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虫尽成
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1 第 1 卷第 4 期 2016 年 4 月 JOURNAL OF DALI UNIVERSITY Vol.1 No.4 Apr DOI / j. issn 康复新液对 2 4-二硝基氯苯联合醋酸诱导大鼠溃疡性结肠炎的影响王朋川何苗 1 2 张汉超李贵轲李辉张成桂 1 2* 1. 云南省昆虫生物医药研发重点实验室云南大理药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心云南大理大理大学药学与化学学院云南大理四川好医生药业集团成都摘要目的探讨中药康复新液经灌肠给药对 2 4-二硝基氯苯联合醋酸诱导大鼠结肠炎的治疗作用方法采用灌肠给药方式对溃疡性结肠炎 UC 模型大鼠进行治疗通过测定大鼠 DAI 指数脏器指数检测血清 IL-4 IL-10 的表达水平观察结肠黏膜损伤程度及病理改变来评价康复新液对大鼠 UC 的影响结果阳性药美沙拉嗪及治疗药物康复新液均能改善 UC 大鼠结肠组织的病变程度修复肠道受损黏膜病理组织学评分明显下降并具有统计学意义 P< 0.01 或 P< 0.05 提示灌肠有明显的治疗效果康复新液高中低组均能不同程度的降低 DAI 评分结肠指数缓解黏膜水肿提高 IL-4 P< 0.01 IL-10 P< 0.01 的表达水平从黏膜损伤及病理组织学评分可见康复新液组促进溃疡面愈合的效果更优结论康复新液对 DNCB 联合醋酸诱导的 UC 大鼠有治疗作用可有效促进 UC 大鼠结肠溃疡的愈合能有效的减轻 UC 大鼠的腹泻症状 DAI 评分降低关键词康复新液美沙拉嗪灌肠溃疡性结肠炎中图分类号 R285 文献标志码 A 文章编号溃疡性结肠炎 Ulcerative colitis UC 是炎症性肠病中的一种其发病机制尚未明确可能与遗传免疫感染精神心理等因素有关主要表现为连续性弥漫性黏膜和黏膜下炎性改变形成肉眼可见的糜烂和溃疡 1 目前临床常用氨基水杨酸糖皮质激素及免疫抑制剂等药物治疗西药以美沙拉嗪应用最广 2 但长期服用会有耐受胃肠反应等不良反应 UC 根据临床表现属中医的便血泄泻肠风脏毒等范畴我国自古就有治疗便血和步探讨其抗 UC 的机制及临床应用提供理论依据实验材料实验动物 SPF 级 SD 大鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司雌雄各半体重 180~220 g 合格证号 SCXK 湘药品与试剂美沙拉嗪灌肠液莎尔福批号 14J37 规格 60 g 4 g 德国福克制药股份有限公司康复新液美洲大蠊干燥虫体提取物批号泄泻的多种中药药方中药在治疗急慢性 UC 上规格 100 ml 四川好医生攀西药业有限责机体创伤愈合修复以及改善胃肠黏膜创面微循基氯苯异氟烷水合氯醛隐血试剂盒大鼠白细也体现了不可比拟的优势其中康复新液具有促进任公司无水乙醇丙酮冰乙酸甲醛 2 4-二硝环促进肉芽组织增生等疗效且在 UC 临床治疗中胞介素-4 IL-4 试剂盒大鼠 IL-10 试剂盒批号药是治疗 UC 直接有效的方法与口服给药相比 1.3 有广泛的应用 UC 病变可累及远端结肠直肠给直肠给药全身性副作用较小局部药物浓度高更有利于治疗本文采用康复新液灌肠方式对 UC 大鼠进行治疗以期观察康复新液的疗效为进一欣博盛生物科技有限公司仪器奥地利安图斯 2010 酶标仪奥地利安图斯公司型号 201 医学图像分析系统成都泰盟 BI 电子天平梅特勒-托利多 EL-104 电热恒温水浴锅上海一恒科学仪器有限公司 HWS-24 基金项目国家自然科学基金资助项目云南省昆虫生物医药研发重点实验室基金资助项目 2015DG030 收稿日期修回日期作者简介王朋川硕士研究生主要从事溃疡性结肠炎药理学研究. *通信作者张成桂副教授博士. 17

