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拾且敖
7 years ago
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1 香港中成藥檢測技術交流會 2015 年 9 月 22 日 Monthly Meeting CMA Testing and Certification Laboratories 檢測方法及對照品的選擇 Mr. Franky CHOI, Assistant Manager, Food and Pharmaceutical Division 蔡鳳奇先生廠商會檢定中心食物及藥物部助理經理

2 內容第一部份對照品的選擇中藥質量控制方法對照品的要求中藥對照品分類對照品製造流程選擇中藥化學對照品第二部份檢測方法的選擇中藥檢測方法品質性檢測鑒別含量安全性檢測

3 中藥質量中藥分為藥材 ( 中藥原藥材飲片 ) 和藥品 ( 中成藥 ) 中藥材炮製加工煎煮提取中藥飲片藥材提取物中成藥安全性製成劑型可控性中藥質量核心穩定性有效性

4 中藥質量控制方法例子 : 人參天麻例子 : 蟲草川貝母例子 : 三七當歸

5 中藥化學分析安全性 : 有毒有害物質有效性 : 有效成分 / 活性成分對照品 Reference Standards 穩定性 : 指標成分 / 主要成分

對照品 (Reference Standards ) 中國藥典 (CP) United States Pharmacopeia (USP) International Conference on Harmonization (ICH) 對照品 - 用於鑒別檢查含量測定的標準物質國家藥品標準物質管理辦法

pharmaceutical and related industries to help ensure the identity, strength, quality, and purity of medicines (drugs, biologics, and excipients), dietary

6 對照品 (Reference Standards ) 中國藥典 (CP) United States Pharmacopeia (USP) International Conference on Harmonization (ICH) 對照品 - 用於鑒別檢查含量測定的標準物質國家藥品標準物質管理辦法第三條規定 : 中藥標準物質是國家頒佈的一種計量標準, 定性定量檢測中藥所使用的實物對照, 具有高度均勻性量值準確性和良好的穩定性 Reference Standards are highly-characterized physical specimens used in testing by pharmaceutical and related industries to help ensure the identity, strength, quality, and purity of medicines (drugs, biologics, and excipients), dietary supplements, and food ingredients. Reference standard, or reference material, is a substance prepared for use as the standard in an assay, identification, or purity test.

7 中藥對照品的類別及要求三大類別 : 中藥化學對照品對照藥材對照提取物資料來源 : 中國食品藥品檢定研究院

8 中藥對照品應用歷年 «中國藥典» 收載對照品的數量 849 應用數量中藥標準物質 ( 包括中藥化學對照品及對照藥材 ) 對照提取物年版中國藥典檢查控制中藥生產, 提高保證品質的主要手段

9 中藥對照品分類按植物來源分類中國藥典 2010 鑒別及含量測定例子 : 丹參系列對照品 Source:

10 中藥對照品分類按化合物類型分類生物鹼類, 倍半萜類, 二萜類, 蒽醌類, 黃酮類, 香豆素類, 三萜類, 酚類, 木脂素類, 環烯醚萜類, 鞣質類, 單萜類, 苯乙醇類, 有機酸類, 甾醇類, 聚乙炔類, 強心苷類化合物類型例子生物鹼類苦參鹼 (Matrine) 烏頭鹼 (Aconitine) 黃酮類淫羊藿苷 (Icaritin) 橙皮素 (Hesperetin) 三萜類黃芪甲苷 (Astragaloside IV) 人參皂苷 Rb1 (Ginsenoside Rb1) 木脂素類連翹苷 (Phillyrin) 五味子甲素 (Schisandrin A) 環烯醚萜類梓醇 (Catalpol) 益母草苷 (Ajugol)

11 中藥化學對照品製造流程 TLC 確定分離條件原藥材 ( 三七 ) 煎煮提取提取液過柱分離半制備型 HPLC 組份 A 不同的組份制備型 LC UV IR MS NMR for confirmation 三七皂苷 R1 分離純化精製純化

12 美國藥典委員會每一種對照品應當附上說明書藥品批號用途用法與用量貯存條件等等 Testing Laboratory for Chinese Medicine 中國食品藥品檢定研究院 Sigma-Aldrich

