 以 甲 烯 兰 为 受 氢 体, 观 察 琥 珀 酸 脱 氢 酶 的 作 用 2. 利 用 与 琥 珀 酸 结 构 相 似 的 草 酸, 观 察 它 是 否 对 琥 珀 酸 脱 氢 酶 有 抑 制 作 用, 并 观 察 它 是 否 有 竞 争 性 抑 制 作 用 3. 为 保 证 各 管 ph 一 致, 便 于 对 比 各 加 适 量 的 缓 冲 液 4. 材 料 试 剂 及 其 参 考 用 量 ( 每 管 ): (1) 肌 肉 提 取 液 : 同 上 次 实 验 所 用 除 去 辅 酶 Ⅰ 者 1ml (2)0.2% 琥 珀 酸 盐 液 : 琥 珀 酸 液 用 NaOH 液 中 和 成 ph7.4, 用 量 1ml 以 内 (3)0.2% 草 酸 钠 液 : 约 0.5 ml 以 内 (4)pH7.4 磷 酸 缓 冲 液 :1M/15Na 2 HPO 4 液 8 滴 加 1M/15KH 2 PO 4 液 2 滴, 混 匀 用 量 1ml (5)0.02% 甲 烯 兰 液 :10 滴 以 内 据 上 列 条 件 写 出 设 计, 进 行 实 验 结 果 处 理 提 出 实 验 报 告, 写 清 实 验 设 计 操 作 及 观 察 到 的 现 象 和 结 果, 分 析 讨 论 草 酸 盐 的 作 用 是 否 为 竞 争 性 抑 制 作 用 实 验 十 六 细 胞 色 素 氧 化 酶 实 验 Experiment of Cytochrome Oxidase 原 理 细 胞 色 素 氧 化 酶 的 作 用 是 由 细 胞 色 素 传 递 电 子 给 氧 使 氧 激 活 而 与 H + 结 合 成 水, 这 几 乎 是 所 有 组 织 中 生 物 氧 化 的 重 要 环 节 另 外, 细 胞 色 素 氧 化 酶 也 能 催 化 a 萘 酚 和 二 甲 基 对 苯 二 胺 ( 即 Nadi 试 剂 ), 被 空 气 氧 化 结 合 生 成 靛 酚 兰 呈 蓝 色 一 般 可 用 此 反 应 证 明 细 胞 色 素 氧 化 酶 之 所 在 又 细 胞 色 素 氧 化 酶 属 于 铁 卟 啉 蛋 白, 其 作 用 可 受 KCN 抑 制 试 剂 及 试 料 :

66 1.Nadi 试 剂 : 分 别 配 成 下 列 三 种 溶 液 (1)1% 萘 酚 酒 精 溶 液 ; (2)1% 二 甲 基 对 苯 二 胺 水 溶 液 ; (3)1.5% Na 2 CO 3 液 在 临 用 前 2 小 时 以 内, 把 三 者 等 容 混 合, 供 使 用 2.0.5% KCN 溶 液 : 此 液 有 剧 毒! 使 用 及 处 理 须 严 加 注 意! 3. 新 鲜 肌 肉 : 碎 肉 1g, 包 在 数 层 纱 布 内, 在 水 道 水 下 揉 洗 到 无 血 色 ( 此 酶 与 肌 肉 的 非 水 溶 性 结 构 结 合 较 牢, 洗 后 仍 留 存 ) +2(O) (H 3 C) 2 N NH 2 + OH (H 3 C) 2 N N OH - 2H O 2 α- 操 作 1. 把 洗 净 的 碎 肉 分 成 三 份, 其 一 加 热 煮 沸 数 分 钟 分 别 放 在 滤 纸 片 上 2. 向 未 煮 的 一 份 上 加 KCN2 滴, 然 后 向 三 者 各 滴 加 Nadi 试 剂 2 滴 3. 经 过 约 10 分 钟 后 比 较 三 者 颜 色, 判 定 结 果 注 可 结 合 本 实 验 观 察 正 常 鼠 及 氰 化 物 中 毒 鼠 肌 肉 的 细 胞 色 素 氧 化 酶 情 况, 即 一 鼠 注 射 氰 化 物, 另 一 鼠 作 正 常 对 照 小 白 鼠 腹 腔 注 射 0.5% KCN 0.2ml( 或 用 大 白 鼠 腹 腔 注 射 0.5% KCN 0.4ml)2 分 钟 致 死, 取 肌 肉 0.5g, 剪 碎 包 在 纱 布 内, 在 水 道 水 下 充 分 揉 洗 到 几 乎 无 色 另 一 只 正 常 鼠 杀 死 后, 同 样 取 肌 肉 洗 到 同 样 程 度 然 后 分 别 放 碎 肉 于 白 瓷 板 或 滤 纸 上, 各 加 Nadi 试 剂 2 滴, 对 比 观 察 结 果 四 糖 代 谢 实 验 十 七 运 动 对 尿 中 乳 酸 含 量 的 影 响 Influence of Exercise on the Content of Urinary Lactic Acid 原 理 采 取 运 动 前 后 的 尿, 测 定 其 乳 酸, 进 行 对 比 先 用 硫 酸 铜 与 氢 氧 化 钙 沉 淀 除 去 干 扰 物 ( 糖 丙 酮 酸 氨 基 酸 等 ), 再 加 浓 硫 酸 加 热, 则 乳 酸 被 氧 化 生 成 乙 醛, 在 铜 离 子 存 在 下, 乙 醛 与 对 羟 联 苯 缩 和 产 生 紫 红 色 化 合 物, 此 呈 色 的 深 浅 即 反 映 着 乳 酸 的 多 寡

67 试 剂 1.20% 硫 酸 铜 液 :CuSO 4 5H 2 O 20g 加 水 加 热 溶 成 100ml 2.1% 硫 酸 铜 液 3. 氢 氧 化 钙 粉 末 ( 分 析 纯, 不 含 碳 酸 钙 ) CH 3 CHOH COOH H 2 SO CH 3 CHO CH 3 CHO + HO Cu 2+ - H 2 O CH 3 CH O 4. 浓 硫 酸 ( 分 析 纯, 比 重 1.84) 5.1.5% 对 羟 联 苯 的 0.5% NaOH 溶 液 : 需 用 较 纯 的 对 羟 联 苯 (p-hydroxydiphenol) 1.5g 加 5% NaOH 液 10ml, 稍 加 温 溶 解 后, 加 水 成 100ml 放 棕 色 瓶 冷 处 保 存 可 用 2~ 3 周, 保 存 中 出 现 白 色 沉 淀 可 振 匀 使 用, 已 变 褐 色 要 重 新 配 制 操 作 1. 采 尿 在 试 验 前 先 排 尿 弃 去, 过 30 分 钟 排 尿 一 次 留 用 为 运 动 前 尿, 然 后 进 行 激 烈 运 动 约 5 分 钟, 自 运 动 开 始 起 过 30 分 钟 再 排 尿, 此 为 运 动 后 尿 将 以 上 两 尿 样 分 别 加 水 稀 释 一 倍 2. 测 定 (1) 两 支 试 管 记 好 记 号, 分 别 取 稀 释 尿 5ml, 各 加 20%CuSO 4 液 0.5ml, 混 匀, 再 加 氢 氧 化 钙 粉 末 0.5g, 强 振 充 分 混 匀, 放 置 约 15 分 钟, 当 中 时 时 振 荡 然 后 离 心 (3000rpm, (1) 5~10 分 钟 ) 或 过 滤 如 果 滤 液 不 清 可 反 复 用 原 滤 纸 重 滤 (2) 另 取 两 支 试 管, 标 清 管 号, 分 别 取 滤 液 0.1ml( 或 用 乳 头 吸 管 分 别 吸 取 基 本 同 样 大 小 的 2 滴 ), 浸 冷 水 中, 各 加 1% CuSO 4 液 1 滴, 再 加 浓 硫 酸 2ml, 边 加 边 混 匀 (3) 把 两 管 同 时 放 沸 水 浴 中 5 分 钟, 按 时 取 出, 浸 冷 水 中 冷 却 到 20 以 下 (2) (4) 各 加 对 羟 联 苯 液 1 滴, 不 使 流 经 管 壁, 要 直 接 滴 到 溶 液 中, 立 即 振 摇 混 匀 两 管 同 时 放 30 水 浴 中 保 温 (30 分 钟 内 可 显 色 ) (5) 对 比 观 察 两 管 的 呈 色, 判 定 结 果 注 (1) 滤 液 应 无 色 透 明, 混 浊 或 带 兰 色 表 示 氢 氧 化 钙 不 足, 应 适 当 补 加, 重 复 振 荡 后 再 过 滤 (2) 加 对 羟 联 苯 液 时, 沉 淀 易 附 着 管 壁 难 以 摇 散 故 应 直 接 加 到 管 内 液 面 上, 并 立 即 振 摇 使 沉 淀 分 散 (3) 本 法 也 可 用 于 测 定 血 液 除 蛋 白 滤 液 及 组 织 中 的 乳 酸 本 法 也 为 定 量 实 验 的 基 础, 与 标 准 乳 酸 盐 液 比 色 测 定 ( 呈 色 物 最 大 吸 收 波 长 为 570nm) (4) 正 常 尿 中 含 微 量 乳 酸,50~200mg/24 小 时

68 实 验 十 八 血 糖 定 量 ( 邻 甲 苯 胺 硼 酸 法 ) Determination of Blood Sugar(o-Toluidine Borate Method) 原 理 葡 萄 糖 与 邻 甲 苯 胺 在 冰 醋 酸 液 中 加 热 时, 结 合 生 成 兰 色 化 合 物 (1) 血 清 与 标 准 液 同 样 处 理 后 进 行 比 色 定 量 试 剂 1. 邻 甲 苯 胺 硼 酸 试 剂 ( 简 称 OTB 试 剂 ) ( 2) : 冰 醋 酸 950ml, 加 邻 甲 苯 胺 (o-toluidine)50ml, 混 匀, 加 饱 和 硼 酸 液 41.7ml, 混 匀, 再 加 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 (Na 2 EDTA)1g, 溶 解 后 充 分 混 匀 贮 于 棕 色 瓶 中 试 药 的 纯 度 显 著 影 响 本 试 剂 发 色 效 力 及 稳 定 性, 尤 其 邻 甲 苯 胺 及 冰 醋 酸 需 用 分 析 纯 或 更 好 的, 必 要 时 要 蒸 馏 精 制 邻 甲 苯 胺 必 须 是 无 色 或 微 黄, 带 粉 色 的 不 适 用 (3) 清 液 饱 和 硼 酸 液 即 6% 硼 酸 液 : 分 析 纯 的 硼 酸 6g 加 水 溶 成 100ml, 放 置 过 夜, 过 滤 用 其 2. 葡 萄 糖 标 准 液 (1) 贮 存 液 ( 10mg/ml) 精 确 称 取 最 纯 脱 水 葡 萄 糖 1.0g, 加 0.25% 苯 甲 酸 液 溶 成 100ml, 混 匀 放 冰 箱 中 保 存 其 中 苯 甲 酸 起 防 腐 作 用 匀 (2) 应 用 液 (1mg/ml): 取 上 液 10.0ml 加 0.25% 苯 甲 酸 液 准 确 地 稀 释 成 100ml, 混 操 作 1. 取 中 试 管 3 支, 做 好 记 号, 分 别 加 液 如 下 : 空 白 管 (B): 蒸 馏 水 0.1ml; 标 准 管 (S): 葡 萄 糖 标 准 液 (100mg/dl)0.10ml ( 4) ; 检 品 管 (U): 血 清 或 血 0.10ml 2. 各 加 邻 甲 苯 胺 硼 酸 试 剂 (OTB 试 剂 )5ml, 混 匀 3. 同 时 放 沸 水 浴 中 8 分 钟, 取 出 用 流 水 冷 却 约 3 分 钟 后, 于 30 分 钟 内, 用 640nm 或 红 色 滤 光 板, 用 空 白 管 (5)] 调 零 点, 读 各 管 光 密 度 值 4. 计 算 : 意 义 血 糖 mg% Du 100 Ds 1. 正 常 值 : 空 腹 静 脉 血 浆 中 含 糖 70~100mg%(3.9~5.6mmol/L) ( 通 常 临 床 上 采 用 的 正 常 值 80~120mg%(4.4~6.7mmol/L), 系 来 源 于 还 原 方 法, 该 值 中 包 含 非 糖 还 原 性 物 质 约 10mg% 但 因 血 中 非 糖 还 原 性 物 质 对 本 法 并 无 干 扰, 故 值 较 低, 为 真 糖 值 ) 2. 增 高 : 见 于 糖 尿 病 及 其 他 内 分 泌 疾 患 如 甲 状 腺 机 能 亢 进 垂 体 前 页 和 肾 上 腺 皮 质 的 机 能 亢 进 或 肿 瘤, 长 期 使 用 肾 上 腺 皮 质 激 素 的 病 人 等 生 理 条 件 下 饭 后 或 精 神 紧 张 时 有 暂 时 性 升 高 3. 减 低 : 见 于 胰 岛 素 增 多 症 胰 岛 肿 瘤 肾 上 腺 皮 质 垂 体 前 叶 或 甲 状 腺 的 机 能 减

69 退 等 严 重 肝 病 时 也 可 见 低 血 糖 注 (1) 呈 色 反 应 机 制 学 说 不 一, 目 前 一 般 认 为 可 能 是 葡 萄 糖 与 邻 甲 苯 胺 结 合 生 成 西 夫 (Schiff) 氏 碱 及 其 衍 生 物 呈 兰 色 H C C O H OH NH 2 CH 3 H HC C OH NH OH CH 3 H H C C N OH CH 3 HO H H C C C H OH OH ( ) H +, 100 HO H H C C C H OH OH - H 2 O HO H H C C C H OH OH 绿 兰 色 物 CH 2 OH CH 2 OH CH 2 OH N- N- 除 葡 萄 糖 外 醛 糖 中 半 乳 糖 有 相 同 反 应, 但 正 常 血 中 含 量 甚 微 其 他 醛 糖 反 应 极 弱 酮 糖 及 非 糖 还 原 物 质 不 参 与 反 应 (2) 试 剂 中 主 要 成 分 是 邻 甲 苯 胺, 其 冰 醋 酸 液 中 加 饱 和 硼 酸 液 有 增 强 呈 色 作 用, 且 因 使 试 剂 中 含 有 约 4% 水 分, 而 使 血 清 蛋 白 不 生 沉 淀 可 使 本 法 对 血 清 不 用 除 蛋 白 而 能 直 接 测 定 试 剂 中 EDTA 钠 盐 可 除 去 Fe 3 + 干 扰 (Fe 3 + 有 抑 制 呈 色 作 用 ) OTB 试 剂 种 类 很 多, 邻 甲 苯 胺 浓 度 不 同 邻 甲 苯 胺 浓 度 高 者 发 色 快 但 退 色 也 快 附 加 成 分 不 同 为 除 干 扰 增 加 试 剂 感 度 及 稳 定 性 另 一 种 常 用 配 方 如 下 : 冰 醋 酸 920ml, 溶 解 硫 脲 1.5g( 防 止 邻 甲 苯 胺 氧 化 ), 再 加 邻 甲 苯 胺 80ml, 混 匀 然 后 加 饱 和 硼 酸 液 41.1ml, 混 匀 (3) 邻 甲 苯 胺 一 般 色 深, 需 重 新 蒸 馏 精 制, 取 199~201 的 馏 出 部 分, 应 为 无 色 或 微 黄 本 试 药 易 氧 化, 必 须 放 棕 色 瓶 中 避 光 保 存 如 放 无 色 透 明 瓶 中 放 室 内 光 亮 处, 数 日 间 即 可 着 色, 用 粉 红 色 者 配 成 试 剂 不 安 定, 有 效 期 短 (4) 如 果 血 糖 较 高 者 可 改 用 血 清 或 血 浆 0.050ml (5) 如 果 试 剂 较 纯, 则 空 白 管 色 甚 浅 且 稳 定 这 样 条 件 下, 为 节 省 试 剂, 可 用 水 管 调 零, 准 确 读 记 试 剂 空 白 管 的 光 密 度 值 D 0, 以 后 试 剂 稳 定 的 期 间 内, 每 次 测 定 时 可 以 不 作 试 剂 空 白, 只 用 水 管 调 零, 读 取 Du Ds, 计 算 时 用 Du-D 0 和 Ds-D 0 (6) 本 法 也 适 用 于 测 定 脑 脊 液 胸 腹 水 尿 等 其 他 检 品 它 们 的 正 常 值 为 50~70mg %(2.2~3.9mmol/L) 70~100mg% 及 1~12mg% 实 验 十 九 肝 糖 原 实 验 Experiments on Liver Glycogen 糖 原 是 动 物 体 内 糖 的 储 存 形 式, 肝 和 肌 肉 组 织 中 糖 原 含 量 丰 富, 肝 糖 原 约 占 肝 重 的 5

70 %, 肌 糖 原 约 占 肌 肉 重 量 的 1~2% 因 此, 肌 肉 和 肝 适 用 于 糖 原 的 提 取 本 实 验 通 过 学 习 分 离 提 取 肝 组 织 中 糖 原 的 基 本 方 法, 并 用 饥 饿 注 射 肾 上 腺 素 和 注 射 葡 萄 糖 胰 岛 素 的 鼠 与 正 常 饮 食 的 鼠 对 比 观 察 肝 糖 原 含 量 的 变 化 以 加 深 理 解 肝 糖 原 代 谢 的 理 论 原 理 利 用 三 氯 醋 酸 使 蛋 白 质 变 性, 并 使 之 与 糖 原 分 离 然 后 利 用 糖 原 不 溶 于 乙 醇 而 溶 于 热 水 的 性 质, 先 用 95% 乙 醇 将 滤 液 中 的 糖 原 沉 淀, 使 糖 原 纯 化, 再 溶 于 热 水 中, 最 后 加 碘 液 呈 色 对 比 观 察 结 果 糖 原 水 溶 液 呈 乳 样 光 泽, 遇 碘 后 呈 红 棕 色 试 剂 1.12% 三 氯 醋 酸 液 2. 葡 萄 糖 胰 岛 素 液 : 将 胰 岛 素 加 入 25% 葡 萄 糖 注 射 液 中, 每 ml 葡 萄 糖 液 含 胰 岛 素 2 个 单 位 3. 肾 上 腺 素 注 射 液 :0.1% 肾 上 腺 素 注 射 液 1ml 加 生 理 盐 水 19ml, 其 浓 度 为 50μg/ml % NaCl 5.95% 乙 醇 6. 稀 碘 液 操 作 1. 动 物 准 备 小 白 鼠 4 只, 分 为 两 组, 一 组 给 足 够 的 饲 料 ; 另 一 组 实 验 前 48 小 时 开 始 禁 食, 只 给 饮 水 饥 饿 组 一 只 鼠 注 射 生 理 盐 水 1ml, 另 一 只 鼠 注 射 葡 萄 糖 胰 岛 素 液 1ml,1 小 时 后 处 死 饱 食 组 一 只 鼠 注 射 生 理 盐 水 1ml, 另 一 只 鼠 注 射 肾 上 腺 素 1ml,30 分 钟 后 处 死 2. 糖 原 提 取 处 死 后 的 各 组 鼠 均 按 下 列 步 骤 提 取 糖 原 : (1) 迅 速 取 出 肝 脏, 用 生 理 盐 水 洗 净, 并 用 滤 纸 吸 干, 称 取 1g 肝 脏 (2) 将 肝 组 织 置 研 钵 中 剪 碎 后, 加 12% 三 氯 醋 酸 3ml, 研 磨 成 糜 状, 经 滤 纸 过 滤 于 试 管 中, 再 用 蒸 馏 水 3ml 洗 残 渣 过 滤 (3) 取 滤 液 2ml 于 离 心 管 中, 加 入 95% 乙 醇 2ml 混 匀, 静 置 10 分 钟 后 离 心 (2000rpm)10 分 钟, 弃 上 清 液, 白 色 沉 淀 即 为 糖 原 3. 糖 原 鉴 定 (1) 糖 原 沉 淀 加 蒸 馏 水 2ml, 置 沸 水 浴 中 使 沉 淀 溶 解 (2) 稍 冷 后 各 试 管 中 加 10 滴 稀 碘 液 对 比 观 察 其 颜 色 进 行 分 析 实 验 二 十 尿 糖 定 性 ( 班 氏 法 ) Qualitative Test for Sugar in Urine(Benedict s Method) 正 常 尿 中 含 糖 甚 微 (0.01~0.03%), 一 般 定 性 反 应 阴 性, 如 果 尿 糖 增 多 出 现 阳 性 结

