Pall L ife Sciences

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1 颇 尔 实 验 室 转 印 膜 使 用 手 册 颇 尔 过 滤 器 ( 北 京 ) 有 限 公 司

2 Pall L ife Sciences

3 目 录 Contents 颇 尔 生 命 科 学 的 膜 产 品 01 Biodyne 尼 龙 膜 01 BioTrace NT 膜 01 颇 尔 PVDF 膜 01 UltraBind 膜 01 膜 选 择 指 南 02 膜 处 理 的 普 遍 建 议 04 核 酸 转 移 用 溶 液 05 核 酸 转 移 的 流 程 05 用 Biodyne 膜 进 行 DNA 点 杂 交 05 用 Biodyne 膜 转 移 DNA(Southern Blot) 06 电 泳 准 备 转 移 的 凝 胶 06 颇 尔 改 进 碱 转 移 法 06 用 Biodyne 膜 转 移 RNA(Northern Blot) 07 用 Biodyne A 膜 影 印 培 养, 克 隆 挑 选 和 噬 菌 斑 挑 选 07 用 Biodyne A 膜 挑 选 克 隆 和 噬 菌 斑 07 用 Biodyne A 膜 影 印 培 养 和 扩 增 07 Biodyne 膜 的 固 定 过 程 08 Biodyne 膜 的 杂 交 过 程 08 预 杂 交 08 杂 交 08 杂 交 溶 液 08 杂 交 后 的 漂 洗 09 放 射 自 显 影 09 重 新 杂 交 09 甲 酰 胺 洗 脱 (DNA 转 移 ) 09 用 煮 沸 的 SDS 洗 脱 10 碱 法 洗 脱 10 甲 酰 胺 洗 脱 (RNA 转 移 ) 10 问 题 解 答 指 南 - 核 酸 11 蛋 白 的 转 移 和 固 定 12 用 BioTraceNT 膜 和 PVDF 膜 蛋 白 转 移 (Western 杂 交 ) 12 蛋 白 转 移 和 固 定 使 用 的 溶 液 12 转 移 过 程 13 免 疫 检 测 的 一 般 流 程 13 用 碱 性 磷 酸 酶 和 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲 哚 基 磷 酸 / 硝 基 四 氮 唑 蓝 (BCIP/NBT) 检 测 13 用 辣 根 过 氧 化 物 酶 和 二 氨 基 联 苯 胺 检 测 13 用 辣 根 过 氧 化 物 酶 和 氯 奈 检 测 14 酰 胺 黑 染 色 14 胶 体 金 染 色 14 考 马 斯 亮 蓝 染 色 14 Ponceau S Reversible Straining 14 问 题 解 答 指 南 - 蛋 白 转 移 15 BiodyneC 型 膜 的 活 化 16 氰 尿 酰 氯 (cyanuric chloride) 活 化 16 DCCD 二 环 己 基 碳 二 亚 胺 (dicyclohexylcarbodiimide) 活 化 16 戊 二 醛 (glutaraldyhyde) 活 化 16 把 蛋 白 质 固 定 到 UltraBind 膜 17 湿 点 法 固 定 17 灌 流 法 固 定 (Slot Blotting) 17 封 闭 和 检 测 的 建 议 17 问 题 解 答 指 南 -UltraBind 膜 18 参 考 资 料 19 其 他 可 能 用 到 的 产 品 19 Biodyne 转 印 膜 20 BioTrace TM NT 纯 硝 酸 纤 维 素 转 印 膜 22 FluoroTrans PVDF 膜 23 BioTrace TM PVDF 转 印 膜 24

