2010,30(6) 陈宏林等 : 一种提取高质量红树植物总 RNA 的有效方法 ml 离心管中 65 预热取 0.2g 三种红树幼嫩叶片, 置于液氮中, 加入适量 PVP 研磨至粉末, 迅速转移至提取液中, 剧烈震荡离心管, 将其混匀室温平放 5 min,12000r/min4 离

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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2010,30(6):84?88 一种提取高质量红树植物总 RNA 的有效方法 1,2 陈宏林王 1 玺 2 何振艳 (1 沈阳农业大学农学院沈阳中国科学院植物研究所光合作用与环境分子生理学重点实验室北京 ) 摘要为了从富含单宁和多糖的红树植物中获得高质量的 RNA, 在总结及改良前人工作的基础上, 优化了提取缓冲液的条件, 采用碱性条件 PVP 及 β 巯基乙醇抑制单宁的氧化 ; 利用 RNA 与单宁多糖在不同浓度的 2 丁氧乙醇中溶解度不同的特性来去除单宁和多糖 ; 同时利用 LiCl 来选择性沉淀 RNA, 获纯度较高的 RNA 可以直接用于 cdna 合成 cdna 文库的构建以及 RACE 等分子生物学操作关键词秋茄红海榄榄李红树植物单宁多糖 RNA 提取中图分类号 Q819 红树林 (Mangrove) 是分布于热带海岸潮间的木本植物群落, 具有海陆边缘生态系统的特点, 是珍贵的物种资源随着现代江河流域工农业的迅猛发展和沿海城市人口与经济的快速增长, 河口海湾区的环境污染日趋严重红树林对区域的污染具有较高承载力和耐受性 [1] 关于红树植物对重金属有机污染物等的抗性研究主要集中于污染物的富集以及生长形态和生理学方面 [2 6] 随着现代分子生物学的发展及其向各个学科的渗透, 人们对红树林这一独特珍贵资源的认识越来越多地使用分子水平技术如采用等位酶和限制性内切酶片段长度的多态性等手段研究红树植物种群的遗传变异和生态分化问题 [7 8] 但到目前为止. 关于红树植物抗污染胁迫的分子机理方面的研究还极少有报道在分子水平探讨红树植物对重金属具较高耐受性的分子生态机理, 鉴定红树植物中高效的重金属结合物质及其调控基因. 可以为可持续利用红树林资源提供更多的依据, 对保护沿海及海洋生态系统具有重要的意义获得高质量的 RNA 是进行分子生物学研究的必要前提红树植物富含单宁和多糖, 普通的 RNA 提取方法 ( 如盐酸胍法和 TRIZOL 法等 ) 无法去除干扰, 得不到高纯度的 RNA 通过比较和改进几种 RNA 提取收稿日期 : 修回日期 : 国家 863 计划资助项目 (2007AA091704) 通讯作者, 电子信箱 :wangxi sn2008@ tom.com;hezhenyan@ ibcas.ac.cn 方法 [9 12], 我们摸索出一种提取红树植物总 RNA 的有效方法用该方法提取出来的 RNA, 可以直接用于合成 cdna, 进行建库 RACE 等分子生物学操作 1 材料和方法 1.1 材料植物材料红树 (Mangrove), 包括秋茄 (Kadeliacandel,Kc) 红海榄 (Rhizophorastylosa,Rs) 榄李 (Lumnitzeraracemosa,Lr) 采自于福建省厦门市陨湖, 移栽于温室培养取幼嫩叶片作为 RNA 提取材料生化试剂 TRIZOL 购于 Invitrogen 公司 ; TransScriptⅡ ReverseTranscriptaseKID 购于 TRANS 公司 ;DEPC 异硫氰酸胍 PVP 等购自上海生工 ;DnaseⅠ Rase 抑制剂 TaKaRa3 FulRACECoreSetVer.2.0 Kit TaKaRa5 FulRACEKit 等购自大连宝生物工程公司 1.2 方法 RNA 酶活性的灭除用于 RNA 提取的研钵药匙镊子试剂瓶等均在 240 条件干热灭菌 2h 以上 ; 无 Rase 塑料管和枪头购于 Invitrogen 公司 RNA 提取 (1) 改良的 RNA 提取法 : 取 0.5ml 提取缓冲液 (1000 mmol/l Tris HC1,pH 8.5; 500mmol/L EDTA. 500mmol/L NaC1; 20% SDS; 5mmol/LDTTpH=8.5;1.5% (v/v)β 巯基乙醇 ) 装

2010,30(6) 陈宏林等 : 一种提取高质量红树植物总 RNA 的有效方法 85 1.5ml 离心管中 65 预热取 0.2g 三种红树幼嫩叶片, 置于液氮中, 加入适量 PVP 研磨至粉末, 迅速转移至提取液中, 剧烈震荡离心管, 将其混匀室温平放 5 min,12000r/min4 离心 10min, 小心取上清至新离心管 ; 加入 0.

