中文摘要 中文摘要 本文以鲜苦瓜为原料, 考察了 先提皂苷后提多糖 的综合性提取方法与质量控制方法, 在提取温度为 60 C 时, 苦瓜皂苷提取的最佳工艺参数为 : 乙醇质量分数 70%, 料液比 1 7, 提取时间 3 小时, 提取次数 1 次, 在最佳工艺条件下, 苦瓜皂苷粗品的提取率为 3.0

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1 硕士学位论文 (2007 届 ) 苦瓜皂苷和多糖的提取及质量控制方法研究 Study on the Extraction and Quality Control Method for Saponins and Polysaccharides from momordica charantia L. 研究生姓名指导教师姓名专业名称研究方向论文提交日期 张经硕谢洪平药物化学天然药物活性成分研究及中药新药开发 2007 年 5 月

2 中文摘要 中文摘要 本文以鲜苦瓜为原料, 考察了 先提皂苷后提多糖 的综合性提取方法与质量控制方法, 在提取温度为 60 C 时, 苦瓜皂苷提取的最佳工艺参数为 : 乙醇质量分数 70%, 料液比 1 7, 提取时间 3 小时, 提取次数 1 次, 在最佳工艺条件下, 苦瓜皂苷粗品的提取率为 3.06%, 含量以人参皂苷 Rg1 计约为 7.69%; 在提取温度为 60 C 时, 苦瓜多糖提取的最佳工艺参数为 : 料液比 1 20, 提取时间 3 小时, 醇沉体积 4 倍, 提取次数 2 次, 在最佳工艺条件下, 苦瓜多糖粗品的提取率为 1.34%, 含量以葡萄糖计约为 28.5% 在苦瓜多糖的提取过程中, 本文用近红外光谱 - 主成分分析模式清晰的观察到了温度对苦瓜多糖的影响 在用 AB-8 大孔吸附树脂纯化苦瓜粗皂苷的实验中, 利用化学模式识别技术和近红外透射光谱技术, 本文建立了苦瓜皂苷粗提物分离纯化的在线质量控制方法, 实现了最大程度溶剂和试剂的节约, 经多次验证, 该方法具有很高的稳定性, 可以用于实际生产过程的监控 关键词 : 苦瓜 ; 皂苷 ; 多糖 ; 提取 ; 质量控制 ; 近红外透射光谱 研究生 : 张经硕 导师 : 谢洪平教授 I

3 英文摘要 Study of the extraction and quality control method of saponins and polysaccharides from momordica charantia L. Abstract The paper investigate the extraction artwork and quality control of saponins and polysaccharides from momordica charantia L.. Extract the crude saponins with water-alcohol and the crude polysaccharides with water from momordica charantia L.,then purify the crude saponins with resin monitoring by near infrared transmission spectrum(nirts). On the condition of optimum, the purity and extraction ratio of the saponins and polysaccharides are stationary. The crude saponins extraction ratio is 3.06% and the content is 7.69%, after purifying with AB-8 resin, the content is about 50%. The crude polysaccharides extraction ratio is 1.34% and the content is 28.5% on the optimum condition. The method can degrade the extraction cost of the saponins and polysaccharides from momordica charantia L.. The NIRTS method can monitor the process of the saponins purify with AB-8 resin. Key words: Momordica charantia L.; Saponin; Polysaccharide; Extration; Quality control; Near infrared transmission spectrum Written by : Jingshuo Zhang Supervised by:hongping Xie Professor II

4 目 录 引言...1 第一部份苦瓜皂苷和多糖定量分析方法研究...8 第一节苦瓜皂苷定量测定方法研究...8 第二节苦瓜多糖的含量测定...19 第二部分苦瓜皂苷和多糖综合提取方法研究...29 第一节基于近红外光谱与主成分分析考察温度对苦瓜粗多糖的影响...29 第二节苦瓜总皂苷的提取方法研究...35 第三节苦瓜多糖提取方法研究...41 第三部分基于柱色谱纯化苦瓜皂苷...49 第一节大孔吸附树脂的选型试验...49 第二节 AB-8 树脂对苦瓜皂苷的吸附性能研究...52 第三节基于近红外光谱在线监控研究苦瓜皂苷的柱色谱纯化方法...57 第四部分结论...64 参考文献...65 攻读硕士学位期间发表论文...72 致谢...73

