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1 前 言 随着医学的进步 社会经济的发展, 人类疾病发生了流行病学转变, 心血管疾病在世界范围内流行, 并已成为人类死亡的首要原因, 而动脉粥样硬化是主要病理基础, 是心血管疾病致残致死的主要原因 目前关于动脉粥样硬化的危险因素以及发病机制研究学说很多, 一直是心血管疾病研究的热点 动脉粥样硬化是发生在大 中动脉, 以粥样硬化斑块形成为病理特征的血管改变, 但其发病机制尚未完全阐明 表观遗传学是指在 DNA 核酸序列不发生改变的情况下, 从染色质水平研究生物体如何对基因的表达实现调控 动脉粥样硬化是环境因素与遗传因素相互作用所致的慢性疾病 表观遗传学修饰可能是链接环境因素与遗传因素的桥梁, 深入了解表观遗传学修饰如 DNA 甲基化 组蛋白修饰以及微小 RNA 对动脉粥样硬化形成和发展的影响及其作用机制, 将进一步阐明动脉粥样硬化的发病机制 此外, 由于表观遗传学修饰的可逆性, 可能为动脉粥样硬化的防治提供新的策略和靶点 早在 20 世纪 90 年代末,Newman 等学者就提出异常的 DNA 甲基化模式促进动脉粥样硬化的假说, 在动脉粥样硬化发生中, 整体基因组低甲基化引起促动脉粥样硬化基因表达增高 近年来研究也证实,DNA 甲基化 非编码 RNA 以及组蛋白修饰如甲基化 乙酰化 磷酸化 泛素化等多种途径启动和促进动脉粥样硬化的发生 发展, 并最终导致粥样斑块破裂, 引发恶性心脑血管事件 表观遗传学修饰学说是动脉粥样硬化发生发展学说中的重要组成部分, 对其进行研究, 进而阐明动脉粥样硬化发生发展机制, 有着深远的意义 我们研究团队多年来一直致力于动脉粥样硬化表观遗传学的研究 在研究生教学和科研工作时, 有许多专业人员向我们索要有关动脉粥样硬化表观遗传学的专业书籍, 他们希望能有一部较为系统介绍动脉粥样硬化与表观遗传学最新研究进展及常用实验技术的专著 这使我们深感写作这样一部专著的必要, 动脉粥样硬化表观遗传学研究前沿及技术 这部著作就是在这样的背景下应运而生的产物 本书基于我们在研究中的发现并结合国内外研究进展, 较为系统地就血管生理基础 动脉粥样硬化病理生理基础 基因的表达与调控 动脉粥样硬化表观遗传学 心血管研究常用实验技术五大内容进行了阐述, 特别对于表观遗传学在动脉粥样硬化及其相关疾病发生发展的作用以及机制给予了详细介绍 我们编写这部书的目的, 较多地考虑了表观遗传学在动脉粥样硬化领域应用的系统性, 并兼顾医学研究工作者和研究生两个层次的阅读需求 我们希望本书的出版能带来关于动脉粥样硬化表观遗传学的科学研究与临床实践的新启示 如果本书能够对此研究领域和临床医师的科学研究与临床实践有一定帮助, 我们将深感欣慰 书中的一些新观点难免会引起争议, 欢迎百家争鸣, 共同完善表观遗传学在心血管疾病中的相关研究 对于本书的不足和错误之处, 也希望广大读者热情指正 姜怡邓徐华 2015 年 6 月 i

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3 目 录 第一篇 血管生理基础 第一章 第二节 第三节 第四节 第二章 血管结构及功能 血管内皮细胞 血管平滑肌细胞 单核细胞 血管壁基质 血管受体 (11) 第三章血管运动功能的异质性 (14) (1) (1) (5) (8) (9) 第二篇 动脉粥样硬化病理生理基础 第一章 概述 (17) 动脉粥样硬化的危险因素 (17) 第二节动脉粥样硬化的病理变化 (19) 第二章与动脉粥样硬化发病有关的学说 (22) 第三章自由基与动脉粥样硬化 (35) 第二节 自由基概述 (35) 自由基清除剂 (52) 第三节活性氧与信号传导 (62) 第四节活性氧与细胞凋亡 (74) 第五节自由基与动脉粥样硬化 (83) 第六节细胞氧化应激与动脉粥样硬化研究进展 (88) 第四章动脉粥样硬化防治的病理生理基础 (96) 第五章动脉粥样硬化动物模型的制备 (99) 实验模型的制备方法 (99) 第二节实验模型的评价指标 (103) 第三篇 基因的表达与调控 第一章基因表达调控基础 (105) 基因导论 iii (105) 第二节基因表达的导论 (110) 第三节基因表达调控的生物学意义 (112) 第四节基因表达调控的基本原理 (113) 第二章原核生物的基因表达调控 (124) 概述 (124) 第二节原核基因调控机制 (125) 第三节乳糖操纵子的表达调控 (127)

4 iv 动脉粥样硬化表观遗传学研究前沿及技术 第四节 第五节 色氨酸操纵元 其他操纵子 (130) (132) 第六节转录后水平调控 (134) 第三章真核生物的基因表达调控 (136) 真核生物基因表达与调控的特点 (136) 第二节真核生物 DNA 水平上的基因表达调控 (143) 第三节真核基因转录水平的调控 (150) 第四节真核基因转录后加工水平的调控 (159) 第五节真核基因翻译和翻译后水平的调控 (168) 第六节真核生物与原核生物基因表达调控的异同 (180) 第四篇 动脉粥样硬化表观遗传学 第一章表观遗传学概述及其分子基础 (184) 表观遗传学概述 (184) 第二节表观遗传学改变的分子基础 (191) 第二章动脉粥样硬化表观遗传学 (265) 第三章动脉粥样硬化相关疾病表观遗传学 (297) 心血管疾病表观遗传学研究进展 (297) 第二节表观遗传学与高血压 (311) 第三节表观遗传学与心力衰竭 (320) 第四节表观遗传学与糖尿病 (329) 第五节表观遗传学与代谢综合征 (337) 第六节表观遗传学与高同型半胱氨酸血症 (338) 第七节表观遗传学治疗及发展方向 (342) 第五篇 心血管研究常用实验技术 第一章心血管研究常用动物模型的制备 (352) 大鼠离体心脏缺血 - 再灌注损伤模型的制备 (352) 第二节兔腹主动脉血管内皮球囊损伤模型的建立及评估 (353) 第三节心肌肥大模型制备 (354) 第四节妊娠高血压模型制备 (356) 第五节心脏缺血 - 再灌注损伤模型制备 ( 在体 ) (358) 第二章 细胞培养技术 概述 (360) (360) 第二节细胞培养的基本技术 (360) 第三节细胞培养的操作步骤 (362) 第四节常见细胞培养实例 (366) 第五节培养细胞的常规观察 (369) 第六节 MTT 比色法检测细胞活率 (369) 第三章 细胞周期的检测 (371) 第四章基因重组与 RNA 干扰 (373) 基因重组 (373)

5 目 录 v 第二节 第三节 第五章 RNA 干扰 转染技术 启动子活性分析 启动子介绍 (377) (379) (389) (389) 第二节启动子分析常用技术 (389) 第三节启动子活性分析实例 (390) 第六章 PCR 技术 (395) 逆转录 PCR (395) 第二节荧光 PCR (397) 第七章 第二节 第八章 蛋白样品的制备 组织匀浆 自由基检测 蛋白含量检测 蛋白免疫印迹 (400) (400) (402) (404) (404) 第二节酶联免疫吸附试验 (409) 第三节 放射免疫法 (411) 第四节免疫组织化学技术 (415) 第九章高效液相色谱技术 (419) 第十章 DNA 的提取 (430) 动物基因组 DNA 提取 (430) 第二节 第三节 细菌 DNA 提取 (432) 质粒 DNA 提取 (433) 第四节 DNA 浓度和纯度测定 (436) 第十一章 DNA 甲基化修饰 (438) 第十二章 mirna 的检测 (441) 参考文献 (443)

