2 期赵芸君等 : 利用高效液相色谱法同时测定瘤胃液中几种水溶性维生素 357 硫胺素 ( 标准品,99.9%) 维生素 C( 标准品, 99.9%) 烟酸 ( 标准品,99.9%) 烟酰胺 ( 标准品,99.7%) 氰钴胺素 ( 标准品,98.5%) 核黄素 ( 标准品,99.0%) 吡哆醇 (

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侣昀伊
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1 动物营养学报 2013,25(2): ChineseJournalofAnimalNutrition doi: /j.issn x 利用高效液相色谱法同时测定瘤胃液中几种水溶性维生素 1,2 赵芸君 1 孟庆翔 (1. 中国农业大学动物科技学院肉牛研究中心, 动物营养学国家重点实验室, 北京 ; 2. 新疆畜牧科学院饲料研究所, 乌鲁木齐 ) 摘要 : 本试验旨在建立利用高效液相色谱同时测定瘤胃液中几种水溶性维生素的方法取瘤胃液, 用正己烷偏磷酸萃取后, 其上清液用氮气吹干浓缩 (40 ), 以流动相 A 溶解色谱条件 :SBC 8 色谱柱, 粒径 5μm,4.6mm 150mm; 流动相 A,V 甲醇 V 0.05mol/L 磷酸三钠 (ph=2.5) =7 93; 流动相 B,V 甲醇 V 0.05mol/L 磷酸三钠 (ph=2.5)=90 10; 流速 1.0mL/min; 检测波长 245nm 结果表明:1) 该方法对烟酰胺烟酸叶酸核黄素和氰钴胺素的最小检出质量浓度分别为 ng/mL( 信噪比 =3), 线性回归相关系数分别为 ;2) 瘤胃液样品中加标烟酰胺烟酸叶酸核黄素和氰钴胺素的平均回收率分别为 97.5% 96.8% 73.2% 84.4% 89.1%, 相对标准偏差分别为 2.9% 3.0% 15.6% 7.8% 5.0% 由此得出, 本方法适用于同时测定瘤胃液中烟酰胺和烟酸的含量关键词 : 高效液相色谱 ; 瘤胃液 ; 水溶性维生素中图分类号 :Q56 文献标识码 :A 文章编号 : X(2013) 水溶性维生素对反刍动物及其瘤胃微生物的正常生命活动具有重要作用, 测定瘤胃液中水溶性维生素含量可为反刍动物瘤胃中水溶性维生素合成代谢及营养相关研究提供参考由于水溶性维生素的易被破坏性和瘤胃液中水溶性物质成分的复杂性, 因而使同时测定瘤胃液中水溶性维生素成为一项难题目前国内外反刍动物瘤胃营养研究中水溶性维生素的测定主要采用微生物法或针对一种维生素的高效液相色谱 (HPLC) 法, 上述方法均具有繁琐耗时且仅针对一种维生素测定等缺点目前, 在奶粉 [1] [2] [3] 食品和药物等方面已开展了利用 HPLC 同时测定几种水溶性维生素方法的研究, 而关于瘤胃液中几种水溶性维生 [4] 素的同时测定仅见 Aruna 等的报道, 并且该方法存在回收率相对较低且使用了对液相色谱柱柱效及泵损害较大的离子对试剂的问题鉴于此, 在参考国内外相关文献和了解瘤胃液成分的基础上, 拟对采用 HPLC 同时测定瘤胃液中几种水溶性维生素的方法进行摸索, 旨在建立一种较为准确实用的同时测定瘤胃液中几种水溶性维生素的方法 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 Agilent1100 型 HPLC 仪 ( 美国 Agilent 公司 ); 紫外检测器 ( 美国 Agilent 公司 ); 色谱柱 :SBC 8 色谱柱, 粒径 5μm,4.6mm 150mm( 美国 Agilent 公司 ); 氮吹仪 ( 天津奥特赛恩斯仪器公司 ); 超纯水器 ( 美国 Milpore 公司 ); 超声波破碎仪 ( 宁波新芝生物科技股份有限公司 );AL-01 溶剂过滤器 ( 天津奥特赛恩斯仪器公司 ); 低温离心机 ( 美国 Beckman 公司 );ph 酸度计 ( 上海雷磁仪器厂 ) 收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ); 动物营养学国家重点实验室开放课题 (2004DA125184F0904) 作者简介 : 赵芸君 (1973 ), 女, 山东招远人, 副研究员, 博士, 主要从事反刍动物营养研究 E mail:somebody_@163.com 通讯作者 : 孟庆翔, 教授, 博士生导师,E mail:qxmeng@cau.edu.cn