2 总第 4 期医学 2 实验方法 2.1 模型建立 70 只 SPF 级 SD 大鼠适应性饲养一周, 挑选 10 只作, 剩余 60 只随机分笼, 做好标记后, 大鼠背部脱毛, 用 2% 2,4- 二硝基氯苯 (DNCB) 的丙酮溶液滴于大鼠背部脱毛区,1 次 /d, 每次 0.3 ml/ 只, 连续 14 d, 正常饮食饮水第 15 天 ( 大鼠禁食不禁水 24 h), 异氟烷麻醉, 用直径 3.0 mm 的尼龙导管经肛门插入 8 cm 处, 注入 0.1%DNCB 乙醇 (50% 浓度 ) 溶液 0.25 ml/ 只, 第 16 天同部位注入 6% 醋酸溶液 0.7 ml, 准确记时 10 s 后用 3 ml 生理盐水冲洗, 造成 DNCB 联合醋酸诱导的慢性大鼠 UC 模型分组及实验方法造模完成 1 周后, 按照疾病 4 活动指数 (DAI) 评分分层, 剔除极轻度炎症模型大鼠 ( 以 0~3 分极轻度炎症 4~6 分轻度炎症 7~9 分中度炎症 10~12 分重度炎症分层 ), 其余大鼠按炎症严重程度分层后再随机分为 ( 灌肠给予生理盐水,2.50 ml/kg); 美沙拉嗪灌肠组 (); 康复新高中低灌肠组 ( )5 个组, ( 灌肠给予生理盐水,2.50 ml/kg), 各组大鼠 10 只, 雌雄各半造模完成 1 周后开始给药,1 次 /d, 连续 14 d 于造模结束后的第天进行 DAI 评分, 评分标准包括体质量下降百分比粪便性状隐血测试末次给药后第 2 天, 将大鼠用 10% 水合氯醛溶液 (3 ml/kg) 腹腔注射麻醉, 腹主动脉取血 4 静置 4 h 后,3 500 r/min(4 ) 离心 10 min, 取上清液并按试剂盒说明测定 IL-4 IL-10 含量 ; 取大鼠肝脏脾脏胸腺称重并计算脏器指数 ; 取结肠测结肠长度宽度和结肠湿重, 将取出的结肠平铺于白瓷板上, 肉眼观察结肠黏膜损伤情况, 并进行结肠黏膜损伤评分 (CMDI)( 冰上操作 ), 结肠放于 10% 中性福尔马林中固定, 常规石蜡包埋切片苏木素 - 伊红 (HE) 染色, 光学显微镜下观察病理切片, 并进行病理组织学评分 (HS) 数据处理各组实验数据均以 ( xˉ ± s) 表示, 采用统计软件 SPSS17.0 进行检验, 符合正态分布的数据采用方差检验, 不合符正态分布的数据, 采用秩和检验 3 实验结果 3.1 康复新液对溃疡性结肠炎大鼠 DAI 分值的影响造模结束后多数大鼠出现大便隐血腹泻, 但正常组大鼠活动进食正常, 无明显体重减轻和腹泻的现象, 治疗前, 正常组与各造模组的 DAI 分值差异均有统计学意义 (P < 0.01), 各造模组组间 DAI 分值差异无统计学意义, 治疗期间各组的 DAI 评分随给药时间均有降低趋势 ; 第 4 天康复新液高组的 DAI 评分与模型组比较差异有统计学意义 (P<0.05), 第天, 模型组 DAI 明显高于和康复新液高中低组, 第 21 天的 DAI 分值与正常组无异, 且与模型组比较差异有统计学意义 (P<0.05), 其次是康复新液高中低组见表康复新液对大鼠脏器指数的影响各组胸腺指数和脾脏指数差异无统计学意义, 其中对胸腺的免疫功能有抑制趋势, 而康复新液各组则显示促进的趋势 ; 在肝脏指数中, 康复新液各组的肝脏指数较模型组降低, 其中中低组与模型组比较差异有统计学意义 (P<0.01) 康复新液各组均能降低结肠指数, 减轻结肠黏膜水肿现象, 其中高中组与模型组比较差异有统计学意义 (P<0.01), 并且高组效果与相当见表 2 表 1 康复新液对大鼠 DAI 分值的影响 (n=10,xˉ ± s) DAI 分值 1 d 4 d 8 d 14 d 0.00± ± ± ± ±0.71 ** 6.40±2.17 ** 5.30±2.26 ** 4.10±1.91 ** 7.50±1.58 ** 5.90±1.37 ** 4.60±1.35 ** 3.20±1.14 ** 康复新高组 7.60±1.26 ** 4.80±1.87 ** 4.10±2.28 ** 3.50±1.51 ** 康复新中组 7.60±1.26 ** 5.40±1.71 ** 5.10±2.38 ** 3.10±1.29 ** 康复新低组 7.80±1.23 ** 6.30±2.26 ** 5.30±2.54 ** 3.50±1.58 ** ** 注 : 与正常组比较 P<0.01; 与模型组比较 P<0.05, P<0.01; 与比较 d 1.30± ±2.08 ** 1.60± ±1.71 ** 2.40±0.84 ** 2.70±1.57 **

