0.15mol/L: 吸 母 液 7.5ml+ 水 42.5ml 0.10mol/L: 吸 母 液 5.0ml+ 水 45.0ml 将 带 有 色 素 的 植 物 组 织 ( 叶 片 ), 一 般 选 用 有 色 素 的 洋 葱 鳞 片 的 外 表 皮 紫 鸭 跖 草 苔 藓 红 甘 蓝 或 黑 藻

Transcription

1 植 物 生 理 学 实 验 指 导 实 验 目 录 一 植 物 组 织 渗 透 势 的 测 定 ( 质 壁 分 离 方 法 ) 二 植 物 组 织 水 势 的 测 定 ( 小 液 流 法 ) 三 蒸 腾 强 度 的 测 定 ( 容 量 法 ) 四 钾 离 子 对 气 孔 开 度 的 影 响 五 单 盐 毒 害 及 离 了 间 拮 抗 现 象 六 植 物 根 系 对 离 子 的 选 择 吸 收 七 硝 酸 还 原 酶 活 性 的 测 定 八 叶 绿 体 色 素 的 提 取 和 分 离 ( 纸 层 析 法 ) 九 植 物 体 色 素 及 其 性 质 十 叶 绿 素 a 和 b 含 量 的 测 定 ( 分 光 光 度 法 ) 十 一 改 良 半 叶 法 测 定 大 田 光 合 强 度 十 二 植 物 呼 吸 强 度 的 测 定 ( 小 篮 子 法 ) 十 三 淀 粉 的 合 成 淀 粉 磷 酸 化 酶 十 四 植 物 体 内 有 机 物 运 输 途 径 ( 环 割 法 ) 十 五 IAA 的 生 物 鉴 定 ( 小 麦 芽 鞘 切 段 伸 长 法 ) 十 六 细 胞 分 裂 素 对 萝 卜 子 叶 的 保 绿 作 用 十 七 种 子 发 芽 率 的 快 速 测 定 十 八 谷 物 种 子 萌 发 时 淀 粉 酶 活 性 的 测 定 十 九 植 物 组 织 培 养 二 十 植 物 缺 水 程 度 的 鉴 定 ( 脯 氨 酸 法 ) 实 验 1 植 物 组 织 渗 透 势 的 测 定 ( 质 壁 分 离 法 ) 观 察 植 物 组 织 在 不 同 浓 度 溶 液 中 细 胞 质 壁 分 离 的 产 生 过 程 及 其 用 于 测 定 植 物 组 织 渗 透 势 的 方 法 当 植 物 组 织 细 胞 内 的 汁 液 与 其 周 围 的 某 种 溶 液 处 于 渗 透 平 衡 状 态, 植 物 细 胞 内 的 压 力 势 为 零 时, 细 胞 汁 液 的 渗 透 势 就 等 于 该 溶 液 的 渗 透 势 该 溶 液 的 浓 度 称 为 等 渗 浓 度 当 用 一 系 列 梯 度 浓 度 溶 液 观 察 细 胞 质 壁 分 离 现 象 时, 细 胞 的 等 渗 浓 度 将 介 于 刚 刚 引 起 初 始 质 壁 分 离 的 浓 度 和 尚 不 能 引 起 质 壁 分 离 的 浓 度 之 间 的 深 液 浓 度 代 入 公 式 即 可 计 算 出 春 渗 透 势 显 微 镜 载 玻 片 及 盖 玻 片 镊 子 刀 片 配 成 mol/L 梯 度 浓 度 的 蔗 糖 溶 液 各 50ml 称 34.23g 蔗 糖 用 蒸 馏 水 配 成 100ml, 其 浓 度 为 1m0le/L( 母 液 ) 再 配 制 成 下 列 各 种 浓 度 : 0.50mol/L: 吸 母 液 25ml+ 水 25ml 0.45mol/L: 吸 母 液 22.5ml+ 水 27.5ml 0.40mol/L: 吸 母 液 20.0ml+ 水 30.0ml 0.35mol/L: 吸 母 液 17.5ml+ 水 32.5ml 0.30mol/L: 吸 母 液 15.0ml+ 水 35.0ml 0.25mol/L: 吸 母 液 12.5ml+ 水 37.5ml 0.20mol/L: 吸 母 液 10.0ml+ 水 40.0ml

2 0.15mol/L: 吸 母 液 7.5ml+ 水 42.5ml 0.10mol/L: 吸 母 液 5.0ml+ 水 45.0ml 将 带 有 色 素 的 植 物 组 织 ( 叶 片 ), 一 般 选 用 有 色 素 的 洋 葱 鳞 片 的 外 表 皮 紫 鸭 跖 草 苔 藓 红 甘 蓝 或 黑 藻 丝 状 藻 等 水 生 植 物, 也 可 用 蚕 豆 玉 米 小 麦 等 作 物 叶 的 表 皮 撕 取 下 表 皮, 迅 速 分 别 投 入 各 种 浓 度 的 蔗 糖 溶 液 中, 使 其 完 全 浸 入,5 10 分 钟 后, 从 0.5mol/L 开 始 依 次 取 出 表 皮 薄 片 放 在 滴 有 同 样 溶 液 的 载 玻 片 上, 盖 上 盖 玻 片, 于 低 倍 显 微 镜 下 观 察, 如 果 所 有 细 胞 都 产 生 质 壁 分 离 的 现 象, 则 取 低 浓 度 溶 液 中 的 制 片 作 同 样 观 察, 并 记 录 质 壁 分 离 的 相 对 程 度 实 验 中 必 须 确 定 一 个 引 起 半 数 以 上 细 胞 原 生 质 刚 刚 从 细 胞 壁 的 角 隅 上 分 离 的 浓 度, 和 不 引 起 质 壁 分 离 的 最 高 浓 度 在 找 到 上 述 浓 度 极 限 时, 用 新 的 溶 液 和 新 鲜 的 叶 片 重 复 进 行 几 次, 直 至 有 把 握 确 定 为 止 在 此 条 件 下, 细 胞 的 渗 透 势 与 两 个 极 限 溶 液 浓 度 之 平 均 值 的 渗 透 势 相 等 将 结 果 记 录 下 表 中 测 出 引 起 质 壁 分 离 刚 开 始 的 蔗 糖 溶 液 最 低 浓 度 和 不 能 引 起 质 壁 分 离 的 最 高 浓 度 平 均 值 之 后, 可 按 下 列 公 式 计 算 在 常 压 下 该 组 织 细 胞 质 液 的 渗 透 势 为 细 胞 渗 透 势 R 为 气 体 常 数 = /L Pа/mol K T 为 绝 对 温 度, 单 位 K, 即 273 +t,t 为 实 验 湿 度 I 为 解 离 系 数, 蔗 糖 为 1 C 为 等 渗 溶 液 的 浓 度, 单 位 为 mol/l 则 : = (273 +t) 1 C 实 验 人 时 期 材 料 名 称 实 验 时 室 温 蔗 糖 摩 尔 浓 度 (mol/l) 渗 透 势 (Pа) 质 壁 分 离 的 相 对 程 度 ( 作 图 表 示 ) : 1 复 习 细 胞 渗 透 作 用 的 原 理 2 测 定 并 计 算 不 同 植 物 组 织 的 渗 透 势 实 验 2 植 物 组 织 水 势 的 测 定 ( 小 液 流 法 ) 了 解 植 物 组 织 中 水 分 状 况 的 另 一 种 表 示 方 法 及 用 于 测 定 的 方 法 和 它 们 的 优 缺 点 水 势 表 示 水 分 的 化 学 势, 象 电 流 之 由 高 电 位 处 流 向 低 电 位 处 一 样, 水 从 水 势 高 处 流 向 低 处 植 物 体 细 胞 之 间, 组 织 之 间 以 及 植 物 体 和 环 境 间 的 水 分 移 动 方 向 都 由 水 势 差 决 定

3 当 植 物 细 胞 或 组 织 放 在 外 界 溶 液 中 时, 如 果 植 物 的 水 势 小 于 溶 液 的 渗 透 势 ( 溶 质 势 ), 则 组 织 吸 水 而 使 溶 液 浓 度 变 大 ; 反 之, 则 植 物 细 胞 内 水 分 外 流 而 使 溶 液 浓 度 变 小 ; 若 植 物 组 织 的 水 势 与 溶 液 的 渗 透 势 相 等, 则 二 者 水 分 保 持 动 态 平 衡, 所 以 外 部 溶 液 浓 度 不 变, 而 溶 液 的 渗 透 势 即 等 于 所 测 植 物 的 水 势 可 以 利 用 溶 液 的 浓 度 不 同 其 比 重 也 不 同 的 原 理 来 测 定 试 验 前 后 溶 液 的 浓 度 的 变 化, 然 后 根 据 公 式 计 算 渗 透 势 试 管 毛 细 滴 管 移 液 管 剪 刀 镊 子 甲 烯 蓝 首 先 配 制 一 系 列 不 同 浓 度 的 蔗 糖 溶 液 ( mol/l) 各 10 ml 注 入 8 支 试 管 中, 各 管 都 加 上 塞 子, 并 编 号 按 编 号 顺 序 在 试 管 架 上 排 成 一 列, 作 为 对 照 组 另 取 8 支 试 管, 编 好 号, 按 顺 序 放 在 试 管 架 上, 作 为 试 验 组 然 后 由 对 照 组 的 各 试 管 中 分 别 取 溶 液 4ml 移 入 相 同 编 号 的 试 验 组 试 管 中, 再 将 各 试 管 都 加 上 塞 子 用 剪 刀 将 菠 菜 叶 剪 成 约 0.5cm2 大 小 相 等 的 小 块 片 向 试 验 组 的 每 一 试 管 中 各 加 相 等 数 目 ( 约 10 片 ) 的 叶 片 小 块, 塞 好 塞 子, 放 置 30 分 钟, 在 这 段 时 间 内 摇 动 数 次, 到 时 间 后, 向 每 一 试 管 中 各 加 甲 烯 蓝 粉 末 少 许, 并 振 荡, 此 时 溶 液 变 成 蓝 色 用 毛 细 滴 管 从 试 验 组 的 各 试 管 中 依 次 吸 取 着 色 的 液 体 少 许, 然 后 伸 入 对 照 组 的 相 同 编 号 试 管 的 液 体 的 中 部, 缓 慢 从 毛 细 滴 管 尖 端 横 向 放 出 一 滴 蓝 色 试 验 溶 液, 并 观 察 小 液 滴 移 动 的 方 向 如 果 有 色 液 滴 向 上 移 动, 说 明 溶 液 从 细 胞 液 中 吸 出 水 分 而 被 冲 淡, 比 重 比 原 来 小 了 ; 如 果 有 色 液 向 下 移 动, 则 说 明 细 胞 从 溶 液 中 吸 了 水, 溶 液 变 浓, 比 重 变 大 ; 如 果 液 滴 不 动, 则 说 明 试 验 溶 液 的 密 度 等 于 对 照 溶 液, 即 植 物 组 织 的 水 势 等 于 溶 液 的 渗 透 势 记 录 液 滴 不 动 的 试 管 中 蔗 糖 溶 液 的 浓 度 重 复 测 定 一 次 按 计 算 水 势 式 中 为 细 胞 水 势, 其 余 符 号 同 实 验 4 注 意 : 毛 细 滴 管 要 各 个 浓 度 专 用 1 用 小 液 流 法 测 定 植 物 组 织 的 水 势 与 用 质 壁 分 离 法 测 定 植 物 细 胞 的 渗 透 势 都 是 以 外 界 溶 液 的 浓 度 算 出 的 溶 质 势, 它 们 之 间 的 区 别 何 在? 实 验 3 蒸 腾 强 度 的 测 定 ( 容 量 法 ) 了 解 测 定 植 物 蒸 腾 作 用 的 方 法 带 叶 的 枝 条 插 在 一 定 体 积 的 水 中, 由 于 叶 子 的 蒸 腾 作 用, 使 容 器 中 水 的 体 积 不 断 减 少, 通 过 水 体 积 的 减 少, 即 可 计 算 植 物 的 蒸 腾 强 度 即 单 位 时 间 内, 单 位 叶 面 积 散 失 的 水 量, 常 以 g /m2.h 表 示 外 界 环 境 条 件, 如 光 温 度 风 速 等 都 会 影 响 蒸 腾 强 度 广 口 瓶 软 木 塞 1ml 移 液 管 小 分 液 漏 斗 铁 架 台 橡 皮 管

