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1 第 36 卷第 1 期 2016 年 1 月 环 境 科 学 学 报 Acta Scientiae Circumstantiae Vol 36 No 1 Jan 2016 DOI 10 13671 j hjkxxb 2015 0677 陈丽华 孙万虹 李海玲 等 2016 石油降解菌对石油烃中不同组分的降解及演化特征研究 J 环境科学学报 36 1 124 133 Chen L H Sun W H Li H L et al 2016 Biological degradation and transformation characteristics of different components in petroleum hydrocarbon by oil degradation bacteria J Acta Scientiae Circumstantiae 36 1 124 133 石油降 解 菌 对 石 油 烃 中 不 同 组 分 的 降 解 及 演 化 特 征 研究 陈丽华1 孙万虹1 李海玲1 杨琴2 张璇2 1 西北民族大学实验中心 兰州 730030 2 长庆油田公司 油气工艺研究院 西安 710018 收稿日期 2015 02 15 修回日期 2015 09 17 录用日期 2015 10 03 摘要 从甘肃华庆油田油井附近石油污染的土壤中得到 5 种菌属的石油降解菌 以各菌剂对原油不同组分的降解率及其标志物演化参数为基 础 利用 GC MS 联用技术分析测定了 7 d 和 15 d 石油烃中正构烷烃 藿烷 芳香烃的降解率 用各种标志物反映各菌剂对原油中正构烷烃 藿 烷 芳香烃演化特征 结果表明 F2 A5 混合菌 H 对于高碳数段的正构烷烃降解率高达 60 以上 混合菌剂对于正构烷烃的降解较均衡 正构 烷烃在前后两个阶段的降解呈现出对低碳和高碳降解的互补规律 奇偶碳数优势 OEP 在 15 d 更明显 F2 菌剂的 w C 21 w C 22 值说 明对其高碳数降解优势最明显 各菌 w Pr w Ph 比值均大于原油 说明原油中类异戊二烯烷烃在不同菌剂的作用中发生了明显的降解 各 菌剂作用能促使五环三萜类化合物的手性碳 R 构型向更稳定的 S 构型转化 短期内已接近转化终点 A5 对藿烷降解的 w Ts w Tm 比值最 大 0 966 转化最彻底 A5 D4 和 F2 菌株后期作用原油时 藿烷系列的降解速率明显大于正构烷烃系列 表现出降解藿烷的优势 各菌剂对芳 香烃具有强烈的去甲基化作用 A5 和 D4 菌降解芳烃优势更明显 关键词 降油菌 石油烃 降解率 生物演化 文章编号 0253 2468 2016 01 124 10 中图分类号 X172 X53 文献标识码 A Biological degradation and transformation characteristics of components in petroleum hydrocarbon by oil degradation bacteria different CHEN Lihua 1 SUN Wanhong 1 LI Hailing 1 YANG Qin 2 ZHANG Xuan 2 1 Experimental Center of Northwest University for Nationalities Lanzhou 730030 2 Institute of oil gas techniques Companies of Changqing Oil Field Xian 710018 Received 15 February 2015 received in revised form 17 September 2015 accepted 3 October 2015 Abstract Five oil degradation bacteria strains were screened and isolated from soil collected in petroleum contaminated sites by enrichment culture on Huaqing Oilfield of Gansu Province China The degradative degree of n Alkanes hopanes and aromatic hydrocarbons were detected by GC MS on the 7 th and 15 th day and biological transformation characteristics of n Alkanes hopanes aromatic hydrocarbons had been analyzed by biological marker ratios The results show that the degradation rates of F2 A5 and the mixed bacteria H for high carbon normal alkanes are greater than 60 The degradation rate of mixed bacteria for normal alkanes is more balanced The normal alkanes degradation in the two stages are complementary for the low carbon and high carbon n Alkanes and the odd even predominance OEP is more obvious on the 15 th day The w C 21 w C 22 of F2 strains shows the most obvious on the degradation of high carbon n Alkane The w Pr w Ph of every strains are higher than crude oil which indicates that isoprenoid alkanes in crude oil have been obviously degraded