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1 第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版!" #$# # %&'&! 基础研究 树突状细胞 信号通路对哮喘小鼠气道变态反应性炎症的调控作用 杨 侠 张进召 张 洁 张秋红 刘艳琴 石 婕 张 明 单 虎 李雅莉 西安交通大学第二附属医院呼吸内科 陕西西安 $ 西安医学院第一附属医院呼吸内科 陕西西安 摘要 目的 探讨 %! &'#!! 信号通路对哮喘小鼠气道变态反应性炎症的调控作用 方法 通过小鼠骨髓细胞诱导分化建立树突状细胞 体系 并用氯化锂 和 ()*& 干预细胞 光镜下观察细胞形态 同种异体混合淋巴细胞反应检测 刺激淋巴细胞的增殖能力 %# #+!, 方法检测 中 -.)& 和 &'#!! 蛋白的表达水平 选用 /0 / 雌性小鼠为研究对象 使用 1 0 联合氢氧化铝构建哮喘模型 并用 和 ()* 干预小鼠 干预结束后收集标本 观察支气管肺泡灌洗液 /0 * 中细胞总数和嗜酸性粒细胞百分比 染色观察小鼠肺部变态反应性炎症情况.0 检测 /0 * 脾细胞培养上清液中干扰素 & * & 和白介素 &$ &$ 的含量及血清总 抗体水平 %# #+!, 检测肺脏组织中 %! &'#!! 信号通路的重要组分 -.)& 和 &'#!! 蛋白的表达变化 结果 组 对同种异体 2 细胞的刺激和促增殖能力明显弱于 ()* 组 组 中 -.)& 的蛋白表达水平明显低于 ()* 组 而其 &'#!! 的蛋白表达水平显著高于后者 动物实验中 与哮喘组相比 组 /0 * 中白细胞总数和嗜酸性粒细胞百分比均较低 而 ()* 组与此相反 肺组织病理表明 组肺部炎症程度最轻 ()* 组最重 组小鼠 /0 * 及脾脏中 &$ 水平最低 * & 水平最高 ()* 组与此相反 哮喘组介于两者之间 各组小鼠血清中总 含量 与正常对照组比较 实验组 显著升高 组总 水平明显低于哮喘组和 ()* 组 组肺组织中 -.)& 的蛋白表达水平明显低于各组 而其 &'#!! 的蛋白表达水平显著高于各组 ()* 组 &'#!! 的蛋白表达水平明显低于各组 哮喘组和 ()* 组之间 -.)& 的蛋白表达水平未见明显差异 结论 和 ()*& 可通过调控哮喘小鼠肺组织中 %! &'#!! 信号通路重要组分 -.)& 和 &'#!! 的蛋白表达而改变哮喘严重程度 为哮喘的治疗提供了新方向 关键词 树突状细胞 %! &'#!! 通路 氯化锂 ()*& 哮喘中图分类号 34 文献标志码 0 4!" ##$%## &" '%!" $ 50-6 ' 7 0-8!&9', # : "&,! ; 5'!&!. 8 # 7 0 -!. 0 " 5'& 3# +',+ # '+ #!#.#,! 0 '#, ', 6 '!8 ',,! ;! #+ 6 '!$ 3# +',+ # '+ #!#* + 0 '#, ', 6 '! # ', # #6 '!!' # # (( ( #( #& "#""" ##)*(+(,-.,#( # " " #. *"/01 & + " ( # )* " ( ## &! " ( # #!. " + # # )*& + " " # $0 " # & + "( 收稿日期 4 $ 修回日期 $ 基金项目 陕西省科技攻关项目 '&0 $0 $ "+ $# #" # / # $ / #'&0 "$0 通讯作者 李雅莉 & ( &#( 优先出版 &# & #(" 4&<<& &&&& (