4 T 形 管 弹 簧 纸 夹 凡 士 林 吹 风 机 100W 台 灯 三 操 作 步 骤 1. 选 取 一 个 与 广 口 瓶 相 匹 配 的 软 木 塞, 按 黑 板 上 的 图 示 安 装 好 所 需 的 测 定 装 置 广 口 瓶 中 装 满 水 2. 选 取 一 枝 生 长 健 壮 的 枝 条, 在 水 中 将 枝 条 基 部 剪 去 一 段, 插 入 软 木 塞 的 孔 中, 在 孔 的 周 围 涂 上 凡 士 林, 以 防 漏 气 盖 紧 软 木 塞, 打 开 分 液 漏 斗 活 塞, 加 入 水, 使 广 口 瓶 和 水 平 放 置 的 移 液 管 中 充 满 水, 不 能 留 有 气 泡 检 查 整 个 系 统 是 否 漏 气 漏 水, 发 现 漏 气 漏 水 处 可 用 凡 士 林 封 好 最 后 关 闭 分 液 漏 斗 活 塞 3. 在 距 离 枝 条 约 20cm 放 置 一 个 100W 台 灯, 照 光 期 间 保 持 叶 面 温 度 在 25-28oC 当 移 液 管 内 水 柱 的 凹 面 移 动 到 刻 度 时, 开 始 计 时 每 0.5h 记 录 1 次 移 液 管 中 液 面 的 位 置, 共 计 2 次 ; 在 距 离 枝 条 15cm 处 用 吹 风 机 吹 风, 记 录 叶 面 温 度, 每 0.5h 记 录 1 次 移 液 管 中 液 面 的 位 置, 共 计 2 次 ; 在 室 内 自 然 光 和 无 吹 风 的 情 况 下 按 上 述 方 法 记 2 次 读 数, 作 为 对 照 如 果 蒸 腾 作 用 强, 已 超 出 移 液 管 读 数, 则 需 从 分 液 漏 斗 向 容 器 补 水, 重 新 开 始 记 录 读 数 4. 实 验 结 束 后, 将 叶 片 剪 下, 计 算 叶 面 积 方 法 是 : 剪 取 100cm2 硫 酸 纸, 在 分 析 天 平 上 称 重 m0 在 此 硫 酸 纸 上 画 出 并 剪 下 叶 片 的 实 际 形 状, 称 重 m1, 叶 面 积 S 即 为 : S=(m1/m0)x 计 算 蒸 腾 强 度 Q: Q=m/(St) 式 中 :Q 为 蒸 腾 强 度 (g/m2.h) m 为 由 于 蒸 腾 作 用 失 去 水 分 水 的 质 量 ( 根 据 失 水 的 体 积 换 算 成 质 量 ) S 为 叶 面 积 T 为 照 光 或 吹 风 时 间 根 据 上 式 公 式, 分 别 计 算 在 照 光 吹 风 和 对 照 条 件 下 作 为 的 蒸 腾 强 度 1 实 验 用 的 枝 条 为 什 么 要 在 水 中 剪 下, 不 这 样 做 会 出 现 什 么 问 题? 2 比 较 不 同 条 件 下 植 物 的 蒸 腾 强 度, 说 明 蒸 腾 强 度 不 同 的 原 因 实 验 4 钾 离 子 对 气 孔 开 度 的 影 响 观 察 钾 离 子 在 气 孔 开 张 中 的 作 用 保 卫 细 胞 的 渗 透 系 统 歌 可 由 钾 离 子 所 调 节, 无 论 是 环 式 或 非 环 式 光 合 磷 酸 化, 都 可 形 成 ATP ATP 不 断 供 给 保 卫 细 胞 原 生 质 膜 上 的 钾 - 氯 离 子 交 换 泵 作 功, 支 持 保 卫 细 胞 逆 着 离 子 浓 度 差 而 从 周 围 表 皮 细 胞 吸 收 钾 离 子, 降 低 保 卫 细 胞 的 渗 透 势, 从 而 使 气 孔 张 开 显 微 镜 镊 子 温 箱

5 载 玻 片 盖 玻 片 培 养 皿 0.5% 硝 酸 钾 0.5% 硝 酸 钠 1. 配 0.5%KNO3 及 0.5%NaNO3 溶 液 2. 在 3 个 培 养 皿 中 分 别 放 0.5%KNO3 0.5%NaNO3 及 蒸 馏 水 各 15ml 3. 撕 蚕 豆 叶 表 皮 若 干 放 入 上 述 3 个 培 养 皿 中 4. 培 养 皿 放 入 25 温 箱 中, 使 溶 液 温 度 达 到 将 培 养 皿 置 于 人 工 光 照 条 件 下 照 光 半 小 时 6. 分 别 在 显 微 镜 下 观 察 气 孔 的 开 度 1 试 比 较 在 何 种 溶 液 中 气 孔 的 开 度 最 大? 为 什 么? 说 明 原 因 实 验 5 单 盐 毒 害 及 离 了 间 拮 抗 现 象 通 过 简 单 试 验 说 明 培 养 液 中 各 种 离 子 平 衡 ( 各 种 离 子 及 其 浓 度 ) 的 重 要 性 离 子 间 的 拮 抗 现 象 的 本 质 是 复 杂 的, 它 可 能 反 映 不 同 离 子 对 原 生 质 亲 水 胶 粒 的 稳 定 度 原 生 质 膜 的 透 性, 以 及 对 各 类 酶 活 性 调 节 等 方 面 的 相 互 制 约 作 用, 从 而 维 持 机 体 的 正 常 生 理 状 态 烧 杯 纱 布 石 蜡 0.12mol/L KCl 0.06mol/L CaCl2 0.12mol/L NaCl ( 所 用 药 品 均 需 用 AR) 实 验 前 3 4 天 选 择 饱 满 的 小 麦 种 子 100 粒 浸 种, 在 室 温 下 萌 发, 待 根 长 1cm 时 即 可 用 作 材 料 取 4 个 小 烧 杯, 依 次 分 别 倒 人 不 列 盐 溶 液 : (1)0.12mol/L KCI (2)0.06 mol/l CaCl2 (3)0.12 mol/l NaCI (4)0.12 mol/l NaCl 100 ml+0.06 mol/l CaCl2 1 ml 十 0.12mol/L KCl 2.2 ml 小 烧 杯 用 涂 石 蜡 的 纱 布 盖 上 挑 选 大 小 相 等 及 根 系 发 育 一 致 的 小 麦 幼 苗 10 株 或 20 株, 小 心 种 植 在 纱 布 盖 的 孔 眼 里, 使 根 系 接 触 到 溶 液, 在 室 温 下 培 育 2 3 星 期 后, 即 可 看 出 在 单 盐 溶 液 中, 小 麦 幼 苗 生 长, 特 别 是 它 们 的 根 部 出 现 畸 形 1 比 较 小 麦 在 不 同 盐 溶 液 中 的 生 长 情 况 并 解 释 之 实 验 6 植 物 根 系 对 离 子 的 选 择 吸 收 通 过 实 验 说 明 植 物 对 环 境 的 阴 离 子 和 阳 离 子 的 吸 收 速 度 不 同, 而 改 变 了 环 境 的 酸 碱 度, 以 示

6 生 产 实 践 中 施 用 化 肥 时, 注 意 它 的 性 质 以 及 带 来 的 问 题 植 物 根 系 对 不 同 离 子 吸 收 量 是 不 同 的, 即 使 是 同 一 种 盐 类, 对 阳 离 子 与 阴 离 子 的 吸 收 量 也 不 相 同 本 实 验 是 利 用 植 物 对 不 同 盐 类 的 阴 阳 离 子 吸 收 量 不 同, 使 溶 液 的 ph 发 生 改 变 以 说 明 这 一 吸 收 特 性 此 实 验 也 使 我 们 了 解 什 么 是 生 理 酸 性 盐 与 生 理 碱 性 盐 ph 计 精 密 ph 试 纸 移 液 管 100ml 三 角 烧 瓶 0.5mg/ml(NH4)2SO4 0.5mg/ml NaNO3 1. 在 实 验 前 约 2 3 周 按 实 验 19 方 法 培 养 根 系 完 好 的 小 麦 ( 或 其 他 植 物 ) 植 株 2. 实 验 开 始 时 吸 取 0.5mg/ml 浓 度 的 (NH4)2SO4 和 NaNO3 各 100ml 分 别 置 于 两 个 100ml 三 角 烧 瓶 中, 另 一 三 角 烧 瓶 中 放 蒸 馏 水 100ml 用 ph 计 或 精 密 ph 试 纸 测 定 以 上 各 溶 液 和 蒸 馏 水 的 原 始 ph 值 3. 取 根 系 发 育 完 善 的 大 小 相 似 的 小 麦 3 份, 每 份 数 株, 但 数 目 相 等, 分 别 放 于 上 述 3 个 三 角 烧 瓶 中, 在 室 温 下 经 2 一 3 小 时 后 * 取 出 植 株, 并 测 定 溶 液 的 ph 值 实 验 结 果 按 下 表 记 录 植 物 从 盐 溶 液 中 吸 收 离 子 后 溶 液 ph 值 的 变 化 处 理 ph 值 放 植 株 前 放 植 株 后 0.5mg/ml(NH4)2SO4 0.5MG/ML NaNO3 蒸 馏 水 注 : 为 了 避 免 根 系 的 分 泌 作 用 影 响 实 验 结 果, 故 用 蒸 馏 水 作 对 照, 将 上 述 ph 值 变 化 进 行 修 正, 即 得 真 实 的 ph 变 化 1 NH4 NO3 是 生 理 酸 性 盐 还 是 生 理 碱 性 盐? 2 本 实 验 中 用 蒸 馏 水 作 对 照, 它 主 要 起 什 么 作 用 / 实 验 7 硝 酸 还 原 酶 活 性 的 测 定 熟 悉 硝 酸 还 原 酶 活 性 的 测 定 的 方 法 硝 酸 还 原 酸 是 植 物 氮 素 代 谢 作 用 中 关 键 性 酶, 与 作 物 吸 收 各 利 用 氮 肥 有 关 它 作 用 于 NO -3 使 还 原 为 NO-3; NO-3+NADH+H+ NO-2+NAD++H2O 产 生 的 NO-2 可 以 从 级 织 内 渗 透 到 外 界 溶 液 中, 并 积 累 在 溶 液 中, 测 定 反 应 溶 液 中 NO-2 含 量 的 增 加, 即 表 现 该 酶 活 性 的 大 小 这 种 方 法 简 单 易 行, 在 一 般 条 件 下 都 能 做 到 NO-2 含 量 的 测 定 用 磺 胺 [ 对 氨 基 苯 磺 酸 胺 (sulfanil-amide)] 比 色 法 在 酸 性 溶 液 中 磺 胺 与

