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省视侯
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1 学校编码 :10384 密级学号 : 硕士学位论文急性髓系白血病 DNA 甲基化相关基因突变检测体系建立和临床意义分析 Establishment of DNA methylation-related gene mutation detection method and analysis of clinical significance on acute myeloid leukemia 王航指导教师姓名 : 鹿全意教授专业名称 : 内科学论文提交日期 : 2013 年月论文答辩日期 : 2013 年月 2013 年 5 月

2 厦门大学学位论文原创性声明本人呈交的学位论文是本人在导师指导下, 独立完成的研究成果本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果, 均在文中以适当方式明确标明, 并符合法律规范和厦门大学研究生学术活动规范 ( 试行 ) 另外, 该学位论文为 ( ) 课题 ( 组 ) 的研究成果, 获得 ( ) 课题 ( 组 ) 经费或实验室的资助, 在 ( ) 实验室完成 ( 请在以上括号内填写课题或课题组负责人或实验室名称, 未有此项声明内容的, 可以不作特别声明 ) 声明人 ( 签名 ): 年月日

3 厦门大学学位论文著作权使用声明本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办法等规定保留和使用此学位论文, 并向主管部门或其指定机构送交学位论文 ( 包括纸质版和电子版 ), 允许学位论文进入厦门大学图书馆及其数据库被查阅借阅本人同意厦门大学将学位论文加入全国博士硕士学位论文共建单位数据库进行检索, 将学位论文的标题和摘要汇编出版, 采用影印缩印或者其它方式合理复制学位论文本学位论文属于 : ( )1. 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文, 于年月日解密, 解密后适用上述授权 ( )2. 不保密, 适用上述授权 ( 请在以上相应括号内打或填上相应内容保密学位论文应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文, 未经厦门大学保密委员会审定的学位论文均为公开学位论文此声明栏不填写的, 默认为公开学位论文, 均适用上述授权 ) 声明人 ( 签名 ): 年月日

4 目录摘要... I Abstract... III 第一章绪论... 1 第一节白血病的概况白血病的研究历史白血病的发病机制... 1 第二节白血病的诊断形态学诊断 -FAB 分型 MICM 分型免疫学诊断细胞遗传学诊断... 5 第三节 DNA 甲基化相关基因概况 DNA 甲基化简介 IDH 基因的简介 DNMT3A 基因的简介... 9 第四节基于实时荧光 PCR 的基因检测方法检测 DNA 甲基化相关基因突变的常用方法实时荧光 PCR 原理...12 第五节本论文提出内容意义第二章 DNA 甲基化相关基因突变检测体系的建立第一节实验材料与方法研究对象仪器与试剂引物和探针的设计质粒的构建引物的筛选及 PCR 体系的优化 PCR 体系的评估灵敏度考察...22 第二节 DNA 相关基因突变检测体系的建立和优化多重 PCR 检测体系的建立多重 PCR 检测体系的优化 PCR 体系评估 - 灵敏度考察...26 第三节讨论第三章急性髓系白血病甲基化相关基因突变检测和临床意义分析第一节材料和方法研究对象临床标本总 RNA 的提取和逆转录 DNA 甲基化相关基因检测方法...30 第二节基因突变的检测结果... 31

5 2.1 IDH1 基因检测结果 IDH2 基因检测结果 DNMT3A 基因检测结果体系阴性样本的验证...37 第三节 DNA 甲基化相关基因突变临床意义 DNA 甲基化相关基因突变比例及突变类型 DNA 甲基化相关基因突变患者的临床与实验室特征 DNA 甲基化相关基因突变的相互关系...40 第四节 DNA 甲基化相关基因突变对白血病疗效和预后的影响 DNA 甲基化相关基因突变与化疗效果的关系 DNA 甲基化相关基因突变对预后的影响...42 第五节讨论参考文献硕士期间发表交流论文致谢... 53