2 期 杨 侠 张进召 张 洁 等 树突状细胞 %! &'#!! 信号通路对哮喘小鼠气道变态反应性炎症的调控作用 $ ( ("+ +( 2%-" " ( #. *" /01 & (+#" #,-.1 " ( "& ( # + "+ 3 " # (( & #,-.1" # "+ 4 ( " ((.5$-" 5 ( ("+.5$-& $0 " # "+ + & )* ". * ( " # ( #!. ( " /01 && $0 )* ". * # )* " /01 &5# # )* ". * )* " /01 && (+#" #,-.1 # #" ( #( " # && # " #+. * "/01 && 5 ( ((. * /01 && *( " (# 5. $,-.1" # # ( # 51' &&. * " 5. $" 51' /01 && 5 ( # #" ( #( " # && # " #+. * "/01 && $0 #. * /01 & # #. * /01 &&. * "/01 ## (+ # " $0 " # # " " # ( ( & ()* "" ## #. */01 ( 支气管哮喘是一种以嗜酸性粒细胞为主的众多炎症细胞和炎症因子参与的慢性气道炎症性疾病 哮喘的发病机制目前不完全清楚 可概括为免疫 & 炎症反应 神经机制和气道高反应性及其相互作用 树突状细胞 嗜酸性粒细胞 肥大细胞 中性粒细胞 巨噬细胞和变应原特异性 2 细胞在气道慢性炎症的发展和持续中发挥重要作用 是体内最重要的抗原递呈细胞 0( 具有摄取 处理和提呈抗原至 2 细胞的功能 在气道过敏性炎症的起始阶段 维持阶段都起着关键作用 是选择新的治疗哮喘药物的较为理想的靶点 以往认为 是激活 2 细胞初始免疫反应的细胞 随着人们认识逐渐深入 诱导免疫耐受的作用成为研究热点 并提出耐受性树突状细胞, #+, #! #! + # 的概念 近年来 在打破肿瘤耐受 抑制自身免 & 疫方面 这种免疫耐受已被广泛研究 并已取得了巨大的突破 然而 调控 致免疫耐受的胞内信号 网络尚不清楚 等发现 肠内 的 %! &'#!! 信号通路调控着肠道炎症反应和抗炎反应之间的平衡 消除 内 &'#!! 的表达能够增强炎症反应 加重炎症性肠 / 小鼠模型的病情 本研究通过卵蛋白 1 0 激发构建哮喘动物模型 使用药物上调或下调 %! 信号通路关键基因蛋白的水平 初步探讨变应原在诱发哮喘过程中 与 %! 信号通路的作用 从而为支气管哮喘的治疗提供新思路 + 材料与方法 + + 实验动物及试剂 清洁级雌性 /0 / 小鼠 4 周龄 由西安交通大学医学院动物实验中心提供 氯化锂 购自 ( 公司 ()*& 和卵清蛋白 1 0 购自. ' 公司 重组小鼠粒 & 巨噬细胞集落刺激因子 + - &.* 和重组小鼠白细胞介素 $+ &$ 购自 (# +,# 公司 兔抗鼠 -.)& 抗体和兔抗鼠 &'#!! 抗体购自.'!' +"9/,& #!,, &$.0 检测试剂盒 * &.0 检测试剂盒和 检测试剂盒购自 3 公司 其他试剂为国产分析纯 +, 小鼠树突状细胞的体外培养及形态功能鉴定 分 组 对照组 组及 ()*& 组 每组取 只小鼠 将 /0 / 小鼠颈椎脱臼处死后 无菌操作取出双侧股骨及胫骨 获得骨髓细胞悬液 离心 实验第 4 天 实验组分别加入 及 ()*& 使其终浓度分别为, 和, 对照组加入无菌 (/. 各培养 4 (. 终浓度为 继续培养 $ 后收集悬浮细胞 强力吹打细胞得悬液 离心 弃去上清 得细胞沉淀 倒置显微镜下每天观察培养中的 的细胞数目 形态 生长状况等