7 NO-2 形 成 重 氮 盐, 再 与 α- 萘 胺 偶 联 形 成 紫 红 色 的 偶 氮 染 料 反 应 液 的 酸 度 大 则 增 加 重 氮 化 作 用 的 速 度, 但 降 低 偶 联 作 用 的 速 度, 颜 色 比 较 稳 定 增 加 温 度 可 以 增 加 反 应 速 度, 但 降 低 重 氮 盐 的 稳 定 度, 所 以 反 应 需 要 在 相 同 条 件 下 进 行 这 种 方 法 非 常 灵 敏, 能 测 定 每 ml 含 0.5μg 的 NaNO2 721 型 分 光 光 度 计 真 空 泵 ( 或 注 射 器 ) 保 温 箱 天 平 真 空 干 燥 器 钻 孔 器 三 角 烧 瓶 移 液 管 烧 杯 0.1mol/L 磷 酸 缓 冲 液,pH7.5( 见 附 表 2) 0.2mol/L KNO3: 溶 解 20.22gKNO3 于 1 000ml 蒸 馏 水 中 磺 胺 试 剂 :1g 磺 胺 加 25ml 浓 盐 酸, 用 蒸 馏 水 稀 释 至 100ml α- 萘 胺 试 剂 :0.2gα- 萘 胺 溶 于 含 1ml 浓 盐 酸 的 蒸 馏 水 中, 稀 释 至 100ml NaNO2 标 准 溶 液 :1g NaNO2 用 蒸 馏 水 溶 角 成 1 000ml 然 后 吸 取 5ml, 再 加 蒸 馏 水 稀 释 成 1 000ml, 此 溶 液 每 ml 含 有 NaNO2 10μg, 用 时 稀 释 之 1. 将 新 鲜 取 回 的 叶 片 ( 蓖 麻 烟 草 向 日 葵 油 菜 小 麦 棉 花 等 均 可 ) 水 先, 用 吸 水 纸 吸 干, 然 后 用 钻 孔 器 钻 成 直 径 约 1cm 的 圆 片, 用 蒸 馏 水 洗 涤 2 3 次, 吸 干 水 分, 然 后 于 台 天 平 上 称 取 等 重 的 叶 子 圆 片 两 份, 每 份 约 g( 或 每 份 取 50 个 圆 片 ), 分 别 置 于 含 有 下 列 溶 液 的 50ml 三 角 烧 瓶 中 :(1)0.1mol/L 磷 酸 缓 冲 溶 液 (ph7.5)5ml+ 蒸 馏 水 5ml;(2) 0.1mol/L 磷 酸 缓 冲 溶 液 (ph7.5)5ml+0.2mol/l KNO3 5ml 然 后 将 三 角 烧 瓶 置 于 真 空 干 燥 器 中, 接 上 真 空 泵 抽 气, 放 气 后, 圆 片 即 沉 于 溶 液 中 ( 如 果 没 有 真 空 泵, 也 可 以 用 20ml 注 射 器 代 替, 将 反 应 液 及 叶 子 圆 片 一 起 倒 入 注 射 器 中, 用 手 指 堵 住 注 射 器 出 口 小 孔, 然 后 用 力 拉 注 射 器 使 真 空, 如 此 抽 气 放 气 反 复 进 行 多 次, 即 可 使 圆 片 中 的 空 气 抽 去 而 沉 于 溶 液 中 ) 将 三 角 烧 瓶 置 于 30 温 箱 中, 使 不 见 光, 保 温 作 用 30 分 钟, 然 后 分 别 吸 取 反 应 溶 液 1ml, 以 测 定 NO-2 含 量 注 意 取 样 前 叶 子 要 进 行 一 段 时 间 的 光 合 作 用, 以 积 累 碳 水 化 合 物, 如 果 组 织 中 的 碳 水 化 合 物 含 量 低, 会 使 得 酶 的 活 性 降 低, 此 时 则 可 于 反 应 溶 液 中 加 入 30μg 3- 磷 酸 甘 油 醛 或 1,6- 二 磷 酸 果 糖, 能 显 著 增 加 NO-2 的 产 生 2.NO-2 含 量 的 测 定 保 温 30 分 钟 的 结 束 时, 吸 取 反 应 溶 液 1ml 于 一 试 管 中, 加 入 磺 胺 试 剂 2ml 及 α- 萘 胺 试 剂 2ml, 混 合 摇 匀, 静 置 30 分 钟, 用 比 色 计 进 行 比 色 测 定, 比 色 波 长 为 520nm, 记 下 吸 光 度 或 透 光 率, 从 标 准 曲 线 上 查 得 NO-2 含 量, 然 后 计 算 酶 活 性, 以 每 小 时 每 克 鲜 重 产 生 的 NO-2μg 或 μmol 表 示 之 3. 绘 制 标 准 曲 线 测 定 NO-2 的 磺 胺 比 色 法 很 灵 敏, 可 以 检 出 低 于 1μg/ml 的 NaNO2 含 量, 可 于 0 5μg/ml 浓 度 范 围 内 绘 制 标 准 曲 线 由 于 显 色 反 应 的 速 度 与 重 氮 化 作 用 及 偶 联 作 用 的 速 度 有 关, 温 度 酸 浓 度 等 都 影 响 显 色 速 度, 同 时 也 影 响 灵 敏 度, 但 如 果 标 准 与 样 品 的 测 定 都 在 相 同 条 件 下 进 行, 则 显 色 速 度 相 同, 彼 此 可 以 比 较 吸 取 不 同 浓 度 的 NaNO2 溶 液 ( 例 如 μg/ml)1ml 于 试 管 中, 加 入 磺 胺 试 剂 2ml 及 α- 萘 胺 试 剂 2ml, 混 合 摇 匀, 静 置 303 分 钟 ( 或 于 一 定 温 度 的 水 浴 中 保 温 30 分 钟 ),

8 立 即 于 分 光 光 度 计 中 进 行 测 定, 测 定 时 的 波 长 为 520nm, 比 色, 读 取 吸 光 度 或 透 光 率 然 后, 以 吸 光 度 为 纵 坐 标,NaNO2 浓 度 为 横 坐 标 于 毫 米 方 格 纸 上 绘 制 吸 光 度 - 浓 度 曲 线 1 比 较 不 同 植 物 的 酶 活 性 实 验 8 叶 绿 体 色 素 的 提 取 和 分 离 ( 纸 层 析 法 ) 了 解 叶 绿 体 色 素 提 取 分 离 的 原 理 以 及 它 们 在 光 合 作 用 中 的 意 义 叶 绿 体 色 素 是 植 物 吸 收 太 阳 光 能 进 行 光 合 作 用 的 重 要 物 质, 主 要 由 叶 绿 素 a 叶 绿 素 b 胡 萝 卜 素 和 叶 黄 素 组 成 从 植 物 叶 片 中 提 取 和 分 离 色 素 是 对 其 认 识 和 了 解 的 前 提 利 用 叶 绿 体 色 素 能 溶 于 有 机 溶 剂 的 特 性, 可 用 丙 酮 提 取 分 离 色 素 的 方 法 有 多 种, 纸 层 析 是 其 中 最 简 便 的 一 种 当 溶 剂 不 断 地 从 层 析 滤 纸 上 流 过 时, 由 于 混 合 物 中 各 成 分 在 两 相 ( 即 流 动 相 和 固 定 相 ) 间 具 有 不 同 的 分 配 系 数, 它 们 的 移 动 速 度 不 同, 使 样 品 中 的 混 合 物 得 到 分 离 大 试 管 台 天 平 研 钵 量 筒 烧 怀 漏 斗 软 木 层 新 华 滤 纸 丙 酮 四 氯 化 碳 无 水 硫 酸 钠 碳 酸 钙 石 英 砂 1. 称 取 新 鲜 叶 子 2 g, 放 入 研 钵 中 加 丙 酮 5ml, 少 许 碳 酸 钙 和 石 英 砂, 研 磨 成 匀 浆, 再 加 丙 酮 5 ml, 然 后 以 漏 斗 过 滤 之, 即 为 色 素 提 取 液 2. 取 准 备 好 的 滤 纸 条 (2 2 cm), 将 其 一 端 剪 去 两 侧, 中 间 留 一 长 约 1.5cm, 宽 约 0.5cm 的 窄 条, 如 图 7 3. 用 毛 细 管 取 叶 绿 素 溶 液 点 于 窄 条 的 上 方, 注 意 一 次 所 点 溶 液 不 可 过 多 如 色 素 过 淡, 用 电 吹 风 吹 干 后 再 点 1 一 2 次 4. 在 大 试 管 中 加 入 四 氯 化 碳 3 5ml 及 少 许 无 水 硫 酸 钠 然 后 将 滤 纸 条 固 定 于 软 木 塞 上, 插 入 试 管 内, 使 窄 端 浸 入 溶 剂 中 ( 色 素 点 要 略 高 于 液 面, 滤 纸 条 边 缘 不 可 碰 图 到 试 管 壁 ), 盖 紧 软 木 塞, 直 立 于 阴 暗 处 进 行 层 析 5. 经 过 0.5 一 1 小 时 后, 观 察 分 离 后 色 素 带 的 分 布 最 上 端 橙 黄 色 为 胡 萝 卜 素, 其 次 黄 色 为 叶 黄 素, 再 下 面 蓝 绿 色 为 叶 绿 素 a, 最 后 的 黄 绿 色 为 叶 绿 素 b 1 提 取 叶 绿 素 时 为 什 么 要 加 少 量 的 碳 酸 钙, 加 多 了 会 出 现 什 么 问 题? 实 验 9 植 物 体 色 素 及 其 性 质 了 解 叶 绿 素 的 光 学 特 性