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7 第一篇 血管生理基础 第一章 血管结构及功能 血管内皮细胞 一 结 1 共同结构 构 扁平的鳞状上皮,呈单层 纵向排列,与血流方向一致 细胞间有 10 ~ 20nm 的缝隙,呈紧密连接 缝隙连接 胞质中含有丰富的吞饮小泡,可双向转运物质 WeibelPalade ( W-P) 小体,长约 3μm,宽 0 1 ~ 0 3μm,杆状,外包被单位膜,能够合成 储存Ⅷ因子相关抗原, 是内皮细胞特有结构 其间含有可以参与调节细胞间隙大小的微丝,而细胞间隙的大小与血管 壁的通透性有关( 图 1-1-1,图 1-1-2) 图 电镜下内皮细 胞的结构( 19000) 2 毛细血管的分类 如图 1-1-3,图 所示 图 人脐静脉内皮细胞 W-P 小体纵横切面电镜 ( A ; B ) (1) 有孔毛细血管:不含核的内皮细胞很薄,有 60 ~ 80nm 的小孔,其中有的含隔膜 例如 胃黏膜 内分泌腺 肾小球等组织中的毛细血管 (2) 连续毛细血管:整个毛细血管的基膜完整,属于紧密连接( tight junction) 例如肌肉 肺 1

8 2 动脉粥样硬化表观遗传学研究前沿及技术 组织 结缔组织 中枢神经系统等组织中的毛细血管 (3) 血窦:毛细血管的基膜不连续,属于间隙连接( gap),例如肝组织 脾组织等组织中的毛 细血管 图 图 毛细血管模式图 肝血窦的扫描电镜图 二 功 能 ( 一) 参与血管内外的物质交换 1 通过血管内皮细胞物质交换的方式 使脂溶性物质可自由透过内皮细胞及其间隙,水溶 性小分子物质可通过细胞间隙及内皮细胞上的小孔进行滤过,而大分子物质则是经吞饮小泡在 细胞间隙的主动转运( 图 1-1-5) 2 血管内皮细胞物质交换的调节 如图 所示 (1) 可以增加通透性的因子:炎症介质,如组胺 5-HT LTs PAF 激肽等;氧自由基,因内皮 细胞富含黄嘌呤脱氢酶,可使细胞 Ca2+ 升高,微丝收缩,骨架改变,细胞间隙增大;鱼精蛋白 阳 离子蛋白均可破坏电荷屏障 (2) 可以降低通透性的因子:糖皮质激素 ADH CA 等,可拮抗通透性升高因子 稳定内皮 细胞骨架;肝素 血管通透性调节蛋白等可保护内皮细胞的电荷屏障

9 第一篇 图 不同物质通过血管内皮的方式 图 血管内皮细胞间隙变化示意图 血管生理基础 3 ( 二) 调节血细胞与内皮细胞的黏附 1 血小板的黏附 参与内皮细胞抗血小板的黏附作用 激活后的内皮细胞介导血小板的 黏附功能,可表达 selectin VCAM ICAM 等 其中血小板黏附分子有Ⅰb Ⅱb Ⅲa Ⅳb Ⅴ等,主 要为Ⅰb 和Ⅱb / Ⅲa 复合体;基质黏附分子有胶原 纤维连接蛋白( fibronectin,fn) 纤维蛋白原 vitronectin vwf( FⅧ) 等 2 白细胞的黏附 可激活其表达的白细胞黏附分子有整合素( integrin,cd11 / CD18) 选择 素-L( L-selectin) TNF PAF LTB4 Phorbol ester 等;内皮细胞黏附分子免疫球蛋白超家族( super- immunoglobulin family,icam-Ⅰ,icam-Ⅱ) E-selectin 等,都可以介导白细胞向血管外的迁移( 图 1-1-7)

10 4 动脉粥样硬化表观遗传学研究前沿及技术 图 白细胞黏附级联反应示意图 ( 三 ) 调节凝血 - 纤溶平衡 1. 促凝血因子 vwf-Ⅷ 因子相关抗原, 储存于血小板中, 由内皮细胞合成, 促进血小板与内皮细胞的黏附 ; 血小板激活因子 (platelet activating factor,paf), 可活化血小板, 增强血管通透性 ; 血小板反应蛋白 (thrombospondin), 储存于血小板 α 颗粒中, 由内皮细胞合成, 促进血小板黏附聚集, 促进凝血 2. 抗凝血因子蛋白聚糖 - 硫酸乙酰肝素, 能够增强 AT-Ⅲ 的活性, 增强内皮细胞表面的负电荷 ; 抗凝血酶 -Ⅲ(AT-Ⅲ), 抑制凝血酶 因子 Ⅹa Ⅻa Ⅺa Ⅸa 纤溶酶 尿激酶 激肽释放酶的活性 ; 血栓调节蛋白 (thrombomodulin) 与凝血酶结合可激活蛋白 C 系统, 灭活 Ⅷa Ⅴa 的活性, 从而抑制血小板聚集 ;PGI 2 NO 可舒张血管平滑肌, 抑制血小板的凝血 3. 纤溶激活物 t-pa, 主要由内皮细胞合成 ;u-pa, 主要由肾脏合成, 亦能由内皮细胞合成 4. 纤溶激活物抑制物 (PAI) 由内皮细胞合成, 可抑制 PA 的活性 ( 四 ) 调节血管运动功能 1. 舒张血管的物质 PGI 2, 通过 camp 途径抑制血小板聚集, 主要由内皮细胞合成, 舒张血管平滑肌 抑制 PDGF 释放 ;NO EDRF, 通过 cgmp 途径使 [ Ca 2+ ] i 下降, 舒张血管平滑肌, 抑制血小板聚集等 2. 收缩血管的物质 ET-1 内皮素, 主要由内皮细胞合成, 通过 IP 3 和 DAG 途径升高 [Ca 2+ ]i, 收缩血管平滑肌 ;ET-1 可激活 c-myc c-fos, 促进平滑肌细胞的增殖 ( 五 ) 调节血管平滑肌的增殖 1. 促增殖类因子 PDGF( platelet derived growth factor) TGF( transforming growth factor) FGF( fibroblastic growth factor) ET( endothelin) AgⅡ( angiotension) NPY( neuropeptide-y) 2. 抑制增殖类因子 CGRP(calcitonin gene related paptide), 主要由血管壁的肽能神经末梢释放 ;PGI 2 NO 硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparin sulfate proteoglycans) ( 六 ) 对生物活性物质的摄取 转换 灭活功能 AgⅠ 向 AgⅡ 转换由血管紧张素转换酶催化完成 ;catacholamine 5-HT 由单胺氧化酶 儿茶酚胺甲基转移酶灭活 ; 脂类活性物质 PGs PAF LTs 等亦可被内皮细胞摄取 灭活

11 第一篇 第二节 血管生理基础 5 血管平滑肌细胞 血管平滑肌细胞( vascular smooth muscle cells,vsmc) 决定血管构型和血管的活性,是血管 壁的主要细胞成分 不同状态 不同部位下血管构型不同,毛细血管缺乏 VSMC,中动脉有丰富 的 VSMC,大动脉富含弹力纤维基质,VSMC 相对较少 某些病理情况下,会出现血管壁的重构 ( vascular remodeling),主要由 VSMC 的变化形成,如动脉粥样硬化 高血压 肺动脉高压等 血管活性的主要构成元素即为血管的舒缩活动,实即 VSMC 的收缩与舒张;VSMC 及其所分 泌的基质决定血管壁的顺应性 血管舒缩活动及血管壁顺应性的异常主要源于 VSMC 的结构 与功能的改变 一 血管平滑肌细胞的结构特征 血管平滑肌细胞有两个基本表型:合成表型和收缩表型 ( 一) 合成表型 见于胚胎期 新生儿期及某些病理状态下 主要以合成 分泌细胞外基质成分为主 细胞 体积大而不规则,核糖体丰富,核浆比例大,核大且呈异染性,高尔基复合体发达,粗面内质网腔 扩张,肌丝( 特别是粗肌丝,myosin) 较少( 图 1-1-8) 图 合成表型的血管平滑肌细胞 ( 二) 收缩表型 仅分布于核周区域,在正常成人体内主要以收缩为主,皆为收缩表型 细胞体积缩小,呈纺锤形; 核缩小且呈致密杆状;核浆比例减小,粗面内质网 高尔基复合体缩小,肌丝明显增多(图 1-1-9) 图 收缩表型的血管平滑肌细胞