13 選擇中藥化學對照品有效成分或指標成分含量的高低中藥品質的重要標誌選擇準則 1. 有效成份 ( 活性成分 ) 2. 指標成分主要成份 3. 毒性成份制訂合理的鑒別或含量測定方法首選 : i) 藥材中有生物活性及代表性的化學成分 ; ii) 處方中的君藥貴重藥及毒性藥的化學成分 ( 一種或以上 ) 避免選擇非專屬性成分 ( 熊果酸齊墩果酸等三萜類成份 ) 不穩定成分 ( 光溫度 ) 含量過低的成分並以高純度的化學對照品作對照進行測定

14 對照品 - 活性成份例子 : 藥材 : 製何首烏首選有效或活性成分, 如含有多種活性成分, 應盡可能選擇與中醫用藥功能與主治相關的成分 2,3,5,4 - 四羥基二苯乙烯 -2-O-β-D- 葡萄糖苷 ( 二苯乙烯苷 ) 為主要水溶性成分, 其含量常作為藥材及製劑質控的指標二苯乙烯苷何首烏具有調節血脂, 抗氧化清除自由基的作用, 提高學習記憶能力, 保護神經細胞, 保護血管上皮細胞等生物活性中成藥 : 首烏丸收載於中國藥典 2010 版一部, 由製何首烏熟地黃牛膝桑椹等 13 味中藥精製而成, 具有補肝腎, 強筋骨, 烏鬚髮的功效每 1g 樣品含 2, 3, 5,4 - 四羥基二苯乙烯 -2-O-β-D- 葡萄糖苷 ( 二苯乙烯苷 ) >2.6mg 香港中藥材標準對照品 ( 二苯乙烯苷 ) HPLC 圖首烏丸樣品 HPLC 圖中国药物警戒第 9 卷第 1 期 2012 年 1 月 January, 2012, Vol.9, No.1

對照品 - 活性成份例子 : 藥材主要活性成分藥理作用 2005 10 年版藥典含量測定 2015 年版藥典含量測定山茱萸具有補益肝腎澀精固脫之功效, 用於臨床處方和中成藥馬錢苷

15 對照品 - 活性成份例子 : 藥材主要活性成分藥理作用年版藥典含量測定 2015 年版藥典含量測定山茱萸具有補益肝腎澀精固脫之功效, 用於臨床處方和中成藥馬錢苷莫諾苷等環烯醚萜苷類成分研究表明, 山茱萸環烯醚萜苷具有廣泛的藥理活性, 包括抗炎抗腫瘤等, 並對心血管系統和神經系統有一定的保護作用馬錢苷馬錢苷的化學結構馬錢苷及增加另一有效成分和專屬性成分莫諾苷的含量測定莫諾苷的化學結構

16 對照品 - 指標成分例子 : 指標成分不一定代表有效成分, 是存在某一味藥材中的某一個成分, 較能代表這一味藥材的成分藥用大黃的化學指標成份蒽醌類成份香港中藥材標準第 II 冊大黃酚 ( 對照品 ) 大黃素 ( 對照品 ) 大黃 ( 對照藥材 ) 樣品中成藥 : 十滴水用於鑒別的化學指標成份空白對照樣品平行樣品加標樣品獨特指標成份作為對照品例子 : 厚朴厚朴酚 Magnolol 和厚朴酚 Honokiol 党参党参炔苷 Lobetyolin 大黃酸大黃酚蘆薈大黃素大黃素當歸藁本内酯 Z-Ligustilide 阿魏酸 Ferulic Acid

17 對照品 - 主要成份例子 : ( 對照品 ) 盧丁 OH 藥材 : 槐花豆科植物槐 Sophora japonica L. 的乾燥花及花蕾, 前者稱槐花, 後者稱槐米, 具有涼血止血清肝瀉火的功效主要成分 : 蘆丁 (Rutin) 藥典要求 : 槐花 > 6.0%, 槐米 >15% OH HO O O Glc OH O Rha 2012 年 12 月第 19 卷第 12 期中国中医药信息杂志 P 甘草酸甘草苷甘草酸藥材 : 甘草含有多種化學成分, 主要成分有甘草酸甘草苷等甘草苷香港中藥材標準第 II 冊