9 植 物 色 素 包 括 脂 溶 性 的 叶 绿 体 色 素 和 水 溶 性 的 细 胞 波 色 素, 前 者 存 在 于 叶 绿 体, 与 光 合 作 用 有 关, 如 叶 绿 素 ; 后 者 存 在 于 液 泡 中, 特 别 与 花 朵 的 颜 色 有 关, 如 花 青 素 属 黄 酮 类 物 质 了 解 它 们 的 性 质 有 助 于 对 其 生 理 功 能 的 理 解 分 光 计 天 平 研 钵 分 液 漏 斗 移 液 管 量 筒 吸 球 试 管 碳 酸 钙 氢 氧 化 钾 丙 酮 乙 醚 甲 酸 盐 酸 醋 酸 铜 1. 叶 绿 体 色 素 的 提 取 取 菠 菜 ( 或 其 他 植 物 ) 叶 子 2g, 放 在 研 钵 中, 加 石 英 砂 和 碳 酸 钙 少 许, 丙 酮 约 5 ml, 研 磨 成 匀 浆, 再 加 丙 酮 15 ml, 则 得 深 绿 色 提 取 液, 用 漏 斗 过 滤 之, 即 为 色 素 提 取 液 2. 叶 绿 素 的 荧 光 现 象 取 上 述 色 素 丙 酮 提 取 液 少 许 于 试 管 中, 用 反 射 光 和 透 射 光, 观 察 提 取 液 的 颜 色 有 无 不 同, 反 射 光 观 察 到 的 溶 液 颜 色, 即 为 叶 绿 素 产 生 的 荧 光 颜 色. 3. 光 对 叶 绿 素 的 破 坏 作 用 取 上 述 色 素 丙 酮 提 取 液 少 许, 分 装 在 2 支 试 管 中,1 支 试 管 放 在 黑 暗 处 ( 或 用 黑 纸 包 裹 ), 另 1 支 试 管 放 在 强 光 下 ( 太 阳 光 ) 经 2 一 3 小 时 后, 观 察 两 支 试 管 中 溶 液 的 颜 色 有 何 不 同? 4, 铜 在 叶 绿 素 分 子 中 的 替 代 作 用 取 上 述 色 素 丙 酮 提 取 液 少 许 于 试 管 中,1 滴 1 滴 加 入 浓 盐 酸, 直 至 溶 液 出 现 褐 绿 色, 此 时 叶 绿 素 分 子 已 遭 破 坏, 形 成 去 镁 叶 绿 素 然 后 加 醋 酸 铜 晶 体 1 小 块, 慢 慢 加 热 溶 液, 则 又 产 生 鲜 亮 的 绿 色 此 即 表 明 铜 已 在 叶 绿 素 分 子 中 替 代 了 原 来 镁 的 位 置 5. 黄 色 素 和 绿 色 素 的 分 离 取 上 述 色 素 丙 酮 提 取 液 10 ml, 加 到 盛 有 20 ml 乙 醚 的 分 液 漏 斗 中, 摇 动 分 液 漏 斗, 并 沿 漏 斗 边 缘 加 入 20ml 蒸 馏 水, 轻 轻 摇 动 分 液 漏 斗, 静 置 片 刻, 溶 液 即 分 为 两 层 色 素 已 全 部 转 入 上 层 乙 醚 中, 弃 去 下 层 丙 酮 和 水, 再 用 蒸 馏 水 冲 洗 乙 醚 溶 液 1 2 次 然 后 于 色 素 乙 醚 溶 液 中 加 入 5ml30%KOH 甲 醇 溶 液, 用 力 摇 动 分 液 漏 斗, 静 置 10 分 钟, 再 加 蒸 馏 水 约 10 ml, 摇 动 后 静 置 分 离, 则 得 到 黄 色 素 层 和 绿 色 素 层, 分 别 保 存 于 试 管 中 6. 观 察 色 素 溶 液 的 吸 收 光 谱 (1) 调 节 分 光 计, 观 察 电 灯 光 的 光 谱 (2) 观 察 色 素 丙 酮 提 取 液, 用 丙 酮 将 溶 液 稀 释 1 倍 比 较 之 (3) 观 察 黄 色 素 乙 醚 溶 液, 用 乙 醚 将 溶 液 稀 释 1 倍 比 较 之 (4) 观 察 皂 化 叶 绿 素 甲 醇 溶 液, 用 甲 醇 将 溶 液 稀 释 1 倍 比 较 之 (5) 观 察 被 光 破 坏 的 色 素 丙 酮 溶 液, 试 与 (2) 作 比 较 (6) 观 察 被 铜 取 代 了 镁 的 色 素 溶 液

10 1 铜 在 叶 绿 素 中 取 代 镁 的 作 用, 有 何 实 用 意 义? 实 验 10 叶 绿 素 a 和 b 含 量 的 测 定 ( 分 光 光 度 法 ) 熟 悉 在 未 经 分 离 的 叶 绿 素 溶 液 中 测 定 叶 绿 素 a 和 b 的 方 法 如 果 混 合 液 中 的 两 个 组 分, 它 们 的 光 谱 吸 收 峰 虽 有 明 显 的 差 异, 但 吸 收 曲 线 彼 此 又 有 些 重 叠 ; 在 这 种 情 况 下 要 分 别 测 定 两 个 组 分, 可 根 据 Lambert-Beer 定 律, 通 过 代 教 方 法, 计 算 一 种 组 分 由 于 另 一 种 组 分 存 在 时 对 吸 光 度 的 影 响, 最 后 分 别 得 到 两 种 组 分 的 含 量 如 图 9 叶 绿 素 a 和 b 的 吸 收 光 谱 曲 线, 叶 绿 素 a 的 最 大 吸 收 峰 在 663nrn, 叶 绿 素 b 在 645nrn, 吸 收 曲 线 彼 此 又 在 重 叠 根 据 Lambert-Beer 定 律, 最 大 吸 收 光 谱 峰 不 同 的 两 个 组 分 的 混 合 液, 它 们 的 浓 度 C 与 吸 光 度 A 之 间 有 如 下 的 关 系 ( 参 阅 实 验 86): A1=Ca ka1+cb kb1 A2=Ca ka2+cb kb2 式 中 :Ca 为 组 分 a 的 浓 度,g/L Cb 为 组 分 b 的 波 度,g/L Al 为 在 波 长 λ1( 即 组 分 a 的 最 大 吸 收 峰 波 长 ) 时, 混 合 液 的 吸 光 度 A 值 A2 为 在 波 长 λ2( 即 组 分 b 的 最 大 吸 收 峰 波 长 ) 时, 混 合 液 的 吸 光 度 A 值 kal 为 组 分 a 的 比 吸 收 系 数, 即 组 分 a 当 浓 度 为 1g/L 时, 于 波 长 λ1 时 的 吸 光 度 A 值 Kb2 为 组 分 b 的 比 吸 收 系 数, 即 组 分 b 当 浓 度 为 1g/L 时, 于 波 长 λ2 时 的 吸 光 度 A 值 ka2 为 组 分 a( 浓 度 为 1 g/l) 在 波 长 λ2 时 的 吸 光 度 A 值 Kb1 为 组 分 b( 浓 度 为 1 g/l) 在 波 长 λ1 时 的 吸 光 度 A 值 从 文 献 中 可 以 查 得 叶 绿 素 a 和 b 的 80% 丙 酮 溶 液, 当 浓 度 为 1g/L 时, 比 吸 收 系 数 k 值 如 下 : 波 长 (nm) 叶 绿 素 a 叶 绿 素 b 将 表 中 数 值 代 入 上 式 (1) (2), 则 得 : A663=82.04 Ca+9.27 Cb A645=16.75 Ca Cb 经 过 整 理 之 后, 即 得 到 下 式 : Ca= A A645 (3) Cb=22.9A A663 (4) CT=Ca+Cb=8.02A A645 (5) (5) 式 中 CT 为 总 叶 绿 素 浓 度, 单 位 为 mg/l 利 用 上 面 (3) (4) (5) 式, 即 可 计 算 出 叶 绿 素 a 和 b 及 总 叶 绿 素 的 浓 度 注 : 一 般 大 学 教 学 实 验 室 所 用 的 人 光 光 度 计 多 为 721 型, 属 低 级 类 型, 其 单 色 光 的 半 波 宽 值 要 比 中 级 类 型 的 751 型 大 得 多, 而 叶 绿 素 a 和 b 吸 收 峰 的 波 长 相 差 仅 18nm( nm), 难 以 达 到 精 确 测 定 此 外 有 时 还 由 于 仪 器 本 身 的 标 称 波 长 与 实 际 波 长 不 符, 测 定

11 的 正 确 性 就 更 差 了 根 据 公 式 计 算 往 往 会 得 到 叶 绿 素 a b 值 小 于 1, 这 就 不 很 奇 怪 了 除 向 学 生 说 明 其 中 原 因 外, 还 可 以 在 实 验 前 对 仪 器 的 波 长 进 行 校 正, 使 标 称 波 长 与 实 际 波 长 一 致 校 正 可 用 纯 的 叶 绿 素 a 和 b 进 行, 分 别 在 波 长 nm 和 nm 之 间, 每 隔 1 2nm 测 定 叶 绿 素 a 或 b 的 吸 光 度 A, 以 确 定 叶 绿 素 a 和 b 的 吸 收 峰 的 波 长 如 果 测 得 的 峰 值 与 文 献 上 的 峰 值 663nm 和 645nm 不 同, 可 按 照 仪 器 说 明 书 步 骤 进 行 校 正, 或 者 更 方 便 的 方 法 可 以 打 开 仪 器 盖 子, 松 动 波 长 刻 度 盘 紧 固 螺 丝, 调 节 刻 度 盘 使 波 长 至 正 确 值, 而 后 旋 紧 螺 丝 复 原 仪 器 为 校 正 仪 器 波 长 所 需 的 叶 绿 素 a 和 b 的 用 量 是 很 少 的, 用 纸 层 析 法 很 快 就 能 分 离 制 得 取 植 物 叶 子 约 1g, 用 乙 醚 提 取 叶 绿 体 色 素, 再 用 毛 细 管 将 色 素 溶 液 画 在 3mm 厚 滤 纸 上 使 成 一 直 线, 为 使 分 离 效 果 好, 一 般 重 复 点 样 一 次 即 可 然 后 于 密 闭 容 器 中 进 行 上 行 层 析, 溶 剂 为 含 0.5% 丙 醇 的 石 油 醚 层 析 结 束, 用 剪 刀 小 心 地 剪 下 蓝 绿 色 的 叶 绿 素 a 和 黄 绿 素 的 叶 绿 素 b, 注 意 剪 时 尽 量 避 开 有 可 能 遭 污 染 的 地 区 最 后 分 别 浸 于 80% 丙 酮 中, 洗 下 叶 绿 素 a 和 b 高 级 型 分 光 光 度 计 离 心 机 台 天 平 剪 刀 研 钵 漏 斗 移 液 管 丙 酮 碳 酸 钙 石 英 沙 1 色 素 的 提 取 取 新 鲜 叶 片, 剪 去 粗 大 的 叶 脉 并 剪 成 碎 片, 称 取 0.5g 放 入 研 钵 中 加 入 纯 丙 酮 5mL, 少 许 碳 酸 钙 和 石 英 沙, 研 磨 成 匀 浆, 再 加 80% 丙 酮 5mL, 将 匀 浆 转 入 离 心 管, 并 用 适 量 80% 丙 酮 洗 涤 研 钵, 一 并 转 入 离 心 管, 离 心 后 弃 沉 淀, 上 清 液 用 80% 丙 酮 定 容 至 20mL 2 测 定 光 密 度 取 上 述 色 素 提 取 液 1 ml, 加 入 80% 丙 酮 4mL 稀 释 后 转 入 比 色 杯 中, 以 80% 丙 酮 为 对 照, 分 别 测 定 663nm 645nm 处 的 光 密 度 值 3 按 公 式 (3) (4) (5) 分 别 计 算 色 素 提 取 液 中 叶 绿 素 a 叶 绿 素 b 及 叶 绿 素 a+ 叶 绿 素 b 的 浓 度 再 根 据 稀 释 的 倍 数 分 别 计 算 每 克 鲜 重 叶 片 中 色 素 的 含 量 1 试 比 较 阴 生 植 物 和 阳 生 植 物 的 叶 绿 素 a 与 叶 绿 素 b 的 比 值 有 无 不 同 实 验 11 改 良 半 叶 法 测 定 大 田 光 合 强 度 熟 悉 植 物 光 合 作 用 强 度 的 测 定 方 法 改 良 半 叶 法 系 将 植 物 称 叶 片 的 一 部 分 遮 光 或 取 下 置 于 暗 处, 另 一 部 分 则 留 在 光 下 进 行 光 合 作 用, 过 一 定 时 间 后, 在 这 两 部 分 叶 片 的 对 应 部 位 取 同 等 面 积, 分 别 烘 干 称 重 因 为 对 称 叶 片 的 两 对 应 部 位 的 等 面 积 的 干 重, 开 始 时 被 视 为 相 等, 照 光 后 叶 片 重 量 超 过 暗 中 的 叶 重, 超 过 部 分 即 为 光 合 作 用 产 物 的 产 量, 并 通 过 一 定 的 计 算 可 得 到 光 合 作 用 强 度 分 析 天 平 烘 箱