by different bacteria strains The various strain could promote the transition of pentacyclic triterpenes from less stable R configuration to more stable S configuration and reach the end of the conversion in 7 days A5 has the greatest w Ts w Tm for hopane degradation 0 966 and the most complete transformation When A5 D4 and F2 strains degrade petroleum hydrocarbon later the degradation rate of hopane series is significantly higher than n Alkane series which showes the degradation of A5 D4 and F2 is advantageous to hopane The bacteria 基金项目 国家自然科学基金项目 No 41361070 中国石油长庆油田分公司基金资助项目 No 14AQ FW 014 2014 年甘肃省自然科学基金 No 145RJZA224 2014 年甘肃省教育厅项目 No 2014B 007 Supported by the National Natural Science Foundation of China No 41361070 the Fund of ChinaNationalPetroleumCorporation Changqing Oilfield Company No 14AQ FW 014 the Natural Sciences Foundation of Gansu Province No 145RJZA224 and the Fund of the Education Department of Gansu Province No 2014B 007 作者简介 陈丽华 1972 女 教授 博士 E mail 673126749 qq com 通讯作者 责任作者 Biography CHEN Lihua 1972 female professor Ph D E mail 673126749 qq com Corresponding author

2 1 期 陈 丽 华 等 : 石 油 降 解 菌 对 石 油 烃 中 不 同 组 分 的 降 解 及 演 化 特 征 研 究 125 have strong demethylation effect to aromatic hydrocarbon, and A5 and D4 strains have more outstanding performance in aromatic hydrocarbon degradation. Keywords: oil degrading bacteria; petroleum hydrocarbon; degradation rate; biological evolution 1 引 言 (Introduction) 随 着 石 油 产 品 需 求 量 的 不 断 增 加, 石 油 及 其 制 品 通 过 多 种 途 径 进 入 环 境, 对 土 壤 和 水 体 造 成 了 严 重 污 染, 并 且 威 胁 着 人 类 的 健 康, 石 油 污 染 土 壤 技 术 的 研 究 及 应 用 正 日 益 受 到 广 泛 重 视 与 关 注 (Farhad et al., 2000; 张 子 间 等, 2009). 由 于 物 理 修 复 ( 如 热 处 理 ) 在 破 坏 土 壤 中 污 染 物 的 同 时 也 破 坏 了 土 壤 的 组 分 和 结 构, 而 且 价 格 昂 贵 ; 化 学 修 复 效 果 较 好, 但 所 使 用 的 化 学 试 剂 会 产 生 二 次 污 染, 限 制 了 其 应 用 范 围 (Kishore et al., 2007). 生 物 修 复 技 术 被 认 为 是 一 种 绿 色 环 保 无 二 次 污 染 高 效 可 彻 底 降 解 污 染 物 的 具 有 发 展 前 景 的 石 油 污 染 修 复 方 法 ( 徐 金 兰 等, 2009; Lu et al., 2014). 该 技 术 关 键 在 于 利 用 功 能 微 生 物 可 降 解 多 种 石 油 烃 组 分, 研 究 内 因 如 何 最 大 程 度 强 化 菌 群 自 身 降 解 石 油 污 染 底 物 的 能 力 ( Zhang et al., 2008), 并 对 影 响 混 合 菌 群 降 解 性 能 的 营 养 条 件 和 环 境 因 素 ( 外 因 ) 进 行 试 验 研 究. 如 利 用 细 菌 和 真 菌 在 生 长 以 及 对 石 油 类 物 质 降 解 途 径 方 面 的 互 补 性, 构 建 了 以 真 菌 和 细 菌 组 成 的 混 合 菌 剂, 大 大 地 提 高 了 石 油 类 物 质 的 生 物 降 解 ( 刘 铮 等, 2008); 利 用 GC MS 数 据 分 析 降 解 菌 对 原 油 中 的 烷 烃 芳 香 烃 的 降 解 能 力 ( 何 丽 媛 等, 2010; 郭 娜 等, 2011);GC MS 联 用 法 用 于 含 油 污 泥 中 碳 氢 化 合 物 降 解 性 能 的 测 定 ( Lazar et al., 1999), 另 外,Ma 等 (2011) 对 降 解 菌 的 生 长 特 性, 降 解 菌 对 不 同 烃 类 的 利 用 能 力 及 添 加 淀 粉 和 葡 萄 糖 碳 源 对 降 解 率 的 影 响 行 进 了 研 究. 国 内 外 研 究 表 明, 石 油 降 解 菌 酶 的 活 性 ( Yan et al.,2013) 环 境 无 机 营 养 肥 料 微 生 物 的 类 型 等 对 油 污 染 场 地 的 修 复 起 到 重 要 作 用 ( Vasudevan et al., 2010). 