18 對照品 - 毒性成份例子 : 製附子為毛茛科植物烏頭 Aconitum carmichaelii Debx. 的子根的炮製品中醫藥條例附表 2 中藥材炮製生物鹼類成分 : 烏頭鹼 (aconitine), AC 次烏頭鹼 (hypaconitine), HA 新烏頭鹼 (mesaconitine), MA 生品製附子參附注射液為參附湯藥味經現代製劑工藝製備而成人參製附子 Chem Cent J Oct 10;7(1):165. doi: / X

19 檢查項應用的對照品例子 : 2010 年版中國藥典飲片檢查項應用的中藥化學對照品飲片中藥化學對照品標準大黃土大黃苷不檢出製川烏烏頭鹼次鳥頭鹼新烏頭鹼含雙酯型生物鹼以烏頭鹼次鳥頭鹼新烏頭鹼的總量計, <0.04% 千里光阿尼弗林鹼 <0.004% 兩面針毛兩面針素不檢出細辛馬兜鈴酸 I <0.001%

20 其他因素選擇對照品種類齊全? 純度達標? 供應短缺 / 充足? 價格高昂? 穩定性明確?

21 中藥檢測方法

22 中藥檢測方法標準方法中國藥典國家標準部頒藥品標準香港中藥材標準科學文獻內部方法方法學考察 : 鑒別含量測定自行建立

中成藥質量檢測制定檢測方法 ( 簡單流程 ) 了解產品的處方劑型及生產工藝, 按中醫藥理論君臣佐使挑選處方內的中藥作為檢測目標, 可按註冊要求, 制訂不同的測試藥味名稱炮製方法處方量參考藥典或文獻制定檢測方法 ( 包括提取方法及分析儀器確認 ), 所採用的鑒別或含量測定方法的可靠性重複性可用性等將通過實驗考察得到

23 中成藥質量檢測制定檢測方法 ( 簡單流程 ) 了解產品的處方劑型及生產工藝, 按中醫藥理論君臣佐使挑選處方內的中藥作為檢測目標, 可按註冊要求, 制訂不同的測試藥味名稱炮製方法處方量參考藥典或文獻制定檢測方法 ( 包括提取方法及分析儀器確認 ), 所採用的鑒別或含量測定方法的可靠性重複性可用性等將通過實驗考察得到 ( 分析方法驗證 ), 確認檢測方法可於不同的時間操作人員及實驗室運作均能適用將主藥從產品中取走 ( 即去除相關指標成分的藥材 ), 生產陰性對照品作測試方法專屬性驗證分析測試前, 應進行系統適應性試驗中國藥典 2010 附錄 XVIII A 中藥質量標準分析方法驗証指導原則應用經確認的檢測方法測試產品及收集數據, 為產品制訂品質標準

24 品質性檢測方法檢測方法的選擇選擇簡便易行的方法鑒別測試常用檢測方法顯微鑒別薄層色譜法 TLC 高效液相色譜法 HPLC ( 適合一般中藥成份的檢測 ) 氣相色譜法 GC ( 適合含揮發性成份的檢測 ) DNA 條形碼分子鑒定法 ( 適合動植物原藥材的檢測 ) 含量測定常用檢測方法高效液相色譜法 HPLC ( 適合一般中藥成份的檢測 ) 氣相色譜法 GC ( 適合含揮發性成份的檢測 ) 紫外 - 可見分光光度法 ( 適合某類成分多糖總黃酮等含量的測定 )

25 鑒別 - 顯微例子 : 中藥產品粉未藥材組織細胞內含物簡單快捷便宜但需要經驗產品 : 保嬰丹藥材川貝母麻黃防風全蠍準則澱粉粒廣卵形或貝殼形, 直徑 20~40µm, 臍點短縫狀, 人字狀或馬蹄狀, 層紋可察見纖維上附有細小晶體油管含金黃色分泌物, 直徑 10~40µm 體壁碎片淡黃色至黃色, 有網狀紋理及圓型毛窩, 有時可見棕褐色剛毛目的鑒別中藥材粉末鑒別對象首選珍稀貴重藥材 ( 選擇易檢出的特徵 ) 避免相似特徵的交叉干擾根據藥典地方標準或客戶提供的標準進行鑒別