12 6 动脉粥样硬化表观遗传学研究前沿及技术 ( 三) 基本构成 1 细肌丝 主要成分为 actin,收缩表型以 α-actin 为主,合成表型以 β-actin 为主 调节成 分包括 filamin( 细丝蛋白) tropomyosin( 原肌球蛋白) 钙调素,troponin( 肌钙蛋白),其肌钙蛋白 不含 TnC 亚基,TnC 亚基的作用被钙调素取代 2 中间丝 时可传导张力 3 粗肌丝 收缩表型含 desmin 和 vimentin,合成表型以 vimentin 为主 构成细胞骨架,收缩 主要成分为 myosin,心肌细胞粗细肌丝之比为 1 6;而平滑肌为 1 (12 ~ 30) 4 密体和密斑 细肌丝的附着点,电子致密小体 密斑位于肌膜内面,密体位于胞质内 相邻的密体间由中间丝连接,为中间丝和细肌丝的共同附着点,相当于横纹肌的 Z 线 5 小凹( caveola) 肌膜表面的凹陷,数量众多,但不深,功能相当于横纹肌的横小管 ( T 管),肌浆网不发达( 图 ,图 ) 图 血管平滑肌细胞的基本构成 二 血管平滑肌细胞的功能特征 ( 一) 收缩功能 平滑肌肌丝附着于胞膜的密斑上,呈螺旋形排列,长轴 与细胞长轴平行,但有一定的倾斜度 细肌丝可沿粗肌丝的 全长滑动,粗肌丝没有 M 线,因此,粗 细肌丝的重叠范围 大 平滑肌相邻横桥的摆动方向相反,使相邻细肌丝的滑动 方向相对而行( 而心肌相邻横桥的摆动方向相同),且肌纤 维呈螺旋形扭曲变短 如图 所示 1 VSMC 收缩机制 (1) 平滑肌收缩:细胞内 Ca2+ 上升至 10 mol / L 后与钙 -6 调蛋白结合,激活肌球蛋白轻链激酶( myosin light-chain ki- nase,mlck),使得肌球蛋白头部轻链磷酸化,磷酸化的肌球 图 蛋白促进肌球蛋白与肌动蛋白结合,激活 Mg2+ -ATPase 进而 血管平滑肌细胞纤维 的超微结构示意图 分解 ATP 释能使横桥滑动,肌肉收缩 (2) 平滑肌松弛:肌质网的钙泵;胞膜钙泵;胞膜 Na +

13 Ca 2+ 交换 ; 线粒体摄钙 钙泵被激活的钙调蛋白启动, 使 Ca 2+ 浓度下降, 钙调蛋白与肌球蛋白轻 链激酶脱离, 使肌球蛋白轻链激酶失活导致肌球蛋白与肌动蛋白结合脱离, 结果引起平滑肌细 胞松弛 第一篇血管生理基础 7 图 血管平滑肌细胞纤维的超微结构模式图 A. 粗肌丝表面横桥排列成行, 相邻两行横桥划动方向相反 ; B. 粗肌丝的两行横桥牵拉细肌丝, 方向却相反 NO 心房肽激活可溶性鸟苷酸环化酶, 使得第二信使 cgmp 浓度增加, 激活肌球蛋白轻链磷 酸酶 (myosin light-chain phosphatase,mlcp), 导致肌球蛋白轻链脱磷酸, 引起平滑肌松弛 ; 同时 cgmp 浓度增加还可以激活蛋白激酶 G(PKG), 激活 L 型钙通道 ( 抑制钙通道, 阻碍钙内流 ) 引起 平滑肌松弛 2. 兴奋 - 收缩耦联 (1) 电 - 机械耦联 : 细胞膜上存在电压门控 Ca 2+ 通道, 这类通道有 L 型及 T 型 L 型电导较 高, 在膜去极化状态下有持续的钙内流, 对钙通道阻断剂异搏定等敏感 ;T 型电导较低, 失活较 快, 作用不大 (2) 药理 - 机械耦联 : 其主要机制是由于肌浆网释放钙, 其钙释放通道有 RyR( ryanodine receptor) 通道 :L 型钙通道主要位于胞膜与肌质网连接处, 即紧邻 RyR 通道, 引起钙诱导的钙释放 (CICR), 是心肌细胞的主要钙来源 ; 对 VSMC 作用不大, 但对膀胱平滑肌 ( phasic smooth muscle) 有较大作用 IP 3 转导的肌浆网 Ca 2+ 释放 : 激动剂 (AgⅡ, 儿茶酚胺等体液因子 ) 与相应的受体结合, 激活 G 蛋白偶联受体, 从而活化磷脂酶 C 经 PIP 2 -DG-IP 3 转导通路上的 IP 3 受体释放到胞浆中 (3) 牵拉引起的平滑肌收缩 : 牵拉使得平滑肌细胞出现非选择性的内向离子流, 包括 K + Na + Ca 2+, 使膜去极化引起 L 型钙通道开放, 引起细胞外钙内流 ; 进而激活内钙释放, 平滑肌 收缩 3. 对收缩调节装置上 Ca 2+ 敏感性的调节 (1) G 蛋白介导的平滑肌收缩敏感性的调节 :Ca 2+ 的敏感性可依 VSMC 收缩调节装置发生 变化 兴奋剂 ( 如儿茶酚胺 PGs) 使其对 Ca 2+ 增敏, 即在同等胞浆游离 Ca 2+ 浓度的情况下, 对 Ca 2+ 增敏, 可增大收缩力 此作用经 G 蛋白介导 (2) PKC 介导的平滑肌收缩敏感性的调节 :DG IP 3 通路产生的 DG 激活 PKC, 使 Caldesmon desmin 磷酸化, 致使平滑肌维持持续的张力 Caldesmon: 钙调素结合蛋白, 低 Ca 2+ 时, 与肌动蛋白结合, 阻碍收缩, 并抑制肌球蛋白头部的 ATP 酶 ; 高 Ca 2+ 时, 与钙调蛋白结合, 解除对肌动蛋白的抑制, 激活肌球蛋白头部的 ATP 酶 (3) Leintonin: 钙敏感调节蛋白, 与 Ca 2+ 结合可直接激活肌动 - 球蛋白的结合和收缩 同时

14 8 动脉粥样硬化表观遗传学研究前沿及技术 还可促进肌球蛋白头部 ATP 酶的活化 ( 表 1-1-1) 表 心肌细胞与血管平滑肌细胞的异同 心肌细胞 血管平滑肌细胞 粗 细肌丝比 (12 ~ 30) 横向相邻横桥摆动方向相同相反 肌小节有无 Ca 2+ 作用物 TnC 钙调蛋白 胞膜内陷结构横小管小凹 肌质网 发达 不发达 收缩时钙浓度的生成 CICR( 主 ) 钙内流 ( 次 ) IP 3 通道 ( 有缩血管物质时 ) 钙内流 ( 无缩血管物质时 ) 肌浆网主要钙释放通道 RyR 通道 IP 3 通道 肌源性作用 ( 牵拉 ) 的调节无有 综上所述, 平滑肌的收缩过程远比骨骼肌 心肌复杂得多 其 Ca 2+ 敏感蛋白是钙调蛋白, 而不是肌钙蛋白, 并需经肌球蛋白轻链磷酸化等过程, 因此收缩过程相对缓慢 除受电刺激影响外, 还受多种药物 激素或信使分子的影响 牵拉亦可引起平滑肌收缩 ( 二 ) 合成分泌功能 血管平滑肌细胞可合成胶原 蛋白聚糖 弹力蛋白等胞外基质, 胶原以 Ⅰ 型为主, 同时伴少量 Ⅲ Ⅳ 型胶原 初生时, 动脉弹力膜和胶原纤维很少, 随着增龄, 弹力膜和胶原纤维增多 增厚, 而平滑肌细胞则由合成表型转变为收缩表型 但平滑肌细胞的环境发生改变后, 又可重新转变为合成表型 1. 血管平滑肌细胞的肥大 VSMC 的肥大表现为 SMC 体积增大, 中膜增厚, 但仍为收缩表型 其 DNA 为四倍体 ( 如在高血压 ), 可能是细胞周期受阻于 G 2 期前 S 期后,DNA 已倍增, 但无分裂 2. 血管平滑肌细胞的增生 VSMC 转变为合成表型后, 收缩能力逐渐减弱甚至丧失, 但却具有增生分裂能力, 细胞总 RNA 增多, 蛋白质合成明显增强, 并向内膜下迁移, 同时细胞外基质大量分泌, 使内膜增厚 ( 如动脉粥样硬化 ) 3. 血管平滑肌细胞向合成表型转化的促进因素 1 生长因子 :CSF PDGF IL- 等 ;2PGI 2 PGE 1 LTC 4 LTD 4 LTB 4 ; 3 内皮的损伤 ; 4 缺氧 ; 5 炎症 - 免疫反应 ; 6 某些基质成分 : 如 fibronectin( 纤维连接素 ) thrombospondin( 血栓黏合素 );7c-myc c-fos 的高表达 ;8 聚胺 : 腐胺 精胺 精脒等, 由 L- 鸟氨酸转变来的小分子有机阳离子, 参与核酸的稳定 蛋白质生物合成等 第三节 单核细胞 一 结构 单核细胞 (monocyte) 来源于骨髓造血干细胞, 并在骨髓中发育 当它进入血流时仍然是尚未成熟的细胞, 在血液中停留 2 ~ 3 天后迁移至周围组织中, 细胞体积继续增大, 直径可达 50 ~ 80μm, 细胞内所含的溶酶体颗粒和线粒体的数目也逐渐增多, 成为成熟的细胞 固定在组织中的单核细胞称为组织巨噬细胞, 经常存在于淋巴结 肺泡壁 骨髓 肝和脾等器官, 数量较多