5 引言 引 言 随着社会经济的快速发展, 糖尿病已经成为危害公众健康的主要疾病之一 据 WHO 报道,2000 年全世界糖尿病患者约有 1.54 亿 预计在 2025 年全球糖尿病人数将猛增至 2.99 亿 1970 年我国 30 万人群调查, 糖尿病患病率为 0.674%;1994 年全国调查结果显示, 患病率达 2.5%;1996 年, 全国 11 省市 4 万人群调查, 患病率已达 3.21% 随着发病率的增加, 病死率也明显上升 1990 年, 全世界有 57 万人死于糖尿病, 如加上各种原因死亡的糖尿病人, 则高达 280 万, 糖尿病已成为世界第 5 位死亡原因 目前, 糖尿病已成为继肿瘤 心血管疾病之后, 危害人类健康的第三大病种 [1,2] 西药治疗糖尿病作用强而迅速, 长期服用将易于出现较多不良反应和并发症, 经过大量的研究证明中药在糖尿病的治疗和减少并发症的发生等方面具有明显的优势 [3,4], 因此寻找新的 用来延缓或阻止糖尿病及其并发症进程的中药已经成为很多研究者所关注的问题 [5,6] 苦瓜中的皂苷和多糖在糖尿病的治疗和减少并发症等方面已经获得了一些研究成果的支持, 表现出了一定的药效学潜能 [7-10] 苦瓜 (Momordica charantia L.) 别名锦荔枝 癞葡萄 ( 救荒本草 ), 红姑娘 ( 群芳谱 ), 菩达 ( 广东新语 ), 凉瓜 ( 广州植物志 ), 癞瓜 ( 民间常用草药汇编 ), 红羊 ( 泉州本草 ) 是葫芦科苦瓜属蔓性草本植物, 幼嫩果实可供食用, 因味苦得名 原产于热带, 广泛分布于亚热带 热带及温带地区 中国明代初年列为救荒植物之一, 当时尚未普遍栽培 至明代中后期才较多地为南方人所食用, 至今仍以华南栽培较多, 全国各地均有栽培 苦瓜味苦性寒, 具有清热解毒 滋养强壮 降血糖 抗突变 抗肿瘤以及提高人体免疫力等功效, 是人们喜爱的瓜类蔬菜之一 [11] 苦瓜果实含有多肽 皂苷 多糖 黄酮 氨基酸等多种生理活性成分, 其中以皂苷和多糖的研究较多见 现代研究表明 : 苦瓜皂苷具有降血糖 [7-10,12-14] 抗氧化 [15] 提高免疫能力 [16] 调节内分泌 [17] 降低胆固醇 [18] [19-21] 抗病毒 和抗肿 瘤等生理功能 [22-24] ; 苦瓜多糖具有降血糖 [25-28] 抑菌 [29,30 ] 抗氧化 [29] 抗 HIV 病毒 [31] 等生理功能 因此, 苦瓜皂苷和多糖表现出了明显的药理活性, 特别是在糖尿病 1