2 2010,30(6) 陈宏林等 : 一种提取高质量红树植物总 RNA 的有效方法 ml 离心管中 65 预热取 0.2g 三种红树幼嫩叶片, 置于液氮中, 加入适量 PVP 研磨至粉末, 迅速转移至提取液中, 剧烈震荡离心管, 将其混匀室温平放 5 min,12000r/min4 离心 10min, 小心取上清至新离心管 ; 加入 0.1ml5mol/LNaCl, 充分混匀 ; 加入 0.3ml 三氯甲烷, 漩涡震荡 2min, 充分混匀, r/min 离心 10min; 此时, 溶液分为两层, 小心取上层溶液至新离心管 ; 加入 0.1ml5mol/LNaCl, 充分混匀 ; 加入 0.3ml 三氯甲烷, 充分混匀, r/min 离心 10min, 取上层溶液 ; 向上清中加入 1/4 体积的 2 丁氧乙醇, 室温放置 20min, r/min 离心 10min; 取上清至新管, 加入 1.4 体积的 10mol/LLiCl, 混匀, 20 过夜 ;4, 12000r/min 离心 15min, 弃上清 ; 沉淀用 1ml75%(V/ V) 乙醇, 洗涤 1 2 次, 晾干 ; 取 30μlDEPC 水溶解沉淀 (2)TRIZOL 法提取总 RNA:TRIZOL 总 RNA 提取试剂盒购于 Invitrogen 公司, 严格按照试剂盒说明书操作 (3) 硫氰酸胍一步法提取总 RNA: 参考分子克隆 [13] 实验指南的方法操作 1.3 RNA 质量检测用紫外分光光度计检测 RNA 纯度和浓度, 用 1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整性 1.4 cdna 的合成按照 TransScriptⅡ ReverseTranscriptaseKID 提供方法严格操作 1.5 RACE 按照 TaKaRa3 FulRACECoreSetVer.2.0Kit TaKaRa5 FulRACEKit 提供方法严格操作 2 实验结果改良法提取秋茄 RNA 的完整性盐酸胍法和 TRIZOL 法, 在提取 RNA 过程中, 材料研磨后, 加入提取液, 待细胞裂解, 溶液呈棕色, 并伴有粘稠物在液体的表面, 说明单宁类化合物已经被氧化, 且糖类物质已经被释放出来, 导致实验无法继续进行采用改良的方法未出现类似的现象分别取用不同方法提取的 RNA 产物 2μl, 用 1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测 ( 电泳上样时加入等量的样品 ), 由图 1 可见, 改良法提取的 RNA, 出现 3 条条带 (28S 18S 5.8S) 其中 28S 比 18S 条带亮, 亮度大概在 2 倍左右, 说明改良法提取的 RNA 完整性较好用 TRIZOL 法提取的 RNA 为弥散状, 没有正常的 28S 18S 以及 5.8S 条带图 1 总 RNA 的琼脂糖凝胶电泳 Fig.1 TotalRNAagarosegelelectrophoresis 1:RNAfromKadeliacandelleavesbyTRIZOLmethod;2:RNA fromkadeliacandelleavesbyimprovemethod;3:rnafrom Rhizophorastylosaleavesbyimprovemethod;4:RNAfrom Lumnitzeraracemosaleavesbyimprovemethod RNA 含量的检测取 1μlRNA 溶液至无 RNA 酶的 PCR 管, 用 DEPC 水稀释 100 倍, 分别测三种红树 RNA, 在紫外光 260nm 和 280nm 处的吸光值, 结果见表 RNA 质量的检测表 1 红树植物 RNA 含量的检测 Table1 MangroveofRNAcontentdetection OD 值方法红树品种 OD 260 OD 280 OD 260 /OD 280 含量 (μg/μl) 产率 (μg/g) Kc Trizol 法 Lr Rs Kc 改良法 Lr Rs 从表中的数据可以看出, 改良法提取的三种红树的 RNA 的 OD 260 /OD 280 均在 1.8~2.0 之间, 进一步验

86 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.30No.62010 证了 RNA 具有较好的完整性从产量上可以看出, 此方法更适合秋茄的 RNA 提取 2.