12 剪 刀 称 量 皿 刀 片 金 属 模 板 纱 布 锡 纸 三 氯 乙 酸 1. 选 择 测 定 样 品 在 田 间 选 定 有 代 表 性 植 株 叶 片 ( 如 叶 片 在 植 株 上 的 部 位 叶 龄 受 光 条 件 等 )20 张, 用 小 纸 牌 编 号 2. 叶 子 基 部 处 理 为 了 不 使 选 定 叶 片 中 光 合 作 用 产 物 往 外 运, 而 影 响 测 定 结 果 的 准 确 性, 可 采 用 下 列 方 法 进 行 处 理 : (1) 可 将 叶 子 输 导 系 统 的 韧 皮 部 破 坏 如 棉 花 等 双 子 叶 植 物 的 叶 片, 可 用 刀 片 将 时 柄 的 外 皮 环 割 约 0.5 cm 宽 (2) 如 小 麦 水 稻 等 单 子 叶 植 物, 由 于 韧 皮 部 和 木 质 部 难 以 分 开 处 理, 可 用 刚 在 开 水 中 浸 过 的 纱 布 或 棉 花 做 成 的 夹 子 将 叶 子 基 部 烫 伤 一 小 段 即 可 ( 一 般 用 90 以 上 的 开 水 烫 20 秒 ) (3) 由 于 棉 花 叶 柄 木 质 化 程 度 低, 叶 柄 易 被 折 断 用 开 水 烫, 又 难 以 掌 握 烫 伤 的 程 度, 往 往 不 是 烫 得 不 够 便 是 烫 得 过 重 而 叶 片 下 垂, 改 变 了 叶 片 的 角 度 因 此 可 改 用 化 学 方 法 来 环 割, 选 用 适 当 浓 度 的 三 氯 乙 酸, 点 涂 叶 柄 以 阻 止 光 合 产 物 的 输 出 三 氯 乙 酸 是 一 种 强 烈 的 蛋 白 质 沉 淀 剂, 渗 入 叶 柄 后 可 将 筛 管 生 活 细 胞 杀 死, 而 起 到 阻 止 有 机 养 料 运 输 的 作 用 三 氯 乙 酸 的 浓 度, 视 叶 柄 的 幼 嫩 程 度 而 异 以 能 明 显 灼 伤 叶 柄, 而 又 不 影 响 水 分 供 应, 不 改 变 叶 片 角 度 为 宜 一 般 使 用 5% 三 氯 乙 酸 3. 剪 取 样 品 叶 基 部 处 理 完 毕 后, 即 可 剪 取 样 品, 记 录 时 间, 开 始 光 合 作 用 测 定 一 般 按 编 号 次 序 分 别 剪 下 对 称 叶 片 的 一 半 ( 主 脉 不 剪 下 ), 按 编 号 顺 序 夹 于 湿 润 的 纱 布 中, 贮 于 暗 处 过 4 一 5 小 时 后, 再 依 次 剪 下 另 外 半 叶, 同 样 按 编 号 夹 于 湿 润 纱 布 中, 两 次 剪 叶 的 速 度 应 尽 量 保 持 一 致, 使 各 叶 片 经 历 相 等 的 照 光 时 数 4. 称 重 比 较 将 各 同 号 叶 片 之 两 半 按 对 应 部 位 叠 在 一 起, 在 无 粗 叶 脉 处 放 上 已 知 面 积 ( 如 棉 花 可 用 1.5 2cm) 的 金 属 模 板, 用 刀 片 沿 边 切 下 两 个 叶 块, 分 别 置 于 照 光 及 暗 中 的 两 个 称 量 皿 中,80 90 下 烘 至 恒 重 ( 约 5 小 时 ), 在 分 析 天 平 上 称 重 比 较 5. 计 算 结 果 叶 片 干 重 差 之 总 和 (mg) 除 以 叶 面 积 ( 换 算 成 dm2,1dm2=100cm2) 及 照 光 时 数, 即 得 光 合 作 用 强 度, 以 干 物 质,mg/(dm2 b) 表 示 之 计 算 公 式 如 下 : 光 合 作 用 强 度 = 由 于 叶 内 贮 存 的 光 合 产 物 一 般 为 蔗 糖 和 淀 粉 等, 可 将 干 物 质 重 量 乘 系 数 1.5, 得 二 氧 化 碳 同 化 量, 单 位 为 CO2,mg/(dm2 h) 1 与 其 他 测 定 光 合 作 用 强 度 的 方 法 相 比, 本 方 法 有 什 么 优 点?

13 实 验 12 植 物 呼 吸 强 度 的 测 定 ( 小 篮 子 法 ) 熟 悉 测 定 呼 吸 强 度 的 方 法 利 用 Ba(OH)2 溶 液 吸 收 呼 吸 过 程 中 释 放 的 CO2, 实 验 结 束 后, 用 草 酸 溶 液 滴 定 残 留 的 Ba(OH)2, 从 空 白 和 样 品 两 者 消 耗 草 酸 溶 液 之 差, 即 可 计 算 出 呼 吸 过 程 中 释 放 的 CO2 量 广 口 瓶 温 度 计 酸 式 滴 定 管 干 燥 管 尼 龙 网 制 小 篮 0.05 mol/l Ba(OH)2 指 示 剂 :0.1% 麝 香 草 酚 酞 酒 精 溶 液 ( 见 附 录 表 4) 1/44 mol/l 草 酸 溶 液 : 准 确 称 取 重 结 晶 的 草 酸 H2C2O4 2H2O2.8652g, 溶 于 蒸 馏 水, 配 成 1 000ml, 每 ml 溶 液 相 当 于 1mg 的 CO2 1. 取 500ml 广 口 瓶 一 个, 装 配 一 只 三 孔 橡 皮 塞, 一 孔 插 入 盛 碱 石 灰 的 干 燥 管, 以 吸 收 空 气 中 的 CO2, 保 证 进 入 呼 吸 瓶 的 空 气 无 CO2, 一 孔 插 入 温 度 计, 另 一 孔 直 径 约 1cm 左 右 供 滴 定 用, 滴 定 前 用 小 橡 皮 塞 塞 紧 瓶 塞 下 面 挂 一 尼 龙 网 制 小 篮, 用 以 盛 实 验 材 料, 整 个 装 置 如 图 所 示 2. 称 取 萌 发 的 小 麦 或 水 稻 种 子 15g, 装 于 小 篮 内, 将 小 篮 挂 在 广 口 瓶 内, 同 时 加 0.05mol /L Ba(OH)2 溶 液 25ml 于 广 口 瓶 内, 立 即 塞 紧 瓶 塞, 并 用 熔 化 的 石 蜡 密 封 瓶 口, 防 止 漏 气 每 10 分 钟 左 右, 轻 轻 地 摇 动 广 口 瓶, 破 坏 溶 液 表 面 的 BaCO3 薄 膜, 以 利 对 CO2 的 吸 收 3.1 小 时 后, 小 心 打 开 瓶 塞, 迅 速 取 出 小 篮, 加 入 2 滴 指 示 剂, 立 即 重 新 塞 紧 瓶 塞 然 后 拔 出 小 橡 皮 塞, 将 滴 定 管 插 入 小 孔 中, 用 1/44 mol/l 的 草 酸 滴 定, 直 到 蓝 绿 色 转 变 成 无 色 为 止 记 录 滴 定 所 耗 用 的 草 酸 溶 液 的 ml 数 4. 另 取 用 沸 水 煮 死 的 种 子 为 材 料, 作 同 样 测 定, 以 此 作 为 对 照 5. 计 算 式 中 V0 为 煮 死 的 种 子, 所 耗 用 草 酸 的 ml 数, V1 为 发 芽 的 种 子, 所 耗 用 草 酸 的 ml 数 一 1 比 较 不 同 类 型 种 子 的 呼 吸 强 度 实 验 13 淀 粉 的 合 成 淀 粉 磷 酸 化 酶 熟 悉 淀 粉 酶 作 用 的 原 理 及 测 定 方 法 植 物 的 组 织 中 有 一 种 淀 粉 磷 酸 化 酶, 能 利 用 1- 磷 酸 葡 萄 糖 合 成 淀 粉, 生 成 的 淀 粉 可 用 I2 -KI 染 色 检 出 1- 磷 酸 葡 萄 糖 淀 粉 台 天 平 离 心 机 水 浴 锅 研 钵