2 2 期赵芸君等 : 利用高效液相色谱法同时测定瘤胃液中几种水溶性维生素 357 硫胺素 ( 标准品,99.9%) 维生素 C( 标准品, 99.9%) 烟酸 ( 标准品,99.9%) 烟酰胺 ( 标准品,99.7%) 氰钴胺素 ( 标准品,98.5%) 核黄素 ( 标准品,99.0%) 吡哆醇 ( 标准品,99.9%) 叶酸 ( 标准品,98.0%), 均为美国 Supelco 公司产品 ; 甲醇 ( 色谱纯 ), 为美国 Fisher 公司产品 ; 磷酸三钠 ( 分析纯 ), 为美国 Sigma 公司产品 ; 正己烷 ( 色谱纯 ) 盐酸 ( 优级纯 ) 碳酸钠 ( 分析纯 ) 和偏磷酸 ( 分析纯 ), 均购于北京化学试剂公司 ; 超纯水为 Milpore 超纯水机自制, 电阻率 18.2MΩ 1.2 标准液及流动相的配制标准贮备液 : 准确称取维生素 C 吡哆醇烟酸烟酰胺氰钴胺素各 10mg 于 10mL 容量瓶中, 用 0.01mol/L 盐酸溶解并定容至刻度准确称取 5 mg 核黄素于 100 ml 容量瓶中, 用 0.01mol/L 盐酸溶解并定容至刻度 ; 准确称取 5mg 叶酸于 50mL 容量瓶中, 用 0.1mol/L 碳酸钠溶液溶解, 调 ph 至 7.0 并定容至刻度将上述标准贮备液于 4 冰箱中保存备用维生素 C 标准贮备液现用现配标准工作液 : 将标准贮备液用超纯水稀释成不同浓度的混合标准液, 冰箱 4 保存备用流动相 :0.05mol/L 磷酸三钠 (ph=2.5) 经溶剂过滤器抽滤后备用流动相 A 为体积比为 7 93 的甲醇与 0.05mol/L 磷酸三钠 (ph=2.5) 混合液, 流动相 B 为体积比为的甲醇与 0.05mol/L 磷酸三钠 (ph=2.5) 混合液 1.3 瘤胃液样品的前处理瘤胃液采用 4 层纱布过滤后经 5400r/min (4 ) 离心 15min, 取上清液 5mL 置于冰水浴中采用 150W 超声破碎 4min( 镜检无完整细胞 ), 然后加入 2mL 正己烷混匀后静置分层, 弃去上层取下层瘤胃液加入质量浓度为 25% 的偏磷酸 0.6mL, 在涡旋震荡器上混匀后在冰水浴中放置 30min 经 10000r/min(4 ) 离心 10min, 取上清液在 40 水浴下用氮气吹干, 用 0.8mL 流动相 A 溶解, 经 0.22μm 滤膜过滤上机分析测定在操作过程中尽量避光 1.4 色谱条件 SBC 8 色谱柱 : 粒径 5μm,4.6mm 150mm; 检测波长 :245nm;20μL 定量环 ; 柱温 : 室温 ; 流速 :1.0mL/min 梯度洗脱条件 : 流动相 A 从 0min 的 100% 减至 22min 的 40%, 流动相 B 从 0min 的 0 升至 22min 的 60% 1.5 统计方法数据采用 SAS8.2 进行 t 检验统计分析, 显著性水平为 P<0.05 数据以平均值 ± 标准差表示 2 结果与分析 2.1 前处理方法的筛选超声破碎瘤胃液超声破碎条件采用功率 150W, 工作 5s, 间隔 5s, 冰水浴超声 4min 后镜检无完整细胞采用 3 种不同梯度浓度的标准混合工作液分别进行超声和未超声处理后进样, 经 t 检验可知, 该超声破碎条件对几种水溶性维生素的含量无显著影响 (P>0.05), 