6 Table of Contents Abstract in Chinese... I Abstract in English... III Chapter1 Introduction... 1 SectionⅠ An overview of leukemia The history of leukemia Pathogenesis of Leukemia... 1 Section II Diagnosis of leukemia Morphologic diagnosis MICM classification Immunological diagnosis Cytogenetic diagnosis... 5 SectionⅢ An overview of DNA methylation-related gene DNA methylation IDH gene DNMT3A gene... 9 SectionⅣ Detection methods based on Real-time PCR Detection methods of gene mutations Introduction of Real-time PCR...12 SectionⅤ Proposal of the thesis Chapter2 Establishment of DNA methylation-related gene mutations detection method SectionⅠ Materials and methods Object of study Equipment and Reagent preparations The design of primers and probes Construction of the plasmids Primer screening and PCR optimization Evaluation of PCR system...22 SectionⅡ Establishment and optimization of real-time PCR system Establishment of multiple real-time PCR system Optimization of multiple real-time PCR system The sensitiveness of PCR system...26 SectionⅢ Discussion Chapter 3 Detection and analysis of clinical significance of DNA methylation-related gene mutations of AML patients SectionⅠ Materials and method Object of study The extraction of total RNA and reverse transcription Detection method of DNA methylation-related gene mutations...30

7 SectionII Detection results of gene mutations Detection results of IDH1 gene Detection results of IDH2 gene Detection results of DNMT3A gene Detection results of gene mutations negative samples...37 SectionⅢ Analysis of clinical significance of DNA methylation-related gene mutations Rate and type of DNA methylation-related gene mutations Clinical and laboratory features Relationship among DNA methylation-related gene...40 SectionⅣ DNA methylation-related gene mutations on efficacy and prognosis DNA methylation-related gene mutations and the effect of chemotherapy DNA methylation-related gene mutations and the prognosis...42 SectionⅤ Discussion References Publications Acknowledgements... 53

8 摘要目的 : 建立基于探针熔解曲线法的检测 DNA 甲基化相关基因突变的 PCR 体系, 了解 DNA 甲基化相关基因突变在急性髓系白血病 ( Acute myeloid leukemia,aml) 患者中的发生率和类型, 分析伴有 DNA 甲基化相关基因突变的患者的临床特征和突变在 AML 中的预后价值方法 : 利用重叠延伸法构建相应质粒, 设计探针引物, 优化检测体系的相关参数, 建立一种可快速检测 DNA 甲基化相关基因突变的方法收集 133 例急性髓系白血病患者的骨髓标本, 提取细胞 RNA, 逆转录成 cdna, 采用所构建的检测体系, 对 AML 患者骨髓标本的 cdna 进行 IDH1,IDH2, DNMT3A 基因突变检测, 且将阳性结果测序验证同时结合其它相关临床资料, 分析含有基因突变患者的临床特征, 进行统计学分析并评价基因突变对急性髓系白血病预后的影响结果 : 利用探针熔解曲线技术, 基于实时荧光 PCR 平台, 建立了多重的 DNA 甲基化相关基因突变的检测体系, 并运用此方法, 检测 AML 病例标本, 结果显示, 有 5 例 AML 患者被检测出 IDH1-R132 突变,13 例有 IDH2 突变, 有 7 例检测出 DNMT3A-R882 突变, 突变形式均为错义突变 IDH1 基因突变在 FAB 各亚型中的 M0 发生率最高,IDH2 在 M1 和 M4 的发生率较高, 而 DNMT3A 则多发生于 M1 IDH1 突变的发生常伴有高白细胞数, IDH2 的发生与高龄高白细胞数 NPM1 有关,DNMT3A 基因突变则与高龄高白细胞数高血小板数 NPM1 密切相关 IDH1 突变阳性者在正常核型的 AML(CN-AML) 中发生概率为 6.3%,IDH2 在 CN-AML 中发生率为 16.7%,DNMT3A 突变在 CN-AML 的发生率为 10.4%, 均高于在异常核型 AML 的发生率结论 :( 1)IDH 基因在 AML 中的总突变率为 13.5%, 其中 IDH1 突变率为 3.8%, IDH2 突变率为 9.8% DNMT3A-R882 位点突变发生率为 4.0%, 突变发生率可能存在人种差异 (2)DNA 甲基化相关基因与高白细胞数密切相关 (3) DNA 甲基化相关基因突变在 M3 型白血病中发生率较低 (4)IDH1 IDH2 DNMT3A 基因突变为 AML 独立的预后影响因子, 提示较差的预后 (5)IDH1 I