14 移 液 管 1%1- 磷 酸 葡 萄 糖 0.1mol/L 柠 檬 酸 -0.2mol/L 磷 酸 缓 冲 液,pH6.5,( 见 附 表 2) I2-KI 溶 液 : 溶 液 1.5gKI 于 少 量 蒸 馏 水 中, 加 入 结 晶 碘 0.3g, 待 溶 解 后, 稀 释 100ml 1. 取 马 铃 薯 块 茎 一 个, 削 去 皮, 切 成 小 块, 称 取 10g, 于 研 钵 中 加 石 英 砂 少 许, 用 10ml 0.1mol /L 柠 檬 酸 -0.2mol/L 磷 酸 缓 冲 溶 液 研 磨 成 匀 浆 2. 用 纱 布 滤 取 汁 液, 于 r/min 离 心 15 分 钟, 以 除 去 淀 粉, 即 为 粗 制 酶 液 3. 取 小 试 管 2 支, 分 别 加 入 1%1- 磷 酸 葡 萄 糖 1ml, 再 于 1 管 中 加 入 1ml 粗 制 酶 液, 另 1 管 中 加 入 已 经 煮 沸 15 分 钟 的 粗 制 酶 液 摇 匀 试 管, 立 即 各 吸 取 1 滴 于 白 瓷 板 上, 分 别 加 1 滴 I2-KI 溶 液, 测 试 有 无 淀 粉 存 在 4. 以 后 每 隔 10 分 钟, 取 试 管 中 混 合 液 1 滴, 检 查 淀 粉 的 生 成 比 较 煮 沸 能 否 使 酶 失 活? 1 淀 粉 磷 酸 化 酶 在 淀 粉 代 谢 中 有 何 作 用? 实 验 14 植 物 体 内 有 机 物 运 输 途 径 ( 环 割 法 ) 熟 悉 植 物 体 有 机 物 运 输 的 途 径 韧 皮 部 的 筛 管 是 植 物 体 内 有 机 物 质 运 输 的 通 道, 环 割 试 验 即 可 以 证 明 这 一 点 在 木 本 植 物 的 枝 条 或 树 干 上, 用 刀 环 形 剥 去 一 层 树 皮, 深 达 形 成 层, 从 而 阻 断 了 割 环 上 下 方 有 机 物 的 交 换, 在 割 环 的 上 方 聚 集 着 从 叶 片 运 率 的 大 量 有 机 物, 引 趄 树 皮 组 织 生 长 加 强, 而 形 成 愈 伤 组 织 或 瘤 状 物 三 仪 器 解 剖 刀 1. 夏 季, 在 幼 龄 杨 树 或 其 他 木 本 植 物 上 选 定 尚 未 发 生 分 枝 的 旺 长 枝 条, 于 其 中 1 2 枝 进 行 环 状 剥 皮, 使 剥 环 宽 度 在 3cm 左 右 环 割 后, 每 星 期 观 察 一 次 枝 条 变 化, 并 与 生 长 情 况 相 似 的 对 照 枝 条 进 行 比 较, 特 别 注 意 观 察 以 下 几 个 方 面 ; (1) 剥 环 上 部 叶 片 是 否 萎 蔫? (2) 枝 条 顶 端 生 长 速 度 有 何 改 变? (3) 剥 环 上 下 切 口 愈 伤 组 织 生 长 情 况 (4) 剥 环 上 下 部 休 眠 芽 萌 发 情 况 2. 另 选 一 相 似 枝 条 进 行 双 环 割, 再 剥 环 相 距 40-50cm, 同 样 观 察 以 上 各 项 3. 秋 季 要 将 以 上 处 理 的 枝 条 剪 下 ( 连 同 对 照 枝 条, 风 于 保 存 作 教 学 材 料 ) 1 试 述 植 物 体 中 有 机 物 从 叶 运 到 根 的 途 径 实 验 15 IAA 的 生 物 鉴 定 ( 小 麦 芽 鞘 切 段 伸 长 法 )

15 熟 悉 生 长 素 含 量 的 生 物 测 定 方 法 将 小 麦 胚 芽 鞘 的 延 长 部 分 切 成 段, 漂 浮 在 含 有 生 长 素 IAA 的 溶 液 中, 这 些 切 段 可 以 继 续 伸 长, 在 一 定 浓 度 范 围 内, 芽 鞘 切 段 的 伸 长 与 生 长 素 浓 度 的 对 数 成 正 比, 因 而 可 通 过 测 定 切 段 伸 观 多 少 来 测 定 生 长 素 的 含 量 25oC 暗 室 滤 纸 旋 转 器 分 析 天 平 小 瓷 缸 大 瓷 缸 培 养 皿 银 试 管 移 液 管 青 霉 素 瓶 刀 片 小 镊 子 尼 龙 网 刻 度 尺 半 对 数 座 标 纸 饱 和 漂 白 粉 溶 液 小 麦 品 种, 扬 麦 1 号 最 好 用 中 农 ppmiaa 母 液 : 称 10 mg IAA 溶 于 少 量 无 水 酒 精 中, 再 用 水 稀 释 至 100ml 此 溶 液 在 冰 箱 中 可 保 存 一 个 月 缓 冲 液 : 称 取 K2 HPO 4,1.7 94g, 柠 檬 酸 1.019g, 蔗 糖 (AR)20g 溶 于 1000ml 重 蒸 馏 水 中,pH 为 挑 选 大 小 均 匀 的 小 麦 种 子 ( 必 须 用 前 一 二 年 的 种 子, 因 当 年 新 收 的 种 子 发 芽 不 整 齐 ), 用 饱 和 漂 白 粉 溶 液 灭 菌 30 分 钟 后, 用 自 来 水 冲 冼 半 天, 放 在 盛 肿 湿 润 滤 纸 的 培 养 皿 中, 腹 沟 朝 下, 在 25oC 黑 暗 条 件 下 萌 发 24 小 时 2. 当 第 一 胚 根 出 现 后, 移 于 用 尼 龙 网 覆 盖 的 小 瓷 缸 中, 胚 根 插 入 尼 龙 网 眼, 如 图 20 所 示 小 瓷 缸 放 入 盛 水 的 大 瓷 缸 中, 以 保 持 湿 度 或 在 小 瓷 缸 上 罩 上 烧 杯 保 湿 3. 继 续 在 25oC 黑 暗 下 培 养, 约 40 小 时 后, 当 胚 芽 鞘 长 达 3cm 左 右 时, 选 取 cm 幼 苗 作 为 生 物 鉴 定 材 料, 因 这 样 大 小 的 芽 鞘 对 IAA 最 敏 感 4. 切 去 芽 鞘 尖 端 3mm, 取 下 面 5mm 切 段 作 试 验, 如 图 21 所 示 5. 将 5mm 切 段 漂 浮 在 重 蒸 馏 水 中 浸 洗 2 3 小 时, 除 去 初 段 中 内 源 激 素 6. 配 制 PPm 的 IAA 的 系 列 标 准 溶 液 ( 配 在 具 塞 试 管 中 ) 吸 取 100ppmIAA1ml+9ml 缓 冲 液 10ppm IAA 吸 取 10PPmIAA1ml+9ml 缓 冲 液 1PPm IAA 吸 取 1PPmIAA1ml+9ml 缓 冲 液 0.1PPm IAA 吸 取 0.1PPmIAAml+9ml 缓 冲 液 0.01 PPm IAA 吸 取 0.01 PPm IAA1ml+9ml 缓 冲 液 0.O01 PPm IAA 7. 在 具 塞 青 霉 素 瓶 中 分 别 吸 入 上 述 IAA 系 列 标 准 溶 液 ( PPm IAA) 2ml, 另 外 吸 取 2ml 缓 冲 浪 作 为 对 照 8. 切 段 浸 泡 后, 用 滤 纸 将 切 段 表 面 水 分 吸 干, 在 上 述 盛 有 不 同 浓 度 生 长 素 的 青 霉 素 瓶 中, 分 别 放 入 芽 鞘 切 段 10 段 ( 最 好 放 段, 以 便 挑 选 ) 加 塞, 每 一 浓 度 重 复 3 次 将 青 霉 素 瓶 置 于 旋 转 器 上 ( 旋 转 速 度 为 16r/min) 在 25 暗 室 中 旋 转 培 养 9. 上 述 操 作 均 需 在 暗 室 中 绿 光 下 进 行 10. 旋 转 培 养 20 小 时 后 取 出 芽 鞘 切 段, 在 滤 纸 上 吸 干, 测 量 芽 鞘 切 段 的 长 度

16 11. 在 半 对 数 坐 标 纸 上, 以 芽 鞘 切 段 增 长 %* 为 纵 坐 标,IAA 浓 度 为 横 坐 标, 作 出 标 准 曲 线 在 生 长 素 浓 度 为 PPm 范 围 内, 切 段 的 伸 长 与 生 长 素 浓 度 的 对 数 成 正 比, 如 需 鉴 定 某 一 植 物 提 取 液 中 生 长 素 含 量, 必 须 与 标 准 的 IAA 作 对 照 1 采 取 小 麦 芽 鞘 切 段 伸 长 法 测 定 生 长 素 含 量 时, 为 什 么 要 将 芽 鞘 尖 端 3mm 切 去 而 取 下 面 的 5mm 作 实 验? 2 为 什 么 要 用 缓 冲 液 了 配 制 IAA 的 系 列 标 准 溶 液? 实 验 16 细 胞 分 裂 素 对 萝 卜 子 叶 的 保 绿 作 用 熟 悉 细 胞 分 裂 素 的 作 用 在 植 物 中 广 泛 存 在 着 细 胞 分 裂 素, 细 胞 分 裂 素 能 够 促 进 细 胞 分 裂, 阻 止 核 酸 酶 和 蛋 白 酶 等 一 些 水 解 酶 的 产 生, 因 而 使 得 核 酸 蛋 白 质 和 叶 绿 素 少 受 破 坏, 同 时 具 有 减 少 营 养 物 质 向 外 运 输 的 作 用 将 植 物 的 离 体 叶 片 放 在 适 宜 浓 度 的 细 胞 分 裂 索 溶 液 中, 置 于 黑 暗 条 件 下, 叶 片 中 叶 绿 素 的 分 解 速 度 比 对 照 慢, 证 明 细 胞 分 裂 素 具 有 保 绿 作 用 生 产 上 可 用 细 胞 分 裂 素 延 长 蔬 菜 的 贮 藏 时 间 721 型 分 光 光 度 计 合 天 平 培 养 皿 量 筒 容 量 瓶 小 漏 斗 剪 刀 研 钵 0.lmol/L HCl 6- 苄 基 氨 基 嘌 呤 ( 或 玉 米 素 ) 溶 液 : 称 取 10mg6- 苄 基 氨 基 腺 嘌 呤, 先 用 0.1mol/L HCl 溶 解, 再 用 蒸 馏 水 稀 释 成 100ml, 则 浓 度 为 100 ppm 再 稀 释 成 ppm, 配 成 的 溶 ph 约 为 5 左 右 取 4 套 培 养 皿 分 别 加 入 蒸 馏 水 和 ppm 的 6- 苄 基 氨 基 脓 瞟 吟 溶 液 各 20ml, 每 种 浓 度 处 理 重 复 2 次 各 培 养 皿 中 放 入 苗 岭 和 长 势 相 同 的 萝 卜 子 叶 1g, 加 盖 后 放 在 黑 暗 的 地 方 培 养 1 2 天 后 取 出 材 料, 用 吸 水 纸 吸 干 子 叶 上 的 溶 液, 然 后 按 实 验 33 的 方 法, 测 定 各 处 理 组 子 叶 中 所 含 的 总 叶 绿 素 含 量 (mg 叶 绿 素 /g 鲜 组 织 ) 1 采 用 不 同 品 种 的 萝 卜 作 为 材 料 进 行 实 验, 比 较 和 分 析 实 验 结 果 实 验 17 种 子 发 芽 率 的 快 速 测 定 : 熟 悉 种 子 活 力 的 测 定 方 法 种 子 发 芽 率 是 指 在 最 适 宜 条 件 下, 在 规 定 天 数 内, 发 芽 的 种 子 占 供 试 种 子 的 百 分 数 它 是 决

