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1 第 52 卷第 5 期厦门大学学报 ( 自然科学版 ) Vol.52 No 年 9 月 JournalofXiamenUniversity (NaturalScience) Sep.2013 doi: /j.issn 亮白曲霉代谢物中两种联苯化合物的分离鉴定 刘芬 1,2, 夏金梅 2, 王伟毅 2, 许建中 2, 许晨 2, 陈建明 2, 王宏涛 1* (1. 厦门大学化学化工学院, 福建厦门 ;2. 厦门市海洋生物遗传资源重点实验室 - 省部 共建国家重点实验室培育基地, 国家海洋局海洋生物遗传资源重点实验室, 福建厦门 ) 摘要 : 对深海来源真菌亮白曲霉 (Aspergiluscandidus) 进行固体发酵, 并采用浸泡萃取法和中高压制备柱对代谢产物进行提取分离, 从中分离得到化合物 1 和 2, 通过波谱解析确定化合物 1 为三联苯曲霉素 (terphenylin), 化合物 2 为 2,4- 二甲氧基 -1,10- 二羟基对联三苯. 对 6 种不同菌株进行抑菌实验, 表明两化合物均具有抗菌活性. 本实验是首次报道化合物 2(2,4- 二甲氧基 -1,10- 二羟基对联三苯 ), 也是第一次从海洋真菌中分离得到化合物 2. 关键词 : 亮白曲霉 ; 海洋真菌 ; 三联苯曲霉素 ;2,4- 二甲氧基 -1,10- 二羟基对联三苯中图分类号 : TQ 文献标志码 : A 文章编号 : (2013) 海洋真菌是海洋微生物生态系统中的重要组成部 分, 生存环境特殊, 导致新陈代谢和生存繁殖的特殊 性, 增加了从中获取新颖结构代谢产物和活性物质的 几率 [1-2], 有巨大的潜在经济价值, 已成为新物质发现 [3-4] 的研究热点. 白曲霉种属作为真菌的一种, 已有不 少研究报道, 它能产生多种具有不同生物活性的化合 [5-6] 物, 在工业上已有应用. 本文使用的亮白曲霉 (Aspergiluscandidus), 来 源于中国海洋微生物菌种保藏管理中心 (MCCC), 编 号为 3A00245, 是国家海洋局第三海洋研究所从大西 洋深海中取样分离得到的, 将其进行固体发酵, 采用浸 泡萃取法和中压制备技术分离得到三联苯曲霉素 (terphenylin, 化合物 1) 和 2,4- 二甲氧基 -1,10- 二羟 基对联三苯 ( 化合物 2). 三联苯曲霉素是一种黄酮类 真菌代谢产物, 熔点为 244~245, 能溶解于甲醇 乙 醇 二甲基甲酰胺 (DMF) 和二甲亚砜 (DMSO) 等有机 溶剂中, 微溶于水, 可作为抗氧化剂和植物生长抑制 [5-8] 剂, 并有弱抗 HIV 螯合酶偶联和链转移反应活性. 进行抑菌实验, 结果表明, 两化合物均具有抗菌活性. 本实验是第一次对化合物 2,4- 二甲氧基 -1,10- 二羟基 对联三苯进行报道, 也是首次从海洋真菌中分离得到 该化合物. 1 材料与方法 1.1 材料 试剂和仪器甲醇 ( 色谱纯 ): 美国 SpectrumChemicalMfg.Corp; 甲醇, 乙酸乙酯 ( 分析纯 ): 汕头市达濠精细化学品有限公司 ;MXR 系列实验室高剪切乳化机 : 上海沐轩实业有限公司 ;APV-2000 实验型高压均质机 : 德国 ;GL-21M 高速冷冻离心机 : 湖南湘仪离心机仪器有限公司 ;Waters2695(aliance 系统 ) 液相色谱仪 : 美国 Waters 公司 ; 制备液相色谱 :Reveleris system, 美国 Grace 公司 ; JA4103 电子天平 : 上海舜宇恒平科学仪器有限公司 ; 质谱 :BrukerEn Apexultra7.0T FT-MS; 红外光谱仪 : NicoletAvatar330, 美国热电公司 ; 全数字化核磁共振谱仪 AV400: 瑞士布鲁克公司 菌种和培养基海洋真菌固体发酵产物 ( 本实验选用亮白曲霉为发酵菌,MCCC, 编号 3A00245); 采用固体发酵, 培养 基为大米和 YPD 培养基混合,YPD 培养基 : 海水 1 收稿日期 : 基金项目 : 国家海洋公益性行业专项 ( ); 中国大洋矿产资源研究开发协会专项 (DY T-01) * 通信作者 :wanght@xmu.edu.cn 000mL, 葡萄糖 20g, 酵母膏 10g, 蛋白胨 20g, 调节 ph 到 6.5( 用盐酸和氢氧化钠调节 ph); 用于抑菌活性测定的 6 株菌分别为 : 弧菌 385(Vibriosp.,MCCC, 编号 E385), 弧菌 333(Vibrio sp.,mccc, 编号 E333), 弧菌 1758(Vibriosp.,MCCC, 编号 E1758),