利 用 石 油 地 质 中 石 油 族 全 组 分 进 行 微 生 物 降 解 分 析 是 一 种 独 特 的 角 度, 需 要 对 全 族 物 质 做 全 面 解 析, 前 面 所 述 研 究 中 对 有 对 正 构 烷 烃 和 姥 鲛 烷, 植 烷 的 降 解 研 究, 但 藿 烷, 甾 烷 族 成 分 的 图 谱 解 析 不 易 识 别, 且 含 量 低, 研 究 很 少. 笔 者 前 期 从 甘 肃 长 庆 油 田 油 污 土 壤 中 富 集 筛 选 出 5 株 降 解 石 油 的 菌 株, 对 其 进 行 了 鉴 定 及 油 污 土 壤 的 修 复 研 究 ( 陈 丽 华 等, 2012; 雒 晓 芳 等, 2012; 张 海 玲 等, 2012). 本 文 运 用 石 油 地 质 学 和 分 析 化 学 对 石 油 降 解 菌 降 解 石 油 烃 的 族 组 分 的 GC MS 指 纹 分 析 和 标 志 物 的 演 化 参 数 分 析, 揭 示 微 生 物 降 解 石 油 族 主 要 成 分 正 构 烷 烃 藿 烷 和 芳 烃 的 降 解 程 度 及 地 球 演 变 特 征, 从 而 对 菌 群 底 物 石 油 族 不 同 化 学 结 构 进 行 优 化 提 供 重 要 实 验 依 据, 同 时 对 降 解 过 程 中 的 生 物 演 化 从 地 球 化 学 的 角 度 进 行 了 机 理 分 析. 使 所 构 建 的 石 油 降 解 菌 群 对 底 物 利 用 达 到 优 化 效 果, 能 对 石 油 烃 进 行 最 彻 底 的 降 解, 以 提 高 菌 群 的 生 物 修 复 功 能. 2 实 验 部 分 (Experiments) 2.1 实 验 材 料 油 样 来 源 所 用 原 油 取 自 甘 肃 陇 东 地 区 西 峰 市 郊 油 井, 将 原 油 用 正 己 烷 ( 色 谱 纯 ) 溶 解, 然 后 水 浴 蒸 发 正 己 烷, 并 在 真 空 干 燥 箱 中 除 尽 残 留 正 己 烷, 得 到 标 准 油 样 品, 放 入 干 燥 器 中 备 用 菌 株 来 源 所 用 菌 种 为 本 实 验 室 分 离 保 存 ( 雒 晓 芳 等, 2012), 分 别 为 :A6 菌 株 属 于 铜 绿 假 单 胞 菌 (Pseudomonas aeruginosa) 菌 属,A5 菌 株 属 于 蒙 氏 假 单 胞 菌 (Pseudomonas monteilii) 菌 属,D4 菌 株 属 于 鲁 菲 不 动 杆 菌 (Acinetobacter lwoffii) 菌 属,F1 菌 株 属 于 黄 色 类 诺 卡 氏 菌 ( Nocardioides luteus) 菌 属,F2 菌 株 属 暗 黑 微 绿 链 霉 菌 ( Streptomyces atrovirens ) 菌 属 无 机 盐 培 养 基 NH 4 NO g L -1,K 2 HPO g L -1,KH 2 PO g L -1,MgSO 4 7H 2 O 0.1 g L -1, 无 水 CaCl g L -1,NaEDTA 2H 2 O 0.01g L -1,pH 值 为 实 验 方 法 试 样 处 理 将 5 种 菌 剂 F1 F2 A5 A6 D4 接 入 20 ml 无 机 盐 培 养 基 的 三 角 烧 瓶, 培 养 基 含 标 准 油 10 mg,28 下 培 养 7 d,15 d 后 取 出 加 入 10 ml 氯 仿, 超 声 破 乳 15 min, 萃 取 出 氯 仿 相, 水 浴 蒸 发 氯 仿, 再 将 残 油 准 确 称 量 后 定 容 10 ml, 即 为 GS MC 测 试 降 解 油 样. 将 不 添 加 菌 剂 的 标 准 油 作 为 对 照 组 GS MC 测 定 各 菌 株 降 解 石 油 各 组 分 含 量 降 解 油 样 各 组 分 分 析 条 件 为 : 气 化 温 度 260, 载 气 He, 柱 温 200, 柱 SE-30(50 m). 质 谱 条 件 为 : 电 子 能 量 70 ev, 质 量 范 围 40 ~ 450.GS MC 图 谱 图 解 析 时 从 总 离 子 流 图 中 提 取 正 构 烷 烃 藿 烷 芳 烃 系 列 物 质, 用 质 量 归 一 法 计 算 出 样 品 中 各 系 列 化 合 物 的 含 量. 在 石 油 混 合 物 组 分 中 分 子 量 相 同 物 质 的 比

3 126 环 境 科 学 学 报 36 卷 较多 但每个物质的结构不同 在 GC MS 离子源中 演化动 态 变 化 规 律 即 用 OEP w C 21 w 而出现各自的特征碎片离子 如正构烷烃的碎片离 演化参数反映各菌株对原油中正构烷烃演化降解 每个分子被电子流轰击打成碎片时 由于结构不同 子为 57 71 85 藿 烷 会 出 现 最 大 的 积 分 碎 片 峰 C 22 姥植比 w Pr w Ph 等生物降解标志物 的规律 191 甾烷的最大特征碎片为 217 α α 型结构 218 M 1 峰 β β 型结构 利用物质的特征碎片值可 3 1 1 正构烷烃的降解差异分析 原始油样与经 石油烃中正构烷烃 藿烷系列物质的降解率 R 15 d 后原油的降解率 从降解率折线图可以看出 7 中标准油各物质质量百分含量 M i 为第 7 15 d 残油 比 7 d 大 菌株在 7 d 主要利用中低碳数的正构烷 以从总离子流图中将同系列物质提取出来 计算方法如下 R M 1 M i M 1 式中 M 1 为对照组 中各物质质量百分含量 混合菌作用 7 15 d 的正构烷烃碳数分布均为 C 14 C 39 从 GC MS 图谱分析计算得到经菌剂作用 7 d 和 d 菌剂作用于原油降解不明显 而 15 d 的降解幅度 烃 而 15 d 菌株主要降解高碳数段 在 C 31 C 39 碳数 段 15 d 的降解均为正值 F2 A5 对高碳数正构烷烃 3 结果与讨论 Results and discussion 降解高达 60 以上 A5 菌 15 d 降解高达 67 58 说 3 1 石油降解菌对正构烷烃的降解 不同石油降解菌对石油中不同烃类的降解能 力不同 多数石油降解菌一般只能降解一种或几种 烃类 徐金兰等 2009 而中 长链正构烷烃能被大 多数石油降解菌所降解 研究在不同时间里各菌株 降解正构烷烃的降解率 及微生物对正构烷烃降解 明 7 d 以 前 降 解 菌 仍 处 于 适 应 阶 段 降 解 优 势 在 15 d更明显 7 15 d 的降解呈明显的互补规律 正构 烷烃各部分含量呈先增后减或先减后增的规律 奇 偶优势在 15 d 体现更明显 各菌株对正构烷烃的降解效果如图 1 所示 由 图 1 可 看 出 A5 和 A6 的 降 解 图 形 相 似 这 可 能 与 图 1 不同菌剂对正构烷烃的降解率 Fig 1 Degradation rate of N Alkanes by different bacteria