9 IDH2 DNMT3A 能否作为 AML 的微小残留病的监测指标尚需进一步实验证实关键词 :DNA 甲基化 ; 急性髓系白血病 ; 基因突变 ; 探针熔解曲线 II

10 Abstract Objective: To establish a method to detect DNA methylation-related gene mutations by probe melting curve, which is based on real-time fluorescent PCR platform. To detect the frequency and forms of DNA methylation-related gene mutations in patients with acute myeloid leukemia (AML), and to investigate the relationship among DNA methylation related gene mutations, prognostic significance, and clinical feature of AML. Methods: Positive plasmids are constructed by overlap extention.design the probes and primers, and optimize the parameters of the detection system, to establish a method to rapidly detect the mutations of DNA methylation-related gene. RNA was extracted from bone marrow samples of 133 AML cases.pcr followed by reverse transcriptase was used to amplify the cdna. Detect IDH1 IDH2 and DNMT3A gene mutations of AML samples by new detected method.test and verify the positive samples by direct sequencing.combine with other associated factors of the positive samples, to statistical analysis and evalue the prognostic effect of geng mutations in AML. Results: Establish a detection system to detect several genes mutations by probe melting curve, which is based on real-time fluorescent PCR platform.and use this method to detect the AML samples.a total of 5 of 133 patients had mutations in IDH1,13 of 133 in IDH2 and 7 out of 133 in DNMT3A. All these mutations are missense mutations. The FAB subtype of the highest incidence of IDH1 mutations is M0.The incidence of IDH2 mutations of M1 and M4 is higher than any other subtypes,however DNMT3A mutations develop in M1.IDH1 mutations occur often accompanied by high WBC, the occurrence of IDH2 associated with older age, high WBC count, NPM1 mutations. DNMT3A mutations have to do with age, WBC count, platelet count, and NPM1 mutations are closely related. The probability of IDH1 mutations of normal karyotype AML (CN-AML) is 6.25%, the incidence of IDH2 in CN-AML is 16.7%, the incidence of DNMT3A mutations in CN-AML is 10.4%, and may be higher than in the analogous incidence of abnormal karyotype AML. III

11 Conclusion:(1)The incidence of IDH1 gene mutations is 3.8%, the IDH2 is 9.8%, the DNMT3A-R882 mutations is 4.0%, the incidence of these mutations may exist racial difference.(2)the mutations of DNA methylation-related gene are closely associated with high WBC account.(3)the mutations is hardly seen in M3 subtype. (4)IDH1 IDH2 DNMT3A are independent prognostic factors, and the patients bearing mutations have a very poor prognosis. (5)The mutations remain to be further discussed as a MRD marker. Key words: DNA methylation; Acute myeloid leukemia; Gene mutation; Probe melting curve IV