6 引言 及其并发症的药效学方面表现出了一定的药物开发研究潜能 1. 苦瓜皂苷 1.1 药理作用研究 苦瓜皂苷系四环三萜型葫芦苦素类化合物, 可用乙醇从苦瓜果实中提取出来, 已经鉴定的有葡萄糖苷, 阿洛糖苷等多种化合物 [32-36] 降血糖作用 对苦瓜醇提物或皂苷的研究表明, 它对糖尿病动物模型表现出了明显的降血糖 [8] 作用 孙宝莹等用苦瓜皂苷 ( 按相当于 40g 生药 /kg 体重 ) 连续饲喂四氧嘧啶糖尿病大 鼠 (n=10)5d, 血糖水平从 l4.18±3.56mmol/l 显著降至 5.93±1.29mmoL/L, 效果优于 [13] 已知有效药物优降糖 (3mg/kg) 潘华等通过喂食苦瓜素试图使高血糖模型小鼠血 糖值恢复到正常水平, 静脉注射 48g/kg 四氧嘧啶 3d 后, 选择高血糖模型动物分别用 不同剂量苦瓜素连续灌胃 10d, 然后取血测血糖 结果表明, 苦瓜素对肾上腺素 (20mg/kg) 葡萄糖 (2g/kg) 和四氧嘧啶引起的高血糖均具有明显降血糖作用 王 [14] 梅芳等研究报道, 由苦瓜中提取的苦瓜皂苷制成的降糖胶囊 11 号, 治疗 NIDDM100 例, 疗程 3 个月, 多数病人在服药 2 个月内临床症状消失, 有效率达 82% 另有研究报 [37] 道苦瓜皂苷对赛庚啶诱导的糖尿病小鼠也有降血糖作用, 还可以提高葡萄糖耐量 [38] 苦瓜皂苷降血糖作用的机理研究也获得了一定的研究成果 骆静等 [9] 用苦瓜醇 提物连续饲喂正常小鼠 链脲菌素糖尿病小鼠 四氧嘧啶糖尿病大鼠 7 天, 然后测定 肝糖原和血糖水平 结果显示, 苦瓜醇提物能够显著增加正常小鼠肝糖原含量, 对 正常小鼠糖耐量有明显改善, 降低四氧嘧啶 链脲菌素糖尿病模型大 小鼠的血糖, 说明苦瓜醇提物降血糖作用与增加肝糖原的合成, 增强正常小鼠胰岛 β 细胞的功能, 清除自由基, 抑制脂质过氧化反应, 对抗链脲菌素 四氧嘧啶所致的 β 细胞损伤, 促进 [10] β 细胞的修复和再生密切相关 王先远等在正常大鼠 (n=10, 体重 180±10g) 饮水 中加入苦瓜皂苷, 每只动物每天摄入 2mg 或 4mg, 连续 5 周 结果显示, 苦瓜皂苷不影 响大鼠空腹血浆胰岛素水平, 但显著降低餐后大鼠的血糖水平和胆固醇水平 ; 而肌 糖原和肝糖原的含量显著增加, 推测苦瓜皂苷可能通过调节糖皮质激素的水平, 刺 激糖原合成来降低血糖水平 2

7 引言 其它药理作用研究 [15] 苦瓜皂苷表现出了一定的抗氧化作用 王先远等在 Wistar 大鼠 (n=l0) 的饮水 中添加以苦瓜皂苷 (100g/L,200g/L), 饲养 5 周 结果两种给药剂量糖尿病大鼠游泳 1 h 体内血清中的丙二醛 (MDA) 浓度分别较对照低 23% 和 43%; 各组织 SOD 的活力分别 是对照的 1.39 和 1.65 倍 ; 血清 肝脏 GSH-Px 的活力均为对照的 1.2 倍左右 体外试验 也证实, 苦瓜皂苷在 25mg/L 50mg/L 浓度条件下, 均能显著减少培养大鼠胸腺细胞 内的 MDA 含量, 增加细胞内 SOD 与 GSH-Px 的活力水平 实验表明 [16] : 苦瓜皂苷能够提高模型动物的免疫能力 能明显增加衰老小鼠胸 腺 CD8 + -T 细胞数, 明显降低胸腺和脾脏中 CD4 + CD8 + 双阳性 T 细胞数 体外研究表明了 苦瓜皂苷不但可促进脾脏分泌 IL-2, 还可显著增强腹腔巨噬细胞分泌 TNFa, 但不影 响胸腺细胞调亡百分数 结果也显示, 苦瓜皂苷可通过改变 T 细胞各亚群比例, 促进 IL-2 分泌增强吞噬指数, 提高衰老小鼠免疫功能 调节内分泌是研究发现的苦瓜皂苷的另一药理作用 [17] 衰老小鼠服用苦瓜皂苷 后, 小鼠血中雌二醇水平可升高一倍, 有时达到青年小鼠的 65% 左右 其原因可能 是苦瓜皂苷有助于提高肾上腺分泌的雄烯二酮转化为雌二醇的效率 与此同时, 苦 瓜皂苷虽不能使胸腺细胞 ER 基因转录水平升高, 但可明显促进其蛋白的表达 由于 ER 表达增加, 从而使大量雌激素受体复合物进入细胞核调控基因表达 可见雌激素 水平升高, 受体表达增加, 对于延缓衰老 保持女性特征 防止骨质疏松可能非常 有益 苦瓜皂苷还表现出了一定的的降低胆固醇和抗病毒作用 以及抗肿瘤活性 有 研究显示, 苦瓜皂苷显著降低进食后的大鼠的血浆胆固醇的含量 [10], 有抗脂肪肝的 作用 [39] ; 文献报道 [40], 苦瓜干粉也具有降胆固醇的作用, 但起作用的是否只有苦瓜 [21] 皂苷, 还有待进一步证实 成兰英等从苦瓜茎叶提取总皂苷并经体外细胞试验表 明 : 总皂苷在浓度为 ~ g/ml 时无细胞毒性 ; 在浓度达 [19,41] g/ml 水平时就表现有一定的抗 HSV-Ⅱ 病毒活性 另有研究表明苦瓜提取物 可抑制艾滋病毒 HIV 的表面活性, 选择性的杀死被 HIV 感染的淋巴细胞和巨噬细胞 朱明静等研究表明, 苦瓜皂苷 A 对 S180 动物癌组织 DNA 和 RNA 蛋白质的合成具有显著的 抑制作用 [22] 有研究显示, 苦瓜皂苷对骨髓瘤也有明显治疗作用 [42], 还可以抑制癌 3