4 1 期 陈 丽 华 等 : 石 油 降 解 菌 对 石 油 烃 中 不 同 组 分 的 降 解 及 演 化 特 征 研 究 127 其 所 属 菌 属 相 似 有 关, 从 而 摄 取 的 碳 源 结 构 也 相 似 ( 崔 志 松 等,2010). 除 去 D4 菌 株, 其 它 菌 株 在 7 d 主 要 降 解 中 低 碳 数 正 构 烷 烃,15 d 以 降 解 高 碳 数 烷 烃 为 主, 而 D4 菌 株 降 解 情 况 与 其 它 菌 株 正 好 相 反. 降 解 结 果 使 中 间 碳 数 烷 烃 含 量 大 幅 增 加, 在 C 20 ~ C 24 间 出 现 降 解 低 谷. 而 对 于 混 合 菌 剂 H( 图 1f), 前 7 d 不 管 对 于 低 碳 数 还 是 高 碳 数 正 构 烷 烃 都 具 有 较 好 的 降 解 效 果, 但 15 d 的 降 解 以 高 碳 数 正 构 烷 烃 为 主, 整 个 石 油 烃 的 含 量 呈 下 降 趋 势. 由 此 可 见, 相 对 于 分 子 量 较 大 的 芳 香 烃 污 染 物 来 说, 微 生 物 降 解 正 构 烷 烃 相 对 容 易, 周 期 较 短 ( Douglas et al., 2012). 同 时, 正 构 烷 烃 降 解 后 的 产 物 也 为 微 生 物 提 供 充 分 可 利 用 的 碳 源, 更 有 利 于 微 生 物 的 生 长, 这 也 是 微 生 物 对 正 构 烷 烃 降 解 率 较 高 的 一 个 原 因 ( Dubinsky et al., 2013). 菌 株 Table 1 表 1 从 表 1 可 以 看 出, 原 始 油 样 和 经 菌 株 降 解 7 d 和 15 d 的 正 构 烷 烃 的 碳 数 分 布 相 同 均 为 C 14 ~ C 39, 经 各 种 菌 剂 作 用 后 正 构 烷 烃 的 主 峰 碳 明 显 前 移, 表 明 菌 剂 对 高 碳 数 正 构 烷 烃 具 有 选 择 性, 有 较 强 烈 的 去 甲 基 作 用 的 结 果 ( 陈 丽 华 等, 2012).15 d,f2 A5 混 合 菌 H 对 于 高 碳 数 段 的 正 构 烷 烃 降 解 率 高 达 60% 以 上, 最 高 为 A5 菌 剂 高 碳 数 降 解 率 为 67.58%, D4 菌 剂 降 解 低 碳 数 达 到 67.50%;7 d 中,A5 菌 剂 降 解 中 低 碳 数 正 构 烷 烃 最 高 为 13.77%,D4 降 解 高 碳 数 正 构 烷 烃 最 高 (32.22%); 表 明 A5 和 D4 菌 剂 对 于 正 构 烷 烃 降 解 表 现 较 优. 混 合 菌 对 于 正 构 烷 烃 的 降 解 率 要 高 于 各 个 单 菌 分 别 作 用, 菌 种 之 间 表 现 为 协 同 作 用, 菌 种 间 可 以 稳 定 共 存. 说 明 菌 种 合 理 混 合 有 利 于 石 油 降 解. 菌 株 对 不 同 碳 数 正 构 烷 烃 平 均 降 解 率 Different carbon number n Alkanes degradation rate by Strains C 14 ~ C 20 C 21 ~ C 30 C 31 ~ C 39 7 d 15 d 7 d 15 d 7 d 15 d F % % 0.60% 9.26% -6.71% 51.57% F % % 18.05% 0.80% % 63.81% A5 8.28% 27.68% 5.49% % -6.71% 67.58% A6-5.86% % 6.11% % -8.24% 45.25% D % 67.50% 7.89% % 32.22% 16.25% H -8.29% 12.25% 1.02% % 5.11% 66.16% 正 构 烷 烃 生 物 演 化 参 数 分 析 从 表 2 可 以 看 出, 原 始 油 的 成 熟 度 高, 经 菌 株 作 用 后 OEP 变 化 不 太 明 显, 但 原 始 油 样 的 OEP 值 多 数 大 于 经 菌 剂 作 用 7 d 的 原 油 样 品, 可 见 各 菌 株 在 7 d 降 解 正 构 烷 烃 时, 奇 数 碳 烷 烃 的 降 解 速 率 大 于 偶 数 碳 烷 烃 ; 而 从 15 d 的 OEP 值 可 看 出,F1 和 A6 样 品 的 OEP 值 与 原 始 油 量 相 比 分 别 为 和 1.067, 略 大 于 原 始 油 样 OEP 值. 除 F1 A6 菌 株 外, 其 它 菌 株 的 OEP 值 都 小 于 1, 且 长 期 的 OEP 值 均 比 短 期 的 小, 说 明 15 d 这 些 菌 剂 降 解 奇 数 碳 的 优 势 更 为 明 显. 表 2 正 构 烷 烃 生 物 演 化 参 数 值 Table 2 N Alkanes biological evolution parameter 烷 烃 主 峰 OEP w( C 21- ) / w( C 22+ ) w(pr) / w(ph) 7 d 15 d 7 d 15 d 7 d 15 d 7 d 15 d 原 油 nc 26 nc F1 nc 20,nC 26 nc F2 nc 20 nc A5 nc 26 nc A6 nc 23 nc D4 nc 20 nc F2 的 w( C 21- ) / w( C 22+ ) 值 在 7 d 和 15 d 都 是 最 大, 说 明 F2 菌 剂 对 高 碳 数 降 解 优 势 最 为 明 显, 这 与 表 1 的 结 果 相 一 致. D4 菌 剂 在 15 d 的 w( C 21- ) / w( C 22+ ) 值 大 幅 降 低 ( 15 d 的 值 为 0.265), 同 样 表 明 D4 菌 剂 没 有 强 烈 降 解 高 碳 数 烷 烃 的 特 征, 反 而 有 选 择 性 降 解 低 碳 数 烷 烃 的 能 力.