3 $ 西安交通大学学报 医学版 第 卷 行混合淋巴细胞反应 3 +-.$& 检测 $ 中 / (. 和 蛋白的表达 提取细胞中的总蛋白 严格按照所购置的试剂盒说明书进行操作 在 4! 波长处测定 0 值 根据标准曲线 << 计算出各组标本蛋白的浓度 激发构建哮喘小鼠动物模型 $ 只 /0 / 小鼠分别为 $ 组 正常对照组和 组模型组 哮喘组 哮喘小鼠经 干预组 组 和哮喘小鼠经 ()*& 干预组 ()* 组 模型组小鼠第 $ 天分别用 注射器腹腔内注射 = 现配制的 致敏 正常对照组用等量的无菌 (/. 代替 1 0 进行实验 第 天模型组小鼠给予 的 1 0 只滴鼻 每天 次 连续激发 对照组用等量的无菌 (/. 代替 1 0 进行实验 激发期间 观察小鼠给药后的反应并记录 实验第 $ 天开始 组和 ()* 组小鼠分别按, > 只 和 > 只 进行药物干预 每天 次 连续 对照组用等量的无菌 (/. 代替药物进行实验 第 天开始激发后 药物干预安排在 1 0 激发前 $ 进行 +- 血清总 ) 抗体水平检测 末次激发后 $ 采用眼球放血法采血 室温下静置 左右 离心 收集上清 检测血清中 抗体水平 +- 中白细胞和嗜酸性粒细胞计数 用颈椎脱臼法处死小鼠 迅速行支气管肺泡灌洗术 收集灌洗液 通过血细胞计数板进行细胞计数 计算每毫升细胞数 光学显微镜下进行细胞分类 计数 个细胞 求嗜酸性粒细胞的百分比 表 + $ 激发的同种异体混合淋巴细胞反应 +- 肺组织病理学观察 取左肺组织用 甲醛溶液固定 $ 后作病理切片 染色后观察 +- 酶联免疫吸附试验 ) 法 检测脾细胞培养上清液及 中 2 和 0 含量 按照试剂盒说明操作 数值以 表示 +-3$& 检测各组小鼠肺组织中 / (. 和 蛋白表达 用 :"'! 1!# 软件进行分析 求取灰度值 将样品蛋白和对应内参照蛋白进行对比 比较各组之间的差异 +-+4 统计学分析 采用.(.. 对数据进行统计学分析 数据均以均数? 标准差? 表示 组间平均数的比较使用配对样本." #! 检验 多组间比较采用单因素方差分析 1!#& ' '!', '+ & '!#0 1 0 表示差异有统计学意义, 结 果, + 树突状细胞形态 功能的比较 在倒置显微镜下观察 至培养第 4 天 细胞形态呈现典型的不规则星状 树突状 细胞集落明显增多 增大 大部分细胞呈半悬浮生长 于第 4 天加入 和 ()*& 继续培养 组细胞树突增加 轴突变长 细胞集落更大 更明显 而 ()* 组细胞体积变小 轴突短小 细胞集落明显减少 同种异体混合淋巴细胞反应结果显示 骨髓细胞诱导的 具有激发同种异体 2 淋巴细胞增殖的能力 与对照组相比 组 对同种异体 2 细胞的刺激和促增殖能力较弱 ()* 组同种异体 2 细胞的刺激和促增殖能力最强 具有统计学差异 表 2' 0, #!# #, #+#',! " '# 组别 0. = = = = = = 对照组 <? 4? $ $? 4 组 4? $ $$?? < $ << ()* 组 $? <? <? 4 4 << $ 2 细胞对照组 $? $? $? $ 细胞中 / (. 和 蛋白表达水平 用 :"'! 1!# 软件进行分析 求取灰度值 将样品蛋白和对应内参照蛋白进行对比 比较各组之间差异 结果显示 组 中 -.)& 的蛋白表达水平明显低于 ()* 组 而其 &'#!! 的蛋白表达水平显著高于后者 差异有统计学意义 图 图 图 + 组和 5( 组 / (. 蛋白表达量 * +#,!, -.)& +,#!! +," '! ()*& +,"