3 总第 4 期王朋川, 何苗, 张汉超, 等康复新液对 2,4- 二硝基氯苯联合醋酸诱导大鼠溃疡性结肠炎的影响第 1 卷表 2 康复新液对大鼠脏器指数的影响 (n=10,xˉ ± s) 康复新高组康复新中组康复新低组胸腺指数 /(mg/g) 1.11± ± ± ± ± ±0.78 脾脏指数 /(mg/g) 2.47± ± ± ± ± ±1.22 肝脏指数 /(mg/g) 23.79± ±3.35 ** 24.35± ± ± ±3.70 结肠指数 /(mg/g) 5.18± ±0.96 ** 5.69± ± ± ±1.38 ** ** 注 : 与正常组比较 P<0.01; 与模型组比较 P<0.05, P<0.01; 与比较 3.3 康复新对大鼠结肠长宽及黏膜损伤评分的影响厚及有重度糜烂溃疡, 溃疡呈椭圆形, 底部可见少与正常组相比, 模型组大鼠结肠变粗长度明显缩量淡黄色覆盖物, 边缘充血水肿, 模型组结肠黏膜短 ; 治疗药物组结肠长度较模型组长, 其中康复新 CMDI 显著升高 (P<0.01); 与模型组比液高组结肠最长 (P<0.01) 模型组的长宽比肠黏膜较光滑, 轻度充血, 无水肿, 结肠黏膜损伤明显小于正常组, (P<0.01) 和康复新液评分明显低于模型组 (P<0.01), 模型组与美沙拉嗪各组 (P<0.05) 更接近正常组见表 3 组的结果提示模型复制成功, 可以用于评价受试正常组大鼠结肠形态正常, 黏膜光滑平整, 皱药物的疗效康复新液高中低组可见少量襞纹理清晰, 肠壁未增厚, 肠组织间无黏连, 未见黏充血水肿, 部分结肠可见轻度糜烂或溃疡, 其中康膜充血水肿糜烂及溃疡等病变与复新液高中组与模型组比较差异有统计学比较, 模型组结肠黏膜充血水肿, 中重度肠壁增意义 (P < 0.05) 见表 3 表 3 康复新液对大鼠结肠的影响 (n=10,xˉ ± s) 结肠长度 /cm 长宽比 /(cm/cm) CMDI 19.89± ± ± ±1.10 ** 17.99±3.98 ** 3.10±0.74 ** 17.97±1.31 ** 22.02±4.41 * 1.90±0.74 康复新高组 18.45±1.24 * 21.55±2.17 * 2.30±0.48 * 康复新中组 17.32±1.27 ** 21.56±4.18 * 2.40±0.87 ** 康复新低组 17.15±2.05 ** 21.06±4.64 ** 2.60±1.10 ** 注 : 与正常组比较 * P<0.05, ** P<0.01; 与模型组比较 P<0.05, P<0.01; 与比较 3.4 康复新液对大鼠血清 IL-4 IL-10 含量的影响和康复新液高中低组大鼠血清 IL-4 和 IL-10 与正常组相比, 模型组大鼠血清 IL-4 和 IL-10 的表表达均有显著升高 (P < 0.01), 其中康复新液高达显著降低 (P < 0.01), 与模型组比较, 组大鼠血清 IL-4 升高最多, 见表 4 表 4 康复新液对大鼠血清 IL-4 IL-10 含量的影响 (n=10,xˉ ± s) IL-4/(pg/mL) IL-10/(pg/mL) 48.46± ± ±3.84 ** 19.30±4.99 ** 41.47± ±7.53 康复新高组 45.54± ±7.61 康复新中组 38.91±5.42 * 45.10±5.71 * 康复新低组 32.75±3.39 ** 38.84±2.50 ** 注 : 与正常组比较 * P<0.05, ** P<0.01; 与模型组比较 P<0.01; 与比较 19

4 总第 4 期医学 3.5 康复新液对大鼠结肠组织 HS 的影响正常组病理组织学评分明显高于正常组 P<0.01 美沙拉嗪大鼠结肠黏膜镜下观察组织形态正常肠壁结构清组康复新液高中组结肠黏膜溃疡数目明显减晰腺体分布均匀未见充血水肿糜烂及溃疡形成少底部可见纤维结缔组织增生充血水肿明显减轻间质少量淋巴细胞浸润模型组镜下可见黏膜糜烂伴少量炎症细胞浸润病理组织学评分明显下降具脱落充血水肿炎症细胞浸润形成多个溃疡缺损有统计学意义 P < 0.01或P < 0.05 见表5及图1 表 5 康复新液对大鼠结肠组织 HS 分值的影响 n=10 xˉ ± s HS 评分上皮细胞评分康复新高组康复新中组康复新低组炎细胞浸润评分总分 0.30± ± ± ±0.48** 2.30±0.48** 4.60±0.85** 3.50±0.53** 3.40±0.52** 2.60±0.52** 2.60±0.52** 2.60±0.52** 2.90±0.57** 2.90±0.74** 3.10±0.63** 6.90±0.88** 5.20±0.63** 5.50±0.97** 6.00±0.74** 