详见表净化和脂肪蛋白质的去除由于生物发酵液成分非常复杂, 有许多物质 [5] 会干扰维生素的测定, 试验采用黄晓兰报道的自制酸性氧化铝小柱取 70~100 目的酸性氧化铝, 湿法装填成长 3~4cm 的小柱, 分别用 10mL 水及 10mL 甲醇冲洗后, 取一定量样品溶液过柱, 用 5% 的乙酸洗脱, 合并流出液和洗脱液定容后过膜测定测定结果发现硫胺素维生素 C 的分离效果不好, 吡哆醇烟酰胺烟酸的回收率不理想, 且需浓缩的体积大用 C 18 小柱处理 [6], 可除去部分蛋白质色素及脂类物质, 但测定效果也不是很好考虑到自制酸性氧化铝小柱和用 C 18 小柱处 [7] 理较麻烦, 后参考 Rizzolo 等的方法采用正己烷去除瘤胃液中脂肪由于偏磷酸具有沉淀蛋白质保护水溶性维生素和络合瘤胃液中微量金属离子的作用 [8], 同时借鉴瘤胃液通常去除蛋白质的方法 ( 加入 25% 的偏磷酸 ) [9] 试验结果表明偏磷酸对硫胺素的测定有干扰, 但对其他水溶性维生素的测定无干扰, 最终选偏磷酸作为蛋白质沉淀剂采集饲喂 5 种不同饲粮 [ 高蛋白质水平全混合日粮 (TMR) 中蛋白质水平 TMR 低蛋白质水平 TMR 青绿饲料饲粮粗饲料饲粮 ] 的肉牛瘤胃液, 分别取 5mL(n=4) 瘤胃液经超声破碎和去脂后分别添加 mL25% 的偏磷酸, 混匀后在冰水浴中放置 30min, 然后 4 离心去除蛋白质结果表明 : 添加 0.6mL

3 358 动物营养学报 25 卷 25% 的偏磷酸已完全能使上述 5 组瘤胃液中的蛋白质发生沉淀, 对硫胺素的测定有干扰, 但对维生素 C 吡哆醇烟酰胺烟酸叶酸核黄素氰钴胺素的测定没有干扰表 1 超声破碎对几种水溶性维生素含量的影响 Table1 Efectsofultrasonicdisruptiononcontentsofseveralwater solublevitamins(n=3) ng/ml 项目 Items 添加量 Supplementallevel 未超声处理的测定值 Measuredvalueof non ultrasonicdisruption 超声处理后的测定值 Measuredvalueof ultrasonicdisruption 硫胺素 Thiamine 维生素 CVitaminC 吡哆醇 Pyridoxine 烟酰胺 Niacinamide 烟酸 Nicotinicacid 叶酸 Folicacid 核黄素 Riboflavin 氰钴铵素 Cyanocobalamin ± ± ± ± ±3 567± ± ± ± ± ±5 596± ± ± ±8 1945± ±4 652± ± ± ± ± ±5 663± ± ± ±8 2646± ±3 800± ± ± ± ± ±7 635± ± ± ±8 2125± ±7 830± ±7 892± ±2 432± ±2 218±2 同行数据肩标无字母或相同小写字母表示差异不显著 (P>0.05), 不同小写字母表示差异显著 (P<0.05) Valuesinthesamerowwithnoleterorthesamesmalletersuperscritsmeannosignificantdiference(P>0.05),while withdiferentsmalletersuperscritsmeansignificantdiference(p<0.05) 浓缩通常, 水溶性维生素在瘤胃液中的含量很低, 且受饲喂饲粮的影响其变化幅度很大, 因此瘤胃液中水溶性维生素未经浓缩时, 常因含量较低而检测不到, 所以本试验采用 40 水浴氮气吹干的方法浓缩瘤胃液, 以便提高该方法的适用性 2.2 色谱条件文献报道的 HPLC 同时测定奶粉 [1] [2] 食品 [3] 和药物中水溶性维生素的方法常采用离子对试剂, 但考虑到其对色谱柱柱效及泵的损害较大, 因而从实用性角度考虑应避免使用离子对试剂测定水溶性维生素常用反相柱 C 18 C 8, 酸性的色谱条件有利于大多数水溶性维生素的稳定, 且 SBC 8 色谱柱的 ph 适宜范围为 2~8, 因此本试验选用反相 SBC 8 色谱柱 ( 粒径 5μm,4.6mm 150mm), 流动相为甲醇和 0.05mol/L 磷酸三钠 (ph=2.5) 的缓冲体系色谱条件的优化和测定水溶性维生素的种类由于瘤胃液基体较复杂, 保留时间的推迟将