8 引言 细胞增殖 [43] 1.2 皂苷的提取工艺研究 苦瓜果实中皂苷的含量相对较高, 对于果实中皂苷的提取方法得到了广泛的关 注 [44-45] [44], 其中有机溶剂提取方法应用较为广泛 崔恒林等将苦瓜粉经乙醇浸提后, 减压浓缩至干, 加蒸馏水溶解, 用水饱和的正丁醇萃取, 再用甲醇 丙酮反复溶解 [45] 沉淀提得苦瓜皂苷粗品 高中松等将苦瓜片用乙醇回流提取, 提取液过滤后水浴 浓缩至干, 加甲醇溶解, 再加入丙酮沉淀皂苷, 沉淀烘干后得苦瓜皂苷粗品 同时, [46] 苦瓜果实中皂苷的生物提取技术也表现出了一定的优势 高晓明等利用果胶酶和 纤维素酶对苦瓜进行酶解提取, 用微孔技术精制提取液, 除去一些大分子化合物和多 糖, 微滤后的精制液在比色法监控下过 LSA-20 大孔树脂柱进行纯化, 乙醇洗脱, 冷 冻干燥洗脱液得产品苦瓜皂苷 苦瓜茎叶中的皂苷也具有一定的研究价值, 其提取方法也被人们所关注 成兰 [21] 英等将干燥的苦瓜茎叶经粉碎, 石油醚脱脂后, 用乙醇煮沸提取, 减压浓缩滤液至 稠状. 乙醇提取物加适量水, 用 CHCl3 多次萃取, 水层用正丁醇萃取 减压浓缩正 丁醇萃取液, 再用有机溶剂除去色素等微少干扰物, 经减压真空干燥得到纯化的总皂 苷 提取工艺的优化是保证高提取率和降低成本的关键, 是工业生产的基础性研究, [47] 同时也是药效学研究的基础 孙磊用采用单因素和正交试验法优选乙醇浸提法提 取苦瓜皂苷的最佳工艺, 结果表明最佳提取温度 70 溶剂用量为苦瓜的 9 倍量, 提取 时间 3 小时 乙醇浓度 60% 提取过程中皂苷含量的测定方法和皂苷含量的监测是工艺过程的关键问题, 可 有效的监测提取的完全程度和判别工艺过程的优化, 对过程的监控大多数研究者还 [48] 是基于比色法 陈勋等将苦瓜匀浆后, 用乙醇浸提, 提取液过滤, 滤液浓缩后用 石油醚萃取脱脂, 过滤后上大孔吸附树脂, 先用水洗脱杂质, 然后在比色法监控下 用乙醇洗脱苦瓜皂苷, 洗脱液经浓缩 冷冻干燥得固体, 固体用甲醇充分溶解, 离 [49] 心, 取上清液, 浓缩挥发, 得苦瓜皂苷制成品 姚毅采用中空夹层套管提取柱提 取法, 进行苦瓜皂苷的提取, 在比色法监测下对柱提取过程进行优化, 选出了最佳 柱提取工艺 4