5 128 环 境 科 学 学 报 图 2 原油样和各菌剂 GC MS 总离子流图 Fig 2 Total ion GC MS chromatogram of crude oil sample and each bacteria 36 卷

6 1 期 陈 丽 华 等 : 石 油 降 解 菌 对 石 油 烃 中 不 同 组 分 的 降 解 及 演 化 特 征 研 究 129 由 表 2 可 以 看 出, 除 A6 降 解 15 d 油 样 姥 植 比 (0.99) 与 原 油 基 本 相 近 外, 其 它 菌 株 对 石 油 降 解 后, 其 w(pr) / w(ph) 比 值 均 大 于 原 油, 说 明 原 油 中 类 异 戊 二 烯 烷 烃 在 不 同 菌 剂 的 作 用 过 程 中, 均 发 生 了 明 显 的 降 解, 使 部 分 植 烷 脱 去 一 个 甲 基 转 化 为 姥 鲛 烷. 3.2 藿 烷 的 降 解 规 律 藿 烷 的 主 要 成 分 为 萜 类 化 合 物, 包 括 三 环 二 萜 烷 和 五 环 三 萜 烷 化 合 物, 藿 烷 不 是 由 生 物 体 直 接 合 成, 而 是 由 死 亡 生 物 体 经 地 球 化 学 过 程 演 化 而 来. 其 微 生 物 转 化 涉 及 羟 基 化 环 氧 化 脱 氢 等 多 种 反 应 类 型. 在 菌 剂 的 作 用 下, 环 氧 化 分 为 两 种, 一 种 氧 化 酶 先 将 其 氧 化 为 环 醇, 接 着 脱 氢 形 成 环 酮 ; 另 一 种 氧 化 酶 再 氧 化 环 酮, 环 断 开, 之 后 深 入 降 解 ( 杨 丽 芹 等,2011). 羟 基 化, 在 化 合 物 的 非 羟 基 化 位 点 上 引 入 一 个 羟 基 能 增 强 其 生 物 学 活 性 ( 张 翔 等,2010). 藿 烷 相 对 稳 定, 常 用 藿 烷 作 为 一 个 可 靠 的 指 标 来 评 估 大 多 数 野 外 条 件 下 的 生 物 降 解 ( Venosa et al., 1997). 目 前 研 究 表 明,C 30 藿 烷 及 其 相 关 同 系 物 ( 如 C 31 ~ C 35 藿 烷 ) 在 一 定 的 实 验 条 件 下 可 被 微 生 物 降 解 菌 降 解 ( Bost et al., 2001; Frontera Suau et al., 2002; Huesemann et al., 2003). 本 节 用 各 菌 株 降 解 藿 烷 各 物 质 相 对 原 油 的 降 解 率, 分 析 各 菌 株 降 解 藿 烷 的 不 同, 用 生 物 标 志 物 Ts / Tm C 31 和 C 31 的 αβ-22s / 22(S+R) hop / 烷 烃 比 值 作 为 生 物 演 化 石 油 过 程 中 藿 烷 降 解 和 构 型 转 化 的 依 据. 其 中 :Ts / Tm 是 石 油 地 质 领 域 常 用 的 有 机 质 演 化 程 度 参 数,Ts 为 18α( H) 三 降 藿 烷,Tm 为 17α(H) 三 降 藿 烷. 在 生 物 体 原 生 质 中 只 有 Tm 构 型 是 没 有 Ts 构 型 的, 当 这 类 生 物 进 入 地 质 体 后 在 热 作 用 微 生 物 作 用 压 力 及 矿 物 催 化 作 用 下 三 降 藿 烷 将 由 Tm 立 体 构 型 逐 渐 向 更 稳 定 的 Ts 立 体 构 型 转 化, 因 而 Ts / Tm 比 值 越 大 既 反 映 了 有 机 质 受 外 作 用 力 的 程 度 越 强, 研 究 样 品 主 要 改 变 的 外 作 用 力 是 混 合 菌 作 用, 所 以 Ts / Tm 比 值 越 大 则 混 合 菌 对 有 机 质 的 降 解 越 强 烈. 大 于 31 个 碳 的 17α( H) 21β( H) 构 型 的 藿 烷 其 第 22 位 碳 原 子 成 为 手 性 碳, 因 而 会 出 现 一 对 镜 像 异 构 体 (22S+22R). 由 于 在 生 物 体 中 22R 异 常 高 而 22S 很 低, 通 常 将 22R 构 型 称 作 生 物 构 型 将 22S 构 型 称 作 生 地 质 构 型. 当 这 类 生 物 进 入 地 质 体 后 在 热 作 用 微 生 物 作 用 压 力 及 矿 物 催 化 等 外 力 作 用 下 22R 将 逐 渐 向 22S 转 化, 其 转 化 终 点 值 为 22S 22R = 6 4. 地 球 化 学 研 究 中 常 用 C 31 αβ - 22S / 22( S +R) 和 C 32 αβ 22S / 22(S+R) 作 为 判 识 有 机 质 手 性 构 型 演 化 程 度 的 参 数. 藿 烷 / 正 构 烷 烃 比 值 是 样 品 中 藿 烷 系 列 的 相 对 丰 度 与 正 构 烷 烃 系 列 相 对 丰 度 的 比 值, 用 来 研 究 原 油 遭 受 不 同 细 菌 作 用 15 d 后, 藿 烷 系 列 与 正 构 烷 烃 系 列 的 降 解 速 率 特 征 藿 烷 的 降 解 差 异 分 析 各 菌 对 藿 烷 的 降 解 率 如 图 3 所 示, 降 解 趋 势 平 缓, 没 有 明 显 被 降 解 的 个 物. 但 芒 柄 花 根 烷 降 莫 烷 γ 蜡 烷 二 升 藿 烷 三 升 藿 烷 四 升 藿 烷 五 升 藿 烷 的 降 解 均 达 到 20% 以 上. A6 菌 种 除 了 17α( H) 21β( H) 22S 四 升 藿 烷 与 17α( H)21β( H) 22R 四 升

7 130 环 境 科 学 学 报 36 卷 图 3 不同菌株作用下藿烷的降解率 备注 峰号代表的物质 1 18α H 22 29 30 三降藿烷 Ts 2 芒柄花根烷 3 17α H 22 29 30 三 降藿烷 Tm 4 降羽扇烷 5 17α H 21β H 30 降藿烷 6 重排 30 降藿烷 7 羽扇烷 8 17β H 21α H 30 降莫烷 9 17α H 21β H 藿烷 10 五环三萜烷 11 五环三萜烷 12 17β H 21α H 莫烷 13 17α H 21β H 22S 31 升藿烷 14 17α H 21β H 22R 31 升藿烷 15 γ 蜡烷 16 17α H 21β H 22S 31 32 二升藿烷 17 17α H 21β H 22R 31 32 二升藿烷 18 17α H 21β H 22S 31 32 33 三升藿烷 19 17α H 21β H 22R 31 32 33 三升藿烷 20 17α H 21β H 22S 31 32 33 34 四升藿烷 21 17α H 21β H 22R 31 32 33 34 四升藿烷 22 17α H 21β H 22S 31 32 33 34 35 五升藿烷 23 17α H 21β H 22R 31 32 