2 cdnaagarosegelelectrophoresis diagram 1:cDNAfromKadeliacandelleaves RNAbyTRIZOLmethod;2: cdna from Kadeliacandelleaves RNA byimprovemethod;3: cdnafromrhizophorastylosaleaves RNAbyimprovemethod;4:

3 86 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.30No 证了 RNA 具有较好的完整性从产量上可以看出, 此方法更适合秋茄的 RNA 提取 2.2 改良法提取的 RNA 合成的 cdna 采用 TRANS 公司的 TransScriptⅡ Reverse TranscriptaseKID 提供的方法用 RNA 合成 cdna 结果见图 2( 电泳上样时加入等量的样品 ) 图 2 秋茄 cdna 琼脂糖凝胶电泳图 Fig.2 cdnaagarosegelelectrophoresis diagram 1:cDNAfromKadeliacandelleaves RNAbyTRIZOLmethod;2: cdna from Kadeliacandelleaves RNA byimprovemethod;3: cdnafromrhizophorastylosaleaves RNAbyimprovemethod;4: cdnafromlumnitzeraracemosaleaves RNAbyimprovemethod 由图 2 可见, 改良方法 RNA 合成得 cdna 在 0.1~ 2kb, 而 TRIZOL 方法获得的 RNA 合成的 cdna 均在 1 kb 以下, 说明改良法提取的 RNA 质量较高, 有较高的转录活性, 普通的 TRIZOL 方法提取的 RNA 质量不能满足以后的实验要求 2.3 RACE 结果分别以改良方法和普通 TRIZOL 法提取的秋茄 RNA 为模板, 分别采用 TaKaRa3 FulRACECoreSet Ver.2.0Kit 和 TaKaRa5 FulRACEKit, 操作 RACE 实验, 对秋茄植物络合素合酶基因 KcPCS 进行克隆方法按照说明书执行结果如图 3 所示 : 由图 3 可以看出, 使用改良方法提取的秋茄 RNA 操作, 成功获得了 450bp5 RACE 条带和 1730bp3 RACE 条带同时经测序以及 NCBI 保守结构域比对验证, 证明所获得的片段确为预期产物这充分证明了通过改良方法提取的 RNA 具有较高的质量而普通 TRIZOL 法提取的 RNA 不能满足 RACE 实验的需要, 没有得到预期条带 3 讨论红树植物富含单宁和多糖, 普通的 RNA 提取方法图 3 RACE 实验琼脂糖凝胶电泳检测 Fig.3 The5 RACE(A)and3 RACE (B)resultsusingKadeliacandelRNA (a)kcpcs5 RACE1:usingKadeliacandelleaves RNAby improvemethod;(b)kcpcs3 RACE2:usingKadeliacandel leaves RNAbyimprovemethod;(c)KcPCS5 RACE3:using Kadeliacandelleaves RNAbyTRIZOLmethod;(d)KcPCS3 RACE4:usingKadeliacandelleaves RNAbyTRIZOLmethod 无法获得高质量的 RNA 关于对红树植物 RNA 提取 [14] 方法的改进, 相关报道比较少方孝东等报道了一种适用于盐生植物的 RNA 提取方法, 但他们仅选用了一种红树植物作为材料进行实验, 且并未提及何种材料, 所以所报道方法未必可用于大多盐生植物 ; 另外所用方法提取的 RNA 条带不完整, 不能满足高要求的分子生物学实验本实验致力于获得较高质量的红树 RNA, 针对普通的 TRIZOL 法改进了提取液和沉淀方法, 排除单宁和多酚的干扰本实验方法不但适用于红树植物的 RNA 提取, 对其他富含多糖多酚的植物 RNA 提取也具有较好的效果 3.1 防止单宁化合物氧化单宁也称植物多酚或鞣质红树植物的单宁含量比较高, 大多数红树植物的单宁含量通常在 10% ~ 30% [15 16] [17] 红树植物的单宁种类也比较多,Hsu 等对秋茄中的缩合单宁进行了结构的研究, 结果不仅发现有原天竺葵定 (propelargonidin) 二聚物原花青定 (procyanidin) 三聚物这些与其他物种共有的原花色素 ( 缩合单宁 ), 还发现了 2 种新的原花色素二聚物 : 秋茄素 A 1 A 2, 和 4 个三聚物 : 秋茄素 B 1 B 2 B 3 B 4 单宁对红树植物的重要性表现在其所处的特殊的物理环境化学环境和生物环境等各方面都有生态适应意义 [18 19] 如依赖单宁的聚盐性是红树植物适应高盐度环境的最重要的机制 [18] 但是, 种类繁多含量较高的单宁化合物却是红树植物 RNA 提取困难的重要原因之一单宁化合物极易氧化, 被氧化的单宁化台物 ( 如醌类 ) 能与 RNA 稳定地结合, 导致 RNA 活性