15 第一篇血管生理基础 9 单核细胞约占 3%, 胞质丰富, 体积大, 染色呈灰蓝色, 胞核常呈肾形 马蹄形, 细胞形状不一, 有多角形 圆形 二 功能 单核细胞是机体防御系统的一个重要组成部分 通过吞噬和产生抗体等方式来抵御 消灭入侵的病原微生物 吞噬作用是生物体最古老的, 也是最基本的防卫机制之一 对于要消灭的对象无特异性, 在免疫学中称之为非特异性免疫作用 中性粒细胞和单核细胞的吞噬作用很强, 而嗜酸性粒细胞虽然游走性很强, 但吞噬能力较弱 单核细胞可通过毛细血管的内皮间隙, 从血管内渗出, 在组织间隙中游走 它们吞噬侵入的病毒 细菌 寄生虫等病原体和一些坏死的组织碎片 一般认为, 单核细胞因具有趋化性, 能向异物处聚集, 并将其吞噬 由于细菌体或死亡的细胞所产生的化学刺激, 诱发单核细胞向该处移动 组织发炎时产生一种活性多肽, 也是单核细胞游动的诱发物质之一 单核细胞内含有更多的非特异性脂酶, 与其他血细胞比较, 具有更强的吞噬作用 中性粒细胞内的颗粒为溶酶体, 内含多种水解酶, 能将其摄取的病原体或其他异物消化 一般一个白细胞处理 5 ~ 25 个细菌后, 本身也就死亡 死亡的白细胞集团和细菌分解产物构成脓液 单核细胞被激活后和组织巨噬细胞能生成并释放多种细胞因子 干扰素和白细胞介素, 参与机体防卫机制, 同时产生一些能促进平滑肌细胞和内皮细胞生长的因子 单核细胞在炎症周围能进行细胞分裂, 并包围异物 其吞噬对象主要为进入细胞内的致病物, 如病毒 细菌和疟原虫等 巨噬细胞还参与激活淋巴细胞的特异免疫功能 此外, 还具有清除衰老与损伤细胞, 识别和杀伤肿瘤细胞的作用 单核细胞是血液中最大的血细胞 具有明显的变形运动, 目前认为它是巨噬细胞的前身, 能吞噬 清除衰老 受伤的细胞及其碎片 此外, 还参与免疫反应, 在吞噬抗原后将所携带的抗原决定簇转交给淋巴细胞, 诱导淋巴细胞的特异性免疫性反应 单核细胞也是对付细胞内致病细菌和寄生虫的主要细胞防卫系统, 还具有识别和杀伤肿瘤细胞的能力 淋巴细胞是具有特异性免疫功能的细胞 T 淋巴细胞主要参与细胞免疫反应, 而 B 淋巴细胞参与体液免疫反应 第四节 血管壁基质 血管壁基质的主要化学成分 : 糖蛋白 (glycoprotein), 主要成分为蛋白, 其上结合少量短链多糖 ; 蛋白多糖 (proteoglycan), 核心为蛋白, 核心外多糖链长且有特异性, 如透明质酸 硫酸肝素 硫酸软骨素 硫酸多糖等, 多糖链皆属于氨基多糖 血管壁基质可分为两大部分 : 血管内皮基底膜和其他结缔组织 其他结缔组织变化较大, 但基底膜从大血管到微血管无明显差别 一 基底膜的特有成分 1. 胶原 (collagen)Ⅳ 是基底膜的主要成分, 其中胶原 Ⅳ 是其特有成分, 大血管壁还含有 Ⅰ Ⅲ Ⅴ Ⅵ 型胶原 2. 网蛋白 (entactin) 网蛋白含大量片层结构 (>50% ), 很少的 α- 螺旋结构, 与片蛋白呈 1 1 结合, 亦含 RGD 序列, 参与内皮细胞的附着

16 10 动脉粥样硬化表观遗传学研究前沿及技术 3. 片蛋白 (laminin) 是基底膜中最丰富的糖蛋位, 其上有内皮细胞的识别位点 血管新生 时, 内皮细胞要形成管状, 必须在片蛋白的基础上 其结构中的 RGD 序列, 为内皮附着 识别位 点 ; 片蛋白的某些序列还可诱导恶性细胞分泌胶原 Ⅳ 4. 串珠素 (perlecan) 又名硫酸肝素蛋白多糖, 硫酸肝素带大量负电荷, 面向内皮细胞面, 在基底膜表面形成一道负电荷屏障 且 bfgf( 碱性纤维母细胞生长因子 ) 也与肝素结合, 在基 底膜处形成高浓度的 bfgf 二 血管壁的其他结缔组织成分 1. 纤维连接蛋白 (fibronectin,fn) FN 为分子量约 的糖蛋白, 其在血管壁基质中呈不可溶状态, 在血浆中存在由肝脏分泌的 FN 以可溶状态存在 其可与肝素 胶原 金葡菌等结合, 亦存在细胞的附着结构 在损伤 修复过程中,FN 合成大幅度增加 2. 血栓黏合素 (thrombospondin,tsp) 是一种三聚糖蛋白, 又名血栓固定蛋白 血小板凝血酶敏感蛋白 可由血小板 平滑肌细胞 内皮细胞 成纤维细胞等多种细胞分泌, 并具有多种功能, 如参与血小板的聚集, 促进纤溶, 炎细胞的趋化 黏附, 调节某些蛋白质因子的活性进而影响细胞的生长和血管的新生 3. 弹力纤维 (elastic fiber) 弹力纤维的主要成分为弹性蛋白, 弹性蛋白疏水性极强, 且化学性质极稳定, 很难溶解, 其寿命几乎与机体寿命同步 弹力纤维的另一成分为微丝, 包括微丝蛋白和微丝结合糖蛋白, 幼年时微丝较多, 成年后只在弹力纤维外周存在稀疏的微丝 4. 蛋白多糖是影响组织顺应性的主要成分, 又名酸性黏多糖, 包括透明质酸 硫酸肝素 硫酸软骨素 硫酸角糖, 巨大的糖链上都含有大量的硫酸根和羧基, 形成强大的阴离子负电荷群, 具有强大的吸水性, 成为填充蛋白纤维网眼的主要基质 透明质酸与其蛋白核心可形成巨大的聚合物, 从而使组织可承受强大的张力 ( 如主动脉壁 ) 透明质酸不含硫酸根, 但分子量可高达百万以上, 它使组织饱满 牢固 ; 其吸水性可影响组织的水平衡 ; 并可影响细胞的附着 迁移等, 巨噬细胞 内皮细胞都有透明质酸的受体 三 血管壁基质的主要功能 1. 依托 屏障功能平滑肌细胞 内皮细胞的附着依托 血管内外液体交换的屏障, 典型表现在肾小球基底膜对肾小球滤过功能的影响, 当基质中负电荷减少时, 尿中蛋白质增多 2. 对内皮细胞生长的影响内皮损伤后的修复性新生有两种方式 :1 损伤周围区的内皮细胞迁移 扩展覆盖面, 将内皮损伤面覆盖, 基本不存在内皮细胞的数量增生 ;2 内皮细胞的数量增生, 并有新毛细血管形成 无论哪种方式都需要有基底膜的形成或支持, 且基底膜上还可吸附大量生长因子 ( 如 bfgf), 促进内皮和血管的新生 3. 对平滑肌细胞生长的影响平滑肌细胞可分泌平滑肌基质, 包括胶原 Ⅳ 片蛋白 串珠素, 抑制平滑肌细胞向合成表型转化 纤维连接蛋白可刺激平滑肌细胞向合成表型转化, 受炎症刺激时, 内皮细胞 平滑肌细胞皆可分泌纤维连接蛋白

第一章 图 1 1 传染病的特征 9 T h1 T h2 细胞调节机制简图 正调节 负调节 细胞因子与细菌的相互作用机制目前尚未完全明了 有实验表明 细胞因子与细菌之间 存在有互利和互抑双重效应 例如 T N Fα 和 IFNγ 可抑制放线菌的生长而 IL 6 的作用则 反之 IL 1 2 和 GM CSF 可促进某些致病性大肠杆菌生长而 IL 1ra 可抑制之 研究表 明 某些致病性大肠杆菌有与