33 34 35 五升藿烷 Fig 3 Degradation rate of hopane by different bacteria 藿烷外 对于其他藿烷降解率都较高 降解平均 A5 华等 2012 S 构型化合物更稳定 所以降解率低 和高碳数的藿烷要彻底 各菌剂 7 d 和 15 d 藿烷降 趋势 菌种在前期对于中间碳数的藿烷降解要比低碳数 解趋势基本一致 说明藿烷的降解主要表现为手性 R 构型物质不稳定 降解率高 呈现出波浪状的降解 图 4 为 A6 降解后的藿烷 m z191 质量色谱 碳向稳定构型转化 但藿烷的降解幅度在 15 d 时比 图 本节仅以 A6 菌株为例 其他菌株霍烷图因篇幅 和 R 构型的交替出现 细菌作用促使五环三萜类化 好的佐证图 4 的结果 7 d 高些 藿烷的降解波动明显 是由于系列物质 S 合物的手性碳 R 构型向更稳定的 S 构型转化 陈丽 有限 在此不一一列举 从 A6 的质量色谱图可以更 图 4 原油和 A6 降解后的藿烷 m z191 质量色谱图 Fig 4 TIC m z191 of hopane degraded by A6 and petroleum 3 2 2 藿烷生物演化参数分析 原油被 5 种菌剂 作用 7 d 原油的藿烷系列碳数分布相同 均为 C 27 样为成熟质 受外力作用变化不会很大 经各菌株降 解后样品的 C 31 αβ 22S C 31 αβ 22 S R 和 C 32 αβ 的 17α H 21β H 构型的藿烷 其第 22 位碳原子 22S C 31 αβ 22 S R 比值均大于原始油样值 且油 样经 5 种菌剂 7 d 降解后 C 31 αβ 22S C 31 αβ 22 S 22R 如 表 3 所 示 原 始 油 样 C 31 αβ 22S C 31 αβ 22 到转化终点 由此可见 该 5 种菌剂能促使五环三萜 C 35 C 28 缺失 主峰均为 C 30 αβ 藿烷 大于 31 个碳 成为 手 性 碳 因 而 会 出 现 一 对 镜 像 异 构 体 22S S R 和 C 32 αβ 22S C 31 αβ 22 S R 比 值 分 别 为 0 591和 0 577 接近转化终点值 0 600 所以原石油 R 和 C 32 αβ 22S C 31 αβ 22 S R 比值均有一项达 类化合物的手性碳 R 构型向更稳定的 S 构型转化 短期内就可以达到转化终点

8 1 期 陈 丽 华 等 : 石 油 降 解 菌 对 石 油 烃 中 不 同 组 分 的 降 解 及 演 化 特 征 研 究 131 样 名 Table 3 表 3 藿 烷 生 物 演 化 参 数 ( 质 量 分 数 ) Hopane biological evolution parameter 碳 数 分 布 C 31 αβ 22S / 22( S+R) C 32 αβ 22S / 22( S+R) 原 油 C 27 ~ C F1 oil C 27 ~ C F2 oil C 27 ~ C A5 oil C 27 ~ C A6 oil C 27 ~ C D4 oil C 27 ~ C 在 实 验 中 通 过 添 加 菌 剂 提 供 外 作 用 力, 可 见 w(ts) / w(tm) 比 值 越 大 则 说 明 菌 剂 对 有 机 质 的 降 解 越 强 烈. 从 表 4 可 以 看 出,5 种 菌 剂 降 解 石 油 的 w(ts) / w(tm) 比 值 均 大 于 原 始 油 样 的 值, 且 菌 剂 在 短 期 内 对 藿 烷 的 降 解 较 明 显.A5 菌 剂 对 藿 烷 降 解 的 w(ts) / w(tm) 比 值 最 大 (0.966), 对 藿 烷 的 降 解 程 度 最 强, 转 化 最 彻 底. 样 名 表 4 藿 烷 转 化 参 数 ( 单 位 : 质 量 分 数 ) Table 4 w(ts) / w(tm) Hopane degradation parameter 样 名 w( 藿 烷 ) / w( 正 构 烷 烃 ) 原 油 原 始 油 样 F1 oil F1 oil F2 oil F2 oil A5 oil A5 oil A6 oil A6 oil D4 oil D4 oil 从 表 4 中 w( 藿 烷 ) / w( 正 构 烷 烃 ) 比 值 可 看 出,A6 F1 菌 剂 的 该 比 值 明 显 大 于 原 始 油 样 的 0.394, 这 两 种 菌 剂 作 用 原 油 时 正 构 烷 烃 的 降 解 优 势 明 显 大 于 藿 烷 系 列, 而 A5 D4 和 F2 的 w( 藿 烷 ) / w( 正 构 烷 烃 ) 比 值 分 别 为 和 0.215, 明 显 小 于 原 始 油 样 的 0.394, 这 3 种 菌 剂 作 用 原 油 时, 藿 烷 的 降 解 速 率 明 显 大 于 正 构 烷 烃 系 列. 各 菌 剂 降 解 藿 烷 优 势 表 现 为 A5>D4>F2>F1>A 芳 香 烃 的 降 解 规 律 陇 东 原 油 芳 烃 主 要 含 萘 菲 联 苯 和 三 芳 甾 烷 等 5 个 系 列, 分 别 含 2 ~ 4 个 芳 核 的 稠 环 芳 烃, 以 及 含 五 个 芳 核 的 α 苯 并 芘. 芳 香 烃 是 重 要 的 原 油 组 分, 相 对 于 烷 烃 来 说 稍 难 降 解, 芳 香 烃 的 有 氧 代 谢 必 须 有 分 子 氧 参 加, 同 时 需 要 加 氧 酶 的 催 化. 细 菌 通 过 过 氧 化 物 酶 将 分 子 氧 的 两 个 氧 原 子 结 合 进 芳 香 烃 中, 形 成 顺 式 构 型 的 二 氢 二 醇, 顺 式 二 氢 二 醇 在 另 外 一 种 过 氧 化 物 酶 的 催 化 下 将 芳 香 环 破 裂 成 邻 苯 二 酚. 与 细 菌 相 反, 真 菌 通 过 催 化 单 氧 化 酶 和 环 氧 化 物 水 解 酶 使 芳 烃 转 化 为 反 式 构 型 二 氢 二 醇 ( 张 翔 等,2010). 在 生 物 质 转 化 中, TMCH / CH 参 数 反 映 了 (CH) 系 列 的 去 甲 基 效 应 的 程 度, 该 值 越 小 则 表 明 分 子 芳 香 环 上 的 甲 基 取 代 基 的 去 甲 基 效 应 越 强 烈.TeMN / N 参 数 反 映 了 萘 ( N) 系 列 去 甲 基 效 应 的 程 度, 该 值 越 小 则 表 明 萘 环 上 甲 基 取 代 基 的 去 甲 基 效 应 越 强 烈. 芳 烃 / 正 构 烷 烃 是 用 来 研 究 原 油 在 不 同 细 菌 时 间 作 用 下, 稠 环 芳 烃 与 烷 烃 的 降 解 速 率 或 降 解 程 度 特 征. 石 油 样 品 中 检 测 出 (CH) 甲 基 (MCH) 二 甲 基 ( DMCH) 和 三 甲 基 ( TMCH), 以 的 相 对 丰 度 最 高 为 特 征. 