注与正常组比较**P<0.01 与模型组比较P<0.05 P<0.01 与比较P<0.05 P<0.01 A 40 4 B 40 C 美沙拉嗪对照组 40 D 康复新液高组 40 E 康复新液中组 40 图 1 康复新液对大鼠结肠病理组织的影响讨论 F 康复新液低组 40 与美沙拉嗪相当康复新液高中低组均能在一定程度上降低 UC 大鼠的 DAI 评分结肠指数缓解结肠黏膜水肿现象减轻炎症缓解黏膜水肿修复溃疡效果较优美沙拉嗪康复新液经灌肠给药后能直接改善 UC 大鼠结肠组织病变程度修复肠道损伤黏膜 UC 的发病机制尚未完全明确根据其临床表现属中医的便血泄泻肠风脏毒等范畴 8 目前该病的临床治疗分为手术治疗与非手术治疗两种 9 但 UC 的治疗总体以非手术治疗为主作为新一代的氨基水杨酸制剂美沙拉嗪由于疗效确切而减轻结肠的炎症反应因 IL-4 具有抑制炎症的特成为治疗 UC 最常用的药物 10 本研究将临床治症反应的抑制作用减弱自身免疫平衡遭到破坏沙拉嗪作为阳性对照观察康复新液的治疗效果导致 UC 的发生发展实验中模型组 IL-4 含量明丰富了中药灌肠治疗 UC 的研究价值研究表明有升高 IL-4 的趋势且高组表达水平高于美沙环的作用可加速机体病损组织修复再生抑菌抗拉嗪组接近正常组表现出增强抑制炎症的作用炎消除水肿和增强机体免疫功能 11 通过灌肠而 IL-10 主要由 Th2 型细胞分泌研究 7 表明 UC 患给药提高了局部药物浓度延长药物在肠腔内停照组低且和疾病严重程度有关实验中康复新液液可通过提高模型大鼠血清 IL-4 和 IL-10 表达水性临床研究发现 UC 患者 IL-4 分泌量减少其对炎 6 显降低其变化趋势与临床相符康复新液各组都疗 UC 的中药康复新液经灌肠治疗 UC 大鼠以美康复新液具有祛腐生肌改善胃肠黏膜创面微循者活动期的血清及黏膜组织的 IL-10 水平较正常对留时间更能充分发挥康复新液的作用康复新各组都能升高 IL-10 含量其中高组表达水平平起到抑制炎症的作用而美沙拉嗪主要通过抑 20

5 总第 4 期王朋川何苗张汉超等康复新液对 2 4-二硝基氯苯联合醋酸诱导大鼠溃疡性结肠炎的影响制前列腺素和白三烯的形成达到抗炎目的 12 二者在对缓解 UC 的症状都体现了各自的效果和优势临床治疗中合理运用能优势互补地提高和改善 UC 患者的生活质量本文作者正开展康复新液抗 UC 大鼠的机制研究为临床中药灌肠治疗 UC 的应用提供依据第1卷 5 易文覃慧林石孟琼等. 四逆散对溃疡性结肠炎小鼠 NF-κB 激活及 MIF 和细胞因子表达的影响 J. 中药材 WEST G A MATSUURA T LEVINE A D et al. Interleu kin- 4 in inflammatory bowel disease and mucosal immune reactivity J. Gastroenterology 张晓博杨宪武党惠姣等. 溃疡性结肠炎患者血清和结肠组织白细胞介素 8 和白细胞介素 10 的表达 J. 临参考文献 1 中华医学会消化病学分会炎症性肠病学组. 炎症性肠病诊断与治疗的共识意见 2012 年广州 J. 中华内科杂志谭启文. 溃疡性结肠炎的药物治疗 J. 内科李瑞东. 化浊抑溃安肠汤对溃疡性结肠炎大鼠血清 NO TNF-ɑ 含量及 IL-6 活性的影响 J. 中成药周天羽张威林庶如等. 重组人小肠三叶因子对大鼠溃疡性结肠炎的治疗作用 J. 第三军医大学学报床荟萃李乾构周学文单兆伟. 实用中医消化病学 M. 北京人民卫生出版社张声生. 溃疡性结肠炎中医诊疗共识意见 J. 中华中医药杂志明荷谢寒何可. 康复新液联合美沙拉嗪治疗溃疡性结肠炎的疗效及对患者炎性因子和氧化应激水平的影响 J. 世界华人消化杂志焦春香刘光明周萍. 天然药物康复新的研究进展 J. 时珍国医国药次仁央宗徐晓蓉刘占举. 氨基水杨酸制剂的药理学与临床应用 J. 临床药物治疗杂志 Effect of Kangfuxin Solution to Ulcerative Colitis Rat Model Made by Treatment of 2, 4-Dinitrochlorobenzene Combined with Acetic Acid Wang Pengchuan1,2,3, He Miao1,2, Zhang Hanchao1,2,3, Li Guike1,2,4, Li Hui1,2,3, Zhang Chenggui1,2* 1. Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D, Dali, Yunnan , China; 2. National-Local Joint Engineering Research Center of Entomoceutics, Dali, Yunnan , China; 3. College of Pharmacy and Chemistry, Dali University, Dali, Yunnan China; 4. Good Doctor Pharmaceutical Group, Chengdu , China Abstract Objective: To explore the effect of Kangfuxin solution through enema adimistration to ulcerative colitis rat model, which was made by the treatment of 2, 4-dinitrochlorobenzene combined with acetic acid. Methods: Ulcerative colitis rats were treated by enema adimistration. For evaluating the effect of Kangfuxin solution on ulcerative colitis rats, the damaged intestinal mucosa and pathological changes were observed through the determination of DAI, viscera index of rats, the expression level of serum IL-4 and IL10. Results: It was showed that positive medicine mesalazine and Kangfuxin solution both can improve the UC rats colon tissue lesions, repair the damaged intestinal mucosa, decrease histologic grade markedly P < 0.01 or P < 0.05 and the effect of enema is obvious. The different doses of Kangfuxin solution can reduce DAI score, colon index and inflammation, alleviate mucosal edema and enhance IL- 4 P < 0.01 and IL- 10 P < 0.01 expression level. The effect of alleviating mucosal edema and promoting healing of ulcer surface of Kangfuxin group was improved. Conclusion: Kangfuxin solution plays an active role in treating the inflammation of UC rats which is induced by 2,4- dinitrochlorobenzene and acetic acid, promoting the healing of UC rats colon ulcer and reducing the diarrhea of UC rats DAI score lower. Key words Kangfuxin; mesalazine; enema; ulcerative colitis 责任编辑 21 李杨

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中草药致谢李沛赵继敏郑智敏江亚楠等病理生理学教研室老师在实验中给予的指导和帮助狄建彬顾振纶赵笑东钱培刚蒋小岗郭次仪中草药中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 10 年 8 月 1324 LDL C 非常明显升高 (