鑒別 - 薄層色譜 (TLC) 例子 : 產品 : 白鳳丸藥材 / 製劑供試品溶液薄層色譜法分析分離藥材中的化學指標成份可見光和 / 或紫外光下檢視目前中成藥應用最多的鑒別方法對照藥材的使用與對照品並用, 增強分析方法的專屬性化學指標成份的斑點 / 條帶 (Rf 值 ) 1 2 3 4 5 6 快速簡便安全及便宜 Band Description

26 鑒別 - 薄層色譜 (TLC) 例子 : 產品 : 白鳳丸藥材 / 製劑供試品溶液薄層色譜法分析分離藥材中的化學指標成份可見光和 / 或紫外光下檢視目前中成藥應用最多的鑒別方法對照藥材的使用與對照品並用, 增強分析方法的專屬性化學指標成份的斑點 / 條帶 (Rf 值 ) 快速簡便安全及便宜 Band Description Rf 1 Negative Sample 除去當歸, 川芎 -- 2 Sample Set 1-1 Lot: Sample Set 1-2 Lot: Sample Set 1-3 Lot: Co-spot Standard + Sample Standard Ligustilide 藁本內酯 0.42

27 鑒別 -HPLC 指紋圖譜區別正品藥材與混淆品或偽品例子 : 天麻中藥材的化學條碼 (Chemical barcode) 不同中藥材有不同的指紋圖譜供試品色譜峰相同保留時間對照物特徵峰天麻提取液 6 個特徵峰的相對保留時間及可變範圍 a. 天麻素 b. 天麻藥材 c. 芭蕉芋 ( 混淆品 ) 芭蕉芋 d. 羊角天麻 ( 混淆品 ) 資料來源 : 名貴藥材鑑別資料來源 : 香港中藥材標準

28 含量測定 -HPLC-UV 含量測定反映產品品質的優劣或均一性色譜條件色譜柱流動相檢測波長理論板數分離度等專屬性強分離度好例子 : 產品 : 整腸丸測定產品中厚朴的成份 Standard Ingredient: Magnolol ( 厚朴酚 ) CAS No.: Formula: C 18 H 18 O 2 Molecular Weight: Structure: Sample

Astragaloside - 6.057 LSU LSU Astragaloside - 6.039 含量測定 -HPLC-ELSD 例子 : ELSD ( 蒸發光散射檢測器 ) 通用型檢測器, 檢測沒有 UV 吸收的化合物, 如人參皂苷黃芪甲苷等 Astragaloside IV ( 黃芪甲苷 ) CAS No.: 84687-43-4 Formula: Molecular Weight.

29 Astragaloside LSU LSU Astragaloside 含量測定 -HPLC-ELSD 例子 : ELSD ( 蒸發光散射檢測器 ) 通用型檢測器, 檢測沒有 UV 吸收的化合物, 如人參皂苷黃芪甲苷等 Astragaloside IV ( 黃芪甲苷 ) CAS No.: Formula: Molecular Weight.: Structure: 產品 : 玉屏風顆粒產品中黃芪為方中主藥, 其活性成分主要為皂苷類, 黃芪甲苷是其主要活性成分之一 C41H68O Standard Minutes Sample Minutes

30 Pentadecane Cinnamaldehyde Pentadecane Cinnamaldehyde 含量測定 -GC-FID 例子 : 肉桂油產品 : 紅花油肉桂揮發油中 90% 都是桂皮醛桂皮醛 CAS No.: Formula: C9H8O Molecular Weight.: Structure: GC-FID ( 火焰離子化檢測器 ) 用於揮發性成分的檢測 pa FID1 A, (D:\INSTRUM\FP-251\2015\ \DATA\150805\ 桂皮醛 Cinnamaldehyde Standard 內標 : Naphthalene 5 10 色譜條件色譜柱檢測器固定相及其塗布濃度柱溫檢測器溫度等專屬性強分離度好 pa FID1 A, (D:\INSTRUM\FP-251\2015\ \DATA\150805\ 肉桂醛 Cinnamaldehyde Sample 內標 : Naphthalene 5 10