71 果, 则 称 之 为 糖 尿 尿 糖 定 性 实 验 是 临 床 尿 液 检 查 的 重 要 项 目, 本 法 是 最 常 用 的 一 种 方 法 (1) 原 理 利 用 糖 的 还 原 性, 糖 与 碱 性 铜 液 共 热 时, 二 价 铜 被 还 原, 生 成 一 价 铜 的 有 色 沉 淀 物 班 氏 试 剂 中, 硫 酸 铜 与 碳 酸 钠 反 应 产 生 氢 氧 化 铜 但 不 出 现 沉 淀, 而 是 与 柠 檬 酸 钠 结 合 成 为 可 溶 性 络 合 物 试 剂 的 颜 色 即 为 由 此 络 合 物 构 成 的 美 丽 的 翠 兰 色 Na 2 CO 3 + H 2 O= NaHCO 3 + NaOH CuSO 4 + 2NaOH= NaSO 4 + Cu(OH) 2 Cu(OH) 2 + 试 剂 被 还 原 时, 则 出 现 黄 色 的 氢 氧 化 亚 铜 和 红 色 的 氧 化 亚 铜 的 沉 淀 葡 萄 糖 +2Cu(OH) 2 葡 萄 糖 氧 化 物 +2Cu(OH) 由 于 出 现 沉 淀 的 情 况, 也 可 得 出 半 定 量 的 判 断 试 剂 ( 黄 色 ) 或 Cu 2 O ( ) 班 氏 定 性 试 剂, 把 柠 檬 酸 钠 173g 和 无 水 碳 酸 钠 100g, 加 水 约 700ml, 加 热 溶 解 另 把 硫 酸 铜 结 晶 (CuSO 4 5H 2 O)17.3g 加 水 约 100ml, 加 热 溶 解 冷 后 把 硫 酸 铜 徐 徐 加 入 前 液 中, 边 加 边 摇 匀 补 水 到 1L, 混 匀 必 要 时 过 滤 (2) 操 作 1. 于 中 试 管 内 加 试 剂 5ml 和 检 尿 8 滴 (3) 用 直 火 煮 沸 1~2 分 钟 (4), 在 室 温 中 放 冷 后 观 察 结 果 2. 结 果 判 定 观 察 所 见 结 果 表 示 法 葡 萄 糖 含 量 (%) 溶 液 无 变 化 或 稍 混 浊 无 糖 微 有 绿 色 混 浊, 放 后 少 量 沉 淀 + 微 量 0.5 以 下 煮 一 分 钟 后 出 现 黄 绿 色 混 浊 及 少 量 黄 橙 色 沉 淀 ++ 少 量 0.5~1 煮 十 几 秒 后 即 出 现 土 黄 色 沉 淀 较 多 +++ 多 量 1~2 煮 沸 即 显 红 色, 沉 淀 红 棕 色 ++++ 大 量 2 以 上 注 (1) 非 糖 还 原 性 物 质 可 发 生 反 应, 尿 中 如 果 含 多 量 肌 酐 尿 酸 或 含 有 尿 黑 酸 维 生 素 C 等 还 原 性 药 物 时, 也 可 出 现 假 阳 性

72 (2) 另 一 改 良 班 氏 配 方 如 下, 配 制 及 使 用 方 法 基 本 同 原 法 硫 酸 铜 结 晶 10g, 柠 檬 酸 钠 25g, 无 水 碳 酸 钠 14.2g, 溶 成 1L (3) 原 法 规 定 试 剂 5ml 加 尿 8 滴 ( 或 0.5ml) 实 际 测 定 中 为 节 省 试 剂, 可 按 比 例 缩 减, 例 如 取 试 剂 2.5ml, 加 尿 4 滴 (4) 也 可 以 沸 水 浴 加 热 但 同 时 要 适 当 延 长 原 法 需 沸 水 浴 5 分 钟, 如 用 改 良 试 剂, 则 需 7 分 钟 思 考 题 1. 既 然 一 些 非 糖 还 原 性 物 质 也 能 出 现 阳 性, 为 什 么 本 法 还 能 用 作 尿 糖 定 性? 2. 尿 糖 和 血 糖 有 什 么 关 系? 什 么 情 况 下 会 出 现 糖 尿? 五 脂 类 实 验 二 十 一 肝 脂 类 的 提 取 及 薄 层 层 析 Extraction and layer chromatography of liver lipid 原 理 组 织 细 胞 内 的 脂 类 通 常 以 Van der Waals 力, 静 电 引 力, 疏 水 作 用, 氢 键 等 与 细 胞 内 非 脂 质 成 分 如 蛋 白 质 糖 类 等 相 结 合 而 存 在 其 中 疏 水 基 团 的 相 互 作 用 是 脂 质 与 非 脂 质 相 互 结 合 的 最 重 要 的 作 用 力 使 用 氯 仿 - 甲 醇 液 能 使 这 种 结 合 破 坏, 并 将 脂 质 抽 提 出 来 氯 仿 - 甲 醇 液 能 使 蛋 白 质 变 性 本 实 验 以 小 白 鼠 肝 匀 浆 为 材 料, 用 氯 仿 - 甲 醇 液 将 脂 质 抽 提 后, 用 薄 层 层 析 鉴 定 其 脂 质 组 成 试 剂 1. 氯 仿 - 甲 醇 (2:1 V/V 液 ): 量 取 100ml 氯 仿, 然 后 再 加 入 50ml 甲 醇 混 合 M KCl: 称 取 KCl 3.72 克 加 水 至 1000ml 3. 硅 胶 G 4. 硫 酸 显 色 液 : 取 50ml 浓 硫 酸 倒 入 40ml 水 中, 然 后 加 水 调 节 到 100ml 5. 展 开 剂 : 乙 烷 : 乙 醚 : 甲 酸 =80:20:2 6. 标 准 样 品 (1% 浓 度 ): 分 别 称 取 胆 固 醇 胆 固 醇 酯 三 油 酸 甘 油 酯 油 酸 各 1g, 各 加 氯 仿 100ml 操 作 1. 肝 脂 质 的 提 取 (1) 肝 匀 浆 的 制 备 : 取 小 白 鼠 一 只, 颈 椎 脱 位 处 死 后, 取 出 肝 脏 (0.5g) 用 生 理 盐 水 洗 涤 并 用 滤 纸 吸 干 后, 放 入 玻 璃 研 钵 中 剪 碎, 加 少 许 玻 璃 砂, 先 用 2ml 氯 仿 - 甲 醇 液 (2:1v/v) 仔 细 研 磨 成 糜 状, 再 加 8ml 氯 仿 - 甲 醇 液 继 续 研 磨 制 得 肝 匀 浆 (2) 将 匀 浆 液 转 移 至 离 心 管 中,2500 转 / 分 离 心 5 分 钟 ( 注 意 : 离 心 管 内 切 勿 混 入 水 ) (3) 脂 质 提 钱 液 的 洗 涤 : 将 上 清 液 ( 即 脂 质 提 取 液 ) 倾 入 125ml 分 液 漏 斗 中, 用

73 2ml 0.05M KCl 溶 液 洗 涤, 轻 摇 2 分 钟, 静 置 分 层 (4) 放 出 氯 仿 - 甲 醇 液, 于 100ml 园 底 烧 瓶 内, 在 70 水 浴 中 蒸 干, 用 4ml 氯 仿 洗 入 试 管 中, 此 即 肝 脂 质 提 取 样 品 2. 肝 脂 的 薄 层 层 析 (1) 薄 层 层 析 板 的 制 备 1 称 取 2g 硅 胶 G 在 研 钵 中, 加 水 8ml 调 匀, 倒 在 干 净 的 玻 璃 板 (8 15cm), 双 手 拿 玻 璃 板 两 端, 沿 桌 边 振 荡, 使 吸 附 剂 均 匀 铺 平 2 在 室 温 中 晾 干, 然 后 在 110 烘 箱 中 活 化 30 分 钟, 放 冷 后 即 可 使 用 (2) 点 样 1 点 样 时, 先 在 玻 璃 板 一 端 1.5cm 处 作 一 记 号, 作 为 起 始 线 上 分 五 点, 即 点 样 处, 两 点 之 间 的 间 隔 为 1.5cm, 并 注 意 五 点 保 持 在 同 一 水 平 上 2 在 1 点 上 点 肝 脂 质 提 取 液 (5 l) 3 同 时 分 别 以 5 l 胆 固 醇, 胆 固 醇 酯 三 油 酸 甘 油 酯 及 油 酸 四 种 标 准 液 在 各 点 上 点 样 点 样 时 务 需 注 意 边 点 边 吹, 使 溶 剂 尽 快 挥 发, 然 后 再 点 第 二 滴, 这 样 可 使 点 样 斑 点 尽 量 缩 小 (3) 展 开 1 在 玻 璃 标 本 缸 中 展 开 展 开 剂 预 先 在 层 析 缸 中 饱 和 2 小 时 以 上 将 层 析 板 斜 放 在 缸 中, 下 端 浸 入 展 开 剂 中, 但 勿 使 点 样 斑 点 触 及 展 开 剂 盖 好, 并 在 层 析 缸 内 表 面 围 上 被 展 开 剂 浸 湿 了 的 滤 纸 以 加 速 平 衡 注 意 : 不 要 随 便 打 开 层 析 缸 盖, 以 免 破 坏 平 衡 2 当 展 开 剂 展 开 到 板 高 3/4 左 右 湿, 从 层 析 缸 中 取 出 层 析 板, 先 在 溶 剂 前 沿 作 一 记 号, 以 便 计 算 Rf 值, 然 后 在 室 温 下 晾 干, 让 其 溶 剂 自 然 挥 发 (4) 显 色 溶 剂 挥 发 殆 尽 时 用 H 2 SO 4 显 色 液 喷 洒, 使 样 品 中 脂 质 碳 化 显 色, 喷 洒 以 均 匀 为 佳, 不 要 多 ( 操 作 中 应 避 免 腐 蚀 衣 物 ) 然 后 在 140 烘 箱 中 烘 20 分 钟 (5) 计 算 Rf 值 取 出 层 析 板, 放 冷 后 测 量 色 斑 中 心 至 原 点 的 距 离 及 溶 剂 前 沿 至 原 点 中 距 离, 计 算 Rf 值, 并 与 标 准 样 品 对 照 实 验 二 十 二 血 清 总 胆 固 醇 定 量 Determination of Total Serum Cholesterol 原 理 血 清 用 无 水 乙 醇 提 取 胆 固 醇, 并 将 蛋 白 质 沉 淀 向 乙 醇 提 取 液 中 加 磷 硫 铁 显 色 剂, 作 用 于 胆 固 醇 显 紫 红 色, 与 同 样 处 理 的 胆 固 醇 标 准 液 比 色 定 量 试 剂 1. 胆 固 醇 标 准 贮 存 液 : 精 确 称 取 干 燥 的 重 结 晶 胆 固 醇 10mg 放 烧 杯 中, 加 少 量 无 水 乙 醇 于 水 浴 稍 加 温 助 溶, 冷 后 完 全 转 移 入 100ml 量 瓶, 补 加 无 水 乙 醇 到 刻 线, 混 匀 放

74 棕 色 瓶 中, 塞 严 瓶 口, 保 存 于 4 冰 箱 中 配 置 应 用 液 时, 应 将 其 预 先 恢 复 至 室 温 2. 胆 固 醇 标 准 应 用 液 : 取 上 液 4.0ml 于 100ml 量 瓶 中, 加 无 水 乙 醇 到 刻 度, 再 加 水 2.0ml, 混 匀 放 棕 色 瓶 中, 于 冰 箱 保 存, 使 用 时 需 使 恢 复 至 室 温 本 液 含 胆 固 醇 为 0.1mg/2.55ml 或 mg/ml 3. 铁 贮 存 液 : 三 氯 化 铁 (FeCl 3 6H 2 O)25g, 用 浓 磷 酸 溶 成 100ml 此 液 在 室 温 可 长 期 保 存 4. 显 色 剂 : 取 上 述 铁 贮 存 液 8ml, 加 浓 硫 酸 成 100ml, 混 匀 此 液 简 称 磷 硫 铁 液 在 室 温 下 注 意 保 存 可 用 6~8 周 在 使 用 中 应 随 时 把 盖 盖 严, 避 免 吸 湿 而 减 弱 发 色 效 力 5. 无 水 乙 醇 : 操 作 1. 准 确 吸 取 血 清 0.5ml, 加 于 离 心 用 小 试 管 中, 对 准 血 清 吹 加 无 水 乙 醇 2.5ml, 使 血 清 蛋 白 分 散 成 很 细 的 沉 淀, 用 拇 指 垫 塑 料 薄 膜 严 密 按 住 管 口, 强 力 振 摇 约 10 秒 钟, 放 置 5 分 钟, 再 振 摇 混 和, 然 后 离 心 2000 rpm 5 分 钟 2. 取 中 试 管 3 支, 标 记 管 号 空 白 管 加 无 水 乙 醇 2ml, 标 准 管 加 胆 固 醇 标 准 应 用 液 2.0ml, 检 品 管 加 血 清 除 蛋 白 上 清 液 2.0ml 3. 斜 持 试 管, 沿 管 壁 缓 缓 加 入 呈 色 剂 2.0ml, 使 它 不 和 乙 醇 提 取 液 相 混 而 使 两 液 重 迭 成 层, 三 管 都 加 完 后, 同 时 振 摇 约 15 次 混 匀 室 温 放 置 15 分 钟 后, 用 550nm 或 绿 色 滤 光 板, 以 试 剂 空 白 调 零, 读 取 检 品 管 及 标 准 管 的 光 密 度 值 4. 计 算 正 常 值 :187±36% 注 mg% = Du Ds 显 色 原 理 尚 不 清 楚, 可 能 由 于 反 应 中 胆 固 醇 生 成 一 些 不 饱 和 的 衍 生 物 或 其 聚 合 体 试 剂 中 浓 硫 酸 可 能 发 生 磺 酸 化 作 用,Fe 3+ 有 氧 化 作 用 水 分 妨 碍 本 反 应, 故 所 用 容 器 及 试 剂 不 得 含 水, 试 剂 保 存 及 操 作 过 程 中 要 防 止 水 分 的 混 入, 以 免 影 响 呈 色 2. 因 为 胆 固 醇 的 呈 色 反 应 受 水 影 响 很 大, 为 使 标 准 管 和 测 定 管 条 件 一 致, 故 向 100ml 标 准 应 用 液 中 加 水 2ml 加 水 后 的 标 准 应 用 液 每 2ml 含 胆 固 醇 ml, 而 2ml 乙 醇 提 取 液 相 当 于 血 清 ml, 故 计 算 每 100ml 血 清 含 胆 固 醇 毫 克 数 时, 要 乘 无 水 乙 醇 应 无 醛, 检 查 醛 的 方 法 可 用 乙 醇 2ml, 加 色 氨 酸 饱 和 水 溶 液 0.05ml 再 加 呈 色 剂 2ml, 混 匀, 应 无 紫 色 如 有 醛 则 呈 紫 色 4. 为 使 充 分 呈 色, 混 合 方 法 及 时 间 应 相 对 固 定, 混 合 方 法 以 旋 转 或 振 摇 为 宜, 时 间 以 10~15 秒 为 宜 5. 温 度 对 呈 色 有 影 响, 如 果 室 温 低 于 10 时, 应 在 加 呈 色 剂 之 前, 先 将 乙 醇 提 取 液 于 37 水 浴 预 温 数 分 钟, 加 呈 色 剂 后, 室 温 放 冷 即 可 实 验 二 十 三 尿 中 酮 体 定 性 Lange 法 Qualitative Test for Ketone Bodies in Urine

75 原 理 乙 酰 乙 酸 和 丙 酮 在 碱 性 条 件 下 皆 可 与 亚 硝 基 铁 氰 化 钠 反 应 生 成 紫 红 色 化 合 物 本 法 是 把 加 油 亚 硝 基 铁 氰 化 钠 和 醋 酸 的 尿 液 与 氨 水 重 迭 成 层, 则 反 应 发 生 两 液 界 面, 在 碱 性 条 件 下 生 成 呈 色 物, 接 触 醋 酸 色 又 加 深 观 察 界 面 反 应 如 有 酮 体 则 呈 现 紫 色 环, 其 颜 色 深 浅 及 出 现 快 慢 反 映 出 量 的 多 少 试 剂 1.5% 亚 硝 基 铁 氰 化 钠 2. 冰 醋 酸 3. 浓 氨 水 操 作 1. 于 试 管 中 加 新 采 的 尿 1~2ml, 冰 醋 酸 5 滴 和 5% 亚 硝 基 铁 氰 化 钠 4 滴, 混 匀 2. 斜 持 试 管, 沿 管 壁 徐 徐 匀 速 地 加 入 浓 氨 水 约 1ml, 注 意 不 要 与 尿 液 相 混 而 是 重 迭 在 尿 液 上 形 成 接 触 面 然 后 把 试 管 静 置 于 试 管 架 上 3. 观 察 界 面 反 应 现 象, 判 定 结 果 强 阳 性 - 立 即 显 现 深 紫 色 环 ; 阳 性 - 立 即 显 现 紫 色 环 ; 弱 阳 性 -5 分 钟 内 出 现 紫 色 环 ; 阴 性 -5 分 钟 后 仍 未 出 现 紫 色 环 意 义 1. 正 常 尿 中 酮 体 甚 少 ( 全 日 尿 中 只 有 30mg 以 下 ), 一 般 定 性 反 应 为 阴 性 2. 体 内 脂 肪 氧 化 增 强, 产 生 酮 体 过 多 时, 可 出 现 酮 血 和 酮 尿, 常 见 于 糖 尿 病 妊 娠 呕 吐 高 热 型 疾 病 ( 伤 寒 麻 疹 败 血 症 等 ) 及 其 他 饮 食 障 碍 等 病 理 饥 饿 状 态 地 病 人 注 1. 本 法 灵 敏 度 对 乙 酰 乙 酸 为 1~5mg%, 对 丙 酮 为 10~25mg% 羟 基 丁 酸 不 参 加 反 应 2. 亚 硝 基 铁 氰 化 钠 需 新 鲜 配 制 也 可 以 用 固 体, 每 管 中 用 几 个 小 粒 即 可 六 蛋 白 代 谢 实 验 二 十 四 血 清 蛋 白 的 醋 酸 纤 维 素 膜 电 泳 分 离 及 测 定 Separation and Determination of Serum Proteins by Cellulose Acetate Electrophoresis 原 理 蛋 白 质 由 氨 基 酸 组 成, 是 一 种 两 性 电 解 质 在 一 定 PH 条 件 下 可 带 电 荷, 带 电 荷 的 蛋 白 质 在 电 场 中 可 发 生 泳 动, 这 种 现 象 叫 电 泳 各 种 蛋 白 质 都 有 一 定 的 等 电 点, 在 等 电 点 时 它 呈 电 中 性, 在 电 场 中 即 不 向 阳 极 也 不