4 2 期赵芸君等 : 利用高效液相色谱法同时测定瘤胃液中几种水溶性维生素 359 有利于各水溶性维生素组分的分离流动相中甲醇含量逐渐降低, 可使各水溶性维生素标准峰的保留时间逐渐推迟且各物质的分离度增加经测定, 瘤胃液样品流动相配比确定为 : 流动相 A, 甲醇与 0.05mol/L 磷酸三钠 (ph=2.5) 的体积比为 7 93; 流动相 B, 甲醇与 0.05mol/L 磷酸三钠 (ph= 2.5) 的体积比为 90 10; 流速为 1.0mL/min; 检测波长为 245nm 梯度洗脱条件确定为 : 流动相 A 从 0min 的 100% 降至 22min 的 40%, 流动相 B 从 0min 的 0 升至 22min 的 60% 采用上述色谱条件, 硫胺素维生素 C 吡哆醇烟酰胺烟酸叶酸核黄素氰钴胺素这 8 种水溶性维生素标准品的色谱图见图 1 1. 硫胺素 ;2. 维生素 C;3. 吡哆醇 ;4. 烟酰胺 ;5. 烟酸 ;6. 叶酸 ;7. 核黄素 ;8. 氰钴胺素 1.thiamine;2.vitaminC;3.pyridoxine;4.niacinamide;5.nicotinicacid;6.folicacid;7.riboflavin;8.cyanocobalamin. 图 1 水溶性维生素标准品的色谱图 Fig.1 Chromatogram ofwater solublevitaminstandardsamples 2.3 标准液的稳定性试验由于维生素稳定性差, 对光热氧酸碱和酶等比较敏感, 易于氧化分解破坏, 为此在操作过程应尽量避光, 样品保存在低温冰箱中尽快分析参考文献 [2] 对水溶性维生素标准液稳定性进行了研究, 结果发现 : 除叶酸用 0.01mol/L 盐酸配制的标准液稳定性稍差外, 其他维生素的稳定性均较好而叶酸采用 0.1mol/L 碳酸钠溶液溶解并调 ph 至 7.0 作为贮备液时, 效果较好研究发现, 本试验所配制的水溶性维生素 ( 除维生素 C 外 ) 贮备液至少可稳定 30d, 而标准工作液除维生素 C 能至少稳定 8h 外, 其余都至少可稳定 72h 2.4 方法考察及性能指标标准曲线线性范围及最低检出限 8 种水溶性维生素的线性范围和峰面积 (X) 对质量浓度 (Y,ng/mL) 的回归方程分别为硫胺素 0.5~50.0μg/mL,Y=1.613X (r= ); 维生素 C 0.25~90.00μg/mL,Y= 2.132X (r=0.9991); 吡哆醇 0.6~ 30.0μg/mL,Y=0.275X (r=0.9999); 烟酰胺 0.5~50.0μg/mL,Y=0.9407X (r=0.9999); 烟酸 0.5~50.0 μg/ml,y= 1.631X (r=0.9993); 叶酸 0.6~ 30.0μg/mL,Y = X (r= ); 核黄素 0.6 ~30.0 μg/ml,y = X (r=0.9990); 氰钴胺素 0.2~ 50.0 μg/ml,y = X (r= ) 按信噪比 (S/N =3) 计算, 得出硫胺素维生素 C 吡哆醇烟酰胺烟酸叶酸核黄素氰钴胺素的最小检出质量浓度分别为 ng/mL 方法的回收率精密度取肉牛瘤胃液按 1.3 和 1.4 操作进行测定, 发现本试验方法对瘤胃液中硫胺素维生素 C 吡哆醇未实现基线分离, 因此仅对烟酰胺烟酸叶酸核黄素氰钴胺素进行瘤胃液样品加标回收率和精密度试验取 3 头肉牛的瘤胃液混匀分成多份备用, 其将用于瘤胃液的本底测定精确度试验和回收率加标试验取其中 5 份分别用于测定瘤胃液中水溶性维生素的本底值, 计算烟酰胺烟酸叶酸核