性質和相對含量差異大影響中藥品質控制的主要因素適用於分析極性大揮發性熱不穩定等類型的成份 ( 彌補 GC-MS

31 液相色譜 - 質譜聯用 LC-MS LC: 高分離效能 ( 中藥分析最常用的儀器之一 HPLC UPLC) MS: 高靈敏度高選擇性 ( 高分辨質譜未知化合物的結構微量成分份測定 ) 中藥材中成藥的基本特徵含化學成份數量多化學結構類型複雜性質和相對含量差異大影響中藥品質控制的主要因素適用於分析極性大揮發性熱不穩定等類型的成份 ( 彌補 GC-MS 技術在樣品上的局限性 ) 對複雜混合物已知成份的定性定量分析多反應監測模式,MRMs 四極桿 Q1 碰撞室 ( 四極桿 Q2) 四極桿 Q3

32 中藥 LC-MS 檢測例子 : 川楝子含量測定檢測成分 : 川楝素 (Toosendanin) 定量分析的離子 (m/z): 573 TIC 图 TIC 图來源 : 上海诗丹德生物技术有限公司

液相色譜 - 質譜聯用 LC-MS 例子 : 2010 版及 2015 版中國藥典分別收載了阿膠龜甲膠鹿角膠三種膠類藥材 ESI + 2015 版藥典對阿膠龜甲膠鹿角膠的定性方法進行修正, 採用液質聯用的方法檢測特徵性肽段分子離子峰, 方法更科學可靠 MRM: m/z 631.3 546.

33 液相色譜 - 質譜聯用 LC-MS 例子 : 2010 版及 2015 版中國藥典分別收載了阿膠龜甲膠鹿角膠三種膠類藥材 ESI 版藥典對阿膠龜甲膠鹿角膠的定性方法進行修正, 採用液質聯用的方法檢測特徵性肽段分子離子峰, 方法更科學可靠 MRM: m/z 樣品對照藥材對龜甲膠和鹿角膠的定量分析方法進行了修改, 氮測定法修改為液相色譜法阿膠定性離子色譜圖藥材 2010 版中國藥典檢測方法定性鑒別含量測定 2015 版中國藥典檢測方法定性鑒別含量測定阿膠 ( 驢皮 ) TLC ( 茚三酮顯色法 ) HPLC LC-MS/MS HPLC 龜甲膠 ( 龜甲 ) 茚三酮或硫酸銅顯色法氮測定法 LC-MS/MS HPLC 鹿角膠 ( 鹿角 ) TLC ( 茚三酮顯色法 ) 氮測定法 LC-MS/MS HPLC Source:

34 安全性檢測方法 1. 重金屬及有毒元素含量 ( 砷鎘鉛汞 ) ( 電感耦合等離子體質譜法 ICP-MS) 2. 農藥殘留量 ( 有機氯農藥 ) ( 氣相色譜分析 - 電子捕獲檢測器 GC-ECD) ( 氣相色譜分析 - 質譜法 GC-MS) 3. 真菌毒素 ( 黃曲霉毒素 )(B1 B2 G1 G2) 4. 微生物限度檢測 ( 總細菌數霉菌及酵母菌大腸桿菌等 ) 5. 二氧化硫殘留量檢測 ( 經硫磺處理的藥材或飲片 ) 6. 有毒成份含量檢測 I. 馬兜鈴酸 ( 防己 vs 廣防己 ; 川木通 vs 關木通 ) II. 烏頭鹼, 新烏頭鹼, 次烏頭鹼 ( 生附子 vs 製附子 ) III. 馬錢子鹼 ( 馬錢子 vs 製馬錢子 vs 雲南馬錢 )

35 謝謝!

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<4D F736F F D20A4A4C3C4B2A3B77EB56FAE69ABD8C4B3AED15F66756C6C> ... 3... 10... 12... 13 3.1... 13 3.2... 13 3.3... 14 3.4... 15 3.5... 17 3.6... 21 3.7... 23 3.8 GMP... 24 3.9... 26... 28 4.1... 28 4.2... 29... 30 5.1... 30 5.2.... 30 5.3... 37 5.4... 38 5.5... 39