2 第 5 期刘芬等 : 亮白曲霉代谢物中两种联苯化合物的分离鉴定 671 枯草芽孢杆菌 (Bacilussubtilis,MCCC, 编号 1A05483), 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus, 中国普通微生物菌种保藏管理中心 (CGMCC, 编号 ), 白色念株菌 (Candidaalbicans, 购于广州微生物菌种保藏中心, 编号 ATCC10231). 1.2 方法 亮白曲霉发酵 YPD 培养基 150 ml 与大米 150g 混合, 在灭菌锅中灭菌, 捣碎, 培养基和亮白曲霉菌菌种按质量比 10 1 接种,25 的培养箱中发酵 20d 发酵产物提取用萃取剂 (V( 甲醇 ) V( 乙酸乙酯 )=80 20) 浸泡发酵物, 收集有机相, 连续萃取 5 次, 合并有机相, 于 35 减压浓缩成浸膏, 得到发酵产物提取物 代谢产物的分离制备取浸膏用约 10 ml 溶剂 ( 少量 DMSO 和甲醇的混合溶剂 ) 溶解, 以 0.25μm 有机滤膜过滤制得浸膏样品溶液. 浸膏样品溶液先进行 HPLC 分析条件优化, 为制备分离建立条件. 以 HPLC 分析结果为参照, 用中压制备柱 (49 mm 310 mm) 对萃取物进行制备分离, 分别收集组分. 制备条件 : 检测波长 254nm, 流 球菌 枯草芽孢杆菌 弧菌 385 弧菌 333 弧菌 1758) 用 LB 平板 37 培养. 培养 24h 后, 取新鲜菌体配置 cfu/ml 菌悬液, 将 20 mg/ μ L 的刃天青 2 μl 菌悬液 194μL 和样品 4μL 加入 96 孔板中 ; 对照为 20mg/ μ L 的刃天青 2μL 菌悬液 196μL 和无菌水 4μL. 在 37 培养 24h 后, 用酶标仪测量激发波长为 571nm 发射波长为 584nm 荧光值. 根据公式 : 抑制 率 =(1- 实验组荧光值 / 对照组荧光值 ) 100%, 得到 抑制率. 2 结果与分析 2.1 代谢产物分离 按 的方法对发酵产物提取物进行分离制 备得到 L2 和 D4a 两个组分. 组分 L2 呈白色粉末状, 其对应的 HPLC 谱图如图 1 所示, 根据峰面积计算 主峰的纯度达到了 99.73%, 记为化合物 1. 组分 D4a 为褐色针状晶体, 相应的 HPLC 谱图如图 2, 根据峰 面积计算主峰的纯度达到了 99.03%, 记为化合 物 2. 速 45 ml/min, 流动相 V ( 甲醇 ) V ( 水 )= , 梯度洗脱, 温度 : 室温. 收集到 7 个组分 (L1~ L7). 将组分 L4 和 L5 合并称为 D4, 取组分 D4 进行 HPLC 条件优化, 以 HPLC 分析结果为参照, 用中压制备柱 (29mm 460mm) 对其进行制备分离. 制备条件 : 检测波长 270 nm, 流速 35 ml/min, 流动相 V( 甲醇 ) V( 水 )= , 梯度洗脱, 温度 : 室温. 收集到 2 个组分 (D4a 和 D4b) 组分 L2 和 D4a 的结构分析测定 图 1 化合物 1 的 HPLC 谱图 Fiġ1 HPLCchromatogramsofcompound1 NMR 检测 : 样品用氘代 DMSO 溶剂溶解, 用全数字化核磁共振仪 AV400 进行检测分析, 获得样品的 13 C-NMR 1 H-NMR DEPT( 无畸变极化转移增强 ) (135,90) COSY( 二维相关谱 ),HSQC( 异核单量子关系 ),HMBC( 多键碳氢关系 ) 和 NOESY( 核奥佛豪瑟效应频谱 ) 谱图. MS 检测 : 离子化模式 :ESI +, 毛细管电压 : 4400V, 干燥气温度 200, 干燥气流速 5.0L/min, 雾化气流速 2.0L/min 抑菌活性测试 [9] 对分离得到的两化合物进行抑菌试验. 白色念 珠菌用 PDA 平板 28 培养, 其余 5 株菌 ( 金黄色葡萄 图 2 化合物 2 的 HPLC 谱图 Fiġ2 HPLCchromatogramsofcompound2