12 第一章绪论第一章绪论第一节白血病的概况 1.1 白血病的研究历史白血病又被称为血癌, 是血液系统恶性肿瘤中最常见的一种疾病白血病是由于造血干细胞异常克隆, 血细胞失去进一步分化成熟能力而停滞在细胞发育不同时期, 在骨髓或者髓外其他造血组织大量增生, 并且侵润其他器官和组织从而发现相应的临床症状 1811 年, 英国科学家报道一例表现为脾脏肿大及血液呈乳白色脓液状病例, [1, 作者只是对疾病进行描述, 并未对其机理进行阐述 2] 1825 年,Alfred Velpeau 发现血管中出现脓液的病人, 同时还可能伴随腹胀发热等症状 [3] 白血病在 1845 年首次由苏格兰的 John Hughes Bennett 和德国的 Rudolf Virchow 进行描述 [4],Rudolf Virchow 于 1847 年用德语将该疾病命名为 Leukämie, 意为白色血液 1877 年, 外周血液涂片的发明及使用 [5], 白血病细胞的形态得到描述, 形态学渐渐成为白血病诊断的标准之一这些早期对白血病的发现及描述, 为近代医学对白血病诊断标准的制定奠定了基础 1.2 白血病的发病机制白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病, 白血病细胞自我更新增强增殖失控分化障碍凋亡受阻, 而停止在细胞发育的不同阶段主要表现为在骨髓和其他造血组织中白血病细胞大量增生累积, 浸润其他组织和器官, 而正常造血受抑制人类白血病病因目前尚不明确主要考虑受以下几个因素影响, 生物因素 : 病毒和免疫功能异常, 如成人 T 细胞白血病 / 淋巴瘤 (ATL) 可由人类 T 淋巴细胞病毒 Ⅰ 型 (HTLV-Ⅰ) 所致 ; 物理因素 : 主要指 X 射线 γ 射线等电离辐射 ; 化学因素 : 接触苯及含苯的有机溶剂, 某些药物如氯霉素保泰松乙双吗啉及抗肿瘤药物中的烷化剂和拓扑异构酶 Ⅱ 抑制剂但这些因素都是通过影响机体的分子水平的染色体或者基因来发挥致病作用的 1

13 第一章绪论白血病发生的分子机制可概括为 : 在造血干细胞分化成熟的过程中, 外界各种不良因素对其影响, 使得调控细胞分化和增殖的某些关键基因发生了突变, 进而使正常的血细胞转化为恶性单克隆细胞细胞转化为恶性主要表现为 : 一成熟或较成熟的的血细胞增殖失控 ; 二造血干细胞分化受阻, 致使血细胞不能进一步分化为成熟的血细胞, 而是停留在某个特定阶段, 大量不成熟的前体细胞堆积在造血组织, 具有功能的正常的血细胞不能产生, 而恶性血细胞大量单克隆, 致使机体产生相应的临床症状虽然融合基因在白血病发病中发挥了重要的作用, 但越来越多的研究表明, 在某些类型的白血病中, 单纯的融合基因的异常可能不足以致病, 还需要伴随其它的分子改变, 比如各种基因突变 ( 点突变插入突变缺失突变框移突变无义突变等 ) 有人提出, 急性髓系白血病是两大类基因异常协同作用的结果, 即二次打击学说 [6], 急性髓系白血病需要累积两次分子水平的变异才能导致最终表达白血病表型第一类突变提高血细胞增殖和 / 或存活潜能, 该类突变是信号传导途径的激活, 主要包括信号转导分子酪氨酸激酶或其下游分子的激活, 如 flt3,c-kit,c-fms,ras 及 BRAF 等 ; 第二类突变使细胞分化受阻, 主要是累及转录因子或转录共激活复合体成分的突变, 造成它们功能丧失, 使造血细胞分化受阻和随后的凋亡受抑 2008 年 Renneville 等 [7] 进一步完善丰富了这一理论, 将 AML 的基因突变分为三类 :(1) 提高细胞增殖潜能的突变, 如 :KIT FLT3 PTPN11 RAS MPL JAK2 等 ;(2) 影响细胞分化的突变, 如 CEBPA RUNX1 PU.1 WT1 等 ; (3) 参与调控细胞分裂周期和凋亡的突变, 如 NPM1 TP53 等一般情况下, 这三类突变可能同时在一个患者发生, 在细胞增殖分化凋亡调控等的不同阶段发挥作用而导致白血病的发生, 但一大类中的几个突变很少同时在一个患者身上出现第二节白血病的诊断 2.1 形态学诊断 -FAB 分型 1976 年由法国 (Franch) 美国(America) 及英国 (Britain) 的血细胞形态学家组成的协作组 (FAB), 根据光镜下白血病细胞的形态学特征以及血细胞对 2