5 360 动物营养学报 25 卷黄素氰钴胺素的保留时间和测定值的相对标准偏差 (RSD) 由表 2 可知, 烟酰胺烟酸叶酸核黄素氰钴胺素测定值的相对标准偏差分别为 2.1% 2.3% 8.1% 6.5% 3.9%, 保留时间的相对标准偏差分别为 0.24% 0.27% 0.41% 0.33% 0.36% 瘤胃液样品中水溶性维生素的色谱图见图 2 1. 硫胺素 ;2. 维生素 C;3. 吡哆醇 ;4. 烟酰胺 ;5. 烟酸 ;6. 叶酸 ;7. 核黄素 ;8. 氰钴胺素 1.thiamine;2.vitaminC;3.pyridoxine;4.niacinamide;5.nicotinicacid;6.folicacid;7.riboflavin;8.cyanocobalamin. 图 2 瘤胃液样品中水溶性维生素的色谱图 Fig.2 Chromatogram ofwater solublevitaminsinrumenfluidsample 表 2 精密度测定结果 Table2 Measuredresultsofprecision(n=5) 项目 Items 测定值 Measuredvalue/ (ng/ml) 测定值相对标准偏差 RSDof measuredvalue/% 保留时间 Retentaiontime/ min 保留时间相对标准偏差 RSDofretentaion time/% 烟酰胺 Niacinamide 烟酸 Nicotinicacid 叶酸 Folicacid 核黄素 Riboflavin 氰钴胺素 Cyanocobalamin 取上述 3 头肉牛的瘤胃液混合样品 3 份, 分别按表 3 所述添加各水溶性维生素标准储备液制成高中低 3 个水平的瘤胃液样品, 然后将制成的高中低水平的瘤胃液样品再分别分成 3 份, 每份分别按 1.3 和 1.4 操作进行测定, 扣除瘤胃液样品中空白水溶性维生素含量 ( 即瘤胃液水溶性维生素的本底值, 见表 2), 计算瘤胃液样品中加标水溶性维生素的回收率相对标准偏差由表 3 可知, 瘤胃液样品中加标烟酰胺烟酸叶酸核黄素和氰钴胺素的平均回收率分别为 97.5% 96.8% 73.2% 84.4% 89.1%, 相对标准偏差分别为 2.9% 3.0% 15.6% 7.8% 5.0% 鉴于在本研究色谱条件下, 测定瘤胃液中叶酸核黄素和氰钴胺素时出现了基线漂移, 同时参考我国国家标准许多检测方法中规定在重复条件下 2 次测定结果要求相对偏差小于 5%, 因此, 确定本研究的方法仅用于测定瘤胃液中烟酰胺和烟酸的含量 2.5 肉牛饲喂不同饲粮时瘤胃液样品的测定选 9 头肉牛, 分为 3 组, 分别饲喂高精料饲粮青绿饲料饲粮粗饲料饲粮, 采集每头肉牛的瘤胃液, 分别按 1.3 和 1.4 所述测定瘤胃液中烟酰胺和烟酸含量由表 4 可知, 高精料饲粮组和青绿饲料饲粮组瘤胃液中烟酰胺的含量显著高于粗饲料饲粮组 (P<0.05); 瘤胃液中烟酸的含量各组间差异不显著 (P>0.05)

6 2 期赵芸君等 : 利用高效液相色谱法同时测定瘤胃液中几种水溶性维生素讨论 3.1 瘤胃液中水溶性维生素的测定方法关于瘤胃液中水溶性维生素的测定方法, 主要集中在针对一种水溶性维生素采用一种检测方法 [10] [4], 虽然 Aruna 等对瘤胃液中烟酸吡哆醇硫胺素和核黄素 4 种水溶性维生素的同时测定方法进行了研究, 但该方法使用了对液相色谱柱柱效及泵损害较大的离子对试剂且回收率较低, 烟酸吡哆醇硫胺素和核黄素的回收率分别为 84.7% ~94.4%,86.5% ~94.3%,84.2% ~ [4] 93.8% 和 80.3% ~90.9% 与上述方法相比, 本试验建立的方法采用了一种色谱条件同时完成瘤胃液中烟酰胺和烟酸的测定, 且具有回收率 ( 