4 期 杨 侠 张进召 张 洁 等 树突状细胞 %! &'#!! 信号通路对哮喘小鼠气道变态反应性炎症的调控作用 $< 表, 各组小鼠 中白细胞总数和嗜酸性粒细胞百分比 2' 2#,'!" #+, #,, # '! #+#!' #, #,!,!," #/0 * 组别 例数 白细胞总数 A $ 嗜酸性粒细胞百分比 B 图, 组和 5( 组 蛋白表达量 * +#,!, &'#!! +,#!! +," '! ()*& +,",-. 各组小鼠一般情况的比较 实验组小鼠一般于多次激后出现头 鼻 面部及躯干瘙痒 并有不同程度的烦躁不安或安静少动 呼吸加快加深 呼吸急促 缩头弓背 抓耳挠腮 前肢缩抬 二便失禁等速发型哮喘反应表现 组上述症状较轻 ()* 组上述症状重 而正常对照组小鼠活动自如 偶可见烦躁不安 无躯体四肢瘙痒或大小便失禁等异常表现,-0 中白细胞总数及嗜酸性粒细胞的比例 结果表明 与正常对照组相比 实验组 /0 * 中白细胞总数和嗜酸性粒细胞分类计数明显升高 差异具有统计学意义 或 个实验组中 与哮喘组相比 组 /0 * 中白细胞总数和嗜酸性粒细胞百分比均较低 或 而 ()* 与此相反 或 差异均有的统计学意义 表 对照组? $4$ $? 哮喘组 $?$ $? 4 组? $? $ ()* 组 $4? $ <? < 值,- 肺组织病理学表现 肉眼可见 实验组小鼠肺脏体积增大 有形状不规则的暗红色充血区 镜下可见 小支气管及伴行血管黏膜下和周围肺组织有明显的炎性细胞 嗜酸性粒细胞 中性粒细胞 淋巴细胞和巨噬细胞 浸润 大量炎性细胞向小支气管和血管迁移 肺间质和肺泡腔内可见嗜酸性粒细胞 上皮细胞部分有脱落 部分可见黏液栓 黏膜皱襞减少 杯状细胞增生 血管壁明显水肿 而对照组无明显变化 小鼠支气管黏膜上皮 黏膜肌层均完好 支气管管腔规则 周围无炎性细胞浸润 图 病理炎症评分发现 与哮喘组? 相比 组分值最低 4? ()* 组分值最高 $ $? 各组之间比较差异统计学意义 图. 各组小鼠肺组织的病理学观察 * (',, ' '! #,," # "! "#A$ 0 对照组 / 哮喘组 组 ()*& 组,- 小鼠 中 0 和 2 的测定结果 与正常对照组相比 实验组 &$ 水平均上升 * & 水平均下降 与哮喘组和 ()* 组相比 组 &$ 水平最低 * & 水平最高 ()* 组与此相反 哮喘组介于两者之间 各组之间两两相比 差异均有统计学意义 表,- 小鼠脾细胞培养上清液中细胞因子的比较 与正常对照组比较 实验组各组小鼠脾脏中 &$ 含量组明显升高 * & 的含量显著降低 其中 表. 各组小鼠 中 0 和 2 含量的比较 2', '+,!, &$'! * &,!#!!," # /0 *? 组别 例数 &$ * & 对照组 4? <? 哮喘组 < $? < $? 组 4 <? $ $4? $ ()* 组? < <? $ 值

5 $ 西安交通大学学报 医学版 第 卷 组 &$ 水平最低 * & 水平最高 ()* 组与此相反 哮喘组介于两者之间 各组之间两两相比 差异均有统计学意义 表 $ 表 0 小鼠脾细胞培养上清液中 0 和 2 的测定结果 2' $ ##+!',!, &$'! * &! " #+!''!,," # ##! #? 组别例数 &$ * & 对照组?4 $ 4? 哮喘组 $ <<?< $? 组 <4? $? $ ()* 组 $ 4?< <$?4,- 小鼠血清中总 ) 含量的比较 通过.0 法测定各组小鼠血清中总 含量 与正常对照组比较 实验组 显著升高 差异有统计学意义 三者中 组总 水平明显低于哮喘组和 ()* 组 差异有统计学意义 表 表 各组小鼠血清中总 ) 含量的比较 2', '+,!, #,',!#!!," # #+" 组别例数 对照组 $? < 哮喘组 4? $ 组? $ ()* 组 $ $$?,-3 各组小鼠肺组织中 / (. 