76 向 阴 极 移 动 Pr NH 3 COOH OH H Pr NH 3 COO OH H Pr NH 2 COO ph<pi ph=pi ph>pi 血 清 蛋 白 质 的 等 电 点 一 般 低 于 ph7, 清 蛋 白 等 电 点 为 4.6, 球 蛋 白 为 5~7, 在 ph 高 于 它 们 等 电 点 的 缓 冲 液 中 则 带 负 电 荷, 在 电 场 中 向 阳 极 移 动 由 于 各 种 蛋 白 质 所 带 电 荷 的 数 量 和 分 子 的 大 小 有 差 别, 在 电 场 中 泳 动 的 速 度 也 不 相 同, 血 清 中 清 蛋 白 电 荷 数 量 较 多 分 子 量 小, 泳 动 最 快 γ 球 蛋 白 则 相 反, 因 而 泳 动 最 慢 因 此, 利 用 醋 酸 纤 维 素 薄 膜 为 支 持 物 可 将 血 清 蛋 白 分 为 清 蛋 白 α 1 球 蛋 白 α 2 球 蛋 白 β 球 蛋 白 γ 球 蛋 白 等 经 染 色 后 则 成 带 色 区 带, 各 区 带 的 宽 窄 及 染 色 深 浅 表 示 各 种 蛋 白 质 含 量 的 多 少, 可 用 比 色 法 ( 或 光 密 度 法 ) 分 别 测 出 各 种 蛋 白 质 含 量 的 百 分 比 采 用 醋 酸 纤 维 薄 膜 做 为 支 持 物 的 电 泳 方 法, 叫 做 醋 酸 纤 维 素 薄 膜 电 泳 醋 酸 纤 维 是 纤 维 素 的 羟 基 乙 酰 化 所 形 成 的 纤 维 素 醋 酸 酯 将 它 溶 于 有 机 溶 剂 ( 如 丙 酮 氯 仿 氯 乙 酸 乙 酸 乙 酯 等 ) 后, 涂 抹 成 均 匀 的 薄 膜, 干 燥 后 就 成 为 醋 酸 纤 维 素 薄 膜 现 有 国 产 醋 酸 纤 维 薄 膜 成 品 出 售, 厚 度 约 为 120 微 米, 使 用 很 方 便 醋 酸 纤 维 素 薄 膜 是 一 种 非 常 好 的 电 泳 支 持 物, 它 具 有 下 列 优 点 : 1. 醋 酸 纤 维 薄 膜 对 样 品 的 吸 附 作 用 小, 因 此 对 少 量 样 品, 甚 至 对 大 分 子 都 能 得 到 较 高 的 分 辨 率 2. 醋 酸 纤 维 薄 膜 具 有 泡 沫 状 结 构, 由 于 它 的 亲 水 性 比 纸 小, 它 所 容 纳 的 缓 冲 液 也 较 少, 因 此 电 流 的 大 部 分 由 样 品 传 导, 所 以 分 离 速 度 很 快 3. 醋 酸 纤 维 薄 膜 的 电 渗 小, 可 避 免 由 于 电 渗 对 泳 动 率 的 影 响 4. 醋 酸 纤 维 薄 膜 染 色 的 本 底 较 浅, 并 且 可 用 液 体 石 蜡 对 其 进 行 透 明 处 理, 使 色 带 更 加 清 晰 可 辨 醋 酸 纤 维 薄 膜 电 泳 是 区 带 电 泳 的 一 种 较 新 的 技 术 自 1958 年 Kohn 建 立 这 种 电 泳 技 术 以 来, 由 于 它 具 有 上 述 特 点, 因 此 在 实 验 室 及 临 床 化 验 中 已 取 代 纸 电 泳 而 广 泛 使 用 器 材 与 试 剂 1. 电 泳 仪 : 整 流 器 可 调 节 输 出 电 压 0~500V, 电 流 0~100mA 2. 醋 酸 纤 维 素 膜 : 切 成 8 2cm (1) 3. 巴 比 妥 缓 冲 液 (ph8.6, 离 子 强 度 0.05): 巴 比 妥 2.208g; 巴 比 妥 钠 12.45g, 加 水 1L 4. 染 色 液 : 氨 基 黑 10B 0.5g, 甲 醇 50ml, 冰 醋 酸 10ml, 蒸 馏 水 40ml (2) 5. 漂 洗 液 : 乙 醇 45ml; 冰 醋 酸 5ml; 蒸 馏 水 50ml 6. 浸 出 液 :0.4N NaOH 液 操 作 1. 准 备 预 先 距 离 醋 酸 纤 维 素 薄 膜 一 端 约 2cm 处 做 好 原 点 标 记, 然 后 把 膜 浸 在 缓 冲 液 中 数 小 时 以 上, 使 膜 完 全 浸 透

77 电 泳 槽 内 放 好 缓 冲 液 (3), 在 两 侧 液 槽 之 间 放 一 连 通 管, 经 过 数 小 时 以 上, 使 两 侧 液 面 达 到 一 平, 然 后 取 下 连 通 管 2. 点 样 将 完 全 浸 透 的 纤 维 素 薄 膜 取 出 夹 于 滤 纸 中, 轻 轻 吸 去 多 余 的 缓 冲 液, 再 于 薄 膜 的 无 光 泽 面 一 端 距 2~3cm 处, 用 微 量 吸 管 (5μl) 直 线 状 滴 加 1~2μl 血 清 ( 或 将 血 清 滴 加 有 机 玻 片 的 一 端, 再 加 到 薄 膜 上 ) 注 意 要 点 匀 (4) 3. 电 泳 将 点 好 样 品 的 膜 驾 在 电 泳 槽 上 (5), 样 品 的 一 面 向 下, 点 样 端 放 在 阴 极 侧, 然 后 用 四 层 纱 布 搭 桥, 待 膜 均 匀 浸 湿 后 经 过 10~20 分 钟, 通 电, 调 好 所 需 电 压, 电 压 100~120V, 电 流 0.4~0.9mA/cm, 通 电 40 分 钟 关 闭 电 源 4. 染 色 从 电 泳 槽 中 将 膜 取 出 浸 于 染 色 液 中, 染 色 5 分 钟 后 取 出, 用 漂 洗 液 浸 洗 数 次, 脱 色 直 至 无 蛋 白 处 无 色 为 止 ( 蛋 白 质 区 带 呈 兰 色 ) 5. 定 量 将 漂 净 的 膜 吸 干, 剪 下 蛋 白 各 区 带, 分 别 浸 于 0.4N NaOH 4ml 中, 振 摇 数 次, 待 着 色 脱 于 溶 液 中, 于 580~920nm( 或 用 红 色 滤 光 板 ) 比 色, 测 读 各 部 光 密 度 值 ( 注 : 清 蛋 白 部 分 也 可 用 8ml, 计 算 时 此 值 2) 6. 计 算 按 测 得 各 光 密 度 值 计 算 各 部 分 蛋 白 质 的 百 分 比 如 所 测 得 各 部 分 光 密 度 为 D D A D α1 D α2 D β D γ 计 算 按 下 述 方 法 : 光 密 度 总 和 DT=D A +D α1 +D α2 +D β +D γ 各 部 分 蛋 白 质 的 百 分 数 为 : 清 蛋 白 ( % ) = D A D T 以 此 类 推 求 出 各 占 百 分 比 如 欲 求 绝 对 值, 则 将 该 血 清 用 双 缩 脲 法 测 得 其 蛋 白 量, 乘 以 各 部 分 蛋 白 质 的 百 分 比, 即 得 正 常 值 及 临 床 意 义 正 常 值 : 清 蛋 白 92~74%;α 1 球 蛋 白 1~9%;α 2 球 蛋 白 5~11%;β 球 蛋 白 8~12%;γ 球 蛋 白 10~18% 临 床 上 所 见 血 清 蛋 白 电 泳 结 果 的 改 变, 多 表 现 为 原 有 蛋 白 质 部 分 的 升 高 或 降 低 某 些 疾 病 时 常 见 的 时 清 蛋 白 降 低 某 种 球 蛋 白 升 高 因 此 蛋 白 电 泳 有 助 于 临 床 疾 病 的 诊 断 例 如 肝 硬 化 时 清 蛋 白 显 著 降 低,γ 球 蛋 白 可 升 高 2~3 倍 肾 病 综 合 症 和 肾 小 球 肾 炎 时, 清 蛋 白 下 降 α 2 及 β 球 蛋 白 升 高 多 发 性 骨 髓 瘤 病 人 γ 及 β 球 蛋 白 增 加, 有 时 在 β 与 γ 球 蛋 白 之 间 出 现 一 种 新 的 蛋 白 质, 名 为 巨 球 蛋 白 而 原 发 性 肝 细 胞 肝 癌 时 在 清 蛋 白 和 α 1 球 蛋 白 之 间 可 出 现 一 种 新 的 蛋 白 质, 名 为 甲 种 胎 儿 蛋 白 (α-fetoprotein,afp) 注 (1) 本 缓 冲 液 为 参 照 C.J.Brackenrdge 配 方 稍 加 修 改 配 成, 用 此 缓 冲 液 区 带 清 晰

78 分 离 效 果 好 (2) 染 色 液 中 甲 醇 如 用 北 京 化 学 试 剂 厂 的 产 品, 则 漂 洗 液 用 5-7 乙 酸 液 即 可 如 用 沈 阳 试 剂 厂 生 产 的 甲 醇 则 脱 色 困 难, 可 用 试 剂 (5) 漂 洗 液 脱 之 (3) 缓 冲 液 每 用 过 一 次, 把 正 负 极 液 体 调 换 一 次 如 缓 冲 液 已 变 质, 应 及 时 更 换 (4) 点 样 时 一 定 要 将 血 清 均 匀 加 到 膜 粗 面 上, 点 样 量 不 宜 过 多 (5) 纤 维 素 薄 膜 一 定 要 平 架 在 电 泳 槽 上, 中 央 不 可 出 现 凹 面 搭 桥 用 纱 布 务 必 贴 紧 纤 维 素 薄 膜 两 端 实 验 二 十 五 血 清 尿 素 氮 定 量 ( 二 乙 酰 一 肟 法 ) Determination of Serum Urea Nitrogen(Diacetyl Monoxime Method) 原 理 尿 素 是 蛋 白 质 代 谢 终 产 物, 测 定 血 中 尿 素 氮 的 方 法 很 多, 常 用 的 有 尿 素 酶 法 二 乙 酰 一 肟 法 等 本 实 验 采 用 二 乙 酰 一 肟 法 此 法 灵 敏 度 高, 操 作 简 便, 呈 色 稳 定 重 复 性 好, 故 广 为 实 际 工 作 者 所 采 用 血 液 中 尿 素 和 二 乙 酰 一 肟 在 强 酸 中 加 热, 缩 合 呈 黄 色 (1), 如 反 应 体 系 中 加 入 氨 基 硫 脲, 在 磷 酸 中 加 热, 则 反 应 呈 红 色, 其 呈 色 强 度 与 尿 素 量 成 正 比, 与 同 样 处 理 的 标 准 液 进 行 比 色 定 量 试 剂 1. 尿 素 氮 液 (1) 贮 存 液 ( 尿 素 氮 10mg/ml): 精 确 称 取 尿 素 (2) ( 一 级 )2.143g, 用 0.01N H2SO4 液 准 确 溶 成 100ml (2) 应 用 液 ( 尿 素 氮 0.2mg/ml): 取 上 液 2.0ml, 用 0.01N H 2 SO 4 准 确 稀 释 成 100ml 2. 二 乙 酰 一 肟 - 氨 基 硫 脲 液 : 二 乙 酰 一 肟 (Diacetyl Monoxime Method)1.6g, 氨 基 硫 脲 (TioSemicarbazid)0.349g, 加 水 溶 解 并 稀 释 成 1L, 于 棕 色 瓶 保 存, 有 效 一 个 月 3. 氯 化 铁 - 磷 酸 液 (1) 贮 存 液 :FeCl 3 6H 2 O 1g, 溶 于 浓 磷 酸 (85%, 分 析 纯 )20ml, 加 水 稀 释 成 30ml (2) 应 用 液 : 取 上 液 1ml, 用 7.5%( 容 积 百 分 比 )H 2 SO 4 液 稀 释 成 1L 操 作 1. 取 中 试 管 3 支, 分 别 做 好 记 号 标 准 管 加 尿 素 氮 标 准 应 用 液 0.02ml; 空 白 管 加 水 0.02ml; 检 品 管 加 血 清 (3 ) 0.02ml (4 ) 2. 各 加 二 乙 酰 一 肟 - 氨 基 硫 脲 液 1ml, 混 匀, 再 各 加 氯 化 铁 - 磷 酸 应 用 液 4.0ml, 混 匀 3. 放 沸 水 浴 中, 准 确 煮 沸 10 分 钟, 取 出 冷 水 中 3~5 分 钟 用 波 长 520nm 或 绿 色 滤 光 板 比 色 应 在 30 分 钟 内 比 完 4. 计 算 : 血 清 尿 素 氮 m g % = D u D s = D u D s 2 0

79 意 义 1. 正 常 血 清 尿 素 氮 含 量 为 8~20mg%, 约 占 非 蛋 白 氮 的 半 量 2. 蛋 白 质 分 解 增 强, 如 高 蛋 白 食 胃 肠 道 大 出 血 严 重 烧 伤 时 增 高 尿 素 排 出 障 碍 如 慢 性 肾 炎 尿 毒 症 等 严 重 肾 脏 疾 病 时, 血 尿 素 氮 明 显 增 高, 有 时 可 达 非 蛋 白 氮 的 80% 血 尿 素 氮 含 量 的 测 定 在 临 床 上 已 成 为 判 定 肾 脏 功 能 的 重 要 指 标 3. 肝 脏 功 能 严 重 障 碍 时 血 尿 素 可 能 减 少 注 (1) 尿 素 与 二 乙 酰 一 肟 在 强 酸 中 加 热, 反 应 如 下 : H 2 N H 2 N H 3 C C=O + C C N O H 加 强 热 酸 N N C H 3 R +N H 2 O H H 3 C O 尿 素 二 乙 酰 一 肟 呈 色 物 试 剂 中 的 Fe 可 增 强 呈 色, 氨 基 硫 脲 液 呈 色 物 安 定 (2) 尿 素 结 晶 于 100 烘 箱 内 烘 干 2 小 时 到 恒 重, 冷 却 后 使 用 (3) 检 品 用 血 清 或 血 浆 均 可, 亦 直 接 适 用 于 尿 ( 需 稀 释 10~20 倍 ) 尿 素 是 安 定 物 质, 室 温 可 放 置 24~48 小 时, 冰 箱 可 保 存 6 个 月, 如 细 菌 污 染 则 破 坏 (4) 个 别 检 品 管 出 现 混 浊 时, 可 另 作 一 对 照 管, 即 用 H 2 O 代 替 二 乙 酰 一 肟 - 氨 基 硫 脲 液 其 他 同 检 品 管, 与 检 品 管 同 时 测 之 Du=D 检 -D 对, 再 通 过 公 式 求 出 尿 素 的 浓 度 (5) 本 法 重 复 性 好, 回 收 率 为 98~101%, 变 异 系 数 ( 同 时 测 定 ) 为 2.55% 一 般 黄 疸 ( 胆 红 素 <20%), 溶 血 (Hb<150mg%) 不 影 响 结 果 思 考 题 : 1. 血 中 尿 素 与 NPN 及 尿 中 尿 素 之 间 有 什 么 关 系? 2. 已 知 血 尿 素 氮 量, 如 何 换 算 出 尿 素 量? 实 验 二 十 六 牛 血 清 抗 胰 蛋 白 酶 (α 1 -AT) 的 分 离 及 鉴 定 Isolation and Identification of α1-antitrypsin from bovine serum 目 的 要 求 1. 掌 握 α 1 -AT 分 离 纯 化 步 骤 及 鉴 定 方 法 2. 掌 握 蛋 白 质 分 离 纯 化 各 步 骤 的 基 本 原 理 及 操 作 过 程 3. 掌 握 层 析 电 泳 等 基 本 技 术 操 作 及 离 心 机 真 空 泵 等 仪 器 使 用 4. 熟 悉 α 1 -AT 的 基 本 性 质 及 功 能 5. 了 解 生 物 大 分 子 物 质 制 备 技 术, 分 离 纯 化 类 型 (-) 盐 析 法