9 引言 2. 苦瓜多糖 2.1 苦瓜多糖的药理作用研究 降血糖 苦瓜多糖能显著改善正常小鼠葡萄糖耐量, 对随机进食 1 型糖尿病小鼠血糖具有 显著降低作用, 并且其降血糖作用在给药后 4h 后还非常显著 苦瓜多糖显著降低随 机进食 2 型糖尿病小鼠血糖, 对 1 型和 2 型糖尿病小鼠空腹血糖都具有显著降低作用 [25] 苦瓜多糖具有抗氧化 免疫调节作用, 可修复受损的胰腺, 降低糖尿病高血糖 引起的氧化应激水平 有研究显示苦瓜多糖对正常小鼠和 2 种糖尿病模型都具有显著 的降糖作用, 苦瓜多糖可能通过多种途径调节血糖代谢 [25] [26] 张慧慧等比较了苦瓜多糖对正常小白鼠和 STZ 诱导的糖尿病模型小鼠的降糖 效果, 并对降糖机理进行初步分析 结果表明苦瓜多糖 400mg/ kg 的剂量可以显著降 低正常小鼠和 STZ 糖尿病小鼠的血糖值, 果糖胺的含量同样也有所降低 同时, 苦 瓜多糖还可以提高糖尿病模型小鼠的葡萄糖耐量以及肝糖原的含量 苦瓜多糖的降 糖机理可能是通过减弱 STZ 对胰岛 β- 细胞的损伤或改善受损 β- 细胞的功能, 从而起 到调节血糖的作用 [27] 徐斌等用苦瓜多糖对 STZ 糖尿病小鼠连续灌胃 10d 后, 解剖取胰腺, 观察小鼠 胰岛组织形态 正常小鼠胰腺组织切片显示胰岛为圆形或椭圆形细胞团, 细胞结构 完整, 排列规则, 与周围胰腺组织边界清晰可辨,HE 染色后比周围胰腺组织着色较 浅 ;STZ 糖尿病对照组小鼠的胰岛数量减少, 胰岛 β 细胞发生程度不等的细胞核凝缩, 细胞破裂, 局部区域出现组织坏死 与 STZ 糖尿病对照组小鼠相比, 经多糖处理后, 胰岛部分组织仍可见炎症浸润, 但未见明显组织坏死 说明苦瓜多糖的降糖作用可 能主要是通过帮助受损胰岛组织恢复, 并刺激胰岛细胞增加胰岛素的分泌, 然后通 过胰岛素对中枢和外周的作用, 促进合成代谢, 抑制分解代谢, 从而起到降低血糖 [28] 的作用 申英爱等对四氧嘧啶糖尿病小鼠, 连续 28 天分别灌胃苦瓜水提醇沉物 3.0g/kg d 复方苦瓜水提醇沉物 4.16g/kg d, 并用葡萄糖氧化酶 - 过氧化物酶法 观察了小鼠血糖水平 结果苦瓜水提醇沉物组比糖尿病对照组有明显的降糖作用 (P<0.01) 提示苦瓜降糖机理可能为改善 β 细胞的胰岛素分泌能力或改善胰岛素的 作用所致 5

