国家标准《绿色食品饲料和饲料添加剂》

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义宫
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1 中国实验动物学会团体标准实验动物爪蟾质控系列标准编制说明联系人 : 李建军联系电话 : 编制单位 : 广东省实验动物监测所编制时间 :2017 年 4 月 20 日 1 / 6

2 中国实验动物学会团体标准实验动物爪蟾编制说明一任务来源鉴于实验爪蟾质量控制标准制定的重要性和紧迫性, 由广东省实验动物监测所向全国实验动物标准化技术委员会提出实验爪蟾第 1 部分 : 遗传质量要求实验爪蟾第 2 部分 : 微生物学和寄生虫学等级及监测实验爪蟾第 3 部分 : 配合饲料和实验爪蟾第 4 部分 : 环境与设施立项申请二制定的意义爪蟾作为两栖类的代表生物, 已有超过 150 年的研究历史, 因具有产卵量大体外受精胚胎体外发育卵径大养殖成本低且比果蝇和线虫等更高等优点, 自上世纪 50 年代以来, 以非洲爪蟾 (Xenopus laevis) 和热带爪蟾 (Xenopus tropicalis) 为代表的爪蟾属动物已成为胚胎学发育生物学生理学生态学毒理学遗传学分子生物学等研究的重要模式生物在疾病模型研究和应用领域, 因实验爪蟾具有体外受精发育, 可全程观察胚胎发育, 现已建立众多人类疾病动物模型, 如恶性肿瘤性血管疾病遗传疾病等在药物筛选和评价方面, 利用爪蟾受精卵评价激素中药提取物小分子化合物微生物细胞色素 C 重组蛋白等对胚胎发育的影响在发育生物学和基因功能研究领域, 利用器官分割技术及转基因技术研究爪蟾胚胎早期发育过程, 包括背腹极性建立原肠胚形成中胚层形成神经胚形成等, 同时由于爪蟾在蝌蚪开始喂食前的早期阶段心脏功能不完全, 是研究心脏不对称发育机制的重要材料在生态毒理学研究领域, Kloas 等于 1999 年最早报道酚类物质对非洲爪蟾内分泌干扰作用, 并明确提非洲爪蟾可作为内分泌干扰的模型 ;Hayes 等研究发现阿特拉津可诱导非洲爪蟾出现双性 ; 美国 Fort 环境实验室多年来致力于 FETAX 开发和利用, 利用非洲爪蟾胚胎对多种环境污染物和环境样品的发育毒性进行评价随着非洲爪蟾和热带爪蟾全基因组序列的解析, 爪蟾的研究和使用将会进一步增加目前我国研究和使用爪蟾单位超过 40 家, 并且成逐年上升趋势, 随着爪蟾在在我国研究与应用领域的逐渐普及, 制订其质量控制标准具有重要意义在实验爪蟾质量控制方面, 国外已制定了一些指南, 如 Guidance on the housing and care of African clawed frog xenopus laevis Guidelines for Egg and Oocyte Harvesting in Xenopus laevis Aquatic Frog Housing Density Guidelines - Animal Care and Use Program Husbandry of Xenopus tropicalis The Laboratory Xenopus sp. 等国内外至今尚无爪蟾质控标准, 行业迫切需要制定实验爪蟾质控标准对生物质量加以规范, 标准的制定将会 2 / 6

3 极大促进我国两栖类实验动物的标准化水平三主要工作过程 2017 年 3-4 月广东省实验动物监测所编制该标准的征求意见稿四编制原则及主要内容本标准的编制遵循下列原则 : 1. 保证标准修订过程的科学性 2. 保证标准执行过程的可操作性 3. 充分考虑我国国情, 符合我国技术发展水平五编制内容说明 1.1 种质检验实验动物典型特征是遗传背景清晰或来源清楚, 种作为遗传背景的最基本要素, 是保证实验动物质量的重要前提条件以非洲爪蟾 (Xenopus laevis) 和热带爪蟾 (Xenopus tropicalis) 为代表的爪蟾属蛙类, 是发育生物学研究的重要模式脊椎动物, 美国国立卫生研究院于 1998 年将非洲爪蟾评为基因功能研究的最佳非哺乳类模型系统之一 [1], 美国 [2] 欧洲 [3] 日本 [4] 等相继建立爪蟾资源数据库爪蟾属 (Xexopus) 物种复杂且多样, 公共数据库中已有 18 个确定的种 [5], 仍存多个物种尚未获得鉴别, 仅 2015 年 Evans 等于非洲中部和西部又发现 6 个爪蟾属新物种 [6] 近缘种大多体型体色相似, 在分类鉴别上难度较大, 如之前均被认为是非洲爪蟾的 4 个爪蟾属物种 [7], 在利用形态和分子生物学等方法进行重新鉴别后, 归为 4 个物种分别为 X. laevis, X. petersii, X. poweri 和 X. victorianus [6] 同时通过调查发现, 国内部分实验爪蟾仍直接来自市场或野外, 为避免近缘种混入风险, 本标准拟采用形态学和 DNA 条形码方法对实验爪蟾进行种质检验抽样用于种质检验的样本数量理论上是越多越准确, 但过多会增大工作量, 造成浪费本标准考虑实际情况和可操作性, 制定了按引进实验爪蟾数量的 6 % 抽样, 优先抽取可疑样品, 最大取样量不多于 30 只形态性状检测非洲爪蟾形态特征主要参考史瀛仙等文献 [8], 热带爪蟾形态特征参考沈国鑫 [9] 和 Evans 等 [6] 人文献 DNA 条形码检测 3 / 6