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L型钙通道 是Ca2+内流的单向转运系统, Ca2+内流激活肌浆网的钙释放 L型钙通道广泛分布于心房及心室肌细胞膜上,尤以T管上的含量最为丰富 心肌L型钙通道由?1、?2、β和? 四个亚单位组成(骨骼肌L型钙通道还含有?亚单位)。 ?1构成电压依赖性离子通道的导孔 ?1亚单位含4个同源基序(I~IV),以近似对称的方式环绕排列,中心为亲水孔道。每个基序由6个跨膜段(S1~S6)组成,其中S4段由20余个非极性氨基酸残基组成?螺旋结构,每隔两个非极性氨基酸残基就有一个带正电荷的精氨酸或亮氨酸残基,共有5~6个正电荷残基与蛋白结构中的其它部分相互作用,形成极性分子,共同构成钙通道的电压感受器 钙通道孔由H5环绕而成,4个基序的H5各构成孔壁的1/4,其上的谷氨酸参与孔道对Ca2+的高度选择性。 L型钙通道的开闭主要受膜电位变化的影响。当心肌细胞膜的去极波接近钙通道蛋白所在膜时,膜电位的降低(负值变小)刺激钙通道蛋白的电压感受器,引起带正电荷的氨基酸残基的运动,使通道蛋白的结构发生变化,钙通道开放,细胞外Ca2+内流;膜电位恢复到静息状态,钙通道关闭,因而称之为电压依赖性钙通道。 β肾上腺素能受体激活可活化Gs蛋白,增加腺苷酸环化酶活性,促进cAMP生成,经蛋白激酶A(PKA)使通道蛋白磷酸化,导致钙通道的构型变化,使功能性钙通道的数目增加,Ca2+内流增强。 Ca2+浓度也可影响钙通道的开闭 Ni2+、Mn2+、Cd2+、La3+等均可阻断L型钙通道。 L型通道开放后持续的时间较长,失活较慢(约100~300mS),又称为慢钙通道。 ?1亚单位含有双氢吡啶类、硫氮卓酮类和异搏定类钙通道阻断剂的结合位点,是药物作用的靶分子。 ?2亚单位为分子量105~140kD的糖蛋白,以 硫键与?亚单位相连。 ?亚单位是一种非糖多肽,含多个磷酸化结合位点,作用于?1亚单位基序I和II之间的细胞浆接头区上,有利于电压感受器的运动与通道开放之间的偶联。 ?亚单位是28kD的糖基肽, ?2、?和?亚单位主要起稳定或调节?1亚单位的作用。 2.T型钙通道 T型钙通道主要分布在窦房结细胞和浦金野纤维膜, 其开闭亦受膜电压变化的控制。与L型钙通道不同的是T型钙通道在较低水平的去极化就可激活,但失活迅速,又称快钙通道。 对β肾上腺素能受体激动剂的刺激不敏感 不是双氢吡啶等钙通道阻断剂作用的靶蛋白,镍能有效阻断T型钙通道 (二)Na+-Ca2+交换蛋白 是Ca2+的双向转运系统,以跨膜Na+电化学梯度为动力,按3:1的比例进行Na+-Ca2+交换。 决定Na+-Ca2+交换方向的主要是膜两侧Na+浓度、Ca2+浓度和膜电位。 生理状态下,Na+-Ca2+交换蛋白的主要转运方向是舒张期Ca2+外流。 转运特点是与Ca2+ 亲和力低但转运量大,不需要ATP水解供能 (三)细胞膜钙泵 Ca2+单向主动转运系统,在存在Ca2+和Mg2+的条件下水解ATP,耗能主动将胞浆内Ca2+运出细胞。 钙泵与Ca2+亲和力高,但转运量小 心肌开始舒张时,胞浆内Ca2+浓度较高,这时主要靠亲和力低、转运量大的Na+-Ca2+交换蛋白将Ca2+转运出细胞;随着胞浆Ca2+浓度的降低,Na+-Ca2+交换系统的作用减弱,而与Ca2+亲和力高的钙泵继续将Ca2+运出心肌,使胞浆Ca2+浓度恢复到0.1μmol/L的水平。 细胞膜三个钙转运系统中,细胞外Ca2+通过钙通道内流,而胞浆内Ca2+则通过Na+-Ca2+交换蛋白和钙泵转运出细胞。 二、心肌肌浆网(sarcoplasmic reticulum,SR)的钙转运系统 (一) 心肌肌浆网的结构 肌浆网由3部分构成: 1.纵行小管(longitudinal SR, L-SR) 由包绕肌丝的网状结构组成,是肌浆网的最主要部分。 2.终囊(junctional SR,J–SR) 是一端与纵行小管相连续,另一端膨大的终端结构(terminal cisternae),其与细胞膜内陷形成的T管共同组成三联管部分。 3.特异性非终囊 CICR学说把细胞膜与肌浆网上的两种钙通道从功能上有机地联系起来。 表8-1 Ryanodine受体亚型的分布 组织 RyR1 RyR2 RyR3 骨骼肌 +++++ - + 肝 - - +/- 肾 - - + 肺 - - + 胃 - +/- + 脾 - - + 空肠 - - + 脑 ? +++ + 心脏 - ++++ +/- ? ? 除Ca2+外,咖啡因、ATP及其非水解性衍生物、蒽醌类化合物(如阿霉素)、Na+和 k+等因素都可以刺激RyR的开放;Mg2+、钌红和钙调素等则可以抑制RyR的钙释放。 (2)三磷酸肌醇(IP3)受体: IP3受体的信号转导途径:由G蛋白偶联的受体或非受体酪氨酸蛋白激酶激活。例如,血管紧张素II与细胞表面受体结合后经Gq蛋白激活磷脂酶C,分解膜磷脂生成甘油二酯(DG)和IP3,IP3与肌浆网上IP3受体结合促进肌浆网内钙释放。T细胞活化可激活非受体酪氨酸蛋白激酶中的Src激酶家族,进而激活磷脂酶γ,导致IP3生成和细胞内钙释放。IP3受体中的酪氨酸磷酸化也可增加受体的开放,促进钙释放。 IP3受体有IP3R1、IP3R2和IP3R3三种亚型,心肌细胞已发现有IP3R1mRNA和蛋白质的表达,但含量明显低于RyR2mRNA和蛋白质。 心肌细胞内主要的钙释放途径是RyR2 激素调节心肌的收缩性主要是通过IP3受体介导的细胞内钙释放 2. 肌浆网钙泵 (1)? 钙泵的亚型与分布: 含量:约占肌浆网膜蛋白总量的40%~50% 分布:肌浆网纵行小管和终囊的非连接面 亚型:3个基因编码5种钙泵蛋白亚型 SERCA1基因位于人16号染色体上 SERCA2基因位于人12号染色体上 SERCA3基因编码在肌肉和非肌肉组织表达的钙泵亚型 表8-2 肌浆网钙泵亚型与分布 亚型 ? 分布 SERCA1 1a 成年快收缩骨骼肌 ? 1b 新生快收缩骨骼肌 SERCA2 2a 心肌/慢收缩骨骼肌 ? 2b 平滑肌/非肌肉组织 SERCA3 ? 肌肉/非肌肉组织 SERCA:sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+-ATPase (2)? 钙泵的结构: 肌浆网钙泵由单条多肽链构成,分子量110kDa, 由跨膜区、茎部和梨状头部组成。 ①跨膜区:跨膜区的疏水结构形成10个α-螺旋,定名为M1-M10,位于磷脂双层膜内,Ca2+结合位点位于跨膜区 ②茎(stalk)部:由5个α-螺旋构成的亲水结构,起连接作用,与M1-M5跨膜螺旋相延续;含胰蛋白酶的作用点 ③头部:由3个伸入胞浆的区域组成 β-束 磷酸化区 核苷酸结合区。 (3)? Ca2+的转运: 根据与Ca2+亲和力的不同可将钙泵分为两种类型:E1与E2。E1与Ca2+亲和力高,E2与Ca2+亲和力低。 ? ATP+2Ca ADP 胞浆 ? E E1·2Ca2+·ATP E1~P·2Ca2+ ? E E2·P E2-P·2Ca2+ ? Pi Ca 肌浆网腔 肌浆网的钙摄取 (4) 钙泵活性的调节: 最主要的是磷酸化与去磷酸化的调节。 ①磷酸化: 受磷蛋白(phospholamban,PLB)由位于人6号染色体上的单基因编码的肌浆网膜蛋白,主要存在于纵行小管。 受磷蛋白单体由52个氨基酸残基组成,5个单体结合成一个5聚体存在于肌浆网膜上。非磷酸化的受磷蛋白与钙泵蛋白结合,抑制钙泵与Ca2+的亲和力,降低ATP酶的活性。 磷酸化的受磷蛋白与钙泵解离,消除对钙泵的抑制作用,钙泵与Ca2+的亲和力增高,Ca2+转运速率加快。 ②去磷酸化:受磷蛋白的去磷酸化是在磷酸酶(phosphatase)的催化下进行的,磷酸酶使受磷蛋白脱去磷酸重新与钙泵结合,从而抑制其活性。 2.????? 肌浆网腔内钙结合蛋白 主要功能是与摄取入肌浆网腔内的Ca2+结合,一方面使肌浆网腔内Ca2+浓度降低,有利于钙泵的转运;另一方面将Ca2+储存起来,以便在下一次心肌收缩时释放。 肌浆网腔内钙结合蛋白以calsequestrin为代表 Calsequestrin存在于终囊和特异性非终囊肌浆网的基质中 富含组氨酸的钙结合蛋白(histidine-rich Ca2+ binding protein,HCP)、sarcalumenin calreticulin 线粒体膜钙转运系统: 将胞浆钙转运入线粒体的是钙泵 钙单向输送体(uniporter) Ca2+–HPO4–同向转运体(symporter) 将线粒体内钙转运到胞浆的是: Ca2+/2H+交换 Ca2+/2Na+交换系统 细胞膜去极化 慢钙通道开放 Ca2+内流 胞浆[Ca2+]↑ 肌浆网钙释放通 道开放(CICR) Na+-Ca2+交换 胞浆[Ca2+]↑↑ 心肌收缩               (高Ca2+)   肌浆网钙摄取↑   细胞膜钙泵 (低Ca2+) 胞浆[Ca2+]↓↓ 心肌舒张 ? 心肌钙稳态的调节 第二节 钙调节紊乱与心血管疾病 一、??? 心力衰竭 心力衰竭的钙转运异常主要表现为细胞膜钙内流、钙外流和肌浆网的钙转运障碍。 1.??? 钙内流障碍 心力衰竭时钙内流减少的机制是: (1)? 钙通道数量减少: L型钙通道密度降低 心肌L型钙通道mRNA表达降低。 (2)? 钙通道开放减少: 心肌局部去甲肾上腺素含量减少,特别是?肾上腺素能受体减敏使儿茶酚胺介导的钙通道磷酸化程度降低,钙内流减少。 2. 钙外流障碍 心力衰竭时的钙外流减少主要是由于胞膜钙泵功能抑制或钙泵数量减少(蛋白水平和mRNA水平减少) Na+-Ca2+交换蛋白变化不大,甚至可代偿性增高。 心肌细胞膜钙内流减少,对肌浆网钙释放的刺激降低;钙外流减少促进钙超载的发生和发展,导致心肌舒缩功能障碍。 3.肌浆网钙转运功能障碍 (1)????? 肌浆网钙释放功能的改变: 晚期心力衰竭患者心脏RyR2mRNA和蛋白表达量亦降低,而IP3受体mRNA却升高。心力衰竭晚期表现出RyR2下调和IP3受体上调。 RyR功能抑制和数量减少使肌浆网钙释放不足,心肌收缩力降低。由于心脏功能障碍,心脏更依赖交感神经系统提供有效的收缩动力,IP3受体mRNA上调可能是衰竭心脏增加对激素调节敏感性的一种机制。 (2)肌浆网钙摄取减少: .细胞膜通透性增加 缺血-再灌注时生成的自由基和激活的磷脂酶均可破坏细胞膜磷脂,使膜的通透性增加而流动性降低,细胞外Ca2+顺浓度差大量流入细胞,胞浆Ca2+浓 细胞膜钙泵↓ 钙外流↓ 肌浆网钙泵 摄钙量↓ 胞浆[Ca2+]↑ 心肌舒张不全 ATP酶活性↓ 蛋白含量↓ 储存钙↓ mRNA表达↓ 心力衰竭 钙释放通道↓ 钙释放↓ 心肌收缩力↓ L型钙通道↓ 钙内流↓ 图8-6 钙转运异常导致心力衰竭的机制 度升高。 缺血-再灌注时,心肌肌浆网钙泵功能也受到抑制,促进钙超载的发生和发展。 三、高血压病 (一)细胞膜钙转运功能异常 最常见的表现为高亲和性Ca2+结合位点减少,膜内侧面结合Ca2+能力下降,引起膜稳定性降低,对Ca2+通透性增加。 (二)肌浆网钙转运功能异常 Ca2+进入细胞增多,不仅使细胞内Ca2+浓度增加,还可促进肌浆网钙释放。此外,在血管紧张素II释放增加或血管紧张素II受体功能异常的患者,还可经激素介导的IP3受体增加钙释放。肌浆网钙泵功能抑制可减少钙摄取,加重胞浆Ca2+浓度升高。 高血压患者和动物细胞内Ca2+浓度增高,一方面增加血管平滑肌对缩血管物质的敏感性;另一方面促进细胞的增殖肥大,从功能和结构两方面增加外周血管阻力,升高血压。 四、缺血性脑损伤 神经元内游离Ca2+浓度约0.05~0.2μmol/L。 介导神经细胞钙内流的通道与脑细胞损伤关系密切的是N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-asparate, NMDA)受体通道。实验发现缺血缺氧所致的脑损伤常伴有细胞内Ca2+浓度的升高,而钙超载的程度与脑组织损伤甚至坏死的程度成正比。脑缺血可通过多种途径引起钙超载,如缺血缺氧引起的能量缺乏可使细胞膜对离子的转运障碍;自由基生成和磷脂酶激活可增加膜的通透性;蛋白激酶C和兴奋性氨基酸可促进钙通道的开放等。 钙超载加重缺血性脑损伤的主要途径: ①引起线粒体内钙超载,干扰其氧化磷酸化功能,导致ATP生成减少; ②激活某些钙依赖性酶,如溶酶体中的中性蛋白酶、胞膜的磷脂酶A及核酸内切酶等,引起细胞结构的破坏; ③脑血管平滑肌钙超载可增加其对血管活性物质的敏感性,诱发脑血管痉挛,并增加血管壁通透性,加重脑缺血和脑水肿的形成; ④兴奋毒(excitotoxin)作用: 所谓兴奋毒作用是指一些兴奋性氨基酸,如谷氨酸、门冬氨酸等由突触前释放增多,在突触间隙堆积,导致对突触后膜受体的过度刺激,从而引起脑细胞损伤。兴奋毒作用既可由Ca2+诱发又可进一步加重钙超载。谷氨酸受体位于突触后膜上,主要调控神经细胞的钙内流通道。缺血性脑损伤的兴奋毒作用主要与钙通道的过度激活有关。将高浓度谷氨酸注射入脑循环,可引起小鼠和猴下丘脑神经细胞死亡。当谷氨酸与大鼠新皮层神经元一起培养5min后,细胞开始肿胀,24h后变性甚至坏死;如培养液中无Ca2+和Na+,则早期肿胀和晚期变性都明显减轻。N型钙通道阻断剂可使脑缺血时谷氨酸释放减少,可见Ca2+在介导谷氨酸诱导的神经元退变及坏死中起重要作用,从而提出了钙依赖性细胞毒学说。在正常情况下,由于能量供应充足,神经细胞通过钙泵、Na+-K+-ATP酶将Ca2+ 、Na+排出细胞,同时减少突触前膜兴奋性递质的释放,并通过摄取递质减少突触间隙兴奋性递质的积聚,从而防止突触后膜毒性反应。脑缺血时,由于ATP减少,细胞膜离子转运障碍,造成细胞内Ca2+增多,引起突触前膜大量释放兴奋性氨基酸如谷氨酸,造成突触后膜受体的过度刺激。谷氨酸又使N型钙通道大量开放,引发Ca2+内流,加重细胞钙超载。钙超载又可激活脂肪酶、蛋白酶和核酸内切酶等,导致神经元变性、坏死。