4 2010,30(6) 陈宏林等 : 一种提取高质量红树植物总 RNA 的有效方法 87 丧失, 在用苯酚氯仿抽提时会导致 RNA 的丢失, 或形成不溶性复合物 [10] 实验结果表明, 普通的方法 (TRIZOL 和硫酸胍法 ) 无法提取红树植物的 RNA, 在提取过程中, 强变性剂使红树植物细胞破裂后释放出大量的单宁化合物, 在酸性 ph(ph4~6) 条件下极易氧化使匀浆变为褐色针对红树植物 RNA 提取的困难, 我们改选用碱性提取缓冲液 (ph=8.5), 一定程度上防止了单宁化合物的氧化同时, 在提取过程中我们还加入了聚乙烯吡咯烷酮 (PVP),PVP 中的 CO N= 对酚类化合物具有较强的结合能力, 可以螯合一部分酚类化合物但由于碱性条件的提取缓冲液, 减弱了 PVP 的螯合作用 [20], 为了防止单宁化合物影响 RNA 的提取, 在改进的缓冲液中加入了还原剂二硫苏糖醇 (DTT) 和 β 巯基乙醇. 有效地防止了单宁类物质的氧化 3.2 多糖污染的去除多糖的去除是 RNA 提取过程中另一个关键问题多糖具有与 RNA 非常相似的理化性质, 很难将其与 RNA 分开因此对多糖的处理不当, 会导致 RNA 的提取出现两种后果 : 第一, 去除多糖的同时大量的 RNA 也被除去, 使得 RNA 的产量受到影响 ; 第二, 未能完全地去除 RNA 中的多糖, 形成难溶于水的沉淀, 或者溶解后为粘稠状溶液影响进一步的生物学实验本改良方法采用 LiCl 沉淀 RNA, 由于 LiCl 可以选择性地沉淀 RNA, 能够获得比较纯净的 RNA 但由于红树植物的特殊性, 单纯的 LiCl 沉淀也不能完全去除多糖的干扰为了解决这个问题, 实验在沉淀 RNA 之前采用 20% 2 丁氧乙醇先去除一部分多糖由于 RNA 多酚和多糖在 2 丁氧乙醇中的溶解度不同 [9] 这样不仅去除了多余的多糖, 同时也去除掉了在溶液中残留的酚类物质参考文献 [1] 李裕红, 章幼玉. 重金属污染对红树植物影响的研究综述与展望. 海峡科学.2007,6: LiYH,ZhangYY.HAIXIAKEXUE.2007,6: [2] 郑文教, 王文卿, 林鹏. 九龙江口桐花树红树林对重金属的吸收与累积. 应用与环境生物学报,1996,2(3): ZhengW J,WangW Q,LinP.ChinJApplEnvironBiot,1996,2 (3): [3] 郑逢中, 林鹏, 郑文教. 红树植物秋茄幼苗对镉耐性的研究. 生态学报,1994,14(4): ZhengFZ,LinP,ZhengW J.ActaEcologicaSinica,1994,14 (4): [4] 覃光球, 严重玲, 韦莉莉. 秋茄幼苗叶片单宁可溶性糖和脯氨酸含量 Cd 胁迫的响应. 生态学报.2006,26(10): QinGQ,YanCL,WeiL.ActaEcologicaSinica,2006,26(10): [5] 吴桂容, 严重玲. 镉对桐花树幼苗生长及渗透调节的影响. 生态环境,2006,l5(5): WuGR,YanCL.EcologyandEnvironment,2006,l5(5): [6]RavikumarS,WiliamsGP,ShanthyS,etal.Efectofheavymetals (HgandZn)onthegrowthandphosphatesolubilisingactivityin halophilic phosphobaeteria isolated from Manakudimangrove. JournalofEnvironmentalBiology,2007,28(1):109 l14. [7] 潘文, 周涵韬, 陈攀, 等. 木榄属 3 种红树植物的遗传变异和亲缘关系分析. 海洋科学,2005,29(5): PanW,ZhouHT,ChenP,etal.MarineSciences,2005,29(5): [8] 黎中宝, 林鹏. 我国不同纬度白骨壤种群遗传多样性和遗传分化的研究. 海洋学报.2002,24(1): LiZB,LinP.ActaOceanologicaSinica,2002,24(1): [9]ManningK.Isolationofnucleicacidsfrom plantsbydiferential solventprecipitation.analyticalbiochemistry,1991,195(1): [10]SchneiderbauerA,SandermannH,ErnstD.Isolationoffunctional RNA from planttisuerichinphenoliccompounds.analytical Biochemistry,1991,197(1): [11]SharmaAD,GilPK,SinghP.RNAisolationfromplanttisues richinpolysaccharides.analyticalbiochemistry,2003,314(2): [12]ZhangH,ChenHT,GlisinaV.IsolationofDNA freerna,dna, andproteinsbycesium trifuoroacetatecentrifugation.biochemical andbiophysicalresearchcommunications,2003,312(1): [13] Sambrook J,Fritsch E F,ManiatisY.MolecularCloningA LaboratoryManual,2 nd ed.beijing:sciencepres,1992, [14] 方孝东, 吴多桂, 林栖凤, 等. 一种适用于盐生植物的 RNA 提取方法. 海南大学学报,1998,l6(4) FangXD,WuD G,LinQ F,etal.NaturalScienceJournalof HainanUniversity,1998,l6(4) [15] 林鹏, 傅勤. 中国红树林环境生态及经济利用. 北京 : 高等教育出版社, LinP,FuQ.Manual.Beijing:AdvancedEducationPres, [16] 林益明, 向平, 林鹏. 红树林单宁的研究进展. 海洋科学,2005, 29(3): LinYI,XiangP,LinP.MarineSciences,2005,29(3): [17] Hsu F L, NonakaG I, Nishioka I. Tanninsand related