80 Salting Out Methods 原 理 盐 析 法 是 一 种 利 用 蛋 白 质 在 高 盐 溶 液 中 溶 解 度 不 同 而 分 离 的 方 法 将 硫 酸 铵 加 入 蛋 白 质 溶 液 中, 使 蛋 白 质 表 面 电 荷 被 中 和, 水 化 膜 被 破 坏, 导 致 蛋 白 质 在 水 溶 液 中 的 稳 定 性 因 素 去 除 而 沉 淀 用 于 盐 析 的 盐 类 主 要 有 硫 酸 铵, 氯 化 钠 及 硫 酸 镁 等 硫 酸 铵 的 主 要 优 点 是 溶 解 度 大, 美 升 水 中 可 溶 解 固 体 硫 酸 铵 76g, 这 样 高 的 浓 度 足 以 使 许 多 蛋 白 质 盐 析 出 来, 这 里 介 绍 三 种 用 硫 酸 铵 盐 析 的 方 法 :(1) 加 入 固 体 盐 ;(2) 加 入 盐 的 饱 和 液 ;(3) 通 过 半 透 膜 对 盐 进 行 透 析 这 三 种 方 法 都 必 须 同 时 采 取 机 械 搅 拌 以 防 止 局 部 电 解 质 过 剩 血 清 中 α 1 -AT 分 离 的 第 一 步 是 通 过 分 段 盐 析 法 所 谓 分 段 盐 析 法 是 指 通 过 分 段 改 变 盐 类 浓 度 达 到 分 离 目 的 的 方 法 为 此 需 将 溶 液 中 盐 类 的 浓 度 分 步 提 到 各 种 蛋 白 质 盐 析 所 需 的 浓 度 当 实 验 中 需 要 将 蛋 白 质 溶 液 的 硫 酸 铵 饱 和 度 从 S1 提 高 到 S2 时, 可 以 方 便 地 直 接 从 表 中 ( 见 附 录 ) 查 出 需 要 添 加 固 体 硫 酸 铵 的 g 数, 也 可 以 按 下 式 求 出 添 加 饱 和 硫 酸 铵 的 ml 数 V=V 0 (S 2 -S 1 )/1-S 2 式 中 V 为 需 要 添 加 饱 和 硫 酸 铵 溶 液 的 体 积 (ml 数 ), V 0 为 需 要 提 高 饱 和 度 的 蛋 白 质 溶 液 的 体 积,S 2 为 所 需 达 到 的 饱 和 度,S 1 为 原 来 蛋 白 质 溶 液 的 盐 的 饱 和 度 仪 器 与 试 剂 1. 离 心 机 2. 真 空 泵 3. 饱 和 硫 酸 铵 溶 液 : 称 取 767g 固 体 硫 酸 铵, 加 入 1000ml 水 中, 加 热 使 之 溶 解, 室 温 冷 却 后 4 静 置 过 夜, 然 后 用 氨 水 将 ph 调 至 中 性 4. 固 体 (NH 4 ) 2 SO 牛 血 清 操 作 1. 每 组 量 取 15ml 牛 血 清, 倒 入 一 干 净 烧 杯 中, 缓 慢 加 入 饱 和 硫 酸 铵 15ml, 边 加 边 搅 拌, 然 后 放 入 4 冰 箱 30 分 钟 2. 时 间 到, 从 冰 箱 中 取 出 烧 杯, 将 血 清 倒 入 离 心 管, 配 平,3000rpm 离 心 20 分 钟 3. 离 心 结 束, 将 上 清 倒 入 一 干 净 量 筒 中, 记 录 体 积 后, 倒 入 干 净 烧 杯 中 按 17.6g/100ml 量 取 固 体 硫 酸 铵, 缓 慢 加 入 上 清 中, 边 加 边 搅 拌 4 冰 箱 放 置 30 分 钟 4. 将 烧 杯 中 液 体 倒 入 抽 滤 器 中, 真 空 泵 负 压 抽 滤 5. 刮 下 滤 纸 上 的 粗 提 蛋 白, 用 2ml 缓 冲 液 溶 解, 准 备 加 样 注 意 事 项 1. 盐 析 所 用 器 皿 一 定 要 干 燥 2. 盐 析 时, 应 将 饱 和 硫 酸 铵 或 固 体 硫 酸 铵 加 入 到 血 清 中, 且 边 加 边 搅 拌 思 考 题 1. 维 持 亲 水 胶 体 稳 定 的 因 素 ( ),( ) 2. 在 α 1 -AT 分 离 纯 化 的 盐 析 实 验 中, 先 用 ( ) 饱 和 度 (NH 4 ) 2 SO 4 除 去 ( ), 再 用 (75%) 饱 和 度 (NH 4 ) 2 SO 4 使 ( ) 沉 淀 出 来, 这 种 盐 析 方 法 称 为 ( )

81 ( 二 ) 凝 胶 过 滤 法 Gel Filtration 原 理 凝 胶 过 滤 又 称 分 子 筛 层 析 混 合 物 随 流 动 相 流 经 装 有 凝 胶 作 为 固 定 相 的 层 析 柱 时, 分 子 量 大 的 物 质 因 不 能 进 入 凝 胶 网 孔 而 沿 凝 胶 颗 粒 间 的 空 隙 先 被 洗 脱 ( 阻 力 小, 流 程 短, 流 速 大 ), 分 子 量 小 的 物 质 因 能 进 入 凝 胶 网 孔 而 受 阻 滞, 流 速 缓 慢, 流 程 长 而 后 被 洗 脱, 由 于 流 速 不 同 可 以 把 大 小 不 同 的 分 子 分 开 试 剂 及 器 材 1.Sephadex G 奈 氏 试 剂 3.0.2MpH6.4 硫 酸 缓 冲 液 4. 双 缩 脲 试 剂 5. 反 应 板 操 作 1. 观 看 教 学 录 像 2. 按 录 像 中 步 骤 灌 胶 (1) 连 接 好 层 析 柱 ; (2) 夹 住 出 口, 加 1/3 体 积 的 缓 冲 液, 灌 胶, 待 胶 自 然 沉 降 约 1cm 时, 打 开 出 口, 控 制 滴 速,60 滴 / 分 ; (3) 待 胶 灌 好 后, 连 好 滴 液 瓶, 使 入 口 和 出 口 滴 速 相 同 平 衡 至 入 口 ph 值 与 出 口 ph 值 相 同 ( 即 ph 试 纸 呈 色 相 同 ), 夹 住 出 口, 等 待 加 样 ; 3. 先 用 吸 管 吸 去 胶 面 以 上 的 缓 冲 液, 立 即 加 入 蛋 白 溶 解 液 ( 沿 管 壁 缓 慢 加 入 ) 4. 打 开 出 口, 调 滴 速 15 滴 / 分, 待 蛋 白 液 完 全 进 入 胶 面, 用 少 量 缓 冲 液 清 洗 管 壁 打 开 入 口, 使 上 下 口 滴 速 相 同 5. 观 察 用 双 缩 脲 试 剂 检 测 洗 脱 液 待 试 剂 变 红, 立 即 收 集, 直 到 试 剂 不 变 色 为 止 测 量 并 记 录 收 集 液 体 积, 留 取 1ml, 放 入 一 小 试 管 中, 剩 余 的 收 集 入 一 大 试 管 中, 标 记, 放 冰 箱 冷 冻 层 保 存, 下 次 实 验 用 6. 全 速 洗 脱, 用 奈 氏 试 剂 检 测 洗 脱 液, 直 到 无 橙 色 为 止, 回 收 凝 胶 注 意 事 项 1. 层 析 柱 上 方 要 留 有 少 量 液 体, 避 免 使 凝 胶 暴 露 于 空 气 中 2. 凝 胶 过 滤 上 样 时, 使 样 品 沿 管 壁 缓 缓 流 下, 勿 冲 破 胶 面 思 考 题 1. 凝 胶 过 滤 层 析 中, 小 分 子 量 的 蛋 白 质 在 前 进 的 道 路 上 通 过 凝 胶 时 遇 到 的 阻 力 ( ), 所 以 流 速 ( ), 而 大 分 子 量 的 蛋 白 质 不 能 进 入 胶 粒 内 部, 所 以 比 较 顺 利 地 通 过 胶 粒 间 的 孔 隙 而 流 出, 所 以 阻 力 ( ), 流 速 ( ) + 2. 检 查 NH 4 的 存 在 可 用 ( ) 3. 除 盐 的 方 法 有 ( ) 和 ( )

82 4. 蛋 白 质 的 检 测 用 ( ) ( 三 ) 纤 维 素 离 子 交 换 层 析 DEAE-Cellulose ion exchange chromatography 原 理 DEAE-cellulose 是 应 用 最 广 的 阴 离 子 交 换 剂, 本 身 带 有 正 电 荷, 能 吸 附 溶 液 中 的 阴 离 子, 然 后 用 含 有 阴 离 子 的 溶 液 洗 柱 含 负 电 荷 少 的 离 子 首 先 被 洗 脱 下 来, 增 加 洗 脱 液 的 阴 离 子 浓 度, 含 负 电 荷 多 的 蛋 白 质 也 被 洗 脱 下 来, 于 是 两 种 蛋 白 质 被 分 开 仪 器 与 试 剂 分 光 光 度 计 2. 恒 温 水 浴 3. 层 析 柱 4.DEAE- 纤 维 素 5. 样 品 : 由 G-25 除 盐 的 α 1 -AT 粗 提 液 mol/L 及 0.12mol/LpH6.4 磷 酸 缓 冲 液 7.0.5mol/lL NaCl 8.0.5mol/L HCl 操 作 1. 取 出 上 次 课 的 粗 提 样 品 ( 大 管 ), 低 温 解 冻 2. 观 看 教 学 录 像 3. 灌 胶 ( 方 法 同 上 次 课 ), 平 衡 4. 加 样 洗 脱, 滴 速 15 滴 / 分 5. 用 双 缩 脲 试 剂 检 测 洗 脱 液, 出 现 红 色, 为 第 一 峰 蛋 白, 不 收 集 6. 待 第 二 次 出 现 红 色, 为 第 二 峰 蛋 白, 收 集, 直 至 红 色 消 失 量 取 体 积, 记 录, 放 4 冰 箱 待 用 7. 蛋 白 定 量 双 缩 脲 法 (1) 取 4 支 干 净 的 试 管 如 下 ( 单 位 :ml) 空 白 标 准 小 管 样 品 大 管 样 品 0.9%NaCl 标 准 蛋 白 液 提 取 液 双 缩 脲 试 剂 (2) 混 匀, 室 温 放 置 30 分 钟,520nm 比 色, 记 录 数 据

83 (3) 计 算 蛋 白 质 含 量 g%=d( 待 测 )/D( 标 准 ) 标 准 蛋 白 质 浓 度 (7%) 8. 结 束 后, 将 收 集 液 放 大 试 管 中 标 记, 冰 箱 冷 冻 层 保 存 注 意 事 项 1. 上 样 前, 层 析 柱 要 达 到 平 衡 2. 上 样 后 要 控 制 滴 速 3. 蛋 白 定 量 实 验 中 所 用 试 管 刻 度 吸 管 要 干 燥, 量 取 试 剂 要 准 确 思 考 题 1.DEAE- 纤 维 素 是 一 种 ( ) 离 子 交 换 剂, 它 可 以 与 介 质 中 的 ( ) 离 子 交 换, 被 交 换 的 离 子 可 通 过 改 变 缓 冲 液 的 ( ) 或 ( ) 被 洗 脱 下 来 2.DEAE- 纤 维 素 离 子 交 换 层 析 的 两 个 主 要 过 程 是 ( ) 和 ( ) 3.DEAE- 纤 维 素 离 子 交 换 层 析 实 验 中, 在 洗 第 一 个 蛋 白 峰 时, 滴 速 不 能 高 与 ( ) 4.DEAE- 纤 维 素 离 子 交 换 层 析 实 验 中, 首 先 使 用 ( ) 浓 度 的 缓 冲 液, 洗 脱 的 是 ( ), 然 后 再 用 ( ) 浓 度 的 缓 冲 液 洗 脱, 得 到 的 是 ( ) ( 四 ) 伴 刀 豆 素 球 蛋 白 琼 脂 糖 亲 和 层 析 Affinity Chromatography on Con A-Sepharose 原 理 伴 刀 豆 素 球 蛋 白 ( 简 称 ConA) 是 由 豆 类 分 离 的 植 物 凝 集 素 蛋 白 质, 它 可 与 多 种 多 糖 糖 蛋 白 形 成 不 溶 性 复 合 物, 象 抗 原 抗 体 复 合 物 一 样,ConA 与 含 糖 分 子 的 结 合, 专 一 性 的 要 求 含 有 甘 露 吡 喃 糖 葡 萄 糖 吡 喃 糖 及 类 似 空 间 结 构 的 残 基,ConA 偶 联 在 经 溴 化 氰 活 化 的 Sepharose 4B 上, 每 ml 胶 偶 联 8mg ConA 血 清 中 α 1 -AT 经 过 前 面 的 纯 化, 还 伴 有 血 清 中 含 量 最 大 的 清 蛋 白, 该 蛋 白 与 α 1 -AT 不 论 在 分 子 量 或 等 电 点 上 都 很 接 近, 用 一 般 层 析 方 法 不 易 分 离, 而 利 用 α 1 -AT 含 糖 这 一 特 点 ( 含 糖 量 达 12%), 用 ConA-Sepharose 4B 进 行 亲 和 层 析, 以 达 到 与 血 清 蛋 白 分 离 的 目 的 仪 器 同 离 子 交 换 层 析 试 剂 1.ConA-Sepharose 的 制 备 2. 样 品 的 处 理 : 将 DEAE- 纤 维 素 离 子 交 换 分 离 的 第 二 峰 ( 即 有 α1-at 活 力 部 分 ) 通 过 G-25 凝 胶 层 析 水 洗 除 盐 ( 同 凝 胶 过 滤 ), 经 20% 聚 乙 二 醇 浓 缩 3. 起 始 缓 冲 液 :0.01mol/L ph4.7 磷 酸 盐 缓 冲 液, 内 含 0.5mol/L NaCl 4. 洗 脱 液 : 在 上 述 液 中, 增 加 0.1mol/L 甲 基 葡 萄 糖 操 作 1. 装 柱 : 取 清 洗 干 净 的 层 析 柱 cm, 用 ConA-Sepharose 4B 悬 液 装 柱, 方 法 同 凝 胶 过 滤 2. 用 约 三 个 床 体 积 的 起 始 缓 冲 液 进 行 平 衡

84 3. 上 样 : 将 处 理 样 品 可 直 接 上 样 4. 洗 脱 : 先 用 起 始 缓 冲 液 洗 层 析 柱, 至 用 双 缩 脲 试 剂 检 测 流 出 液 变 化, 收 集 第 一 峰 ; 更 换 洗 脱 液 进 行 洗 脱, 收 集 第 二 峰 ( 为 所 需 要 成 分 ) 5. 柱 的 再 生 : 用 起 始 缓 冲 液 洗 柱, 直 至 流 出 液 检 查 无 糖 ( 五 )α 1 -AT 酶 活 力 测 定 Enzyme Activity Assay 原 理 α 1 -AT 是 通 过 它 对 胰 蛋 白 酶 的 抑 制 力 而 测 定 的, 胰 蛋 白 酶 可 以 水 解 低 分 子 底 物 苯 甲 酰 精 氨 酰 对 硝 基 苯 胺 (BAPNA), 使 之 释 放 出 黄 色 产 物 对 硝 基 苯 胺, 用 410nm 波 长 进 行 比 色 测 定, 抑 制 力 的 测 定 是 将 样 品 与 已 知 量 胰 蛋 白 酶 反 应 后 测 定 胰 蛋 白 酶 的 剩 余 活 力, α 1 -AT 活 力 与 这 种 剩 余 活 力 呈 负 相 关 水 BAPNA 对 硝 基 苯 胺 ( 黄 色 ) 胰 蛋 白 酶 仪 器 分 光 光 度 计 2. 恒 温 水 浴 试 剂 α 1 -AT 抑 制 1. 胰 蛋 白 酶 液 : 取 1mg 胰 蛋 白 酶 溶 解 于 16.6ml ph3 水 中, 浓 度 为 60μg/ml 2. 苯 甲 酰 精 氨 酰 对 硝 基 苯 胺 (BAPNA): 取 18mg BAPNA 溶 解 于 10ml 甲 醇 中, 加 Tris-HCl 缓 冲 液 3.33% 乙 酸 mol/L ph8.2 Tris-HCl 缓 冲 液, 内 含 0.02mol/LCaCl 2 5. 各 步 蛋 白 提 取 液 ( 血 清 G25 样 品 DEAE 样 品 ConA 样 品 ) 操 作 1. 取 6 支 干 试 管 加 液 如 下 ( 单 位 :ml) 空 白 对 照 血 清 小 管 样 品 大 管 样 品 Tris 缓 冲 液 提 取 液 胰 蛋 白 酶

85 37 水 浴 5 分 钟 BAPNA 水 浴 10 分 钟 33% 乙 酸 nm 比 色, 记 录 数 据 酶 活 计 算 α 1 -AT 活 力 (mg/ml)=(d 对 -D 检 )/D 对 /0.1 式 中 D 对 : 标 准 品 光 密 度 ;D 检 : 检 品 光 密 度 ;0.03: 加 入 胰 蛋 白 酶 的 mg 数 意 义 结 果 表 示 每 ml 样 品 ( 所 含 有 的 α 1 -AT) 能 够 抑 制 胰 蛋 白 酶 的 mg 数, 用 mg/ml 表 示 注 酶 活 测 定 实 验 中 所 用 试 管 刻 度 吸 管 要 干 燥, 量 取 试 剂 要 准 确 ( 六 )SDS- 聚 丙 稀 酰 胺 凝 胶 平 板 电 泳 SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis 目 的 1. 学 习 SDS-PAGE 测 定 蛋 白 质 分 子 量 的 原 理 2. 掌 握 垂 直 板 电 泳 的 操 作 方 法 原 理 1. 带 电 质 点 的 运 动 速 度 带 电 质 点 在 电 场 中 的 运 动 速 度 V=EQ/6πrη 迁 移 率 : 带 电 质 点 在 电 场 中 的 泳 动 速 度 常 用 迁 移 率 来 表 示, 即 带 电 质 点 在 单 位 场 强 下 的 移 动 速 度 M(mobility) = V/E = Q/6πrη 2. 电 泳 带 电 质 点 在 电 场 中 向 带 有 异 相 电 荷 的 电 极 移 动, 这 种 现 象 称 为 电 泳 电 泳 分 类 : 移 动 界 面 电 泳 区 带 电 泳 稳 态 电 泳 区 带 电 泳 是 在 半 固 相 或 胶 状 介 质 上 加 一 个 点 或 一 薄 层 样 品 溶 液, 然 后 加 电 场, 分 子 在 支 持 介 质 上 或 支 持 介 质 中 迁 移 支 持 介 质 的 作 用 主 要 是 为 了 防 止 机 械 干 扰 和 由 于 温 度 变 化 以 及 大 分 子 溶 液 的 高 密 度 而 产 生 的 对 流 区 带 电 泳 使 用 不 同 的 支 持 介 质, 早 期 有 滤 纸 玻 璃 珠 淀 粉 粒 纤 维 素 粉 海 砂 海 绵 聚 氯 乙 烯 树 脂 ; 以 后 有 淀 粉 凝 胶 琼 脂 凝 胶 醋 酸 纤 维 素 膜, 现 在 则 多 用 聚 丙 烯 酰 胺 (PAGE) 和 琼 脂 糖 凝 胶 3.SDS- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳

86 SDS- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳, 是 在 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 系 统 中 引 进 S D S( 十 二 烷 基 磺 酸 钠 ), SDS 能 断 裂 分 子 内 和 分 子 间 氢 键, 破 坏 蛋 白 质 的 二 级 和 三 级 结 构, 强 还 原 剂 能 使 半 胱 氨 酸 之 间 的 二 硫 键 断 裂, 蛋 白 质 在 一 定 浓 度 的 含 有 强 还 原 剂 的 SDS 溶 液 中, 与 SDS 分 子 按 比 例 结 合, 形 成 带 负 电 荷 的 SDS- 蛋 白 质 复 合 物, 这 种 复 合 物 由 于 结 合 大 量 的 SDS, 使 蛋 白 质 丧 失 了 原 有 的 电 荷 状 态 形 成 仅 保 持 原 有 分 子 大 小 为 特 征 的 负 离 子 团 块, 从 而 降 低 或 消 除 了 各 种 蛋 白 质 分 子 之 间 天 然 的 电 荷 差 异, 由 于 SDS 与 蛋 白 质 的 结 合 是 按 重 量 成 比 例 的, 因 此 在 进 行 电 泳 时, 蛋 白 质 分 子 的 迁 移 速 度 取 决 于 分 子 大 小 4.SDS- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 的 特 点 SDS- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 系 统 的 不 连 续 性 : 凝 胶 孔 径 的 不 连 续 性, 缓 冲 液 ph 值 的 不 连 续 性, 缓 冲 液 种 类 的 不 连 续 性 SDS- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 的 三 种 效 应 : 样 品 的 浓 缩 效 应, 电 荷 效 应, 分 子 筛 效 应 试 剂 1. 电 极 缓 冲 液 (ph 8.3): 0.025mol/L 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 (Tris), 0.1% 十 二 烷 基 硫 酸 钠 (SDS) 称 3.02 克 Tris 克 甘 氨 酸,1 克 SDS, 用 蒸 馏 水 定 容 至 1000 毫 升 2. 分 离 胶 缓 冲 液 (ph8.8): 1.5 mol/l Tris-HCl 称 克 Tris,80 毫 升 蒸 馏 水 溶 解, 用 浓 HCl 调 ph 8.8, 蒸 馏 水 定 容 至 100 毫 升 3. 浓 缩 胶 缓 冲 液 (ph6.8): 0.5 mol/l Tris-HCl 称 克 Tris,80 毫 升 蒸 馏 水 溶 解, 用 浓 HCl 调 ph 6.8, 蒸 馏 水 定 容 至 100 毫 升 4. 凝 胶 :30% 丙 稀 酰 胺 (Acr), 1.6% 甲 叉 双 丙 稀 酰 胺 (Bis) 称 30 克 Acr 0.8 克 Bis, 加 少 许 蒸 馏 水 热 溶, 用 蒸 馏 水 定 容 至 100 毫 升 5. 染 色 液 : 称 2.5 克 考 马 斯 亮 兰 R-250, 加 500ml 甲 醇,100ml 醋 酸, 用 蒸 馏 水 定 容 至 1000ml 6. 脱 色 液 : 取 250ml 甲 醇,70ml 醋 酸, 用 蒸 馏 水 定 容 至 1000ml 7. 样 品 缓 冲 液 : 取 10%SDS 1ml, 二 巯 基 乙 醇 (13.5mol/L)0.6ml, 甘 油 1.5ml,0.05% 溴 酚 兰 少 许,0.5mol Tris-HCl(pH6.8) 定 容 至 10ml 8.10%SDS % 溴 酚 兰 操 作 1. 样 品 处 理 : 将 血 清 用 样 品 缓 冲 液 稀 释 至 蛋 白 含 量 为 1mg/ml, 煮 沸 5 分 钟 2. 配 胶 ( 分 离 胶, 浓 缩 胶 ), 如 下 表 : 试 剂 (ml) 10% 分 离 胶 4% 浓 缩 胶 30%Acr-Bis M Tris-HCl ph M Tris-HCl ph H 2 O

87 甘 油 %SDS 过 硫 酸 铵 10%( 催 化 剂 ) 75μl 200μl TEMED( 加 速 剂 ) 20μl 20μl Acr + Bis 过 硫 酸 铵 TEMED 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 (PAG) 3. 组 装 电 泳 槽 4. 灌 入 分 离 胶, 缓 慢 加 入 1~2cm 高 度 蒸 馏 水, 使 重 叠 于 胶 面 上, 待 分 离 胶 凝 固 后, 倒 出 胶 面 上 层 水, 剩 余 的 水 用 滤 纸 吸 干 5. 灌 浓 缩 胶, 插 入 梳 子 6. 胶 凝 固 后, 拔 出 梳 子 7. 在 梳 子 孔 中 加 入 处 理 好 的 样 品 20µl( 样 品 处 理 如 7 所 述 ), 每 板 胶 需 加 10µl 蛋 白 质 分 子 量 Marker 8. 样 品 处 理 : 将 每 次 留 取 的 各 管 样 品, 首 先 用 蒸 馏 水 稀 释 到 2mg/ml; 再 取 稀 释 液 按 样 品 样 品 缓 冲 液 =1 1 比 例 加 入 样 品 缓 冲 液, 煮 沸 5 分 钟, 冷 却 后 加 样 9. 连 接 好 电 极 线, 黑 对 黑, 红 对 红 稳 压 100v, 电 泳 2~3 小 时 10. 电 泳 结 束, 取 下 胶, 去 掉 浓 缩 胶 后, 染 色 40 分 钟 11. 脱 色 24 小 时 12. 干 胶 2~3 天 注 意 事 项 1.30%Acr-Bis 是 神 经 毒 化 合 物, 操 作 时 要 小 心, 做 好 个 人 防 护 2. 过 硫 酸 铵 需 现 用 现 配 3. 过 硫 酸 铵 和 TEMED 在 灌 胶 前 加 入 即 可 4. 用 微 量 加 样 器 上 样 时, 勿 刺 破 胶 面 思 考 题 1. 在 不 连 续 体 系 SDS-PAGE 中, 当 分 离 胶 加 完 后, 需 在 其 上 加 一 层 水, 为 什 么? 2. 样 品 缓 冲 液 中 各 组 分 的 作 用? 3. 样 品 液 为 何 在 加 样 前 需 在 沸 水 中 加 热 几 分 钟? ( 七 ) 总 结 各 步 纯 化 结 果 列 表 分 离 阶 段 总 体 积 (ml) 蛋 白 浓 度 (mg/ml) α 1 -AT 抑 制 活 力 α 1 -AT 总 抑 制 α 1 -AT 比 活 性 纯 化 回 收 率

88 (mg/ml) 活 力 mg/mg 倍 数 (%) 血 清 G-25 DEAE Con A 总 体 积 : 各 部 分 样 品 收 集 总 ml 数 蛋 白 浓 度 : 根 据 双 缩 脲 定 蛋 白 试 验 计 算 Cu/Cs=Au/As(Cs=7%=7g/100ml=70mg/ml) α 1 -AT 抑 制 活 力 :(A 对 -A 检 )/A 对 = α 1 -AT 总 抑 制 活 力 : 各 部 分 样 品 抑 制 活 力 总 体 积 α 1 -AT 比 活 性 : 各 部 分 样 品 α 1 -AT 抑 制 活 力 / 相 应 蛋 白 浓 度 纯 化 倍 数 : 各 部 分 样 品 α 1 -AT 比 活 性 / 血 清 比 活 性 回 收 率 (%): 各 部 分 样 品 总 抑 制 活 力 / 血 清 总 抑 制 活 力 100% 实 验 二 十 七 免 疫 印 迹 Western Blot 原 理 免 疫 印 迹 是 将 蛋 白 质 转 移 到 膜 上, 然 后 利 用 抗 体 进 行 检 测 的 技 术 Western Blot 采 用 的 是 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳, 被 检 测 物 是 蛋 白 质, 探 针 是 抗 体, 显 色 用 标 记 的 二 抗 经 过 PAGE 分 离 的 蛋 白 质 样 品, 转 移 到 固 相 载 体 ( 例 如 硝 酸 纤 维 素 薄 膜 ) 上, 固 相 载 体 以 非 共 价 键 形 式 吸 附 蛋 白 质, 且 能 保 持 电 泳 分 离 的 多 肽 类 型 及 其 生 物 学 活 性 不 变 以 固 相 载 体 上 的 蛋 白 质 或 多 肽 作 为 抗 原, 与 对 应 的 抗 体 起 免 疫 反 应, 再 与 酶 或 同 位 素 标 记 的 第 二 抗 体 起 反 应, 经 过 底 物 显 色 或 放 射 自 显 影 以 检 测 电 泳 分 离 的 特 异 性 目 的 基 因 表 达 的 蛋 白 成 分 该 技 术 也 广 泛 应 用 于 检 测 蛋 白 水 平 的 表 达 Western Blot 由 三 部 分 实 验 组 成 : 1. 生 物 大 分 子 凝 胶 电 泳 分 离 一 般 是 SDS-PAGE 各 种 蛋 白 质 按 分 子 量 大 小 排 列 2. 分 子 区 带 的 转 移 和 固 定 将 凝 胶 电 泳 已 分 离 的 区 带 转 移 并 固 定 到 一 种 特 殊 的 载 体 上, 使 之 形 成 稳 定 的 经 的 起 各 种 材 料 处 理 并 容 易 检 出 的, 即 容 易 和 各 自 的 特 意 行 配 体 结 合 的 固 定 化 生 物 大 分 子 比 如 NC 膜 3. 特 异 性 谱 带 的 检 出 利 用 抗 原 抗 体 反 应, 将 酶 荧 光 素 或 同 位 素 标 记 的 特 异 蛋 白 分 别 欧 联 在 此 特 异 抗 体 的 二 抗 上, 再 用 显 色 荧 光 放 射 自 显 影 等 方 法 检 出 我 们 感 兴 趣 的 抗 原 western 显 色 的 方 法 主 要 有 以 下 几 种 :

89 1 放 射 自 显 影 ;2 底 物 化 学 发 光 ECL;3 底 物 荧 光 ECF;4 底 物 DAB 呈 色 现 常 用 的 有 底 物 化 学 发 光 ECL 和 底 物 DAB 呈 色, 体 同 水 平 和 实 验 条 件 的 是 用 第 一 种 方 法, 目 前 发 表 文 章 通 常 是 用 底 物 化 学 发 光 ECL 只 要 买 现 成 的 试 剂 盒 就 行, 操 作 也 比 较 简 单, 原 理 如 下 ( 二 抗 用 HRP 标 记 ): 反 应 底 物 为 过 氧 化 物 + 鲁 米 诺, 如 遇 到 HRP, 即 发 光, 可 使 胶 片 曝 光, 就 可 洗 出 条 带 本 实 验 在 实 验 二 十 六 的 基 础 上, 对 1 -AT 进 行 蛋 白 免 疫 印 迹 的 检 测 器 材 电 泳 系 列 仪 器 : 电 泳 仪, 电 泳 槽, 制 胶 器,1.5mm 玻 璃 板, 加 样 梳, 微 量 进 样 器, 一 次 性 吸 管 等 转 印 系 列 仪 器 : 转 印 槽, 海 绵, 滤 纸,NC 膜 或 PVDF 膜 等 孵 育 系 列 仪 器 : 钝 头 镊 子, 摇 床, 封 闭 瓶 皿 等 试 剂 1.5 样 品 缓 冲 液 (10ml): 0.5M ph6.8 Tris-HCl 2.13ml, 甘 油 5ml,SDS 1g, 溴 酚 兰 少 量,β- 巯 基 乙 醇 2.56ml 2.5 电 泳 缓 冲 液 (500ml):36g 甘 氨 酸,7.55 g Tris,2.5g SDS 3. 电 转 缓 冲 液 (1000ml, 用 于 湿 转 ):3.02 g Tris,14.42 g 甘 氨 酸,100ml MeOH, 加 dh 2 O 到 1000ml 4.TBS:50 mm Tris-Cl [ph 7.5],150 mm NaCl,6.05 g Tris,8.76 g NaCl,970 ml dh 2 O, 用 盐 酸 调 ph 到 TTBS:TBS + 0.1% Tween 20 操 作 步 骤 1. 蛋 白 的 获 取 : 实 验 二 十 六 提 纯 的 1 -AT 样 品 2.SDS-PAGE: 见 实 验 二 十 六 3. 转 膜 根 据 所 选 蛋 白 的 分 子 量, 截 取 分 离 胶, 转 印 到 NC 膜 上 转 印 方 法 : 先 将 海 棉 滤 纸 转 印 膜 在 转 印 液 中 浸 泡 在 转 印 槽 的 夹 板 中 铺 好 海 绵 和 滤 纸, 放 好 所 取 的 分 离 胶, 对 应 铺 好 NC 膜 或 PVDF 膜,( 注 意 : 膜 和 胶 之 间 不 能 有 气 泡 ), 固 定 好 并 放 入 转 印 槽 中, 注 满 转 印 液 开 始 进 行 转 印 ( 记 住 : 膜 在 正 极!) 转 印 条 件 :50 伏,100 min ( 不 同 分 子 条 件 不 同 ) 转 印 液 可 反 复 利 用 多 次 膜 做 好 标 记 以 区 分 反 正 面 4. 封 闭 : 转 印 结 束 后 打 开 转 印 装 备 将 膜 用 镊 子 小 心 取 出, 放 入 5% 奶 粉 的 TBS 中, 4 封 闭 过 夜 ( 或 室 温 1 hour 放 入 摇 床 慢 慢 孵 育 ) 5.TBS 洗 3*10 min 换 液 6. 一 抗 室 温 孵 育 1 hour 7.TTBS 洗 10 min 2 次 8.TBS 洗 10 min 2 次 9. 二 抗 室 温 孵 育 40 min 10.TTBS 冲 洗 10min 3 次 ( 时 间 可 适 度 延 长 ) 步 骤 5~10 孵 育 过 程 均 放 入 水 平 摇 床 中 进 行, 注 意 及 时 换 液

90 11.ECL 发 光 : 仔 细 阅 读 说 明 书, 按 照 说 明 选 取 等 量 的 A 液 与 B 液 混 合, 将 膜 沥 干, 放 于 保 鲜 膜 之 上 再 将 发 光 混 合 液 滴 于 膜 上, 放 入 专 门 的 仪 器 中 ( 比 如 LAS3000) 冷 光 成 像 注 : 一 抗 :AAT, 编 号 2A-0007, 中 杉, 兔 抗 人 七 核 酸 实 验 二 十 八 RNA 的 制 备 与 分 析 Preparation and Analysis of RNA 原 理 RNA 是 一 类 极 易 降 解 的 分 子, 要 得 到 完 整 的 RNA 必 须 最 大 限 度 地 抑 制 提 取 过 程 中 核 糖 核 酸 酶 (RNase) 对 RNA 的 降 解 高 浓 度 强 变 性 剂 异 硫 氰 酸 胍, 可 溶 解 蛋 白 质, 破 坏 细 胞 结 构, 使 核 蛋 白 与 核 酸 分 离, 失 活 RNA 酶, 所 以 RNA 从 细 胞 中 释 放 出 来 时 不 被 降 解 细 胞 裂 解 后, 除 了 RNA, 还 有 DNA 蛋 白 质 和 细 胞 碎 片, 通 过 酚 氯 仿 等 有 机 溶 剂 处 理 得 到 纯 化 均 一 总 RNA RNA 可 直 接 用 于 Northern 斑 点 分 析 斑 点 杂 交,Poly (A) + 分 离, 体 外 翻 译,RNase 封 阻 分 析 和 分 子 克 隆 提 取 RNA 的 五 个 关 键 点 :1 样 品 细 胞 或 组 织 的 有 效 破 碎 ;2 有 效 地 使 核 蛋 白 复 合 体 变 性 ;3 对 内 源 RNA 酶 的 有 效 抑 制 ; 4 有 效 地 将 RNA 从 DNA 和 蛋 白 混 合 物 中 分 离 ;5 对 于 多 糖 含 量 高 的 样 品 还 牵 涉 到 多 糖 杂 质 的 有 效 去 除 Trizol 试 剂 含 有 异 硫 氰 酸 胍 和 酚 两 种 RNA 酶 抑 制 剂, 提 取 的 总 RNA 无 蛋 白 和 DNA 污 染 Trizol 试 剂 不 仅 可 裂 解 细 胞, 而 且 可 保 持 RNA 的 完 整 性 加 入 氯 仿 后 离 心, 溶 液 则 分 为 水 相 和 有 机 相,RNA 绝 大 部 分 保 留 于 水 相,RNA 转 移 至 水 相 后, 用 异 丙 醇 沉 淀 以 获 得 RNA, 移 去 水 相 后, 样 品 中 的 DNA 和 蛋 白 质 可 用 连 续 沉 淀 法 获 得 用 乙 醇 沉 淀 可 在 中 间 相 获 得 DNA, 用 异 丙 醇 沉 淀 可 在 有 机 相 获 得 蛋 白 质 该 技 术 适 用 于 在 人 动 物 植 物 细 菌 少 量 组 织 (50~100mg) 和 细 胞 ( ) 以 及 大 量 组 织 (1g) 和 细 胞 ( ) 中 分 离 RNA, 效 果 很 好, 整 个 过 程 可 在 1h 内 完 成 Trizol 法 适 用 于 人 类 动 物 植 物 微 生 物 的 组 织 或 培 养 细 菌, 样 品 量 从 几 十 毫 克 至 几 克 RNA 为 单 链 分 子, 链 内 碱 基 容 易 配 对 形 成 二 级 结 构 RNA 电 泳 可 以 在 变 性 和 非 变 性 两 种 条 件 下 进 行 非 变 性 电 泳 使 用 1.0%-1.4% 的 凝 胶, 不 同 的 RNA 条 带 也 能 分 开, 但 其 分 子 量 与 电 泳 移 动 距 离 没 有 严 格 的 相 关 性, 无 法 判 断 其 分 子 量 只 有 在 完 全 变 性 的 条 件 下, RNA 的 泳 动 率 与 分 子 量 的 对 数 呈 现 线 性 关 系 因 此 要 测 定 RNA 分 子 量 时, 一 定 要 用 变 性 凝 胶 因 此 必 须 破 坏 RNA 的 空 间 结 构 后, 在 变 性 条 件 下 电 泳, 才 能 使 RNA 移 动 距 离 与 其 分 子 量 对 数 成 正 比 常 用 的 RNA 的 变 性 胶 电 泳 有 两 种, 一 种 为 含 有 乙 二 醛 和 二 甲 基 亚 砜 (DMSO) 的 凝 胶, 另 一 种 为 含 有 甲 醛 的 凝 胶, 前 者 比 后 者 更 难 电 泳, 因 为 电 泳 缓 慢 而 且 需 要 电 泳 液 循 环, 避 免 形 成 高 H + 梯 度 两 者 的 分 辨 率 相 近, 但 前 者 的 杂 交 带 更 锐