14 第一章绪论酸性碱性染料的亲和力不同, 讨论并制定了白血病的分型诊断标准, 成为 FAB 分型 [8] 将急性白血病分为急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)L1-L3 及急性髓系白血病 (acute myelocytic leukemia,aml)m0-m7 ALL 分别为 :L1 原始和幼稚淋巴细胞以小细胞为主 ;L2 原始和幼稚淋巴细胞以大细胞为主 ;L3 原始和幼稚淋巴细胞以大细胞为主, 大小较一致, 细胞内有明显空泡, 胞浆嗜碱性, 染色深 AML 分别为 :M0 急性粒细胞白血病微分化型 ;M1 急性粒细胞白血病未分化型 ;M2 急性粒细胞白血病部分分化型 ;M3 急性早幼粒细胞白血病 ;M4 急性粒单核细胞白血病 ;M5 急性单核细胞白血病 ;M6 红白血病 ;M7 急性巨核细胞白血病将慢性淋巴细胞白血病分为 : 慢性淋巴细胞白血病慢性粒细胞白血病慢性粒 - 单核细胞白血病及慢性单核细胞白血病 2.2 MICM 分型 [9, 1986 年 MIC 协作组织提出了 MIC 分型法 10], 即综合形态学 (morphology, M) 免疫学(immunology,I ) 细胞遗传学(cytogenetics,C) 进行分型随着分子生物学 (molecular biology,m) 研究的发展, 越来越多证据表明染色体核型的变化及基因突变的发生与急性白血病的发病机制预后评估及分子靶向治疗有密切联系 2001 年 3 月, 国际血液学家及血液病理学家在里昂会议上公布了造血和淋巴组织肿瘤的 WHO 分类法, 该方法应用 MICM 分类技术从多方面反映疾病本质, 成为国际上一种新的通用的分类标准分子生物学的进步, 让现代医学进入了新的阶段, 对白血病发病机制的探讨也深入到染色体基因水平染色体的结构及数目的异常原癌基因的激活抑癌基因的失活或者缺失均可影响机体细胞的复制及分化, 这其中某一环节的异常均可能导致白血病的发生此外, 针对疾病发生的关键融合基因或者突变的靶向药物的出现, 更是为疾病的治疗提供了新选择目前已广泛应用临床的分子靶向药物有针对急性早幼粒细胞白血病的 PML-RARa 的全反式维甲酸, 以及针对慢性粒细胞白血病的 BCR-ABL 的伊马替尼此类药物作用靶点明确, 疗效肯定, 为患者带来了生机 3

15 第一章绪论表 1.1 WHO 髓系肿瘤和急性白血病的分类疾病类型染色体异常融合基因 / 突变 AML t(8;21)(q22;q22) AML-ETO AML inv(16)(p13.1q22)/t(16;16)(p13.1;q22) CBFB-MYH11 APL t(15;17)(q22;q12) PML-RARA AML t(9;11)(p22;q23) MLLT3-MLL AML t(6;9)(p23;q34) DEK-NUP214 AML inv(3)(q21q26.2)/ t(3;3)(q21;q26.2) RPN1-EVI1 AML ( 巨核细胞 ) t(1;22)(p13;q13) RBM15-MKL1 B 淋巴细胞性白血病 / 淋巴瘤 t(9;22)(q34;q11.2) BCR-ABL1 B 淋巴细胞性白血病 / 淋巴瘤 t(12;21)(p13;q22) TEL-AML1 (ETV6-RUNX1) B 淋巴细胞性白血病 / 淋巴瘤 t(5;14)(q31;q32) IL3-IGH B 淋巴细胞性白血病 / 淋巴瘤 t(1;19)(q23;p13.3) TCF3-PBX1 B 淋巴细胞性白血病 / 淋巴瘤 t(v;11q23) MLL 重排 AML -- NPM1 突变 AML -- CEBPA 突变 2.3 免疫学诊断 1975 年,Kohler 和 Milstein 首次报道了淋巴细胞杂交技术 [2], 利用此技术制备单克隆抗体, 发现了造血细胞表面存在各种分化抗原 1982 年, 国际人类白细胞分化抗原国际会议对表达于免疫细胞表面的蛋白分子标记, 统称为分化簇或者分化抗原 (cluster of differentiation,cd) 血细胞在分化发育的不同阶段, CD 可出现表达增多与减少甚至消失的变化, 而且血细胞来源及分化程度的不同, CD 种类及数目也随之不同, 两者具有相关特异性白血病细胞与正常血细胞形态变化很大, 其抗原表达常可出现某些抗原缺乏过度表达系列交叉甚至表达某一系列或阶段不应有的抗原, 这些抗原表达谱的改变常被作为做血液系统疾病免疫分型的依据不同来源 ( 髓系 / 淋巴系 ) 或处于不同分化阶段的血细胞表达的表面抗原有所不同如白血病分化抗原 [10] :T 淋巴细胞白血病 :CD3 CD5 CD7;B 淋巴细胞白血病 :CD10 CD19 CD22;NK 淋巴细胞白血病 :CD16 CD56 CD57; 髓系白血病 :CD13 CD14 CD33 MPO( 髓过氧化物酶 ); 红白血病 :GlyA( 血型糖蛋白 A); 巨核细胞白血病 :CD41 CD42 CD61 基于流式细胞术进行 4