表 5 显 示 原 油 的 TMCH / CH 为 0.500, 在 7 d 各 菌 剂 的 降 解 当 中, F2 A5 D4 的 TMCH / CH 不 变 仍 为 0.500, 对 芳 烃 的 降 解 效 果 不 明 显, 而 菌 剂 F1 A6 的 TMCH / CH 分 别 为 , 表 明 对 芳 烃 具 有 降 解 效 应. 表 5 芳 香 烃 的 降 解 参 数 ( 质 量 分 数 ) Table 5 Aromatic hydrocarbon degradation parameter 样 名 丰 度 最 高 组 分 DMP / P TeMP / P 9 MP / MP TMCH / CH TeMN / MN 原 油 DMP F1 oil DMP F2 oil DMP A5 oil DMP A6 oil DMP D4 oil DMP H oil DMP 萘 是 含 有 两 个 芳 香 环 的 稠 环 芳 烃, 研 究 的 样 品 中 检 测 出 : 甲 基 萘 ( MN) 二 甲 基 萘 ( DMN) 三 甲 基

9 132 环 境 科 学 学 报 36 卷 萘 TMN 和四甲基萘 TeMN 以四甲基萘的相对 择性降解高碳数正构烷烃的特点 而 D4 菌株相对 5 200 各菌剂的 TeMN MN 值均比原油的小 表明 2 藿烷的演化分析可以看出 所筛选的 5 种菌 丰度最高为特征 表 5 显示原油的 TeMN MN 值为 具有选择低碳数正构烷烃降解的特点 几种菌株对萘环上的甲基均有去甲基化效应 其中 剂均能促使五环三萜类化合物的手性碳 R 构型向 效应最强 这也与文献报道假单胞菌物种具有降解 到转化终点 各菌剂降解藿烷优势表现为 A5 D4 F2 的去甲基化效应最弱 而 A5 对原油的去甲基化 各种石油化合物能力 包括脂族和芳族化合物相一 致 Deppe et al 2005 Lo Giudice et al 2010 Whyte et al 1997 Table 6 Aromatic hydrocarbon biological evolution parameter 萘 正构烷烃 菲 正构 烷烃 原油 15 F1 oil 0 167 0 074 15 A5 oil 0 206 0 048 15 D4 oil 15 F2 oil 15 A6 oil 0 394 0 064 0 285 0 023 正构 烷烃 F2 F1 A6 3 菌剂在对芳香烃的降解中表现出强烈的去 甲基化作用 在对菲和 解优势最明显 表 6 芳香烃的演化参数 质量分数 名称 更稳定的 S 构型转化 7 d 对石油的降解就可以达 藿烷 正构烷烃 0 091 0 028 0 119 0 011 的降解中 A5 和 D4 菌降 综上所述 这 5 株菌在对石油主要成分正构烷 烃 藿烷 芳香烃的降解中 F2 A5 和 D4 菌株表现 优于其他菌株 同时标志物演化参数进一步揭示了 0 394 物质结构的降解演化特征 其演化参数值与降解率 0 215 的降解差异 所以 在石油污染的微生物修复应用 0 464 0 111 0 541 0 158 从表 6 中看出 15 d 菌剂降解油样中未检测出 结果保持一致性 也进一步佐证和解释了不同菌株 中 利用各种标志物反映菌株对原油中正构烷烃 藿烷 芳香烃的降解差异和演化特征具有更清晰地 辨识度 同时可以帮助我们对降解中各成分结构的 演化有更深入的认识 在石油修复过程中 对合理 萘 证明萘在 15 d 前已经被菌剂的强烈去甲基反应 利用菌株或者混合菌株的选择上更具有科学性 于原油样的 0 167 值 表明这 3 种细菌作用原油时 责任作者简介 陈丽华 1972 女 博士 教授 从事土壤 降解完全 而 F1 F2 A6 的菲 正构烷烃比值明显大 正构烷烃的降解速率明显大于菲系列 但 D4 A5 的 菲 正构烷烃比值明显小于原油样的值 表明这 2 种 菌作用原油时菲系列的降解速率较正构烷烃快 同 理 正构烷烃比值中 D4 A5 F2 均小于原油样的 值 表明这 3 种菌降解原油时正构烷烃的降解速率 明显小于 系列 从各参数的综合比较可以看出 A5 D4 菌剂对芳香烃有较好的降解优势 4 结论 Conclusions 通过微生物降解石油族主要成分正构烷烃 藿 烷和芳烃的降解程度及地球演变特征分析 可以看 出各菌对石油族重要组分 正构烷烃 藿烷 芳 香烃具有不同的降解程度和演化特征 1 各菌对石油族成分中正构烷烃的降解最主 要 表现为 7 d 与 15 d 的降解呈明显的互补规律 即 7 d 到 15 d 正构烷烃各物质含量呈先增后减或先减 后增的规律 F2 A5 对高碳数正构烷烃降解率高达 60 以上 在降解菌中占据优势 F2 A5 和 D4 菌株 15 d 时 OEP 值说明他们后期降解奇数碳优势更为 明显 w C 21 w C 22 值表明 F2 菌株具有选 石油污染机理与修复研究 E mail 673126749 qq com 参考文献 References Bost F D Frontera Suau R McDonald T J et al 2001 Aerobic biodegradation of hopanes and norhopanes in Venezuelan crude oil J Org Geochem 32 105 114 陈丽华 马金珠 雒晓芳 等 2012 添加混合菌剂对石油污染土壤 的降解 J 中南大学学报 43 4581 4589 Deppe U Richnow H H Michaelis W et al 2005 Degradation of crude oil by an arctic microbial consortium J Extremophiles 9 6 461 470 Douglas G S Hardenstine J H Liu B et al 2012 Laboratory and field verification of a method to estimate the extent of petroleum biodegradation in soil J Environ Sci Techno 46 8279 8287 Dubinsky E A Conrad M E Chakraborty R et al 2013 Succession of hydrocarbon degrading bacteria in the aftermath of the deepwater horizon oil spill in the gulf of mexico J Environ Sci Technol 47 10860 10867 Frontera Suau R Bost F D McDonald T J et al 2002 Aerobic biodegradation of hopanes and other biomarkers by crue oil degrading enrichment cultures J Environ Sci Technol 36 4585 4592 郭娜 李志敏 叶勤 2011 烷烃降解菌的筛选 鉴定及优势菌株的 降解特性 J 应用与环境生物学报 17 4 572 576