细胞钙转运与心血管疾病 ? 细胞外液游离Ca2+浓度约1~2mmol/L 胞浆游离Ca2+浓度约0.1nmol/L 心肌胞浆游离Ca2+浓度随着心动周期在0.1~10μmol/L的范围内变动 第一节 心肌钙转运及其调节 一、心肌细胞膜(sarcolemma,SL)的钙转运系统: 钙通道(Ca2+ channel) Na+-Ca2+交换(Na+-Ca2+ exchanger) 钙泵(Ca2+ pump,又称Ca2+-ATP酶)    (一)钙通道 1.????? L型钙通道   是Ca2+内流的单向转运系统, Ca2+内流激活肌浆网的钙释放 L型钙通道广泛分布于心房及心室肌细胞膜上,尤以T管上的含量最为丰富  心肌L型钙通道由?1、?2、β和? 四个亚单位组成(骨骼肌L型钙通道还含有?亚单位)。 ?1构成电压依赖性离子通道的导孔 ?1亚单位含4个同源基序(I~IV),以近似对称的方式环绕排列,中心为亲水孔道。每个基序由6个跨膜段(S1~S6)组成,其中S4段由20余个非极性氨基酸残基组成?螺旋结构,每隔两个非极性氨基酸残基就有一个带正电荷的精氨酸或亮氨酸残基,共有5~6个正电荷残基与蛋白结构中的其它部分相互作用,形成极性分子,共同构成钙通道的电压感受器 钙通道孔由H5环绕而成,4个基序的H5各构成孔壁的1/4,其上的谷氨酸参与孔道对Ca2+的高度选择性。 L型钙通道的开闭主要受膜电位变化的影响。当心肌细胞膜的去极波接近钙通道蛋白所在膜时,膜电位的降低(负值变小)刺激钙通道蛋白的电压感受器,引起带正电荷的氨基酸残基的运动,使通道蛋白的结构发生变化,钙通道开放,细胞外Ca2+内流;膜电位恢复到静息状态,钙通道关闭,因而称之为电压依赖性钙通道。 β肾上腺素能受体激活可活化Gs蛋白,增加腺苷酸环化酶活性,促进cAMP生成,经蛋白激酶A(PKA)使通道蛋白磷酸化,导致钙通道的构型变化,使功能性钙通道的数目增加,Ca2+内流增强。 Ca2+浓度也可影响钙通道的开闭 Ni2+、Mn2+、Cd2+、La3+等均可阻断L型钙通道。 L型通道开放后持续的时间较长,失活较慢(约100~300mS),又称为慢钙通道。 ?1亚单位含有双氢吡啶类、硫氮卓酮类和异搏定类钙通道阻断剂的结合位点,是药物作用的靶分子。     ?2亚单位为分子量105~140kD的糖蛋白,以 硫键与?亚单位相连。  ?亚单位是一种非糖多肽,含多个磷酸化结合位点,作用于?1亚单位基序I和II之间的细胞浆接头区上,有利于电压感受器的运动与通道开放之间的偶联。 ?亚单位是28kD的糖基肽, ?2、?和?亚单位主要起稳定或调节?1亚单位的作用。 2.T型钙通道   T型钙通道主要分布在窦房结细胞和浦金野纤维膜, 其开闭亦受膜电压变化的控制。与L型钙通道不同的是T型钙通道在较低水平的去极化就可激活,但失活迅速,又称快钙通道。 对β肾上腺素能受体激动剂的刺激不敏感 不是双氢吡啶等钙通道阻断剂作用的靶蛋白,镍能有效阻断T型钙通道  (二)Na+-Ca2+交换蛋白  是Ca2+的双向转运系统,以跨膜Na+电化学梯度为动力,按3:1的比例进行Na+-Ca2+交换。 决定Na+-Ca2+交换方向的主要是膜两侧Na+浓度、Ca2+浓度和膜电位。 生理状态下,Na+-Ca2+交换蛋白的主要转运方向是舒张期Ca2+外流。 转运特点是与Ca2+ 亲和力低但转运量大,不需要ATP水解供能  (三)细胞膜钙泵 Ca2+单向主动转运系统,在存在Ca2+和Mg2+的条件下水解ATP,耗能主动将胞浆内Ca2+运出细胞。 钙泵与Ca2+亲和力高,但转运量小 心肌开始舒张时,胞浆内Ca2+浓度较高,这时主要靠亲和力低、转运量大的Na+-Ca2+交换蛋白将Ca2+转运出细胞;随着胞浆Ca2+浓度的降低,Na+-Ca2+交换系统的作用减弱,而与Ca2+亲和力高的钙泵继续将Ca2+运出心肌,使胞浆Ca2+浓度恢复到0.1μmol/L的水平。  细胞膜三个钙转运系统中,细胞外Ca2+通过钙通道内流,而胞浆内Ca2+则通过Na+-Ca2+交换蛋白和钙泵转运出细胞。 二、心肌肌浆网(sarcoplasmic reticulum,SR)的钙转运系统  (一) 心肌肌浆网的结构 肌浆网由3部分构成: 1.纵行小管(longitudinal SR, L-SR) 由包绕肌丝的网状结构组成,是肌浆网的最主要部分。 2.终囊(junctional SR,J–SR) 是一端与纵行小管相连续,另一端膨大的终端结构(terminal cisternae),其与细胞膜内陷形成的T管共同组成三联管部分。 3.特异性非终囊 CICR学说把细胞膜与肌浆网上的两种钙通道从功能上有机地联系起来。      表8-1  Ryanodine受体亚型的分布 组织 RyR1 RyR2 RyR3 骨骼肌 +++++ - + 肝 - - +/- 肾 - - + 肺 - - + 胃 - +/- + 脾 - - + 空肠 - - + 脑 ? +++ + 心脏 - ++++ +/- ? ?  除Ca2+外,咖啡因、ATP及其非水解性衍生物、蒽醌类化合物(如阿霉素)、Na+和 k+等因素都可以刺激RyR的开放;Mg2+、钌红和钙调素等则可以抑制RyR的钙释放。  (2)三磷酸肌醇(IP3)受体:  IP3受体的信号转导途径:由G蛋白偶联的受体或非受体酪氨酸蛋白激酶激活。例如,血管紧张素II与细胞表面受体结合后经Gq蛋白激活磷脂酶C,分解膜磷脂生成甘油二酯(DG)和IP3,IP3与肌浆网上IP3受体结合促进肌浆网内钙释放。T细胞活化可激活非受体酪氨酸蛋白激酶中的Src激酶家族,进而激活磷脂酶γ,导致IP3生成和细胞内钙释放。IP3受体中的酪氨酸磷酸化也可增加受体的开放,促进钙释放。  IP3受体有IP3R1、IP3R2和IP3R3三种亚型,心肌细胞已发现有IP3R1mRNA和蛋白质的表达,但含量明显低于RyR2mRNA和蛋白质。 心肌细胞内主要的钙释放途径是RyR2 激素调节心肌的收缩性主要是通过IP3受体介导的细胞内钙释放 2. 肌浆网钙泵   (1)? 钙泵的亚型与分布: 含量:约占肌浆网膜蛋白总量的40%~50% 分布:肌浆网纵行小管和终囊的非连接面 亚型:3个基因编码5种钙泵蛋白亚型 SERCA1基因位于人16号染色体上 SERCA2基因位于人12号染色体上 SERCA3基因编码在肌肉和非肌肉组织表达的钙泵亚型 表8-2  肌浆网钙泵亚型与分布 亚型 ? 分布 SERCA1 1a 成年快收缩骨骼肌 ? 1b 新生快收缩骨骼肌 SERCA2 2a 心肌/慢收缩骨骼肌 ? 2b 平滑肌/非肌肉组织 SERCA3 ? 肌肉/非肌肉组织 SERCA:sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+-ATPase (2)? 钙泵的结构: 肌浆网钙泵由单条多肽链构成,分子量110kDa, 由跨膜区、茎部和梨状头部组成。 ①跨膜区:跨膜区的疏水结构形成10个α-螺旋,定名为M1-M10,位于磷脂双层膜内,Ca2+结合位点位于跨膜区 ②茎(stalk)部:由5个α-螺旋构成的亲水结构,起连接作用,与M1-M5跨膜螺旋相延续;含胰蛋白酶的作用点 ③头部:由3个伸入胞浆的区域组成 β-束 磷酸化区 核苷酸结合区。 (3)? Ca2+的转运: 根据与Ca2+亲和力的不同可将钙泵分为两种类型:E1与E2。E1与Ca2+亲和力高,E2与Ca2+亲和力低。 ?   ATP+2Ca ADP 胞浆 ?  E E1·2Ca2+·ATP E1~P·2Ca2+ ?     E E2·P E2-P·2Ca2+ ? Pi Ca 肌浆网腔 肌浆网的钙摄取  (4) 钙泵活性的调节: 最主要的是磷酸化与去磷酸化的调节。 ①磷酸化: 受磷蛋白(phospholamban,PLB)由位于人6号染色体上的单基因编码的肌浆网膜蛋白,主要存在于纵行小管。 受磷蛋白单体由52个氨基酸残基组成,5个单体结合成一个5聚体存在于肌浆网膜上。非磷酸化的受磷蛋白与钙泵蛋白结合,抑制钙泵与Ca2+的亲和力,降低ATP酶的活性。 磷酸化的受磷蛋白与钙泵解离,消除对钙泵的抑制作用,钙泵与Ca2+的亲和力增高,Ca2+转运速率加快。 ②去磷酸化:受磷蛋白的去磷酸化是在磷酸酶(phosphatase)的催化下进行的,磷酸酶使受磷蛋白脱去磷酸重新与钙泵结合,从而抑制其活性。 2.????? 肌浆网腔内钙结合蛋白   主要功能是与摄取入肌浆网腔内的Ca2+结合,一方面使肌浆网腔内Ca2+浓度降低,有利于钙泵的转运;另一方面将Ca2+储存起来,以便在下一次心肌收缩时释放。 肌浆网腔内钙结合蛋白以calsequestrin为代表 Calsequestrin存在于终囊和特异性非终囊肌浆网的基质中 富含组氨酸的钙结合蛋白(histidine-rich Ca2+ binding protein,HCP)、sarcalumenin calreticulin 线粒体膜钙转运系统: 将胞浆钙转运入线粒体的是钙泵 钙单向输送体(uniporter) Ca2+–HPO4–同向转运体(symporter) 将线粒体内钙转运到胞浆的是: Ca2+/2H+交换 Ca2+/2Na+交换系统 细胞膜去极化    慢钙通道开放   Ca2+内流    胞浆[Ca2+]↑ 肌浆网钙释放通 道开放(CICR) Na+-Ca2+交换      胞浆[Ca2+]↑↑    心肌收缩                  (高Ca2+)   肌浆网钙摄取↑   细胞膜钙泵 (低Ca2+)      胞浆[Ca2+]↓↓     心肌舒张 ? 心肌钙稳态的调节 第二节  钙调节紊乱与心血管疾病 一、??? 心力衰竭 心力衰竭的钙转运异常主要表现为细胞膜钙内流、钙外流和肌浆网的钙转运障碍。 1.??? 钙内流障碍   心力衰竭时钙内流减少的机制是: (1)? 钙通道数量减少:  L型钙通道密度降低 心肌L型钙通道mRNA表达降低。 (2)? 钙通道开放减少: 心肌局部去甲肾上腺素含量减少,特别是?肾上腺素能受体减敏使儿茶酚胺介导的钙通道磷酸化程度降低,钙内流减少。 2. 钙外流障碍   心力衰竭时的钙外流减少主要是由于胞膜钙泵功能抑制或钙泵数量减少(蛋白水平和mRNA水平减少) Na+-Ca2+交换蛋白变化不大,甚至可代偿性增高。 心肌细胞膜钙内流减少,对肌浆网钙释放的刺激降低;钙外流减少促进钙超载的发生和发展,导致心肌舒缩功能障碍。 3.肌浆网钙转运功能障碍   (1)????? 肌浆网钙释放功能的改变: 晚期心力衰竭患者心脏RyR2mRNA和蛋白表达量亦降低,而IP3受体mRNA却升高。心力衰竭晚期表现出RyR2下调和IP3受体上调。 RyR功能抑制和数量减少使肌浆网钙释放不足,心肌收缩力降低。由于心脏功能障碍,心脏更依赖交感神经系统提供有效的收缩动力,IP3受体mRNA上调可能是衰竭心脏增加对激素调节敏感性的一种机制。 (2)肌浆网钙摄取减少: .细胞膜通透性增加  缺血-再灌注时生成的自由基和激活的磷脂酶均可破坏细胞膜磷脂,使膜的通透性增加而流动性降低,细胞外Ca2+顺浓度差大量流入细胞,胞浆Ca2+浓 细胞膜钙泵↓    钙外流↓ 肌浆网钙泵     摄钙量↓   胞浆[Ca2+]↑     心肌舒张不全 ATP酶活性↓ 蛋白含量↓     储存钙↓ mRNA表达↓   心力衰竭 钙释放通道↓    钙释放↓ 心肌收缩力↓ L型钙通道↓    钙内流↓ 图8-6  钙转运异常导致心力衰竭的机制     度升高。 缺血-再灌注时,心肌肌浆网钙泵功能也受到抑制,促进钙超载的发生和发展。     三、高血压病     (一)细胞膜钙转运功能异常      最常见的表现为高亲和性Ca2+结合位点减少,膜内侧面结合Ca2+能力下降,引起膜稳定性降低,对Ca2+通透性增加。 (二)肌浆网钙转运功能异常  Ca2+进入细胞增多,不仅使细胞内Ca2+浓度增加,还可促进肌浆网钙释放。此外,在血管紧张素II释放增加或血管紧张素II受体功能异常的患者,还可经激素介导的IP3受体增加钙释放。肌浆网钙泵功能抑制可减少钙摄取,加重胞浆Ca2+浓度升高。    高血压患者和动物细胞内Ca2+浓度增高,一方面增加血管平滑肌对缩血管物质的敏感性;另一方面促进细胞的增殖肥大,从功能和结构两方面增加外周血管阻力,升高血压。     四、缺血性脑损伤 神经元内游离Ca2+浓度约0.05~0.2μmol/L。 介导神经细胞钙内流的通道与脑细胞损伤关系密切的是N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-asparate, NMDA)受体通道。实验发现缺血缺氧所致的脑损伤常伴有细胞内Ca2+浓度的升高,而钙超载的程度与脑组织损伤甚至坏死的程度成正比。脑缺血可通过多种途径引起钙超载,如缺血缺氧引起的能量缺乏可使细胞膜对离子的转运障碍;自由基生成和磷脂酶激活可增加膜的通透性;蛋白激酶C和兴奋性氨基酸可促进钙通道的开放等。      钙超载加重缺血性脑损伤的主要途径: ①引起线粒体内钙超载,干扰其氧化磷酸化功能,导致ATP生成减少; ②激活某些钙依赖性酶,如溶酶体中的中性蛋白酶、胞膜的磷脂酶A及核酸内切酶等,引起细胞结构的破坏; ③脑血管平滑肌钙超载可增加其对血管活性物质的敏感性,诱发脑血管痉挛,并增加血管壁通透性,加重脑缺血和脑水肿的形成; ④兴奋毒(excitotoxin)作用: 所谓兴奋毒作用是指一些兴奋性氨基酸,如谷氨酸、门冬氨酸等由突触前释放增多,在突触间隙堆积,导致对突触后膜受体的过度刺激,从而引起脑细胞损伤。兴奋毒作用既可由Ca2+诱发又可进一步加重钙超载。谷氨酸受体位于突触后膜上,主要调控神经细胞的钙内流通道。缺血性脑损伤的兴奋毒作用主要与钙通道的过度激活有关。将高浓度谷氨酸注射入脑循环,可引起小鼠和猴下丘脑神经细胞死亡。当谷氨酸与大鼠新皮层神经元一起培养5min后,细胞开始肿胀,24h后变性甚至坏死;如培养液中无Ca2+和Na+,则早期肿胀和晚期变性都明显减轻。N型钙通道阻断剂可使脑缺血时谷氨酸释放减少,可见Ca2+在介导谷氨酸诱导的神经元退变及坏死中起重要作用,从而提出了钙依赖性细胞毒学说。在正常情况下,由于能量供应充足,神经细胞通过钙泵、Na+-K+-ATP酶将Ca2+ 、Na+排出细胞,同时减少突触前膜兴奋性递质的释放,并通过摄取递质减少突触间隙兴奋性递质的积聚,从而防止突触后膜毒性反应。脑缺血时,由于ATP减少,细胞膜离子转运障碍,造成细胞内Ca2+增多,引起突触前膜大量释放兴奋性氨基酸如谷氨酸,造成突触后膜受体的过度刺激。谷氨酸又使N型钙通道大量开放,引发Ca2+内流,加重细胞钙超载。钙超载又可激活脂肪酶、蛋白酶和核酸内切酶等,导致神经元变性、坏死。 心血管病理生理学 Pathophysiology of cardiovascular disease 北京大学医学部病理生理室吴立玲 课程内容 心血管疾病发病机制的研究进展 常用心血管实验技术方法 研究生心血管病理生理学课程安排 时间 :2010 年 3 月 6-7 月 3 日星期六下午 13:30~16:30 地点 :1 4 教 日期内容教师 3.6 细胞钙转运与心血管疾病 吴立玲 3.13 缺血再灌注损伤及预处理的保护机制

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