3 672 厦门大学学报 ( 自然科学版 ) 2013 年 2.2 化合物 1 结构分析测定傅里叶变换 - 离子回旋共振质谱 (FT-ICR-MS) 测定化合物 1 得到的质荷比 m/z 为 [M + Na] +, 分子式为 C20H18O5, 不饱和度 12; 在紫外光谱上的最佳吸收波长为 270nm.DEPT 和 13 C-NMR: 化合物结构中存在 2 个 CH3,9 个 CH 和 9 个 C 结构. 1 H-NMR: δ3.63(s,3h) 和 3.29(s,3H) 为 2 个甲氧基的氢信号,δ 9.51(s,1H),9.30(s,1H) 和 8.51(s,1H) 为 3 个活泼的氢信号 ( OH),δ7.43(d,J=8.6Hz,2H),7.09(d,J= 8.5Hz,2H),6.84(d,J=8.6 Hz,2H),6.75(d,J=8.6 Hz,2H) 和 6.38(s,1H) 为次甲基的氢信号, 其中 δ7.43, 6.84,7.09 和 6.75 为对称的苯环氢信号, 同时, 由 CO- SY 图知,δ7.43 和 6.84 为 3 J 耦合,δ7.09 和 6.75 为 3 J 耦合. 13 C-NMR 和 HSQC:δ55.57(C19) 和 60.04(C20) 为甲氧基中的碳信号,δ153.06(C4) 和 (C1) 为与甲氧基相连的苯环碳信号,δ148.12(C2),155.89(C16) 和 (C10) 为与活泼氢相连的碳信号,δ (C9,C11),129.72(C8,C12),131.84(C14,C18) 和 (C15,C17) 为 4 对对称苯环碳的信号. 具体的 C 和 H 位置关系列于表 1 中, 将图谱与文献 [10-11] 比对基本一致, 因此, 确认本品为三联苯曲霉素,CAS 号 : , 结构式如图 3. 表 1 化合物 1 的 1 H-NMR 和 13 C-NMR 数据 Tab.1 1 H-NMRand 13 C-NMRspectraldataofcompound1 C 位置 δc(101 MHz,DMSO) δh(400 MHz,DMSO) (s,1H) (s,1H) , (d,J=8.6 Hz,2H) 9, (d,J=8.6 Hz,2H) (s,1H) , (d,J=8.5 Hz,2H) 15, (d,J=8.6 Hz,2H) (s,1H) (s,3H) (s,3H) 图 3 化合物 1( 三联苯曲霉素 ) 的结构 Fiġ3 Structureofcompound1 (terphenylin) 2.3 化合物 2 结构分析测定 FT-ICR-MS 测定化合物 2 得到的质荷比 m/z 为 [M + Na] +, 分子式为 C20H18O4, 不饱和度 12; 在紫外光谱上的最佳吸收波长为 266.5nm. DEPT 和 13 C-NMR: 化合物结构中存在 2 个 CH3,10 个 CH 和 8 个 C 结构. 1 H-NMR:δ3.65(s,3H) 和 3.29(s,3H) 为 2 个甲氧基的氢信号,δ9.33(s,1H) 和 8.61(s,1H) 为 2 个活泼的氢信号 ( OH),δ7.61(d, J=7.1 Hz,2H),7.46(t,J=7.5 Hz,2H),7.37(t,J =7.3 Hz,1H),7.11(d,J=8.6 Hz,2H),6.76(d,J =8.6Hz,2H) 和 6.44(s,1H) 为次甲基的氢信号, 其中 δ7.61,7.46,7.11 和 6.76 为对称的苯环氢信号, 同时, 由 COSY 图知,δ7.61 和 7.46 为 3 J 耦合,δ7.11 和 6.76 为 3 J 耦合. 13 C-NMR 和 HSQC:δ55.61(C19) 和 60.32(C20) 为甲氧基中的碳信号,δ153.15(C4) 和 (C2) 为与甲氧基相连的苯环碳信号,δ (C1) 和 (C10) 为与活泼氢相连的碳信号,δ (C9,C11),131.81(C8,C12),128.65(C14, C18) 和 (C15,C17) 为 4 对对称苯环碳的信号. 具体的 C 和 H 位置关系列于表 2 中, 未在文献中检索到与之匹配的谱图, 因此, 推测该化合物可能为一种新的化合物, 相应的化合物结构式如图 4. 依据有机化合物的系统命名法, 化合物 2 命名为 2,4- 二甲氧基 -1, 10- 二羟基对联三苯. 该化合物 2 同化合物 1 的主体骨架结构类似, 都为三联苯结构, 且苯环侧链上也含有羟基和甲氧基. 从文献 [5-8,12] 中得知, 化合物 1 具有抗氧化性, 可作为植物生长的抑制剂, 同时还具有细胞毒性, 很多类似骨架结构的化合物也具有细胞毒性, 或作为合成的中间体. 化合物的结构决定性质, 可大胆推测, 化合物 2 与化合物 1 具有相近的性质, 可能是一种潜在的抗氧化剂, 或可作为合成抗氧化剂的中间体. 2.4 活性测定结果以化合物 1 和 2 为样品分别对 6 种不同菌株进行抑菌试验, 并与对照组比较, 其中对照组刃天青 ( 阳性