17 定 种 子 品 质 和 实 用 价 值 大 小 的 主 要 依 据, 与 播 种 的 用 种 量 直 接 有 关 但 是 常 规 方 法 ( 直 接 发 芽 ) 测 定 发 芽 率 所 需 时 间 较 长, 特 别 是 有 时 为 了 应 急 需 要, 没 有 足 够 的 时 间 来 测 定 发 芽 率, 遇 到 休 眠 种 子 也 无 法 知 道 快 速 测 定 法 则 能 在 较 短 时 间 内 获 得 结 果 氯 化 三 苯 四 氮 唑 法 (TTC 法 ) 凡 有 生 命 活 力 的 种 子 胚 部, 在 呼 吸 作 用 过 程 中 都 有 氧 化 还 原 反 应, 而 无 生 命 活 力 的 种 胚 则 无 此 反 应 当 TTC 渗 入 种 胚 的 活 细 胞 内, 并 作 为 氢 受 体 被 脱 氢 辅 酶 (NADH2 或 NADPH2) 上 的 氢 还 原 时, 便 由 无 色 的 TTC 变 为 红 色 的 三 苯 基 甲 (TTE) 恒 温 箱 烧 坏 培 养 皿 镊 子 刀 片 天 平 0.5%TTC 溶 液 : 称 取 0.5gTTC 放 在 烧 杯 中, 加 入 少 许 95% 乙 醇 使 其 溶 解, 然 后 用 蒸 馏 水 稀 释 至 100ml 溶 液 避 光 保 存, 若 变 红 色, 即 不 能 再 用 1. 浸 种 将 待 测 种 子 在 温 水 中 浸 种 ( 大 麦 小 麦 籼 谷 6 8 小 时, 玉 米 5 小 时 左 右, 粳 谷 2 小 时 ), 以 增 强 种 胚 的 呼 吸 强 度, 使 显 色 迅 速 2. 显 色 取 吸 胀 的 种 子 200 粒, 用 刀 片 沿 种 子 胚 的 中 心 线 纵 切 为 二 半, 将 其 中 的 一 半 置 于 2 只 培 养 皿 中, 每 皿 100 个 半 粒, 加 入 适 量 的 0.5%TTC, 以 覆 盖 种 子 为 度 然 后 置 于 30 恒 温 箱 中 小 时 观 察 结 果, 凡 胚 被 染 为 红 色 的 是 活 种 子 将 另 一 半 在 沸 水 中 煮 5 分 钟 杀 死 胚, 作 同 样 染 色 处 理, 作 为 对 照 观 察 3. 计 算 活 种 子 的 百 分 离, 如 果 可 能 的 话 与 实 际 发 芽 率 作 一 比 较, 看 是 否 相 符? 1 实 验 结 果 与 实 际 情 况 是 否 相 符? 为 什 么? 实 验 18 谷 物 种 子 萌 发 时 淀 粉 酶 活 性 的 测 定 了 解 种 子 萌 发 时 淀 粉 的 水 解 与 淀 粉 酶 形 成 的 关 系 种 了 中 的 贮 藏 物 质 淀 粉, 在 萌 发 过 程 中, 主 要 是 在 淀 粉 酶 水 解 作 用 下 转 变 成 简 单 的 有 机 化 合 物, 这 些 物 质 是 构 成 新 器 官 的 材 料 在 一 定 条 件 下 定 量 淀 粉 糖 化 过 程 时 间 的 长 短 即 可 表 示 酶 活 力 的 大 小 天 平 恒 温 水 浴 锅 研 钵 白 磁 板 漏 斗 漏 斗 架 培 养 皿 滤 纸 1% 淀 粉 溶 液 0.2mol/L 磷 酸 缓 冲 液,Ph6

18 I-KI 溶 液 : 1. 原 碘 液 :I211g,KI22g, 定 容 至 500ml 2. 标 准 稀 碘 液 : 取 原 碘 液 15ml, 加 KI8g 定 容 至 500ml 3. 比 色 稀 碘 液 : 原 碘 液 2ml 加 KI20g, 定 容 至 500ml 标 准 糊 精 : 称 取 0.12g 糊 精, 悬 浮 于 少 量 水 中, 再 移 至 沸 水 中, 冷 却 定 容 至 200ml, 取 其 中 1ml 加 3ml 标 准 稀 碘 液 作 为 比 较 颜 色 1. 实 验 材 料 的 准 备 于 实 验 前 6 天, 采 用 水 培 法 培 养 出 几 种 不 同 环 境 条 件 下 生 长 的 作 物 幼 苗 ( 水 稻 小 麦 ) 2. 淀 粉 酶 溶 液 的 制 备 将 不 同 幼 苗 用 水 洗 净, 各 种 取 幼 苗 胚 乳 部 分 0.5g, 分 别 置 于 研 钵 中, 加 5ml ph6 的 磷 酸 缓 冲 液, 仔 细 研 磨, 滤 纸 过 滤 ( 或 离 心 ), 用 适 量 缓 冲 液 冲 洗, 最 后 定 容 至 10ml 3. 保 温 糖 化 取 20ml 1% 淀 粉 液 和 5ml ph6 的 磷 酸 缓 冲 液 于 三 角 烧 瓶 中, 置 于 35 水 浴 中 平 衡 15 分 钟, 加 1ml 制 备 好 的 酶 溶 液, 搅 匀, 立 即 记 时 间 4. 显 色 观 察 及 测 定 吸 上 述 混 合 液 1 滴 于 白 瓷 反 应 板 上, 加 1 滴 稀 碘 液, 观 察 颜 色, 与 标 准 糊 精 比 较 颜 色, 相 同 即 是 反 应 达 到 终 点, 记 录 糖 化 时 间 t 计 算 : f 为 稀 释 倍 数 (20) Ua 为 酶 活 力 单 位 ( 表 示 每 g 材 料 每 小 时 消 化 1g 淀 粉 的 酶 活 力 为 1 个 单 位 ) 1 比 较 萌 发 天 数 不 同 或 不 同 温 度 下 萌 发 的 幼 苗 的 淀 粉 酶 活 力 实 验 19 植 物 组 织 培 养 实 验 目 的 : 熟 悉 组 织 培 养 的 操 作 过 程 植 物 组 织 培 养 是 把 植 物 的 器 官, 组 织 以 到 单 个 细 胞, 应 用 无 菌 操 作 使 其 在 人 工 条 件 下, 能 够 继 续 生 长, 甚 至 分 化 发 育 成 一 完 整 的 植 株 的 过 程 植 物 的 组 织 在 培 养 条 件 下, 原 来 已 经 分 化 停 止 生 长 的 细 胞, 又 能 重 新 分 裂, 形 成 没 有 组 织 结 构 的 细 胞 图, 即 愈 伤 组 织 这 一 过 程 称 为 脱 分 化 作 用, 已 经 脱 分 化 的 愈 伤 组 织, 在 一 定 条 件 下, 又 能 重 新 分 化 形 成 辅 导 系 统 以 及 根 和 芽 等 组 织 和 器 官, 这 一 过 程 称 为 再 分 化 作 用 植 物 激 素 在 此 过 程 中 起 着 重 要 作 用, 吲 哚 乙 酸 和 6- 苄 基 氨 基 腺 嘌 呤 的 比 例, 决 定 了 根 和 芽 的 分 化 近 年 来, 组 织 培 养 作 为 一 种 研 究 技 术, 已 广 泛 地 应 用 于 许 多 学 科 中, 它 不 仅 对 理 论 研 究 有 重 要 意 义, 并 已 展 现 了 十 分 广 阔 的 应 用 前 景 Ⅰ. 愈 伤 组 织 培 养 和 分 化 原 理 植 物 组 织 经 过 脱 分 化 作 用, 形 成 愈 伤 组 织, 经 过 再 分 化 作 用, 愈 伤 组 织 又 能 重 新 分 化 为 有 结 构 的 组 织 和 器 官, 最 终 形 成 完 整 的 植 株 早 在 1957 年 Skoog 即 发 现 培 养 基 中 植 物 激 素 的 类 型 和 它 们 的 比 例, 对 再 分 化 过 程 起 着 重 要 的 作 用 仪 器 药 品

19 培 养 室 接 种 箱 或 超 净 工 作 台 高 压 灭 菌 锅 分 析 天 平 水 浴 锅 长 镊 子 解 剖 刀 剪 刀 三 角 饶 瓶 (100ml) 容 量 瓶 烧 杯 移 液 管 量 简 牛 皮 纸 培 养 皿 称 量 纸 棉 线 HgCl2( 或 次 氨 酸 钠 ) 乙 醇 6- 苄 基 氨 基 腺 嘌 呤 IAA 或 2,4-D MS 培 养 基 ( 见 附 表 16 和 17) 操 作 步 骤 1. 配 制 培 养 基 (1) 愈 伤 组 织 诱 导 培 养 基 :MS 培 养 基 ( 蔗 糖 含 量 为 10g/L,2,4-D 含 量 为 2mg/L, 琼 脂 10g/L) (2) 试 验 培 养 基 : 按 下 表 配 制 序 号 吲 哚 乙 酸 (mg/l)6- 苄 基 氨 腺 嘌 呤 相 对 比 值 : : : : : : : 吲 哚 乙 酸 用 少 量 0.1mol/L NaOH 溶 解,6 苄 基 氨 基 腺 瞟 吟 用 少 量 0.lmol/L HCI 溶 解 2. 培 养 基 灭 菌 将 配 好 的 培 养 基 加 入 琼 脂 加 热 溶 解, 调 至 PH5.8, 趁 热 分 装 于 100 ml 三 角 饶 瓶 中, 每 瓶 约 20ml 待 培 养 基 冷 却 凝 固 后, 用 一 层 称 量 纸 和 一 层 牛 皮 纸 包 扎 瓶 ( 管 ) 口, 并 用 棉 线 扎 牢, 然 后 在 高 压 灭 菌 锅 中 (121 (1kg/cm2) 下 灭 菌 20 分 钟 取 出 三 角 烧 瓶 放 在 台 子 上, 冷 却 后 备 用 接 种 操 作 所 需 的 一 切 用 具 ( 如 长 镊 子 解 剖 刀 剪 刀 等 ) 及 灭 菌 水, 需 同 时 灭 菌 3. 诱 导 产 生 愈 伤 组 织 (1) 取 健 壮 的 烟 草 茎 数 段, 每 段 约 5cm 长, 于 烧 杯 中 用 0.1 另 氯 化 汞 ( 升 汞 ) 浸 泡 20 分 钟, 取 出 用 无 菌 水 洗 3 4 次 置 于 无 菌 培 养 皿 中, 在 接 种 箱 中 按 无 菌 操 作 要 求 剥 去 外 皮 ( 接 种 箱 事 先 用 紫 外 灯 灭 菌 30 分 钟 ), 用 解 剖 刀 切 成 5mm 厚 的 圆 片 ( 弃 去 开 始 一 片 和 最 后 一 片 ), 用 长 镊 子 将 它 接 种 在 诱 导 培 养 基 上, 注 意 图 片 的 切 口 朝 向 培 养 基, 每 瓶 接 种 4 片, 接 种 后 扎 好 瓶 口 (2) 将 已 接 入 植 物 组 织 ( 外 植 体 ) 的 三 角 烧 瓶, 培 养 在 25 温 室 中, 每 星 期 检 查 1 2 次, 剔 除 材 料 已 被 杂 菌 污 染 的 三 角 烧 瓶,3 4 周 后 产 生 愈 伤 组 织 (3) 选 取 愈 伤 组 织 生 长 良 好 的 三 角 烧 瓶, 用 解 剖 刀 将 愈 伤 组 织 切 下, 转 移 到 含 有 不 同 激 素 的 试 验 培 养 基 中 ( 也 可 以 连 同 原 来 的 外 植 体 一 起 转 移 ), 每 瓶 放 1 2 块, 仍 培 养 在 25 温