和 蛋白的表达水平 结果显示 组肺组织中 -.)& 的蛋白表达水平明显低于各组 而其 &'#!! 的蛋白表达水平显著高于各组 哮喘组和 ()* 组两者之间 -.)& 的蛋白表达水平无统计学差异 ()* 组 &'#!! 的蛋白表达水平明显低于哮喘组 图 $ 图 图 0 各组小鼠肺组织中 / (. 蛋白的表达量 * $ +#,!, -.)& +,#!!," # "! "#. 讨 论 树突状细胞是迄今为止发现的功能最强的 0( 其激发 2 细胞增殖的能力及抗原提呈能力分 $ 别是巨噬细胞和 / 细胞的 倍 而且 也是体内唯一可活化初始 2 细胞的 0( 既能 图 各组小鼠肺组织中 蛋白的表达量 * +#,!, &'#!! +,#!!," # "! "#!#' +," 引起免疫应答 又能诱导免疫耐受 在免疫反应中起着重要的引导和调节作用 其具体机制复杂 %! 信号通路中任一传导程序改变 都可导致该通路的传导异常 进一步引起信号传导下游靶基因的过度表达 影响细胞及组织的生物功能 &'#!! 是经典 %! 通路的核心蛋白 而 -.)& 在 %! &'#!! 信号通路中上游 在 &'#!! 降解过程中起着重要作用 这奠定了 -.)& 在 %! 通路中的关键作用 -.)& 的失调尤其是过度表达与许多疾病相关 如糖 &4 尿病 肥胖 炎症 神经系统功能紊乱和肿瘤 因此 -.)& 的抑制剂在疾病治疗方面具有潜在优势 锂是一种具有广泛生物活性的单价碱金属阳离子 是人体非必须的微量元素 是目前最明确的 -.)& 的抑制剂之一 是一个相对专一的抑制剂 它通过与 C 竞争抑制 -.)& 的活性 被广泛用于肿瘤 阿尔兹海默病 糖尿病 肾病等相关细胞生物 & 学研究中 ()* 是靶向作用于经典 %! 信号级 < 联反应的代表复合物 被广泛应用于肿瘤研究 有研究显示 %! 通路在放射诱导的骨肉瘤中具有转录活性 同时 %! &'#!! 通路的拮抗剂 ()*& 和姜黄素在人类骨肉瘤细胞实验中显示了抗肿 瘤活性 因此 和 ()*& 是明确的 %! &'#!! 信号通路的调节剂 目前已被广泛用于各项研究中 本实验采用这两种试剂作用于 观察 中 %! &'#!! 信号通路的变换及其与 形态和功能的关系 在本实验中我们观察到 哮喘组小鼠支气管及小血管周围有淋巴细胞 嗜酸性粒细胞浸润 支气管内膜充血 水肿 小气道上皮破坏 部分脱落 杯状细胞增多 管腔内有大量分泌物 可见黏液栓 /0 * 炎性细胞也较对照组明显增多 实验还发现 分别经 和 ()*& 处理的哮喘小鼠与哮喘组小鼠相比 组小鼠肺部病理改变较轻 局部炎症细胞浸润少 气道上皮轻度损伤 而 ()*& 组小鼠肺部病理改变重 气道上皮脱落明显 杯状细胞增生显著 黏液栓明显增多 提示 可减轻哮喘小鼠肺部变应性炎症 而 ()*& 与此相反

6 期 杨 侠 张进召 张 洁 等 树突状细胞 %! &'#!! 信号通路对哮喘小鼠气道变态反应性炎症的调控作用 $ 22 细胞比例和功能失衡是哮喘的主要免疫学改变 2 细胞可分泌产生 &$ & & 和 & 等细胞因子 其中 &$ 是 2 细胞最为特异分泌的 可激活 2 细胞 活化 / 细胞 使 合成增多 2 细胞主要分泌 & & * & 和 2 *& 等 其中 * & 是最特异分泌的 * & 可抑制 2 细胞因子的作用 对哮喘有保护作用 本实验发现 哮喘组小鼠 /0 * 和脾细胞培养上清中 &$ 显著升高 * & 明显降低 表明 1 0 致敏激发成功诱导了小鼠 2 型免疫应答 此应答反应与哮喘患者 2 功能低下 2 功能亢进的免疫异常相吻合 我们还通过对血清总 水平的检测 发现哮喘组小鼠血清 水平显著高于对照组 说明经 1 0 致敏和激发 可诱导小鼠发生过敏反应性疾病 本实验还发现 与哮喘组小鼠相比 /0 * 和脾细胞培养上清中 &$ 水平及血清中总 水平 组最低 而 ()*& 组最高 * & 结果与此相反 本结果提示 可减轻哮喘小鼠 2 型免疫应答 而 ()*& 与此相反 %! &'#!! 