4 第 5 期刘芬等 : 亮白曲霉代谢物中两种联苯化合物的分离鉴定 673 对照 ) 的抑制率以 100% 计. 依据公式计算, 得到试验 结果如表 3. 从表中可知, 化合物 1 对其中的 5 种菌株 均具有抑制作用, 且抑制率都超过 80%. 而化合物 2 只对其中的白色念珠菌有较高的抑制作用. 表 2 化合物 2 的 1 H-NMR 和 13 C-NMR 数据 Tab.2 1 H-NMRand 13 C-NMRspectraldataofcompound2 C 位置 δc(101 MHz,DMSO) δh(400 MHz,DMSO) (s,1H) (s,1H) , (d,J=8.6 Hz,2H) 9, (d,J=8.6 Hz,2H) (s,1H) , (d,J=7.1 Hz,2H) 15, (t,J=7.5 Hz,2H) (t,J=7.3 Hz,1H) (s,3H) (s,3H) 3 结论 采用浸泡萃取法和中压制备色谱, 对深海来源亮白曲霉固体发酵的代谢产物进行提取分离, 从中分离得到化合物 1 和 2, 在常温常压下, 化合物 1 为白色粉末状固体, 化合物 2 为褐色针状晶体. 通过波谱解析确定化合物 1 为三联苯曲霉素, 化合物 2 为 2,4- 二甲氧基 -1,10- 二羟基对联三苯. 对 6 种不同菌株进行抑菌实验, 表明化合物 1 对其中的 5 种菌株均具有抑制作用, 且抑制率都超过 80%, 而化合物 2 只对其中的白色念珠菌有较高的抑制作用. 化合物 1 具有抗氧化性, 还具有细胞毒性, 化合物 2 主体结构与化合物 1 相似, 结构决定性质, 化合物 2 可能是一种潜在的抗氧化剂, 或可作为合成抗氧化剂的中间体. 本文是第一次对化合物 2 进行报道, 也是首次从海洋真菌中分离得到化合物 2. 参考文献 : [1] 李春远, 佘志刚, 林永成, 等. 红树林内生真菌 K38 和 E33 混合发酵代谢产物研究 [J]. 中山大学学报 : 自然科学版, 2010,49(6): [2] 李越中, 陈琦. 海洋微生物资源及其产生生物活性代谢产物的研究 [J]. 生物工程进展,2000,20(5): [3] 王琳, 骆祝华, 黄翔玲, 等. 海洋真菌及其活性物质的研究 概况 [J]. 台湾海峡,2002,21(3): [4] KobayashiJ,LshibashiM,Walch M R,etal.AmphidionlideC:thefirst25-memberedmacrocycliclactonewithpotentantineoplasticactivityfromthecultureddinoflagelate Amphidiniumsp.[J].JAm Chem,1988,110: [5] CutlerH G,LeFilesJH,CrumleyFG,etal.Hydroxyter- 菌株 图 4 化合物 2 的结构 Fiġ4 Structureofcompound2 表 3 化合物 1 和 2 的抑菌活性 Tab.3 Antibacterialactivitiesofcompounds1and2 % 三联苯曲霉素 抑制率 弧菌 弧菌 弧菌 枯草芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌 ,4- 二甲氧基 -1, 10- 二羟基对联三苯 白色念珠菌 phenylin:anovelfungalmetabolitewithplantgrowthin- hibitingproperties[j].jagricfoodchem,1978,26(3): [6] TakahashiC,YoshihiraK,NatoriS,etal.Thestructures oftoxicmetabolitesofaspergiluscandidus.i.thecompoundsaande,actotoxicp-terphenyls[j].chem Pharm Bul,1976,24: [7] SinghSB,JayasuriyaH,DeweyR,etal.Isolation,structure,andHIV-1-intergraseinhibitoryactivityofstructuralydiversefungalmetabolites[J].JInd MicrobiolBiotechnol,2003,30: [8] Yen G C,Chang Y C,SuS W.Antioxidantactivityand activecompoundsofricekojifermentedwithaspergilus candidus[j].foodchemistry,2003,83: [9] Monteiro M C,delaCruzM,CantizaniJ,etal.Anewap-