20 室 中, 每 周 1 2 次 观 察 不 同 处 理 的 三 角 烧 瓶 中, 愈 伤 组 织 分 化 情 况, 直 至 长 出 根 和 芽 长 成 的 幼 小 植 株 即 为 试 管 苗, 可 移 栽 于 花 盆 中 Ⅱ 原 生 质 体 的 分 离 和 培 养 原 理 植 物 细 胞 在 纤 维 素 酶, 半 纤 维 素 酶 和 果 胶 酶 的 作 用 下, 细 胞 壁 被 消 化, 可 以 得 到 裸 露 的 原 生 质 体 原 生 质 体 在 合 适 的 培 养 条 件 下, 能 再 生 细 胞 壁, 进 行 分 裂 生 长 形 成 愈 伤 组 织, 进 一 步 分 化 形 成 根 和 芽, 长 成 新 的 植 物 体, 表 现 了 植 物 细 胞 的 全 能 性 利 用 植 物 原 生 质 体 可 以 进 行 细 胞 生 理 生 化 和 遗 传 等 多 方 面 的 研 究, 已 成 为 植 物 生 理 学 细 胞 生 物 学 及 遗 传 学 等 学 科 的 重 要 研 究 方 面 要 进 行 原 生 质 体 的 培 养, 首 先 要 分 离 得 到 具 有 活 力 的 原 生 质 体, 因 此, 掌 握 分 离 植 物 原 生 质 体 的 方 法, 就 显 得 十 分 重 要 仪 器 药 品 培 养 室 超 净 工 作 合 或 接 种 稻 真 空 系 或 水 泵 高 压 灭 菌 锅 离 心 机 手 摇 离 心 机 细 菌 过 滤 器 过 滤 瓶 血 球 计 数 器 移 液 管 培 养 皿 三 角 烧 瓶 不 锈 钢 网 k 目 ) 长 镊 子 剪 刀 漂 白 精 片 70% 乙 醇 NT 琼 脂 培 养 基 ( 见 附 表 16 和 17), 另 加 入 1.2% 琼 脂 酶 液 :0.7g 纤 维 素 酶 (EA3-867)5.5g 甘 露 醇,0.05gCaCl2, 配 成 100ml,PH 5.7, 溶 解 后 4000r/min 离 心 15 分 钟, 取 上 清 液, 通 过 灭 菌 漏 斗 过 滤 消 毒 ( 用 0.45 m 微 孔 滤 膜 减 压 过 滤 ), 滤 液 在 超 净 工 作 台 上 分 装 在 灭 菌 的 三 角 烧 瓶 中, 每 瓶 约 10m1, 贮 于 冰 箱 中 备 用 洗 涤 液 :5.5g 甘 露 醇,0.05g CaCl2 用 NT 培 养 液 配 成 100ml 操 作 步 骤 1. 材 料 准 备 苗 龄 在 60 天 以 上 的 烟 草 植 株, 取 上 中 部 叶 子, 在 灯 光 或 日 光 下 照 射 2 小 时 左 右, 使 萎 蔫 萎 蔫 后 的 叶 片 用 清 水 洗 净, 浸 入 吐 温 溶 液 中 数 分 钟, 移 至 70% 酒 精 浸 数 秒 钟, 再 在 漂 白 精 溶 液 中 浸 分 钟, 用 无 菌 水 冲 洗 2 3 次, 再 用 无 菌 滤 纸 吸 去 表 面 的 水 分 以 上 均 按 无 菌 操 作 要 求 进 行 2. 游 离 原 生 质 体 用 镊 子 撕 去 下 表 皮, 切 成 小 块, 取 1g 材 料 放 人 盛 有 10ml 酶 液 的 三 角 烧 瓶 中, 于 28 左 右 保 温 小 时 3. 净 化 经 过 保 温 的 材 料, 通 过 带 有 目 不 锈 钢 网 的 细 菌 漏 斗, 滤 去 未 被 消 化 的 组 织 碎 片, 得 到 的 原 生 质 体 悬 液 移 至 1Oml 离 心 管 中, 用 翻 口 塞 密 封 离 心 管 口, 手 摇 离 心 机 离 心 2 分 钟, 吸 去 上 溶 液, 加 入 洗 涤 液, 重 新 悬 浮 原 生 质 体, 这 样 重 复 洗 涤 2 3 次, 最 后 用 NT 培 养 液 洗 1 次 4. 培 养 (1) 将 悬 浮 在 NT 培 养 液 中 的 原 生 质 体, 用 血 球 计 数 器 计 算 原 生 质 体 的 密 度, 使 每 ml 达 到 101 一 105 个 原 生 质 体

21 (2) 吸 取 原 生 质 体 悬 液 1 1.5ml 于 灭 菌 的 6cm 培 养 皿 中, 加 入 熔 化 的 NT 琼 脂 培 养 基 1 1.5ml, 立 即 轻 经 展 动 培 养 皿, 使 原 生 质 体 均 匀 分 布 在 固 体 培 养 基 中 (3) 待 培 养 基 冷 却 凝 固 后, 将 培 养 皿 倒 置 于 9cm 培 养 皿 中, 皿 四 周 垫 有 湿 润 滤 纸 条, 培 养 皿 外 用 胶 布 或 石 蜡 纸 密 封 之 (4) 再 将 培 养 皿 放 在 有 盖 搪 瓷 盘 中, 于 保 温 培 养, 当 原 生 质 体 开 始 变 形 长 大 时, 可 将 它 连 同 周 围 琼 脂 切 成 块, 移 贴 到 新 鲜 的 NT 培 养 基 上, 再 进 行 倒 置 培 养 (5) 当 产 生 愈 伤 组 织 后, 即 可 用 一 般 的 组 织 培 养 方 法, 如 实 验 I 中 选 用 合 适 的 试 验 培 养 基, 诱 导 根 芽 的 分 化 和 再 生 成 植 株 作 业 : 1 你 认 为 组 织 培 养 成 功 与 否 的 关 键 是 什 么? 2 植 物 激 素 与 植 物 器 官 分 化 有 何 关 系? 3 组 织 培 养 技 术 有 何 生 产 实 践 意 义 / 实 验 20 植 物 缺 水 程 度 的 鉴 定 ( 脯 氨 酸 法 ) 了 解 植 物 体 内 水 分 亏 缺 与 脯 氨 酸 积 累 的 关 系 当 植 物 缺 水 时 体 内 的 脯 氨 酸 含 量 增 加 植 株 体 内 脯 氨 酸 含 量 在 一 定 程 度 上 反 映 了 植 株 内 的 水 分 情 况, 因 而 可 以 作 为 植 物 缺 水 情 况 的 参 考 性 生 理 指 标 用 人 造 沸 石 (permutit) 在 ph1 7 范 围 内 振 荡 溶 液, 可 除 去 干 扰 的 氨 基 酸 或 使 不 与 茚 三 酮 反 应 ( 如 甘 氨 酸 谷 氨 酸 谷 氨 酸 天 冬 氨 酸 丙 氨 酸 缬 氨 酸 胱 氨 酸 苯 丙 氨 酸 精 氨 酸 等 ), 脯 氨 酸 与 茚 三 酮 试 剂 呈 显 色 反 应, 其 含 量 与 色 度 成 正 相 关, 可 用 分 光 光 度 计 测 定 此 法 有 专 一 性 721 型 分 光 光 度 计 离 心 机 水 浴 锅 烧 杯 移 液 管 研 钵 容 量 瓶 具 塞 试 管 冰 醋 酸 80% 乙 醇 脯 氨 酸 人 造 沸 石 茚 三 酮 试 剂 : 将 2.50g 茚 三 酮 于 60ml 冰 醋 酸 和 40ml6mol/L 磷 酸 中, 加 热 (70 ) 溶 解 试 剂 至 少 在 24 小 时 内 稳 定 1. 绘 制 标 准 曲 线 取 脯 氨 溶 于 80% 乙 醇 中, 然 后 稀 释 成 下 列 浓 度 Pg/ml 分 别 取 标 准 溶 液 2ml, 冰 醋 酸 2ml, 茚 三 酮 试 剂 2ml 加 入 试 管 中, 用 橡 皮 塞 塞 紧, 于 沸 水 浴 中 加 热 15 分 钟 用 分 光 光 度 计 于 波 长 515nm 下 进 行 比 色 测 定, 以 浓 度 0 为 空 白 对 照 将 测 定 结 果 以 辅 氨 酸 浓 度 为 横 坐 标, 以 吸 光 度 为 纵 坐 标 作 标 准 曲 线 2. 植 株 样 品 液 的 提 取 选 取 植 株 功 能 叶 片 2g, 用 3ml80% 乙 醇 研 磨 ( 放 少 许 石 英 砂 ) 成 浆 状 用 80% 乙 醇 洗 研 钵,

22 将 提 取 物 和 洗 液 置 于 试 管 中 80% 乙 醇 总 量 为 10ml 加 盖 置 于 黑 暗 中 室 温 下 提 取 24 小 时 将 提 取 液 在 放 有 活 性 炭 的 滤 纸 大 进 行 过 滤, 重 复 过 滤 一 次, 除 去 色 素 和 残 渣 将 提 取 液 置 于 试 管 中, 加 其 重 量 1/5 的 人 造 沸 石 强 烈 振 荡 5 分 钟 将 上 层 波 在 离 心 机 上 离 心 10 分 钟, 取 上 清 液 备 用 3. 样 品 溶 液 之 测 定 将 离 心 后 所 得 之 上 层 液, 取 2ml 置 于 试 管 中, 再 加 入 2ml 冰 醋 酸 和 2ml 茚 三 钢 试 剂, 加 盖 密 封, 在 沸 水 浴 上 加 热 15 分 钟 用 3ml80% 乙 醇 代 替 样 品 液 作 为 对 照 在 分 光 光 度 计 上 用 515nm 进 行 比 色 测 定 读 出 吸 光 度 后, 从 标 准 曲 线 上 求 出 样 品 溶 液 中 脯 氨 酸 含 量 1 比 较 正 常 及 缺 水 情 况 下, 幼 苗 中 脯 氨 酸 含 量 的 变 化