10 引言 多糖的其它活性 苦瓜多糖表现出了一定的抑菌活性, 已经被一些研究者所关注 [29,50] 吴笳笛等 [29] 采用滤纸片法测定苦瓜多糖对供试菌的抑菌圈大小, 并计算其半致死剂量, 了解 其抑菌程度 结果表明 : 苦瓜多糖对某些病原菌有显著的抑制效果, 如金黄色葡萄 球菌 大肠杆菌 鼠伤寒沙门氏菌 枯草杆菌等,IC50 分别为 mg/ml, 其中以金黄色葡萄球菌最为明显 ; 对志贺氏菌 真菌等效果不明显 另 [30] 有文献表明, 苦瓜多糖对白色念珠菌 新型隐球菌也有很好的抑制作用 [29] 吴笳笛等采用 Smirnoff 的方法研究苦瓜多糖对羟基自由基的清除作用, 用邻 苯三酚自氧化法研究苦瓜多糖对超氧阴离子自由基的清除作用 结果表明 : 苦瓜多 糖对 OH 的最大抑制率达 100%,LD50 为 mg/ml; 对 O2 的抑制率最大可达近 100%,LD50 为 0.005mg/ml 对比表明苦瓜多糖对 OH 的抑制率优于 O2 2.2 苦瓜多糖的提取工艺进展 苦瓜果实中多糖的含量较高, 对于果实中多糖的提取方法得到了相当的关注 [51-54], 其中水提醇沉法应用较为广泛 程霜等 [51] 将鲜苦瓜捣碎, 通过沸水提取 醇 析 脱蛋白和透析, 从鲜苦瓜中分离出多糖粗品, 粗品经 sephadexg-100 柱层析纯化, 硫酸苯酚法鉴定出多糖部位, 收集单一峰组分, 冷冻干燥得到苦瓜多糖样品 刘金 [53] 福等将苦瓜粉先用乙醇回流除去单糖 低聚糖 苷类等杂质, 残渣经热水浸提 [54] 过滤 浓缩 醇析 洗涤 干燥得苦瓜多糖 董英等将苦瓜粉先加乙醇回流, 然 后经热水浸提 过滤 浓缩 醇析 洗涤 干燥得苦瓜粗多糖, 粗多糖进一步经脱 蛋白 透析 离心分离 减压浓缩 醇析 离心分离 脱水干燥得精制苦瓜多糖 [29,51] 另外, 苦瓜果实中多糖的生物提取技术也表现出了一定的优势 吴笳笛等对苦 瓜多糖的水提醇沉法进行了改进, 在苦瓜水溶性多糖的浸提及脱蛋白过程中分别加 入纤维素酶和中性蛋白酶, 经乙醇浸提 过滤 离心除杂 浓缩 透析 除蛋白 除色素 醇沉 冷冻干燥得多糖粗品, 通过 DEAE-32 柱的进一步纯化, 得到单一组分 3 本文对苦瓜皂苷和多糖的研究工作 [55-62] 我国苦瓜资源丰富, 但利用率不高, 多是停留在苦瓜茶 酒 冲剂 含片 等 6

11 引言 初加工产品, 生产水平低 科技含量不高, 缺乏市场竞争力 而苦瓜皂苷和多糖又具有广泛的药理学活性, 表现出了潜在的可观的药用价值 然而, 目前对苦瓜皂苷和苦瓜多糖提取方法的研究多数只针对其中的某类成分 [44-49,51-54], 将明显具有开发研究潜能的两类组分的提取工艺相结合的研究还未见报道, 以此工艺将有利于提高苦瓜原料的利用率, 达到对苦瓜的综合利用和降低其成本 同时, 目前苦瓜皂苷和多糖的提取方法和工艺过程质量控制也还存在一些问题 皂苷的传统提取方法乙醇浸泡 浓缩后用正丁醇萃取法操作繁琐, 皂苷损失多 ; 近年来, 有学者采用大孔树脂柱 中空夹层套管提取柱等方法进行苦瓜皂苷的提取研究, 收到了很好的效果, 但苦瓜皂苷本身没有明显的紫外 - 可见吸收, 对纯化过程的监控多是利用皂苷与强酸反应显色, 相当繁琐, 缺乏简便 快速 灵敏的方法 基于苦瓜皂苷和多糖提取工艺以及工艺过程质量控制等两个方面存在的问题与不足, 我们以鲜苦瓜为原料, 以苦瓜皂苷和苦瓜多糖作为研究对象, 将对 先提皂苷后提多糖 的综合性提取方法与质量控制方法进行研究, 在此基础上, 将开展苦瓜皂苷柱纯化过程的近红外在线监控方法研究和多糖纯化过程的质量控制方法研究, 以期对苦瓜药物的开发性研究提供基础性资料 7