5 674 厦门大学学报 ( 自然科学版 ) 2013 年 proachto drug discovery:high-throughputscreening of microbialnaturalextractsagainstaspergilusfumigates usingresazurin[j].journalofbiomolecularscreening, 2012,17(4): [10] MarcheliR,ViningLC.Terphenylin,anovelp-terphenylmetabolitefromAspergiluscandicus[J].JAntibiotics,1975,28: [11] KurobaneI,Vining L C,Mcinnes A G,et al.3- IsolationandIdentificationofTwoTerphenylCompounds fromaspergiluscandicus Metabolites LIU Fen 1,2,XIAJin-mei 2,WANG Weiȳi 2,XUJian-zhong 2, XU Chen 2,CHENJian-ming 2,WANG Honḡtao 1* (1.ColegeofChemistryandChemicalEngineering,XiamenUniversity,Xiamen361005,China; 2.StateKeyLaboratoryBreedingBaseofMarineGeneticResource,KeyLaboratoryofMarine GeneticResourceofStateOceanicAdministration & FujianProvince,Xiamen361005,China) Hydroxyterphenylin,anew metaboliteofaspergilus candicus structureelucidation by 1 H and 13 C nuclear magnetic resonance spectroscopy [J].J Antibiotics, 1979,32(6): [12] YenGC,ChiangHC,WuCH,etal.Theprotectiveefects ofaspergiluscandidus metabolitesagainsthydrogenperoxide-inducedoxdativedamagetoint407cels[j].foodand ChemicalToxicology,2003,41: Abstract: Thevastoceanareaisagreattreasuretroveofresources,buttheresearchandutilizationisnotenough,especialyfor deep-seamicroorganisms.deep-seahasspecificenvironments,andthechanceofobtainingnovelstructureisbig.deep-seamicroorganismshavebeenfocusedonitssignificanteconomicvalue.solidfermentationwasperformedusingaspergiluscandicusfrom deepsea.thesolidfermentationwasextractedusingsoakingmethodandthemetaboliteswereseparatedusingmedium-pressurepreparativeliquidchromatographycolumn.twocompoundsofantifungalbioactivitywereobtained.basedontheirspectroscopicdata,their structureswereelucidated.compound1isterphenylin.it'saantioxidantandhascytotoxicity.compound2is2,4-dimethyl-1,10-dihydroxȳp-terphenyl,apotentialantioxidant.itisthefirstreportofcompound2,especialyfromaspergiluscandicusofdeep-sea. Keywords: Aspergiluscandicus ;marinefungi;terphenylin;2,4-dimethyl-1,10-dihydroxȳp-terphenyl

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