5 88 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.30No compounds. XXXI. isolation and characterization of proanthocyanidinsinkandeliacandel.drucechem Pharm Bul, 1985,33(3): [18] 王宗训. 中国资源植物利用手册. 北京 : 中国科学技术出版社, [19]LinP,FuQ.EnvironmentalEcologyandEconomicUtilizationof MangrovesinChina.ChinaHigherEducationPresBeijingand Springer VerlagBerlinHeidelberg,2000. [20] LoomisW D,BataileJ.Plantphenoliccompoundsand the isolationofplantenzymes.phytochemisty.1966,5(1): AnEfectiveMethodofHighQualityTotalRNA IsolationoftheMangrovePlants CHENHong lin 1,2 WANGXi 1 HEZhen yan 2 (1ColegeofAgronomy,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang ,China) (2KeyLaboratoryofPlantPhotosynthesisandMolecularEnvironmentalPhysiology,InstituteofBotany, ChineseAcademyofSciences,Beijing ,China) Abstract InordertogethighqualityRNAfrommangroveplantsrichintanninsandpolysaccharides,based onsummingupandimprovedourpredecesors,theconditionsofextractionbuferwasoptimizedtoinhibitthe oxidationoftanninsbytheconditionsofalkalineconditions, PVP and β mercaptoethanol. Mostofthe polysaccharidesandtanninsextractedwithnucleicacidsareremovedbytakingadvantageofdiferencesin solubilityofthesecompoundsinthesolvent2 butoxvethano.moreover,liclwasusedtoselectivelyprecipitate RNAandobtainedhigherpurityoftheRNA whichcanusedforoperationofmolecularbiologysuchascdna synthesis,cdnalibraryconstructionandracetechnique. Keywords Kadelia candel Rhizophora stylosa Lumnitzera racemosa Mangrove Tannins Polysaccharides RNAisolation

:TGF-β bfgf 23 KEY WORDS:transforminggrowthfactor-β ;basicfibroblastgrowthfactor; bonemarrow mesenchymalstemcels;eukaryoticexpressionvector; liposomet

:TGF-β bfgf 23 KEY WORDS:transforminggrowthfactor-β ;basicfibroblastgrowthfactor; bonemarrow mesenchymalstemcels;eukaryoticexpressionvector; liposomet 2 ( )208 58 JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)208,Vol.58No. TGF-β bfgf,, 2 (., 330006; 2., 5040) : -β (TGF-β ) (bfgf) (BMSCs), SD BMSCs Percol PCR TGF-β bfgf, pcdna3.(+), 3 BMSCs RT-PCR Westernblot

2010,30(6) 陈宏林等 : 一种提取高质量红树植物总 RNA 的有效方法 ml 离心管中 65 预热 取 0.2g 三种红树幼嫩叶片, 置于液氮中, 加入适量 PVP 研磨至粉末, 迅速转移至提取液中, 剧烈震荡离心管, 将其混匀 室温平放 5 min,12000r/min4 离

2010,30(6) 陈宏林等 : 一种提取高质量红树植物总 RNA 的有效方法 ml 离心管中 65 预热取 0.2g 三种红树幼嫩叶片, 置于液氮中, 加入适量 PVP 研磨至粉末, 迅速转移至提取液中, 剧烈震荡离心管, 将其混匀室温平放 5 min,12000r/min4 离