91 利, 而 甲 醛 变 性 胶 电 泳 操 作 更 方 便 由 于 RNA 酶 广 泛 存 在 而 稳 定, 一 般 反 应 不 需 要 辅 助 因 子 RNA 抑 制 剂 中 只 要 存 在 少 量 的 RNA 酶 就 会 导 致 RNA 降 解, 因 此 RNA 制 备 与 分 析 操 作 过 程 中 一 定 要 严 格 控 制 外 源 性 和 内 源 性 RNA 酶 的 污 染 RNA 酶 可 耐 受 多 种 处 理 而 不 被 灭 活, 如 煮 沸 高 压 灭 菌 等 外 源 性 的 RNA 酶 多 存 在 于 手 汗 唾 液 和 灰 尘 中, 实 验 中 使 用 的 RNA 酶 也 会 造 成 污 染 这 些 外 源 性 RNA 酶 可 污 染 器 械 玻 璃 制 品 塑 料 制 品 电 泳 槽 研 究 人 员 的 手 及 各 种 试 剂 各 种 组 织 和 细 胞 中 则 含 有 大 量 内 源 性 RNA 酶 1. 防 止 RNA 酶 污 染 的 措 施 (1) 所 有 的 玻 璃 器 皿 均 应 在 使 用 前 于 180 的 高 温 下 干 烤 6h 或 更 长 时 间 (1) (2) 凡 是 不 能 用 高 温 烘 烤 的 材 料 如 塑 料 器 皿 可 用 0.1%DEPC 水 浸 泡 或 用 氯 仿 冲 洗 (3) 有 机 玻 璃 的 电 泳 槽 等, 可 先 用 去 污 剂 洗 涤, 双 蒸 水 冲 洗, 乙 醇 干 燥, 再 浸 泡 在 3%H 2 O 2 室 温 下 10min, 然 后 用 0.1%DEPC 水 冲 洗, 晾 干 (4) 所 用 的 溶 液 或 水 尽 可 能 的 进 行 高 压 处 理 (5) 操 作 人 员 戴 一 次 性 口 罩 帽 子 手 套, 实 验 过 程 中 手 套 要 勤 换 (6) 设 置 RNA 操 作 专 用 实 验 室, 所 有 器 械 等 应 为 专 用 2. 常 用 的 RNA 酶 抑 制 剂 (1) 焦 磷 酸 二 乙 酯 (DEPC): 是 一 种 强 烈 但 不 彻 底 的 RNA 酶 抑 制 剂 它 通 过 和 RNA 酶 的 活 性 基 团 组 氨 酸 的 咪 唑 环 结 合 使 蛋 白 质 变 性, 从 而 抑 制 酶 的 活 性 DEPC 可 不 加 选 择 地 修 饰 蛋 白 质 和 RNA, 因 此 在 分 离 和 纯 化 RNA 过 程 中 不 能 使 用 (2) 异 硫 氰 酸 胍 : 目 前 被 认 为 是 最 有 效 的 RNA 酶 抑 制 剂, 它 在 裂 解 组 织 的 同 时 也 使 RNA 酶 失 活 它 既 可 破 坏 细 胞 结 构 使 核 酸 从 核 蛋 白 中 解 离 出 来, 又 对 RNA 酶 有 强 烈 的 变 性 作 用 (3) 氧 钒 核 糖 核 苷 复 合 物 : 由 氧 化 钒 离 子 和 核 苷 形 成 的 复 合 物, 它 和 RNA 酶 结 合 形 成 过 渡 态 类 物 质, 几 乎 能 完 全 抑 制 RNA 酶 的 活 性 氧 钒 核 糖 核 苷 复 合 物 可 加 入 完 整 细 胞 中, 在 RNA 提 取 和 纯 化 的 所 有 过 程 中, 其 使 用 浓 度 都 是 10mmol/L 所 得 到 的 mrna 可 直 接 在 蛙 卵 母 细 胞 中 进 行 翻 译, 并 能 作 为 某 些 外 酶 促 反 应 ( 如 mrna 反 转 录 ) 的 模 板 然 而 氧 钒 核 糖 核 苷 复 合 物 强 烈 抑 制 mrna 在 无 细 胞 体 系 中 的 翻 译, 因 此 必 须 用 含 0.1% 羟 基 喹 啉 的 苯 酚 [ 用 0.01mol/L Tris-HCl(pH7.8) 平 衡 ] 多 次 抽 提 以 去 除 之 (4)RNA 酶 的 蛋 白 抑 制 剂 (RNasin) 是 从 大 鼠 肝 或 人 胎 盘 中 提 取 得 来 的 酸 性 糖 蛋 白 RNasin 是 RNA 酶 的 一 种 非 竞 争 性 抑 制 剂, 可 以 和 多 种 RNA 酶 结 合, 使 其 失 活 此 蛋 白 质 体 内 可 能 是 血 管 生 成 素 的 抑 制 剂, 血 管 生 成 素 是 氨 基 酸 序 列 和 推 测 的 三 级 结 构 与 胰 RNA 酶 类 似 的 一 种 血 管 生 成 因 子, 该 蛋 白 质 应 置 于 含 5mmol/L 二 硫 苏 糖 醇 (DTT) 的 50% 甘 油 中, 贮 存 于 -20 抑 制 剂 制 品 冻 融 数 次 后 或 放 置 在 氧 化 条 件 下 即 应 弃 之 不 用, 因 为 上 述 处 理 会 使 蛋 白 质 变 性 从 而 释 放 出 所 结 合 的 RNA 酶 因 此, 在 使 用 变 性 剂 裂 解 哺 乳 动 物 细 胞 这 一 提 取 RNA 的 初 始 步 骤 中 不 应 使 用 这 种 蛋 白 抑 制 剂 其 最 大 活 性 的 发 挥 要 求 巯 基 试 剂, 而 且 它 并 不 干 扰 反 转 录 或 mrna 在 无 细 胞 体 系 中 的 翻 译 试 剂 1.0.1%DEPC:37 处 理 12 小 时, 分 钟 高 压 清 除 剩 余 DEPC ( 2) 2.Trizol 试 剂 (Takara 或 Invitrogen 公 司 )

92 3. 氯 仿 4. 异 丙 醇 5.75% 酒 精 ( 用 DEPC 水 配 制 ) 6.3M 醋 酸 钠 (ph5.2): 称 量 40.8g NaAc 3H 2 O 置 于 100~200ml 烧 杯 中, 加 入 约 40ml 的 去 离 子 水 搅 拌 溶 解 加 入 冰 醋 酸 调 节 ph 5.2, 加 DEPC 水 将 溶 液 定 容 至 100ml. 高 温 高 压 灭 菌 后, 室 温 保 存 7.10 PBS:80g NaCl 2g KCl 14.4g Na 2 HPO 4 和 2.4g KH 2 PO 4, 溶 于 800ml 蒸 馏 水 中, 用 HCl 调 节 溶 液 的 ph 值 至 7.4, 最 后 加 蒸 馏 水 定 容 至 1L 即 可 在 15lbf/in2( Pa) 高 压 下 蒸 气 灭 菌 ( 至 少 20 分 钟 ), 保 存 于 室 温 或 4 冰 箱 中 8. 上 样 染 料 :50% 甘 油,1mmol/L EDTA,0.4% 溴 酚 蓝,0.4% 二 甲 苯 蓝 9. 甲 醛 10. 去 离 子 甲 酰 胺 11. 高 纯 度 琼 脂 糖 12. 溴 化 乙 锭 (1mg/ml) 操 作 1.RNA 提 取 (1) 将 50~100mg 组 织 加 入 1ml Trizol 液 中, 用 组 织 粉 碎 机 破 碎 组 织 (3) (2) 研 磨 液 室 温 放 置 5min, 然 后 以 每 1ml Trizol 液 加 入 1 ml 的 比 例 加 入 氯 仿, 盖 紧 离 心 管, 用 手 剧 烈 摇 荡 离 心 管 15s,8000rpm 离 心 5min (3) 取 上 层 水 相 于 一 新 离 心 管 中, 按 每 1ml Trizol 液 加 1ml 异 丙 醇 的 比 例 加 入 异 丙 醇, 室 温 放 置 10min,12000rpm 离 心 15min (4) 弃 去 上 清 液, 按 每 1ml Trizol 液 加 入 至 少 1 ml 的 比 例 加 入 75% 乙 醇, 涡 旋 混 匀, 4 下 12000rpm 离 心 5min (5) 小 心 弃 去 上 清 液, 然 后 室 温 或 真 空 干 燥 5~10min ( 4), 然 后 DEPC 水 溶 解, 检 测 RNA 浓 度 为 了 长 期 保 存 RNA, 在 一 定 量 的 RNA 中 加 入 1/10 体 积 的 3mol 醋 酸 钠 (ph5.2) 和 2 倍 以 上 体 积 的 乙 醇 2.RNA 电 泳 (1) 电 泳 槽 处 理 : 电 泳 槽 用 去 污 剂 洗 干 净 ( 一 般 浸 泡 过 夜 ) 后, 用 乙 醇 干 燥, 然 后 盛 满 3% 的 过 氧 化 氢 于 室 温 处 理 10min, 最 后 用 0.1%DEPC 处 理 水 彻 底 冲 洗 (2)1.2% 甲 醛 变 性 琼 脂 糖 凝 胶 : 根 据 电 泳 凝 胶 槽 的 大 小 和 上 样 量 体 积, 计 算 制 胶 的 体 积 制 备 100ml 凝 胶 时, 称 取 1.2g 琼 脂 糖, 加 72ml DEPC 处 理 的 灭 菌 水, 微 波 炉 中 融 化 后, 冷 却 至 60, 加 入 10ml 10 PBS 和 18ml 7 %(12.3mol/L) 甲 醛 ( 终 浓 度 为 2.2mol/L), 铺 制 凝 胶 (3)RNA 变 性 : 取 DEPC 处 理 过 的 500μl 小 离 心 管, 依 次 放 入 如 下 试 剂 :10 PBS 缓 冲 液 2μl, 甲 醛 3.5μl, 甲 酰 胺 10μl,RNA 样 品 5-30μg,1mg/ml 溴 乙 锭 0.5μl, 加 DEPC 水 至 20μl 72 变 性 5min 后, 在 冰 上 迅 速 冷 却, 瞬 时 离 心 收 集 样 品 (4) 上 样 电 泳 : 上 样 前 将 凝 胶 在 1 PBS 缓 冲 液 中 预 电 泳 5min, 随 后 上 样, 同 时 加 入 RNA 标 准 分 子 量 参 照 物 在 3~5V/cm 条 件 下 电 泳 2~3h, 期 间 可 将 电 泳 缓 冲 液 混 合 一 次

93 (5) 照 相 : 电 泳 结 束 后 ( 溴 酚 蓝 迁 移 出 8cm), 在 紫 外 灯 下 观 察 28S 和 18S rrna, 并 照 相 注 (1) 有 机 玻 璃 器 皿 因 可 被 氯 仿 腐 蚀, 故 不 能 使 用 (2)DEPC 也 可 能 和 腺 嘌 呤 作 用 而 破 坏 mrna 的 活 性 因 DEPC 能 与 胺 和 巯 基 反 应, 因 而 含 Tris 和 DTT 的 试 剂 不 能 用 DEPC 处 理 Tris 溶 液 可 用 DEPC 处 理 过 的 无 菌 水 配 制 然 后 高 压 灭 菌 不 能 高 压 灭 菌 的 试 剂, 应 当 用 经 DEPC 处 理 过 的 无 菌 双 蒸 水 配 制, 然 后 经 0.22μm 滤 膜 除 菌 (3) 样 品 总 体 积 不 能 超 过 所 用 Trizol 体 积 的 10% (4) 不 要 干 燥 过 分, 否 则 会 降 低 RNA 的 溶 解 度 (5) 甲 醛 易 挥 发, 而 且 有 毒, 制 备 变 性 胶 应 在 通 风 橱 内 进 行, 电 泳 时 应 盖 严 电 泳 槽 思 考 题 1. 防 止 RNA 酶 污 染 的 措 施 有 那 些? 2.RNA 酶 抑 制 剂 的 种 类 及 作 用 机 理? 3.RNA 提 取 和 电 泳 的 用 途? 实 验 二 十 九 从 小 鼠 肝 中 提 取 DNA Isolation of Liver DNA from Mouse 目 的 要 求 1. 掌 握 DNA 分 离 的 原 理 各 试 剂 作 用 及 操 作 过 程 2. 掌 握 肝 匀 浆 制 备 及 注 意 事 项 3. 熟 悉 DNA 浓 度 纯 度 测 定 原 理 及 方 法, 仪 器 使 用 4. 了 解 分 子 生 物 学 实 验 技 术 ( 录 像 ) 教 学 内 容 1. 从 肝 中 提 取, 小 鼠 处 死 法, 试 剂 配 制, 离 心 机 使 用, 肝 匀 浆 制 备,DNA 分 离 纯 化 原 理 及 注 意 事 项 2.DNA 浓 度 纯 度 测 定 原 理 及 方 法, 仪 器 使 用 3.( 录 像 带 教 学 ) 核 酸 分 离 纯 化,DNA 序 列 测 定, 核 酸 探 针 标 记 与 分 子 杂 交 原 理 在 浓 氯 化 钠 (1-2M) 溶 液 中, 脱 氧 核 糖 核 蛋 白 的 溶 解 度 很 大, 核 糖 核 蛋 白 的 溶 解 度 很 小 在 稀 氯 化 钠 (0.14M) 溶 液 中, 脱 氧 核 糖 核 蛋 白 的 溶 解 度 很 小, 核 糖 核 蛋 白 的 溶 解 度 很 大 因 此, 可 利 用 不 同 浓 度 的 氯 化 钠 溶 液, 将 脱 氧 核 糖 核 蛋 白 和 核 糖 核 蛋 白 从 样 品 中 分 别 提 取 出 来 将 抽 提 得 到 的 核 蛋 白 用 SDS( 十 二 烷 基 磺 酸 钠 ) 处 理,DNA( 或 RNA) 即 与 蛋 白 质 分 开, 可 用 氯 仿 - 异 戊 醇 将 蛋 白 质 沉 淀 除 去, 而 DNA 则 溶 解 于 溶 液 中 向 溶 液 中 加 入 适 量 乙 醇,DNA 即 析 出 为 了 防 止 DNA( 或 RNA) 酶 解, 提 取 时 加 EDTA(ethy-lenediamine tetracetic acid,

94 乙 二 胺 四 乙 酸 ) 1. 生 物 组 织 中 DNA 是 以 核 蛋 白 形 式 存 在,DNA- 蛋 白 质 2. 在 稀 NaCl 溶 液 中,DNA- 核 蛋 白 溶 解 度 小,RNA- 核 蛋 白 溶 解 度 大 ; 在 浓 NaCl 溶 液 中,DNA- 核 蛋 白 溶 解 度 大,RNA- 核 蛋 白 溶 解 度 小 ( 分 开 DNA 和 RNA) 3.SDS SDS( 十 二 烷 基 硫 酸 钠 ), 使 蛋 白 质 变 性, 分 开 DNA- 蛋 白 质 ( 分 开 DNA 和 蛋 白 质 ) (1)SDS 是 一 种 阴 离 子 表 面 活 性 剂, 能 使 蛋 白 质 的 氢 键 和 疏 水 键 打 开, 并 结 合 到 蛋 白 质 的 疏 水 部 位 ;(2)SDS 可 引 起 蛋 白 质 构 象 改 变 ;(3) 是 一 种 良 好 的 解 离 剂, 可 使 蛋 白 质 溶 解, 变 性 ;(4) 形 成 SDS- 蛋 白 质 复 合 物, 并 使 复 合 物 带 负 电 4. 氯 仿 - 异 丙 醇 可 以 将 蛋 白 质 除 去 离 心 后 形 成 三 层 上 层 :DNA 异 丙 醇 和 水 中 层 : 蛋 白 质 沉 淀 下 层 : 氯 仿 5. 适 量 的 冷 无 水 乙 醇 可 使 DNA 析 出 6. 防 止 DNA 酶 解 的 办 法 加 入 EDTA( 乙 二 胺 四 乙 酸 ) 7. 检 查 DNA 纯 度 :A 260 /A 280 A 260 /A 280 =1.8, 高 纯 度 DNA A 260 /A 280 <1.8, 含 蛋 白 质 A 260 /A 280 >1.8, 含 RNA 器 材 1. 匀 浆 机 2. 离 心 机 试 剂 M NaCl,0.1M EDTA 2.5M NaCl 3.30% SDS 4. 氯 仿 - 异 丙 醇 M NaCl M 柠 檬 酸 钠 6. 冷 无 水 乙 醇 操 作 1. 提 取 脱 氧 核 糖 核 蛋 白 杀 鼠 取 肝 (3 克 )( 2~3 只 小 鼠 ) 15ml 0.14M NaCl,0.1M EDTA 洗 去 血 液 肝 匀 浆 制 备 (1) 乳 钵 中 剪 碎 (2)15ml 0.14M NaCl,0.1M EDTA (3) 不 要 用 力 研 磨 离 心 (3000rpm 10 分 钟 ) 弃 上 清

95 沉 淀 0.14M NaCl,0.1M EDTA 15ml 轻 轻 悬 起 沉 淀 离 心 3000rpm 10 分 钟 弃 上 清 沉 淀 ( 加 入 0.14M NaCl,0.1M EDTA 10ml 使 之 溶 解, 转 至 50 毫 升 三 角 烧 瓶 中 ) 2. 除 蛋 白 质 : 30% SDS 1ml 混 匀 60 水 浴 轻 摇 15 分 钟 取 出 冷 至 室 温 5M NaCl 2.75ml 轻 摇 10 分 钟 氯 仿 - 异 丙 醇 19ml( 沉 淀 蛋 白 ) 轻 摇 20 分 钟 离 心 2500rpm 10 分 3. 粗 提 DNA: 吸 上 清 ( 水 相 ) 转 入 玻 璃 离 心 管 (DNA) 用 吸 管 吸 弃 沉 淀 ( 剩 余 物 ) 冰 乙 醇 ( 无 水 乙 醇 )1.5 倍 体 积 轻 摇 DNA 析 出 ( 用 镊 子 或 玻 璃 棒 取 出 置 试 管 中 ) 4. 检 测 : 0.015M NaCl M 柠 檬 酸 钠 1 毫 升 稀 释 适 当 倍 数 : 量 取 10-50μl(0.1ml 刻 度 吸 管 取 ) 原 液, 用 0.015M NaCl M 柠 檬 酸 钠 稀 释 到 5ml( 稀 释 倍 ) 测 A 260 /A 280 ( 使 用 0.015M NaCl M 柠 檬 酸 钠 做 空 白 溶 液 ) 5. 计 算 : DNA 浓 度 :(μg/ml)=a 稀 释 倍 数 DNA 纯 度 :A 260 /A 280 (1)A 260 /A 280 =1.8, 高 纯 度 DNA (2)A 260 /A 280 <1.8, 含 蛋 白 质 (3)A 260 /A 280 >1.8, 含 RNA 注 意 事 项 1. 研 磨 时 上 下 用 力, 尽 量 避 免 DNA 链 断 裂 2. 加 入 氯 仿 异 丙 醇 后 勿 剧 烈 摇 动, 以 免 大 分 子 断 裂 3. 有 机 溶 剂 对 人 体 有 害, 操 作 时 要 注 意 实 验 三 十 核 酸 的 定 量 测 定 ( 定 磷 法 )