10 1 期 陈 丽 华 等 : 石 油 降 解 菌 对 石 油 烃 中 不 同 组 分 的 降 解 及 演 化 特 征 研 究 133 韩 慧 龙, 陈 镇, 刘 铮, 等 真 菌 细 菌 协 同 修 复 石 油 污 染 土 壤 的 场 地 试 验 [J]. 环 境 科 学, 29(2): 何 丽 媛, 党 志, 唐 霞, 等 混 合 菌 对 原 油 的 降 解 及 其 降 解 性 能 的 研 究 [J]. 环 境 科 学 学 报, 30(6): Huesemann M H, Hausmann T S, Fortman T J Biodegradation of hopane prevents use as conservative biomarker during bioremediation of PAHs in petroleum contaminated soils [J]. Biorem. 7: Kishore E D, Ashis K M Crude petroleum oil biodeg radation efficiency of Bacillus subtilis and pseudomonas aeruginosa strains isolated from a petroleum oil contami nated soil from North East India [ J]. Bioresource Tech nology, 98(7): Lazar I, Dobrota S, Voicu A, et al Microbial degradation of waste hydrocarbons in oily sludge from some romanian oil fields [ J]. Pet Sci Eng, 1 3: Lo G A, Bruni V, De Domenico M, et al Psychrophiles cold Adapted hydrocarbon degrading microorganisms [ M]. In Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology, Timmi K N, Ed, Springer Verlag: Heidelberg, Lu L, Huggins T, Jin S, et al Microbial metabolism and community structure in response to bioelectrochemically enhanced remediation of petroleum hydrocarbon contaminated soil [ J ]. Environ Sci Technol, 48: 雒 晓 芳, 陈 丽 华, 王 冬 梅, 等 石 油 降 解 菌 株 的 分 离 鉴 定 及 降 油 特 性 [J]. 微 生 物 学 杂 志, 32(5): Ma X, Hou X, Chen J, et al The screening and degradation of oil degrading bacteria from the crude oil contaminated sites [ C]. Environment and Transportation Engineering, RSETE 2011 Proceedings, ,DOI: / RSETE Nadim F, Hoag G E, Liu S, et al Detection and remediation of soil and aquifer systems contaminated with petroleum products: an overview [ J ]. Journal of Petroleum Science and Engineering, (26): Vasudevan N, Rajaram P Bioremediation of oil sludge contaminated soil [ J ]. Environment International, 26 ( 5 ): Venosa A D, Suidan M T, King D, et al Use of hopane as a conservative biomarker for monitoring the bioremediation effectiveness of crude oil contaminating a sandy beach [ J]. J Ind Microbiol Biotechnol, 18: Whyte L G, Bourbonniere L, Greer C W Biodegradation of petroleum hydrocarbons by psychrotrophic Pseudomonas strains possessing both alkane ( alk) and naphthalene ( nah ) catabolic pathways [ J]. Appl Environ Microbiol, 63(9): 徐 金 兰, 黄 廷 林, 唐 智 新, 等 石 油 污 染 土 壤 生 物 修 复 高 效 菌 的 降 解 特 性 [J]. 石 油 学 报, 25: Yan S, Wang Q, Qu L, et al Characterization of oil degrading bacteria from oil contaminated soil and activity of their enzymes [J]. Biotechnology and Biotechnological Equipment, 27(4): 杨 丽 芹, 蒋 继 辉 微 生 物 对 石 油 烃 类 的 降 解 机 理 [ J]. 油 气 田 环 境 保 护, 23(2): 张 海 玲, 周 立 辉, 陈 丽 华, 等 修 复 黄 土 塬 区 石 油 污 染 土 壤 的 微 生 物 混 合 菌 剂 及 修 复 方 法 [P]. 中 国, 张 翔, 胡 昌 华 二 萜 类 化 合 物 微 生 物 转 化 研 究 [J]. 化 学 工 程 与 装 备, 38(4): 张 子 间, 刘 勇 弟, 孟 庆 梅, 等 微 生 物 降 解 石 油 烃 污 染 物 的 研 究 进 展 [ J]. 化 工 环 保, 29(3):

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