烟酰胺 97.5% 烟酸 96.8%) 相对较高和未使用离子对试剂的优点同时, 本试验建立的检测方法也适用于饲粮中外源添加烟酰胺和烟酸后瘤胃液中烟酰胺烟酸的检测表 3 回收率测定结果 Table3 Measuredresultsofrecovery(n=3) 项目 Items 水平 Level 添加量 Supplementallevel/ (ng/ml) 回收率 Recovery/% 平均回收率 Averagerecovery/ % 相对标准偏差 RSD/% 烟酰胺 Niacinamide 烟酸 Nicotinicacid 叶酸 Folicacid 核黄素 Riboflavin 氰钴胺素 Cyanocobalamin 高中低高中低高中低高中低高中低表 4 瘤胃液中烟酰胺和烟酸的含量 Table4 Contentsofniacinamideandnicotinicacidinrumenfluid(n=3) ng/ml 项目 Items 烟酰胺 Niacinamide 烟酸 Nicotinicacid 高精料饲粮瘤胃液 Rumenliquidofahighconcentratediet 985.7±215.1 b 454.6±66.3 青绿饲料饲粮瘤胃液 Rumenliquidofagreenforgagediet 789.2±72.9 b 412.1±49.6 粗饲料饲粮瘤胃液 Rumenliquidofaroughagediet 376.4±59.8 a 352.8±53.7 同列数据肩标不同小写字母表示差异显著 (P<0.05) Valuesinthesamecolumnwithdiferentsmalletersuperscritsmeansignificantdiference(P<0.05). 此外, 本试验采用的色谱条件可使水溶性维生素混合标准液中的维生素 C 吡哆醇烟酰胺烟酸叶酸核黄素和氰钴胺素实现较好的基线分离, 由于多维添加剂成分相对简单, 因此本试验采用的色谱条件可为多维添加剂中同时测定多种水溶性维生素方法的开发提供参考 3.2 瘤胃液的前处理方法及影响瘤胃液水溶性维生素测定结果的因素分析本试验选用偏磷酸对瘤胃液进行去蛋白质前 [11] 处理干扰了硫胺素的测定, 据王希希等报道, 甲

7 362 动物营养学报 25 卷醇可沉淀蛋白质用于测定水溶性维生素, 因此今后可采用甲醇对瘤胃液进行去蛋白质处理, 并考察在本试验色谱条件下对水溶性维生素测定结果的影响本试验采用的色谱条件流速为 1mL/min 时, 瘤胃液中的吡哆醇未完全实现基线分离, 当流速为 0.9mL/min 时, 也未完全实现基线分离今后可采取降低流速或优化色谱的其他条件, 使瘤胃液中的吡哆醇最终实现基线完全分离而对于硫胺素维生素 C, 需继续研究瘤胃液前处理方法以进一步净化瘤胃液, 以及降低流速或优化色谱的其他条件, 使瘤胃液中硫胺素维生素 C 最终实现基线完全分离本试验采用的色谱条件测定瘤胃液中叶酸核黄素和氰钴胺素出现了基线漂移, 原因可能与流动相是梯度洗脱以及瘤胃液样品本底在检测波长有吸收有关本试验结果表明, 叶酸虽然实现了基线分离, 但回收率偏低和相对标准偏差较大, 原因可能与叶酸在酸性条件下易被破坏有关, 也即在本试验中瘤胃液经 25% 的偏磷酸沉淀蛋白质后以及被溶解在 ph=2.5 的酸性流动相 A 中均受到破坏, 所以本试验建立的瘤胃液前处理方法和色谱条件更适用于在酸性溶液中能稳定存在的水溶性维生素, 如烟酸和烟酰胺本试验中核黄素氰钴胺素的回收率偏低和相对标准偏差较大, 原因可能与核黄素氰钴胺素出现了基线漂移有关, 并可能与核黄素易见光分解有关在整个检测过程中作者用锡箔纸保护尽量避光, 但依旧出现核黄素回收率较低和相对标准偏差较大, 更具体原因有待进一步分析因此, 为实现同时测定瘤胃液中多种水溶性维生素, 需在本试验的基础上进一步优化色谱条件, 解决基线漂移的问题, 同时沉淀蛋白质时采用冷乙醇或甲醇, 