96 Determination of Nucleic Acid 原 理 核 酸 分 子 中 含 有 一 定 比 例 的 磷, 可 用 以 求 得 核 酸 的 量 各 种 含 磷 有 机 物 经 硫 酸 或 过 氯 酸 水 解, 使 有 机 磷 消 化 成 为 无 机 磷 无 机 磷 在 酸 性 条 件 下, 与 钼 酸 盐 ( 常 用 钼 酸 铵 或 钼 酸 钠 ) 反 应 生 成 磷 钼 酸 盐 络 合 物 用 还 原 剂 处 理, 磷 钼 酸 盐 络 合 物 被 还 原 生 成 钼 蓝, 在 660nm 处 有 最 大 光 吸 收 峰 在 一 定 浓 度 范 围 内, 颜 色 的 深 浅 与 磷 含 量 成 正 比 关 系 因 此 可 应 用 分 光 光 度 法 进 行 磷 的 定 量 测 定 在 酸 性 环 境 中, 定 磷 试 剂 中 的 钼 酸 铵 以 钼 酸 形 式 与 样 品 中 的 磷 酸 反 应 生 成 磷 钼 酸, 当 有 还 原 剂 存 在 时 磷 钼 酸 立 即 转 变 蓝 色 的 还 原 产 物 钼 蓝 H 3 PO 4 +12H 2 MoO 4 H 3 P(Mo 3 O 10 )4+12H 2 O 还 原 剂 钼 蓝 钼 蓝 最 大 的 光 吸 收 在 nm 波 长 处 当 使 用 抗 坏 血 酸 为 还 原 剂 时, 测 定 的 最 适 范 围 为 1~10 微 克 无 机 磷 测 定 样 品 核 酸 总 磷 量, 需 先 将 它 用 硫 酸 或 过 氯 酸 消 化 成 无 机 磷 再 行 测 定 总 磷 量 减 去 未 消 化 样 品 中 测 得 的 无 机 磷 量, 即 得 核 酸 含 磷 量, 由 此 可 以 计 算 出 核 酸 含 量 器 材 1. 分 析 天 平 2. 容 量 瓶 (50 及 100 毫 升 ) 3. 台 式 离 心 机 4. 凯 氏 烧 瓶 (25 毫 升 ) 5. 恒 温 水 浴 锅 烘 箱 型 分 光 光 度 计 试 剂 以 下 试 剂 均 用 分 析 纯, 溶 液 要 用 重 蒸 水 配 制 1. 标 准 磷 溶 液 : 将 分 析 纯 磷 酸 二 氢 钾 (KH 2 PO 4 ) 预 先 置 于 110 烘 箱 烘 至 恒 重 然 后 放 在 干 燥 器 内 使 温 度 降 到 室 温, 精 确 称 取 克 用 少 量 蒸 馏 水 溶 解, 转 移 至 定 容 至 500 毫 升 容 量 瓶 中, 加 入 5 毫 升 10N 硫 酸 及 氯 仿 数 滴, 用 蒸 馏 水 定 容 至 500 毫 升 作 为 贮 存 液 置 冰 箱 中 待 用 测 定 时, 取 此 溶 液 稀 释 20 倍, 使 含 磷 量 为 20 微 克 磷 / 毫 升 2. 定 磷 试 剂 (1)17% 硫 酸 : 取 17ml 浓 硫 酸 ( 比 重 1.84) 缓 缓 加 入 83ml 水 中 (2)2.5% 钼 酸 铵 溶 液 : 取 2.5g 钼 酸 铵 溶 于 100ml 蒸 馏 水 中 (3)10% 抗 坏 血 酸 溶 液 : 取 10g 抗 坏 血 酸 溶 于 100ml 蒸 馏 水 中, 贮 棕 色 瓶 中 溶 液 呈 淡 黄 色 尚 可 用, 呈 深 黄 色 甚 至 棕 色 即 失 败 临 用 时 将 上 述 溶 液 与 水 按 以 下 比 例 混 合,17% 硫 酸 2.5% 钼 酸 铵 溶 液 10% 抗 坏 血 酸 溶 液 水 = (V/V) 3.5% 氨 水 (A.R)

97 4.27% 硫 酸 :27ml 浓 硫 酸 ( 比 重 1.84,A.R) 缓 慢 倒 入 73ml 水 中 5.30% 过 氧 化 氢 操 作 1. 标 准 曲 线 的 绘 制 : 取 8 支 洗 净 烘 干 的 硬 质 玻 璃 试 管, 按 下 表 加 入 标 准 磷 溶 液 水 及 定 磷 试 剂 管 号 标 准 磷 溶 液 (ml) 蒸 馏 水 (ml) 定 磷 试 剂 (ml) OD 将 试 管 内 溶 液 立 即 摇 匀, 于 45 恒 温 水 浴 内 保 温 10 分 钟 取 出 冷 却 至 室 温, 于 660nm 处 测 定 光 密 度 以 标 准 磷 含 量 ( 微 克 ) 为 横 坐 标, 光 密 度 为 纵 坐 标, 绘 出 标 准 曲 线 2. 测 总 磷 量 : 称 取 样 品 ( 如 粗 核 酸 )0.1g, 用 少 量 水 溶 解 ( 如 不 溶, 可 滴 加 5% 氨 水 至 ph7.0) 转 移 至 50ml 容 量 瓶 中, 加 水 至 刻 度 ( 此 溶 液 每 毫 升 含 样 品 2mg) 吸 取 上 述 样 品 液 1.0ml, 置 于 50ml 凯 氏 烧 瓶 中, 加 入 2.5ml27% 硫 酸 及 一 粒 玻 璃 珠, 并 加 30%H 2 O 2 数 滴, 然 后 在 凯 氏 烧 瓶 口 插 一 小 漏 斗, 放 在 通 风 橱 内 加 热, 至 溶 液 透 明, 表 示 消 化 完 成 3. 测 无 机 磷 量 : 冷 却, 将 消 化 液 移 入 100ml 容 量 瓶 中, 用 少 量 水 洗 涤 凯 氏 烧 瓶 两 次, 洗 涤 液 一 并 倒 入 容 量 瓶, 再 加 水 至 刻 度, 混 匀 后 吸 取 3.0ml 置 于 试 管 中, 加 入 定 磷 试 剂 3.0ml 45 保 温 10 分 钟, 冷 却, 用 660nm 测 定 结 果 与 讨 论 1. 绘 制 出 标 准 曲 线 2. 计 算 总 磷 OD 无 机 磷 OD 660 = 有 机 磷 OD 660 由 标 准 曲 线 查 得 无 机 磷 ug 数 (X) 按 下 式 计 算 样 品 中 核 酸 的 百 分 含 量 : 思 考 题 定 磷 法 的 操 作 中 有 哪 些 关 键 环 节? 为 什 么 所 用 水 的 质 量 消 化 时 间 钼 酸 铵 的 质 量 和 显 色 时 酸 的 浓 度 对 测 定 结 果 影 响 很 大? 操 作 中 应 如 何 控 制? 实 验 三 十 一 DNA 的 定 量 测 定 ( 改 良 二 苯 胺 法 ) Determination of DNA

98 原 理 在 强 酸 环 境 下 加 热, 可 以 使 DNA 中 嘌 呤 碱 与 脱 氧 核 糖 间 的 糖 苷 键 断 裂, 因 而 DNA 酸 解 后 生 成 嘌 呤 碱 基, 脱 氧 核 糖 和 脱 氧 嘧 啶 核 苷 酸 脱 氧 核 糖 在 酸 性 条 件 下 脱 水 生 成 ω- 羟 基 -γ- 酮 基 戊 醛, 后 者 与 二 苯 胺 作 用 后 显 示 兰 色, 在 595nm 有 最 大 吸 收 反 应 方 程 式 如 下 : 用 二 苯 胺 法 测 定 DNA 含 量 时 灵 敏 度 不 高, 待 测 样 品 中 DNA 含 量 若 低 于 50ug/ml 就 难 以 测 定 如 用 乙 酸 戊 酯 把 反 应 中 形 成 的 蓝 色 产 物 抽 提 到 有 机 溶 剂 相 内, 则 可 使 测 定 灵 敏 度 提 高 按 此 改 良 二 苯 胺 法, 待 测 样 品 中 DNA 含 量 在 10~150ug(150ug/ml) 范 围 内, 光 密 度 与 DNA 含 量 成 正 比 关 系 样 品 中 含 少 量 RNA 不 影 响 测 定, 而 蛋 白 质 多 种 糖 类 及 衍 生 物 芳 香 羟 基 醛 亦 能 与 二 苯 胺 形 成 各 种 有 色 物 质, 故 干 扰 测 定 器 材 1. 分 析 天 平 2. 恒 温 水 浴 锅 3. 试 管 4. 吸 量 管 (2 毫 升 和 5 毫 升 ) 5. 分 光 光 度 计 试 剂 1.DNA 标 准 溶 液 ( 须 经 定 磷 确 定 其 纯 度 ): 准 确 称 取 鱼 精 DNA, 并 以 水 配 成 100ug/ml 的 溶 液 (DNA 在 水 内 较 难 溶, 可 隔 夜 配 制 ) 2. 待 测 DNA: 以 水 配 成 约 50ug/ml 的 溶 液 3.4% 二 苯 胺 冰 醋 酸 溶 液 :20g 二 苯 胺 加 少 量 冰 醋 酸 微 热 至 全 部 溶 解 后, 再 加 冰 醋 酸 至 500ml, 只 限 当 天 使 用 4.20% 过 氯 酸 :74.4ml 70% 过 氯 酸 (HClO 4 分 析 纯 ) 加 水 至 250ml 5. 乙 酸 戊 酯 或 乙 酸 异 戊 酯 操 作 1. 按 下 表 在 各 管 内 分 别 加 入 不 同 量 的 100ug/mlDNA 标 准 溶 液, 然 后 每 管 加 水 使 体 积 均 达 3ml 向 各 管 加 入 2ml20% 过 氯 酸 与 4ml 4% 二 苯 胺 冰 醋 酸 溶 液, 充 分 混 匀 56

99 保 温 一 小 时 后, 流 水 冷 却, 并 向 各 管 反 应 混 合 液 内 加 2ml 乙 酸 戊 酯, 试 管 加 塞, 剧 烈 振 摇, 使 反 应 生 成 的 蓝 色 物 资 充 分 地 被 抽 提 到 乙 酸 戊 酯 相 内, 室 温 下 放 置 5~10 分 钟 使 有 机 相 与 水 相 分 层 清 楚 用 滴 管 小 心 吸 取 上 层 有 机 相, 使 用 0.5cm 光 电 比 色 杯 于 595nm 处 测 定 光 密 度 (OD) 值 管 号 DNA 标 准 液 (ml) 蒸 馏 水 (ml) % 过 氯 酸 (ml) % 二 苯 胺 冰 醋 酸 (ml) 水 浴 保 温 一 小 时 水 冷 却 乙 酸 戊 酯 (ml) 充 分 抽 提 后 静 止 5~10 分 钟 后 取 上 层 OD 595 以 OD 595 为 纵 坐 标,DNAug 数 为 横 坐 标, 绘 出 标 准 曲 线 2. 样 品 中 DNA 含 量 测 定 ( 如 下 表 ) 吸 取 每 毫 升 约 含 50ugDNA 地 待 测 样 品 溶 液 2ml, 与 制 作 标 准 曲 线 同 样 步 骤 操 作 595nm 下 测 得 OD 值 从 标 准 曲 线 上 可 查 得 出 相 应 DNA 量 标 品 测 定 需 与 制 作 标 准 曲 线 使 用 同 一 批 试 剂, 同 一 台 分 光 光 度 计 管 号 样 品 溶 液 (ml) 蒸 馏 水 (ml) % 过 氯 酸 (ml) % 二 苯 胺 冰 醋 酸 (ml) 水 浴 保 温 一 小 时 水 冷 却 乙 酸 戊 酯 (ml) 充 分 抽 提 后 静 止 5~10 分 钟 后 取 上 层 OD 595 DNA 量 (µg)

100 平 均 DNA 量 (µg) 计 算 按 下 式 计 算 : DNA % = Y N 2 W % 式 中 :Y 为 样 品 测 得 OD 595 值 在 标 准 曲 线 查 得 得 DNA µg 数 N 为 所 测 样 品 稀 释 倍 数 W 为 配 制 样 品 溶 液 时 所 用 的 样 品 mg 数 2 为 测 定 时 取 2ml 样 品 溶 液 思 考 题 利 用 二 苯 胺 法 测 定 DNA 含 量 时, 若 DNA 样 品 中 混 有 DNA 或 蛋 白 质 糖 类 时, 是 否 会 有 干 扰? 实 验 三 十 二 DNA 酶 解 和 DNA 片 段 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 Enzymolysis of DNA and Agarose gel Electrophoresis of DNA Segments 目 的 要 求 1. 掌 握 限 制 性 内 切 酶 的 概 念 特 性 及 工 作 原 理 2. 掌 握 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离 DNA 片 段 的 原 理 及 操 作 方 法 3. 熟 悉 电 泳 基 本 原 理 和 影 响 因 素 一 DNA 酶 解 原 理 1. 限 制 性 核 酸 内 切 酶 : 是 一 类 能 识 别 双 链 DNA 分 子 特 异 性 核 酸 序 列, 并 在 识 别 位 点 及 其 周 围 进 行 切 割 的 DNA 水 解 酶 限 制 性 内 切 酶 识 别 的 序 列 回 文 结 构 限 制 性 内 切 酶 识 别 的 DNA 位 点 的 核 苷 酸 序 列 呈 二 元 旋 转 对 称 如 :HindⅢ A A G C T T 2. 酶 的 单 位 数 : 在 最 适 温 度 ph 条 件 下,1 小 时 完 全 水 解 1μg λdna 所 需 酶 量 为 1 个 单 位 试 剂 1.λDNA(0.38μg/μl) 2.HindⅢ,XhoⅠ(16u/μl) 3. 酶 解 Buffer (Tris-HCl,NaCl,MgCl2,DTT ) 4. 反 应 终 止 液 ( 溴 酚 蓝 1%,SDS 1%,EDTA 2%, 甘 油 50%) 仪 器 及 耗 材 EP 管 EP 管 架 微 量 移 液 器 离 心 机 水 域 箱

101 操 作 1. 取 4 个 EP 管 按 下 表 所 示 加 样 后 充 分 混 匀, 离 心 试 剂 λdna(μl) XhoⅠ(μl) HindⅢ(μl) H 2 O(μl) 水 浴 2 小 时 3. 保 温 结 束 后 加 入 终 止 液 5μl, 混 匀, 离 心 二 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 原 理 1.DNA 含 有 PO 3-4 基 团, 在 ph7.5 Buffer 中 带 负 电, 在 电 场 中 向 正 极 移 动 由 于 不 同 大 小 的 DNA 片 段 的 电 荷 密 度 大 致 相 同, 自 由 电 泳 时, 各 核 酸 分 子 的 迁 移 率 区 别 很 小, 难 以 分 开 2. 选 用 适 当 浓 度 的 凝 胶 作 为 支 持 物, 使 之 具 备 一 定 的 孔 径, 即 可 发 挥 分 子 筛 效 应 ( 凝 胶 孔 径 对 大 小 不 同 的 分 子 有 不 同 的 阻 力 ), 使 大 小 不 同 的 核 酸 片 段 迁 移 率 出 现 较 大 差 异, 达 到 分 离 的 目 的, 同 样 条 件 对 Maker 电 泳, 对 比 观 察 DNA 酶 解 效 果 3.DNA 经 溴 乙 锭 (EB) 染 色, 溴 乙 锭 可 以 插 入 DNA 双 螺 旋 结 构 两 个 碱 基 之 间, 与 核 酸 形 成 络 合 物, 在 紫 外 (302nm,360nm) 激 发 下, 产 生 桔 黄 色 由 于 EB 有 致 癌 性 故 目 前 本 实 验 室 采 用 低 毒 的 DNAgreen 进 行 染 色, 呈 绿 色 荧 光 试 剂 1.0.8% 琼 脂 糖 凝 胶 2.TAE 液 3.Marker 4.EB /DNAgreen 仪 器 水 平 电 泳 槽 电 泳 仪 紫 外 分 析 仪 微 波 炉 微 量 移 液 器 100 ml 量 筒 等 操 作 1. 琼 脂 糖 凝 胶 的 制 备 ( 带 上 手 套 操 作 ): (1) 称 取 0.4g 琼 脂 糖, 置 于 三 角 烧 瓶 中, 加 入 50mlTAE 液, 标 记 液 面 位 置, 将 该 三 角 烧 瓶 置 于 微 波 炉 加 热 直 至 琼 脂 糖 完 全 溶 解 ( 加 热 过 程 注 意 观 察, 勿 因 沸 腾 使 液 体 溢 出 ), 如 果 瓶 中 液 面 有 明 显 下 降 用 蒸 馏 水 补 齐, 摇 匀 后 室 温 放 置, 冷 却 至 65, 然 后 加 入 DNAgreen 2μl 混 匀, 备 用 (2) 取 塑 料 内 槽, 洗 净 晾 干 放 入 水 平 模 具 适 宜 方 格 内 ( 使 黑 色 宽 带 位 于 梳 子 正 下 方 ), 压 紧 后 将 模 具 水 平 放 置 将 冷 却 至 65 左 右 的 琼 脂 糖 凝 胶 液, 倒 在 塑 料 内 槽 上, 使 胶 液 缓 慢 地 展 开, 直 到 在 整 个 内 槽 表 面 形 成 均 匀 的 胶 层, 放 好 梳 子, 室 温 下 静 置 30min

102 左 右, 待 凝 固 完 全 后, 轻 轻 拔 出 梳 子, 在 胶 板 上 即 形 成 相 互 隔 开 的 上 样 孔 将 铺 好 胶 的 塑 料 内 槽 放 在 含 有 1 TAE 液 的 电 泳 槽 中 使 用 ( 液 体 应 没 过 凝 胶 表 面 ) 2. 电 泳 仪 接 线 ( 带 上 手 套 操 作 ): 黑 ( 负 ) 黑, 红 ( 正 ) 红 3. 加 样 : 用 微 量 加 样 器 将 上 述 4 个 样 品 和 DNA Marker 分 别 加 入 胶 板 的 上 样 孔 内 每 加 完 一 个 样 品, 换 一 个 加 样 头 加 样 时 应 防 止 碰 坏 上 样 孔 周 围 的 凝 胶 面 以 及 穿 透 凝 胶 底 部, 本 实 验 样 品 孔 容 量 约 15~20μl Marker 加 入 第 一 或 最 后 一 个 上 样 孔 内 4. 电 泳 ( 带 上 手 套 操 作 ): 加 完 样 后 的 凝 胶 板 即 可 通 电 进 行 电 泳 ; 建 议 在 80~100V 的 电 压 下 电 泳 ; 当 溴 酚 兰 移 出 2/3 处 停 止 电 泳 5. 观 察 与 记 录 : 在 紫 外 灯 下 观 察 染 色 后 的 凝 胶 DNA 存 在 处 显 示 出 绿 色 的 荧 光 条 带 记 录 电 泳 图 谱 注 λ 噬 菌 体 DNA 全 长 48,502bp; 有 7 个 HindⅢ 酶 切 位 点 将 噬 菌 体 切 成 23,130 2,027 2,322 9, ,557 4,361 八 条 带 ;1 个 XhoⅠ 酶 切 位 点 可 将 噬 菌 体 切 成 33,498 和 15,004 两 条 带 (XhoⅠ 可 将 9,416 片 段 切 成 6019 和 3397 两 条 带 ) 注 意 事 项 1.EP 管 内 加 入 试 剂 混 合 后 要 离 心 2. 加 完 反 应 终 止 液 后 要 立 即 清 洗 微 量 移 液 器 3. 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 时 上 样 孔 应 位 于 负 极 端 4. 溴 乙 锭 可 引 起 基 因 突 变,DNAgreen 具 低 毒 性, 操 作 时 带 手 套 要 注 意 个 人 防 护 5. 紫 外 光 对 人 眼 有 害, 观 察 时 加 盖 玻 璃 罩, 观 察 时 间 不 宜 太 长 思 考 题 为 什 么 λdna 经 HindⅢ 酶 切 后 564bp 和 125bp 的 片 段 看 不 见? 实 验 三 十 三 PCR Polymerase Chain Reaction 目 的 要 求 1. 掌 握 PCR 技 术 概 念 原 理 方 法 及 应 用 2. 熟 悉 PCR 仪 的 使 用 及 注 意 事 项 3. 了 解 TaqDNA 聚 合 酶 的 来 源 和 特 点, 引 物 的 设 计 原 则 4. 了 解 现 代 PCR 技 术 的 扩 展 教 学 内 容 1.PCR 技 术 概 念 原 理 方 法 应 用 及 技 术 扩 展 2.TaqDNA 聚 合 酶 的 来 源 和 特 点, 引 物 的 设 计 原 则 3.PCR 仪 的 使 用 及 注 意 事 项 4. 模 板 的 制 备 原 理 PCR 即 聚 合 酶 链 式 反 应, 是 指 在 DNA 聚 合 酶 催 化 下, 以 母 链 DNA 为 模 板, 以 特 定 引 物 为 延 伸 起 点, 通 过 变 性 退 火 延 伸 等 步 骤, 体 外 复 制 出 与 母 链 模 板 DNA 互 补 的 子