12 第一部份 第一部份苦瓜皂苷和多糖定量分析方法研究 皂苷和多糖这两类成分, 由于分子中没有能够产生紫外 - 可见光吸收或产生荧光 [63-65] 的结构, 因此, 含量测定多采用先显色后比色的方法 通过文献调研发现, 皂苷 [66-69] 和多糖的显色方法较多, 且同样的显色试剂有多种不同的显色条件 为了找到 适合于苦瓜皂苷和多糖的显色试剂和反应条件, 我们对此含量测定方法进行了研究 第一节苦瓜皂苷定量测定方法研究 皂苷类成分是一类化学结构比较复杂的化合物, 测定的方法虽有多种, 但检测难度大, 灵敏度明显不如其他类型化合物 这是因为皂苷类成分除少数化合物如甘草酸 远志皂苷等外, 大多无明显的紫外吸收或仅在 200nm 附近有末端吸收, 故直接用紫外分光光度法和高效液相色谱紫外检测器测定的不多 多是利用皂苷类化合物与某些试剂反应后产生颜色, 然后于可见光区进行比色测定 常用的三萜类皂苷的显色剂有 : 香草醛 - 硫酸 香草醛 - 高氯酸 醋酐 - 硫酸 高氯酸 浓硫酸等 [70] 基于此, 本文以比色法为基础, 研究适用于苦瓜皂苷的定量测定方法 1. 实验材料与仪器 1.1 原料与试剂实验原料为苦瓜, 购于本市农贸市场, 产于山东, 经苏州大学药学院刘春宇教授鉴定为苦瓜 试剂 : 香草醛 ( 化学纯 ), 乙醇 硫酸 高氯酸 冰醋酸等均为分析纯, 水为自制蒸馏水 人参皂苷 Rg1 含量测定用对照品 ( 批号 : ) 购于中国药品生物制品检定所 1.2 仪器试验仪器 :TDL-60B 型台式离心机 ( 上海安亭科学仪器厂 );LD5-10 型低速离心 8

13 第一部份 机 ( 北京医用离心机厂 ); GZX-GF-9023-BS 型电热恒温鼓风干燥箱 ( 上海博泰实验设备有限公司 ); UV-2401PC 型紫外 - 可见分光光度仪 (SHIMADZU 公司 ); 电子天平 (Sartorius 公司 );RE-52C 型旋转蒸发器 ( 巩义市英峪予华仪器厂 );HH-S 型恒温水浴锅 ( 巩义市英峪予华仪器厂 ) 2. 苦瓜皂苷比色法显色体系研究 2.1 对照品与溶剂 参考有关文献苦瓜总皂苷的测定方法 [48,63], 同时从人参皂苷 Rg1 与苦瓜皂苷的 比色物质具有极为相似的光谱 ( 图 1-1 和 1-2) 的特征, 表明选用人参皂苷 Rg1 为苦 瓜皂苷的比色对照品具有合理性, 据此本文以人参皂苷 Rg1 为含量测定的对照品 皂苷一般易溶于热水 含水乙醇 热甲醇 热乙醇, 几乎不溶于或难溶于乙醚 苯 石油醚等极性较小的有机溶剂, 考虑到溶剂的挥发性和毒性以及本研究的前期 工作, 本实验中选择含水乙醇溶解皂苷 2.2 苦瓜总皂苷含量测定的比色法考察 从文献调研可知 : 三萜类皂苷常用比色法测定其总皂苷含量, 常用的方法有香 草醛 - 硫酸法 香草醛 - 高氯酸法 醋酐 - 硫酸法 高氯酸法和浓硫酸法等 [70] 基于文 献和前期研究, 本文认为香草醛 - 高氯酸法和香草醛 - 硫酸法具有一定的优势, 因 [63] 此, 用方法学的重复性指标对该两类方法测定苦瓜皂苷含量的性能进行考察, 其 结果见表 1-1 和表 1-2 由表中数据分析可见 : 香草醛 - 高氯酸法测定苦瓜皂苷含量的 重复性明显好于香草醛 - 硫酸法, 因此, 本文以香草醛 - 高氯酸比色法测定苦瓜总皂苷 的含量 表 1-1 香草醛 - 硫酸法的重复性 Tab.1-1 The reproducibility for vanillin-sulfuric acid method 测定次数 吸光度 (544nm) RSD%