以避免酸性环境对叶酸的破坏以及个别水溶性维生素测定的干扰另也可针对需要研究的某种特定水溶性维生素进行色谱条件优化, 实现基线分离 3.3 饲喂不同饲粮时肉牛瘤胃液中烟酰胺和烟酸含量的变化研究表明, 瘤胃中烟酸能转化成烟酰胺 [12], 因此, 了解瘤胃液中烟酸和烟酰胺的含量对于深入研究瘤胃的烟酸营养以及从烟酸营养的角度调控反刍动物营养代谢具有意义本试验测定了饲喂 3 种不同饲粮对肉牛瘤胃液中烟酰胺和烟酸含量的影响, 结果发现, 高精料饲粮组和青绿饲料饲粮组瘤胃液中烟酰胺的含量显著高于粗饲料饲粮组 ; 瘤胃液中烟酸的含量各组间差异不显著该 [13] 检测结果与 Santschi 等报道的瘤胃液中烟酰胺和烟酸含量的数值较接近 4 结论本试验建立的方法相对简单, 适用于同时测定瘤胃液中烟酰胺和烟酸的含量参考文献 : [1] ALBALA H S,VECIANA N M T,IZQUIERDO P M,etal.Determinationofwater solublevitaminsin infantmilkbyhigh performanceliquidchromatogra phy[j].journalofchromatographya,1997,778(1/ 2): [2] 成志强, 孙成均, 黎源倩. 反相高效液相色谱法同时测定食品和多维片中 8 种水溶性维生素 [J]. 分析化学,2001,29(9): [3] IVANOIC D,POPOVIC A,RADULOVIC D,etal. Reversed phaseion pairhplcdeterminationofsome water solublevitaminsinpharmaceuticals[j].journal ofpharmaceuticalandbiomedicalanalysis,1999,18: [4] ARUNAC,ANUJAD.Simultaneousdeterminationof ruminalniacin,pyridoxine,thiaminandriboflavinlev elsbyhighperformanceliquidchromatography[j]. IndianJournalofAnimalSciences,1999,69(8): [5] 黄晓兰, 陈云华. 液相色谱法测定生物发酵液中水溶性维生素的研究 [J]. 分析测试学报,1997,16 (3): [6] MORENO P,SALVADO V.Determinationofeight water andfat solublevitaminsinmulti vitaminphar maceuticalformulationsby high performanceliquid chromatography[j].journalof Chromatography, 2000,870(2): [7] RIZZOLO A,BALDO C,POLESELLO A.Applica tionofhigh performanceliquidchromatographytothe analysisofniacinandbiotininitalianalmondcultivars [J].JournalofChromatography,1991,553: [8] 陈骁熠. 甜玉米中水溶性维生素含量的 HPLC 测定法及其动态变化研究 [J]. 湖北农业科学,2001(6): [9] ERWINES,MARCO J,EMERY EM.Volatilefaty acidanalysesofbloodandrumenfluidbygaschroma

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g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.