103 链 DNA 的 过 程 PCR 技 术 的 基 本 原 理 是 一 项 DNA 体 外 合 成 放 大 技 术, 能 快 速 特 异 地 在 体 外 扩 增 任 何 目 的 DNA 可 用 于 基 因 分 离 克 隆, 序 列 分 析, 基 因 表 达 调 控, 基 因 多 态 性 研 究 等 许 多 方 面 PCR 技 术 实 际 上 是 在 摸 板 DNA 引 物 和 4 种 脱 氧 核 苷 酸 存 在 的 条 件 下, 依 赖 于 DNA 聚 合 酶 的 酶 促 反 应 试 剂 1.Taq DNA 聚 合 酶 2.dNTP 3. 引 物 4. 模 板 5. 缓 冲 液 (50mmol/L,10mmol/L,Tris-HCl,1.5mmol/L MgCl 2 ) 步 骤 1. 将 PCR 反 应 组 分 放 在 冰 上 解 冻, 并 进 行 短 时 间 离 心 以 使 组 分 沉 降 管 底 2. 根 据 下 列 顺 序 在 PCR 反 应 管 中 加 入 各 反 应 组 分 : 试 剂 体 积 10 Reaction Buffer(MgCl 2 free) MgCl 2 (25mM) 4 dntp Mixture(each 2.5mM) Primer L-500(12.5pmoles/μl) Primer R-500(12.5pmoles/μl) DNA(1ng/μl) Taq DNA Polymerase(3u/μl) 5μl 3μl 4μl 2μl 2μl 2μl 2~3μl

104 Nuclease-free H 2 O to 3. 将 反 应 组 分 混 匀 后, 加 入 50μl 石 蜡 油, 离 心 数 秒 4. 根 据 下 列 参 数 进 行 PCR 扩 增 : 50μl 预 变 性 94 3~5min 变 性 94 60s 退 火 55~65 60s 25~30 循 环 延 伸 72 60s 最 终 延 伸 72 5min 5. 将 10μl PCR 扩 增 产 物 ( 含 1 上 样 缓 冲 液 ) 点 样 于 % 琼 脂 糖 凝 胶 中, 电 泳 后 在 紫 外 灯 下 观 察 DNA 扩 增 产 物 PCR 技 术 的 应 用 1. 在 法 医 学 上 的 应 用 : 一 根 毛 发, 一 滴 血, 少 量 精 液, 牙 齿, 口 腔 上 皮 细 胞 可 进 行 DNA 鉴 定 2. 遗 传 疾 病 的 诊 断 和 治 疗 : 可 在 怀 孕 早 期 获 得 少 量 样 品 ( 羊 水, 绒 毛 ) 进 行 扩 增, 发 现 异 常 的 胎 儿 早 期 终 止 妊 娠 3. 在 艾 滋 病 检 测 中 的 应 用 : 对 于 大 多 数 AIDS 患 者, 通 过 血 清 学 方 法 检 测 其 血 清 中 HIV-1 抗 体 可 特 异 敏 感 地 加 以 筛 查 和 诊 断, 但 对 于 疑 似 HIV-1 感 染 的 病 例, 早 期 机 体 内 尚 无 HIV-1 抗 体 产 生, 或 携 带 病 毒 的 母 亲 生 产 的 婴 儿 是 否 已 感 染 HIV-1( 垂 直 传 播, 新 生 儿 体 内 尚 无 抗 体 产 生 ), 直 接 检 测 病 毒 则 十 分 必 要 4. 检 测 癌 基 因 : 可 选 择 性 地 扩 增 ras 基 因 百 万 倍, 灵 敏 度 为 5-10%, 即 100 个 细 胞 含 有 5-10 个 具 有 ras 基 因 点 突 变 的 细 胞 即 可 检 测 出 来 5.DNA 克 隆 : 只 要 知 道 目 的 基 因 的 两 侧 序 列, 通 过 一 对 和 模 板 DNA 互 补 的 引 物, 就 可 以 十 分 有 效 地 扩 增 出 所 需 要 的 片 段 6.DNA 序 列 的 测 定 和 基 因 定 量 7. 考 古 学 的 应 用 PCR 技 术 的 扩 展 1.RT-PCR 2. 不 对 称 PCR 3. 巢 式 PCR 4. 原 位 PCR 5. 反 向 PCR 6. 重 组 PCR 注 意 事 项 1. 加 各 试 剂 时, 要 注 意 准 确 操 作 2.PCR 仪 运 行 时 勿 随 意 改 动 3. 溴 乙 锭 可 引 起 基 因 突 变, 操 作 时 要 注 意 个 人 防 护 4. 紫 外 光 对 人 眼 有 害, 观 察 结 果 时 加 盖 玻 璃 罩, 观 察 时 间 不 宜 太 长

105 原 理 八 血 液 生 化 实 验 三 十 四 血 清 无 机 磷 定 量 Determination of Inorganic Phosphate in Serum 血 清 中 无 机 磷 即 指 以 无 机 磷 酸 盐 形 式 存 在 的 磷 磷 酸 盐 与 钼 酸 形 成 磷 钼 酸, 磷 钼 酸 被 还 原 剂 ( 本 法 中 用 Fe 2+ ) 还 原 生 成 钼 兰, 钼 兰 为 低 价 钼 的 化 合 物, 溶 液 呈 蓝 色 此 蓝 色 深 浅 与 无 机 磷 量 成 正 比 血 清 除 蛋 白 滤 液 与 磷 标 准 液 同 样 处 理 呈 色, 进 行 比 色 定 量 试 剂 0.4mg 磷 8µg 1.12% 三 氯 醋 酸 液 :CCl 3 COOH 12g, 加 水 溶 成 100ml 血 清 除 蛋 白 用 % 三 氯 醋 酸 液 : 空 白 及 稀 释 标 准 液 用 3. 磷 标 准 液 : (1) 贮 存 液 : 纯 KH 2 PO g, 加 水 溶 成 1l 放 冰 箱 中 保 存 此 液 3ml 中 含 磷 (2) 应 用 液 : 取 上 液 2ml, 用 11.5% 三 氯 醋 酸 液 准 确 稀 释 成 100ml 此 液 3ml 中 含 4. 硫 酸 亚 铁 钼 酸 铵 液 : (NH 4 ) 2 MoO 4 + H 2 SO 4 H 2 MoO 4 + (NH 4 ) 2 SO 4 12H 2 MoO 4 + H 3 PO 4 H 3 PO 4 12MoO H 2 O H 3 PO 4 12MoO 3 Fe 2+ MoO + 钼 兰 还 原 (1)10% 钼 酸 铵 10N 硫 酸 液, 先 配 制 10N 硫 酸 液, 向 约 600ml 水 中 慢 慢 地 加 入 浓 硫 酸 278ml, 边 加 边 摇 匀, 冷 后 加 水 成 1l, 混 匀 称 取 (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 4H 2 O 50g, 放 大 烧 杯 中, 边 摇 边 加 10N H 2 SO 4 液 约 400ml, 全 溶 后 移 入 500ml 量 瓶 中, 并 用 10N H 2 SO 4 液 冲 洗 烧 杯 使 全 部 移 入 量 瓶, 加 10N H 2 SO 4 液 到 刻 线, 混 匀 (2) 硫 酸 亚 铁 钼 酸 铵 液 : 要 在 临 用 前 新 配 移 取 上 液 10.0ml, 放 入 100ml 干 净 的 棕 色 量 瓶 中, 加 入 约 70ml, 混 匀 加 入 FeSO 4 5H 2 O 粉 末 5g, 加 水 到 刻 线, 振 摇 使 结 晶 全 溶 并 混 匀, 必 要 时 过 滤 放 棕 色 瓶 中 操 作 1. 于 试 管 或 离 心 管 中 加 12% 三 氯 醋 酸 液 3.8ml, 加 血 清 0.20ml, 充 分 混 匀, 放 置 10 分 钟, 过 滤 ( 小 漏 斗 干 滤 纸 ) 或 离 心 (1 500~2 000rpm,10 分 钟 ) 2. 取 3 支 试 管, 做 好 记 号, 分 别 加 溶 液 如 下 : B( 空 白 ):11.5% 三 氯 醋 酸 液 3ml S( 标 准 ): 磷 标 准 液 3.0ml U( 检 品 ): 血 清 除 蛋 白 上 清 3.0ml

106 3. 各 加 硫 酸 亚 铁 钼 酸 铵 溶 液 2ml, 混 匀, 约 10 分 钟 后 进 行 比 色 用 650nm 或 红 色 滤 光 板 以 空 白 管 调 零, 读 取 标 准 管 及 检 品 管 光 密 度 值 (Ds,Du) 4. 计 算 : 意 义 mg% = Du Ds = Du Ds 正 常 值 : 成 人 为 3~5mg%(1.7~2.9mEq/L), 儿 童 为 4.5~6.5mg% 2. 血 无 机 磷 增 高 见 于 甲 状 旁 腺 机 能 减 退 肾 功 能 不 全 摄 取 过 量 维 生 素 D 或 多 发 性 骨 髓 瘤 骨 折 愈 合 期 等 血 磷 减 低 见 于 甲 状 旁 腺 机 能 亢 进 佝 偻 病 骨 质 软 化 症 糖 尿 病 或 大 量 葡 萄 糖 静 脉 注 入 等 注 (1) 本 法 操 作 简 便, 呈 色 稳 定, 一 般 室 温 数 分 钟 即 可 达 最 大 呈 色, 数 小 时 后 基 本 不 变, 本 法 也 可 用 于 测 定 尿 脑 脊 液 中 无 机 磷 或 血 清 磷 酸 酶 等 (2) 钼 兰 的 显 色 深 浅 与 溶 液 酸 性 有 关, 本 实 验 中 无 论 空 白 标 准 和 检 品, 都 要 使 它 们 三 氯 醋 酸 的 终 浓 度 相 等 附 录

107 一 缓 冲 液 ( 一 ) 一 些 常 用 缓 冲 液 的 化 合 物 的 酸 解 离 常 数 化 合 物 pk 酸 化 合 物 pk 酸 化 合 物 pk 酸 二 苯 胺 0.85 柠 檬 酸,K 二 乙 基 巴 比 妥 酸 7.98 草 酸,K 苹 果 酸,K 三 -( 羟 四 基 ) 氨 基 甲 烷 (Tris) 8.08 顺 丁 烯 二 酸,K 吡 啶 5.19 甘 氨 酰 甘 氨 酸,K 磷 酸,K 苯 二 四 酸,K ,4- 或 2,5- 二 甲 基 咪 唑 8.36 乙 二 胺 四 乙 酸 (EDTA),K 琥 珀 酸,K 焦 磷 酸,K 甘 氨 酸,K 丙 二 酸,K 氨 基 -2- 甲 基 -1,3- 丙 二 醇 8.67 乙 二 胺 四 乙 酸 (EDTA),K 羟 胺 6.09 吡 啶 8.85 哌 啶 2.80 组 氨 酸,K 二 乙 醇 胺 8.88 丙 二 酸,K 二 甲 胂 酸 6.15 精 氨 酸,K 苯 二 甲 酸,K 乙 二 胺 四 乙 酸 (EDTA),K 硼 酸 9.23 酒 石 酸,K β,β - 二 甲 戊 二 酸,K 氢 氧 化 铵 9.3 延 胡 索 酸,K 顺 丁 烯 二 酸,K 乙 醇 胺 9.44 柠 檬 酸,K 碳 酸,K 甘 氨 酸,K 甘 氨 酰 甘 氨 酸,K 柠 檬 酸,K 三 甲 胺 9.87 α,β 二 甲 基 戊 二 酸,K 或 5- 羟 甲 基 咪 唑 6.40 乙 三 胺,K 甲 酸 3.75 焦 碳 酸,K 乙 二 胺 四 乙 酸 (EDTA),K 4 巴 比 妥 酸 3.79 胂 酸,K 碳 酸,K 乳 酸 3.89 磷 酸,K 乙 胺 琥 珀 酸,K 咪 唑 6.95 甲 胺 苯 甲 酸 氨 基 嘌 呤 7.14 二 甲 胺 草 酸,K 乙 二 胺,K 二 乙 胺 酒 石 酸,K ,4,6- 三 甲 吡 啶 7.32 哌 唑,K 延 胡 索 酸,K 或 5- 甲 基 咪 唑 7.52 磷 酸,K 乙 酸 4.73 三 乙 醇 胺 7.77 精 氨 酸,K ( 二 ) 常 用 缓 冲 液 的 配 制 方 法 1. 磷 酸 缓 冲 液 (1) 磷 酸 氢 二 钠 - 磷 酸 二 氢 钠 缓 冲 液 (0.2M)

108 ph 0.2MNa 2 HPO 4 0.2MNaH 2 PO 4 0.2MNa 2 HPO 4 0.2MNaH 2 PO 4 ph (ml) (ml) (ml) (ml) Na 2 HPO 4 2H 2 O 分 子 量 =178.05;0.2M 溶 液 为 35.61g/L Na 2 HPO 4 12H 2 O 分 子 量 =358.14;0.2M 溶 液 为 71.64g/L NaH 2 PO4 H 2 O 分 子 量 =138.01;0.2M 溶 液 为 27.6g/L NaH 2 PO4 2H 2 O 分 子 量 =156.01;0.2M 溶 液 为 31.21g/L (2) 磷 酸 氢 二 钠 - 磷 酸 二 氢 钾 缓 冲 液 (1/15M) ph M/15Na 2 HPO 4 M/15KH 2 PO 4 M/15Na 2 HPO 4 M/15KH 2 PO 4 ph (ml) (ml) (ml) (ml) Na 2 HPO 4 2H2O 分 子 量 =178.05;1/15M 溶 液 为 g/L KH 2 PO 4 分 子 量 =136.09;1/15M 溶 液 为 9.078g/L 2. 巴 比 妥 钠 - 盐 酸 缓 冲 液 (18 ) ph 0.4M 巴 比 妥 钠 溶 液 0.2M 盐 酸 (ml) ph 0.4M 巴 比 妥 钠 溶 液 0.2M 盐 酸 (ml)

109 (ml) (ml) 巴 比 妥 钠 盐 分 子 量 =206.18;0.04M 溶 液 为 8.25g/L 100ml 3.Tris- 盐 酸 缓 冲 液 (0.05M,25 ) 50ml 0.1M 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 (Tris) 溶 液 与 X ml 0.1M 盐 酸 混 匀 后, 加 水 稀 释 至 ph X(ml) ph X(ml) 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 (Tris) 分 子 量 = M 溶 液 为 g/L Tris 溶 液 可 从 空 气 中 吸 收 二 氧 化 碳, 使 用 时 注 意 将 瓶 盖 严 HOCH 2 C CH 2 OH HOCH 2 NH 4 二 层 析 法 常 用 数 据 表

110 ( 一 ) 葡 聚 糖 凝 胶 的 某 些 技 术 数 据 分 子 筛 类 型 干 颗 粒 直 径 (μm) 分 子 量 分 级 的 范 围 肽 及 球 型 蛋 白 质 葡 萄 糖 ( 线 性 分 子 ) 床 体 积 ml/g 干 分 子 筛 得 水 值 溶 胀 最 少 平 衡 时 间 (h) Sephadex G ± 室 温 沸 水 浴 柱 头 压 力 (cm H2O) (2.5cm 直 径 柱 ) Sephadex G ± Sephadex G-25 粗 级 中 级 细 级 ( 目 ) ( 目 ) ( 目 ) 超 级 ± Sephadex G-50 粗 级 中 级 细 级 ± 超 级 Sephadex G 超 级 ± Sephadex G 超 级 ± Sephadex G 超 级 ± Sephadex G ± ( 二 ) 琼 脂 糖 凝 胶 的 技 术 数 据 琼 脂 糖 是 琼 脂 内 非 离 子 型 的 组 分, 它 在 0~4,pH4~9 范 围 内 是 稳 定 的 名 称 型 号 凝 胶 内 琼 脂 排 阻 的 下 限 ( 分 级 分 离 的 范 围 生 产 厂 商

111 糖 百 分 含 量 (W/w) 分 子 量 ) ( 分 子 量 ) Sepharose4B Sepharose2B Sagavac Sagavac Sagavac Sagavac Sagavac Bio-GelA-0.5M > Bio-GelA-1.5M > Bio-GelA-5M Bio-GelA-15M Bio-GelA-50M Bio-GelA-150M Pharmacia.Sweden Saravac Laboratories, Maidenhead, England Bio-Rad Laboratories, California,U.S.A ( 三 ) 各 种 凝 胶 所 允 许 最 大 操 作 压 凝 胶 建 议 的 最 大 静 水 压 (cmh 2 O) Sephadex G-10 G-15 G-25 G-50 Sephadex G-75 Sephadex G-100 Sephadex G-150 Sephadex G 三 硫 酸 铵 饱 和 度 常 用 表 1. 调 整 硫 酸 铵 溶 液 饱 和 度 计 算 表 (25 25 )

112 硫 酸 铵 终 浓 度 % 饱 和 度 每 1L 溶 液 加 固 体 硫 酸 铵 的 g 数 硫 酸 铵 初 浓 度 % 饱 和 度 在 25 下, 硫 酸 铵 溶 液 由 初 浓 度 调 到 终 浓 度 时, 每 L 溶 液 所 加 固 体 硫 酸 铵 的 g 数 2. 调 整 硫 酸 铵 溶 液 饱 和 度 计 算 表 (0 ) 在 0 硫 酸 铵 终 浓 度 饱 和 度

113 硫 酸 铵 初 浓 度 饱 和 度 在 0 下, 硫 酸 铵 溶 液 由 初 浓 度 调 到 终 浓 度 时, 每 100ml 溶 液 所 加 固 体 硫 酸 铵 的 g 数 四 离 心 机 转 子 的 转 速 与 相 对 离 心 力 RCF(g) 间 的 换 算 关 系 相 对 离 心 力 RCF 值 (g 值 ) 取 决 于 转 子 的 转 速 (rpm) 和 旋 转 半 径 (r, 以 mm 计 算 ), 可 用 如 下 公 式 表 示 : RCF(g)= (rpm) 2 r

114 此 外, 根 据 RCF 值 (g 值 ) rpm 值 r 值 之 间 的 关 系, 可 从 图 A 图 B 中 大 致 读 出 各 种 数 值 图 A 高 速 转 子 的 相 对 离 心 力 列 线 图 要 确 定 某 一 列 上 的 未 知 值 时, 用 尺 子 排 列 其 他 两 列 的 已 知 值, 所 需 值 落 在 尺 子 与 第 三 列 的 交 切 处 如 : 转 子 速 度 为 80,000 rpm, 旋 转 半 径 为 20 mm 时, 相 对 离 心 力 RCF 值 约 为 150,000 g

115 图 B 低 速 转 子 的 相 对 离 心 力 列 线 图 要 确 定 某 一 列 上 的 未 知 值 时, 用 尺 子 排 列 其 他 两 列 的 已 知 值, 所 需 值 落 在 尺 子 与 第 三 列 的 交 切 处 如 : 转 子 速 度 为 5,000 rpm, 旋 转 半 径 为 40 mm 时, 相 对 离 心 力 RCF 值 约 为 g