14 第一部份 表 1-2 香草醛 - 高氯酸法的重复性 Tab.1-2 The reproducibility for vanillin-perchloric acid method 测定次数 吸光度 (560nm) RSD% 香草醛 - 高氯酸法测定苦瓜皂苷含量的波长选择 [63] 取人参皂苷 Rg1 和苦瓜总皂苷溶液, 按香草醛 - 高氯酸法显色后进行可见紫 外扫描, 其光谱见图 和 1-3 从光谱图可见 : 人参皂苷与苦瓜皂苷的比色 物质具有极为相似的光谱, 且具有相同的光谱吸收峰 (540 nm), 并表现出与皂苷含 量的相关性, 说明可以选用人参皂苷 Rg1 为对照品在 540nm 处以高的灵敏度测定苦 瓜皂苷含量, 同时空白无干扰, 表明该方法对苦瓜皂苷含量测定表现出了选择性特 征 吸光 0.4 度 Rg1 高浓度 Rg1 中浓度 Rg1 低浓度 波长 (nm) 图 1-1 人参皂苷 Rg1 的紫外光谱 Fig.1-1 Absorption peak wave-length of ginsenoside Rg1. 10

15 第一部份 吸光度 1.0 高浓度中浓度低浓度 波长 (nm) 图 1-2 苦瓜皂苷的紫外光谱 Fig.1-2 Absorption peak wave-length of saponins from momordica charantia L. 3.0 吸光度 波长 (nm) Fig.1-3 图 1-3 空白的紫外扫描图 Absorption peak wave-length of the background 2.4 香草醛 - 高氯酸法的影响因素研究 [63] 基于文献方法, 对前期研究结果分析, 本文认为香草醛用量 高氯酸用量 比色反应温度 比色反应时间将对香草醛 - 高氯酸法测定苦瓜皂苷含量的方法学指 标产生较大的影响, 因此, 本文对这四个因素进行优化研究 香草醛用量考察 11

16 第一部份 取人参皂苷对照品 (0.4892mg/ml)0.2mL 9 份, 分别加 8% 的香草醛 - 冰醋酸液 0.2mL 0.4mL 0.5mL 0.6mL 0.7mL 0.8mL 0.9mL 1.0mL 1.2mL, 加高氯酸 5ml, 摇匀,60 水浴 15min, 在 540nm 处测定吸收值, 结果见图 吸光度 香草醛用量 (ml) Fig.1-4 图 1-4 不同香草醛用量结果 Result of the different volume of vanillin-acetic acid glacial 试验结果表明, 随着香草醛用量增加, 吸光度也逐渐增加, 当香草醛用量在 0.6mL 以上时, 吸光度增加缓慢, 综合考虑, 选择香草醛用量为 0.6mL 优化高氯酸用量取人参皂苷对照品 (0.4892mg/ml)0.2mL 3 份, 加 8% 的香草醛 - 冰醋酸液 0.6mL, 分别加高氯酸 2mL 5mL 10mL, 摇匀,60 水浴 15min, 在 540nm 处测定吸收值, 结果见图 1-5 试验结果表明, 随着高氯酸用量增加, 吸光度逐渐降低, 当高氯酸用量为 2.0mL 时, 比色皿中的液面偏低, 综合含量与灵敏度考虑, 选择高氯酸用量为 5.0mL 比色反应温度对含量测定方法的影响取人参皂苷对照品 (0.4892mg/ml)0.2mL 3 份, 加 8% 的香草醛 - 冰醋酸液 0.6mL, 加高氯酸 5mL, 分别在 水浴反应 15 min, 在 540nm 处测定吸收值, 结果见图 1-6 试验结果表明, 随着水浴温度的提高, 吸光度逐渐升高, 因此, 选择水浴温度 12