信号通路是调控细胞生长 发育和分化的关键途径 对造血干细胞和祖细胞的自我更新 2 细胞和 / 细胞分化发育 的成熟起着至关重要的作用 通过这些机制可改变致免疫原性和致耐受性的平衡 临床上 一些自身免疫性疾病 器官移植和变态反应性疾病需要致耐受性 而肿瘤和炎症时则需要致免疫原性 等发现 中的 %! &'#!! 信号通路在调控肠内肠道炎症反应和抗炎反应之间平衡方面起着关键作用 消除 内 &'#!! 的表达小鼠 调节性 2 细胞数量减少 炎症反应增强 病情加重 并在体外使用 处理 激活 %! &'#!! 信号通路 发现与未处理的 相比 前者能更有效地诱导调节性 2 细胞的产生 该研究认为 &'#!! 信号通路对于维持 处于致免疫耐受状态起着重要作用 在本实验中 我们首先用 1 0 致敏小鼠 并分别给予 %! &'#!! 信号通路的激活剂 和抑制剂 ()*& 来处理小鼠 激发后观察各组小鼠反应 评价各组小鼠 2 型免疫应答程度 并检测各组小鼠靶器官肺组织中 %! &'#!! 信号通路中两 个重要的蛋白 -.)& 和 &'#!! 的表达水平 结果发现经 处理的小鼠 2 型免疫应答程度低 肺部病理改变轻 -.)& 蛋白含量低而 &'#!! 蛋白含量高 本结果提示 %! &'#!! 信号通路在调控肺内变态反应性炎症反应和免疫耐受之间起着关键作用 参考文献!* 3$ &1 ""# #"$2*$ " ( 4""# ( # &-( *!, $ <& 张吉成 王弼 贾军 等 &-1/ 和 5. 双表达腺病毒转染 )* 肝癌瘤苗的制备及表达 & 医学争鸣 <4 &!-'5*-$$-!6$ 575$, -%5') -' &-# + # "" ## (( # &$# $ < <<$<& $ 7 3' )*23 '* 5 6 & "" # #!3* "#( + ( "" # ##( " # & 5(($$4 4& -)- -& $0 + " # " " # &1, # < $ & 4-6-$-! %.-$5%0$2)35 & #! ( &, / (# <44 <& 2. )2 5' $ 2$- '&-# + ( " 4"#" (( ( ( " " + -// /$ ' < (("-4 ( " &!/# < & 赵龙德 华福洲 钱燕宁 & 氯化锂预先给药对老龄大鼠腹部手术后认知功能的影响 & 中华麻醉学杂志 44< 4& <. /2 *.!*3 ' 6'/1 -'* )$ &$( (# # # # # #( &*##$< &. 2 /* 5-' 82' 76 &- (# #( "##( "/01 # ( #(# &5 ' ) 444 & 编辑 卓选鹏

高 云 钟良军 张源明 周晓欢 梁 平 徐 隽 探讨兔牙周炎对动脉粥样硬化炎性因子的影响及抗生素对其的作用 将 只雄性新西兰大白兔随机分为 组 组为对照组 组为牙周炎组 组为动脉粥样硬化组 组为牙周炎 动脉粥样硬化组 组为干预组 牙周炎 动脉粥样硬化 替硝唑组 各组分别按照实验设计进行相应干预处理 周末处死动物 检测牙周指标 血清中总胆固醇 三酰甘油 高密度脂蛋白胆固醇 低密度脂蛋白胆固醇 反应蛋白

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