4 线粒体 12S,16S 和 COI 等基因已广泛用于物种鉴别, 现已建立了以线粒体 COI 基因序列编码基础的生命 DNA 条形码数据库 (BLODSYSTEMS) 在检测方法上,12s 检测通用引物通过 blast 寻找 12s 保守区域, 利用 primer 于保守区域设计获得,16s 检测通用引物参考后生动物通用引物 [10] (Simon,et al,1994) 主要参考,COI 检测通用引物主要参考 Ivanova 等 [11] 的文献, 并在此基础上经过对不同扩增反应条件摸索后确定了适合于实验爪蟾检测的实验方法结果判定为序列歧异度均 1.0 %, 判定为合格大量的研究表明 DNA 条形码序列进化速率较慢, 即使亲缘关系很近的类群在 DNA 条形码序列上也存在几个百分比的差异, 因此不同种间的 DNA 条形码序列差异极显著 Hebert [12] 等把 DNA 条形码序列歧义度小于 2.7% 作为鸟类种内判别阈值,Lambert 等 [13] 的研究结果显示种内条形码序列歧义度在 0~1.24% 之间, 通常序列歧义度在 1% 以内为种间差异 [14] 因此标准中把种内序列歧义度阈值定为 1% 判定当形态符合规定时, 判定为合格, 当形态不符合规定或不可检测时, 增加 DNA 条形码检测, 序列歧异度均 1.0 %, 判定为合格 1.2 遗传质量要求封闭群的命名封闭群的命名主要参照标准 GB 实验动物哺乳类实验动物的遗传质量控制 [15] 封闭群繁殖方法引种和繁殖方法参考标准 GB 14923[15] 其余主要参照国际爪蟾养殖和管理指南 [16-17] 和书籍 [18] 六采用国际标准和国外先进标准情况本标准未直接采用国际标准和国外先进标准七与现行法律法规强制性标准的关系本标准按 GB/T 规则和实验动物标准的基本结构编写, 与实验动物标准体系协调统一, 与实验动物管理条例实验动物质量管理办法实验动物许可证管理办法实验动物种子中心管理办法等国家相关法规和实验动物强制性标准的规定和要求协调一致, 是我国实验动物标准体系的重要补充八重大分歧意见的处理经过和依据无九标准性质的建议 4 / 6

5 本标准旨在规范和指导我国实验爪蟾的质量控制, 促进实验爪蟾行业有序较快发展本标准作为推荐性团体标准十贯彻标准的要求和措施建议本标准制定过程中进行了广泛的讨论交流, 使标准具有较强的科学性先进性和适用性目前我国实验爪蟾质量良莠不齐, 标准颁布后, 工作组将通过现场培训视频讲座网站专栏派发宣传资料等多形式多途径宣贯标准颁布后, 我们将建立示范基地, 供全国实验爪蟾生产使用单位人员学习交流十一参考文献参考文献 [1] 秦占芬, 徐晓白. 非洲爪蟾在生态毒理学研究中的应用 : 概述和实验动物质量控制 [J]. 科学通报, 2006, 51(8): [2] [3] [4] [5] [6] Evans B J, Carter T F, Greenbaum E, et al. Genetics, morphology, advertisement calls, and historical records distinguish six new polyploid species of African clawed frog (Xenopus, Pipidae) from West and Central Africa[J]. PloS one, 2015, 10(12): e [7] Kobel HR, Loumont C, Tinsley RC. The extant species. In: Tinsley RC, Kobel HR, editors. The Biologyof Xenopus. Oxford: Clarendon Press; p [8] 史瀛仙. 爪蟾蜍 (Xenopus laevis Daudin) 的习性和饲养 [J]. 动物学杂志, 1959, 2: 014. [9] 沈国鑫. 热带爪蟾繁殖生物学及其人工养殖研究 [D]. 南昌大学, [10] Simon C, Frati F, Beckenbach A, et al. Evolution, weighting, and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers[j]. Annals of the entomological Society of America, 1994, 87(6): [11] Ivanova, N V,Zemlak, T S,Hanner,R H,et al. Universal primer cocktails for fish DNA barcoding[j]. Molecular ecology notes,2007,7(4): [12] Hebert P D N, Cywinska A, Ball S L. Biological identifications through DNA barcodes [J]. Proc. R. Soc. B, 2003, 270: [13] Lambert D M,Baker L,Huynen O,et al. Is a Large-Scale DNA-Based Inventory of Ancient Life Possible?[J]. Journal of Heredity, 2005, 96(3): [14] Avise J C. Phylogeography-The History and Formation of Species[M]. Cambridge:Harvard University Press, [15] GB 实验动物哺乳类实验动物的遗传质量控制 [S]. [16] Reed B T. Guidance on the housing and care of the African clawed frog Xenopus laevis[j]. London: Royal Society of the Prevention of Cruelty to Animals, Research Animals Department, [17] Guide_for_the_Care_and_Use_of_Lab_Animals [18] Green S L. The laboratory Xenopus sp[m]. CRC Press, / 6

6 标准编制组 2017 年 4 月 6 / 6

标准名称

标准名称 ICS 65.520.30 B0 中国实验动物学会团体标准 T/ CALASx XXXX 实验动物爪蟾遗传质量要求 Laboratory animal -- clawed frog genetic quality control ( 征求意见稿 ) XXXX - XX - XX 发布中国实验动物学会发布 XXXX - XX - XX 实施 I 目次前言... II 1 范围... 1 2 规范性引用文件...1

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