16 第一章绪论免疫表型分析已经成为当前白血病诊断的一个常规检测手段 2.4 细胞遗传学诊断血液病细胞遗传学诊断是建立在对染色体的认识不断发展的基础上的自 Waldeyer 提出染色体 (chromosome) 的概念以来, 人类对细胞遗传学的认识日新月异, 标志着人类细胞遗传学的开始 1956 年, 首次报道了人类染色体的正常数目是 46 条 [11, 12],1960 年, 在费城的 CML 病人体内发现了的一个特殊的 [12, 22 号染色体 13], 表现为特征性的缩短, 被命名为费城染色体 [13] 1970 年后由于显带染色技术的发展, 促进了细胞遗传学, 人们可以描述染色体数量的变化和结构异常具体位置 1972 年 Rowley 首次在 AML 里, 发现了重现性染色体易位 t(8;21)(q22;q22), 这是白血病中发现的第一个染色体易位 [14] 随着对白血病患者染色体研究的深入, 发现大多数白血病患者都伴有非随机的染色体畸变, 且其对诊断和预后有重要的意义, 许多种类的染色体变化是白血病独立的预后影响因子 [15] 当前, 已发现的染色体异常包括染色体数目增减, 如单体三体等 ; 染色体核型结构的异常, 如易位 (translocation) 丢失 (deletion) 插入 (insertion), 倒位 (inversion) 等利用染色体显带技术进行核型分析 ( 即细胞遗传学分析 ) 已成为白血病诊断的常规流程之一第三节 3.1 DNA 甲基化简介 DNA 甲基化相关基因概况表观遗传修饰是指在不改变基因组 DNA 序列的情况下, 表达了可逆的可遗传的变化, 包括 DNA 甲基化基因组印记 RNA 干扰和组蛋白修饰等表观遗传学在肿瘤的发生与发展中发挥重要的作用当肿瘤抑制基因发生突变或者缺失, 负调控子缺失或者失活, 最终导致机体肿瘤的发生机体的这些改变, 常通过表观遗传学改变如 DNA 甲基化来实现 DNA 甲基化或者脱甲基化的表观遗传学功能是基因表达的调节当基因的可启动转录的启动子区域的 DNA 甲基化, [16, 基因就处于失活或者沉默状态 17] DNA 甲基化是通过 DNA 甲基转移酶 (DNMTs) 调节, 使胞嘧啶环的第 5 号位的碳原子增加一个甲基集团, 形成 5- 甲基胞嘧啶 (5mC) [16] 这些甲基集团主 5

17 Degree papers are in the Xiamen University Electronic Theses and Dissertations Database. Full texts are available in the following ways: 1. If your library is a CALIS member libraries, please log on and submit requests online, or consult the interlibrary loan department in your library. 2. For users of non-calis member libraries, please mail to etd@xmu.edu.cn for delivery details.

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