4 颇 尔 生 命 科 学 的 膜 产 品 Biodyne 尼 龙 膜 Biodyne 尼 龙 6,6 膜 提 供 了 出 色 的 分 辨 率, 高 敏 感 性 和 低 背 景 Biodyne 膜 生 产 出 来 就 是 亲 水 的, 不 需 要 提 前 润 湿 它 们 能 达 到 严 格 的 分 子 生 物 学 应 用 的 标 准, 比 如 法 医 学 检 测 当 用 于 多 次 的 杂 交, 洗 脱 和 重 新 杂 交, 这 些 膜 不 会 皱 缩, 开 裂 或 撕 裂 能 提 供 四 种 不 同 的 化 学 表 面, 用 于 不 同 的 应 用 ( 更 多 信 息 见 选 择 图 表 ) Biodyne A 膜 是 一 种 不 带 电 的 尼 龙 6,6 膜 它 具 有 对 生 物 分 子 高 结 合 容 量, 提 供 高 度 敏 感 的 核 酸 的 截 留 特 别 适 用 于 化 学 发 光 检 测 系 统 或 者 其 它 的 背 景 成 为 问 题 的 系 统 Biodyne B 膜 的 多 孔 表 面 分 布 着 高 密 度 的 四 铵 基 基 团, 使 它 带 有 正 电 这 种 正 电 荷 可 以 在 宽 的 ph 范 围 内 维 持 提 高 了 核 酸 的 离 子 结 合 力, 使 其 对 快 速 核 酸 转 移 技 术 很 理 想 除 此 之 外, 这 一 强 的 结 合 使 膜 适 合 于 长 时 间 的 转 移 过 程, 而 没 有 核 酸 从 膜 上 扩 散 的 风 险 Biodyne B 膜 适 于 高 敏 感 的 检 测, 对 使 用 放 射 性 探 针 很 理 想 Biodyne Plus 膜 像 Biodyne B 膜 一 样, 也 含 有 分 布 有 高 密 度 的 四 级 铵 基 基 团 的 多 孔 表 面 Biodyne Plus 膜 应 该 应 用 于 非 放 射 性 的 检 测 系 统, 这 种 系 统 会 在 Biodyne B 型 膜 上 留 下 高 背 景 Biodyne Plus 膜 在 这 些 系 统 里 常 常 有 比 Biodyne A 膜 更 好 的 敏 感 性 Biodyne C 膜 是 一 种 带 负 电 的 具 有 分 布 有 高 密 度 羧 基 基 团 的 多 孔 表 面 的 膜 这 种 膜 可 以 通 过 与 这 些 基 团 偶 联 反 应 衍 生 来 它 对 于 可 逆 点 杂 交 和 亲 和 纯 化 应 用 很 理 想 BioTrace TM NT 膜 BioTrace NT 膜 由 纯 的, 无 支 持 的 硝 酸 纤 维 素 构 成 它 的 强 拉 伸 强 度 使 它 相 比 与 别 的 牌 子 的 硝 酸 纤 维 素 膜 撕 裂 和 开 裂 的 可 能 性 更 小 此 膜 对 蛋 白 和 核 酸 都 具 有 高 的 结 合 容 量, 对 于 克 隆 / 噬 菌 斑 挑 选 和 蛋 白 的 转 移 很 理 想 颇 尔 PVDF 膜 PVDF( 聚 偏 氟 乙 烯 ) 膜 是 多 孔 疏 水 膜, 可 结 合 蛋 白 和 核 酸, 但 主 要 用 于 蛋 白 的 固 定 和 检 测 BioTrace PVDF 膜 在 化 学 发 光 和 比 色 法 检 测 系 统 中 表 现 特 别 好 它 高 度 地 抗 有 机 溶 剂 和 亲 水 溶 液 所 有 的 蛋 白 转 移 都 可 用 BioTrace PVDF 膜 FluoroTrans 蛋 白 结 合 力 极 高 ( 通 过 疏 水 相 互 作 用 ),N 端 蛋 白 测 序 和 免 疫 检 测 western 转 移 时 推 荐 使 用 FluoroTrans W 膜 是 最 适 用 于 Western 检 测 的 滤 膜, 该 膜 的 蛋 白 检 测 灵 敏 度 极 高, 背 景 低, 蛋 白 熔 穿 低 FluoroTrans W 膜 可 以 和 所 有 总 蛋 白 染 色 兼 容 并 适 用 于 免 疫 检 测 方 法 UltraBind TM 膜 UltraBind( 改 性 聚 醚 砜 ) 膜 含 有 活 性 的 乙 醛 基 团, 在 使 用 前 不 需 要 特 殊 的 预 处 理 蛋 白 质 和 多 肽 通 过 自 由 的 氨 基 与 膜 上 的 乙 醛 基 团 反 应 能 够 共 价 连 接 到 膜 该 膜 对 于 固 相 的 酶 联 免 疫 反 应 十 分 理 想 - 1 -

5 膜 选 择 指 南 Pall Life Sciences 提 供 用 于 转 移 和 固 定 的 不 同 类 型 的 膜, 这 些 膜 可 以 用 于 核 酸 和 蛋 白 应 用, 并 适 用 于 放 射 性 或 非 放 射 性 检 测 系 统 Biodyne A Biodyne B 描 述 不 带 电 尼 龙 6,6 带 正 电 的 尼 龙 6,6 最 佳 用 途 同 样 适 用 于 优 点 克 隆 / 噬 菌 体 挑 选 DNA 和 RNA 转 移 DNA 指 纹 ( 非 放 射 性 ) ELISA 核 酸 点 / 狭 缝 杂 交 影 印 培 养 高 灵 敏 低 背 景 DNA 和 RNA 转 移 多 次 反 复 杂 交 DNA 指 纹 核 酸 点 / 狭 缝 杂 交 基 因 探 针 分 析 克 隆 / 噬 菌 体 挑 选 影 印 培 养 结 合 作 用 疏 水 和 静 电 疏 水 和 静 电 极 高 灵 敏 在 很 宽 的 PH 值 内 带 正 点 核 酸 固 定 烘 烤 和 紫 外 交 联 烘 烤 和 紫 外 交 联 检 测 方 法 放 射 性 标 记 探 针 酶 联 抗 体 化 学 发 光 和 色 原 底 物 放 射 性 标 记 探 针 酶 联 抗 体 化 学 发 光 和 色 原 底 物 Biodyne Plus Biodyne C 描 述 带 正 电 的 尼 龙 6,6 带 负 电 的 尼 龙 6,6 最 佳 用 途 同 样 适 用 于 优 点 结 合 作 用 DNA 和 RNA 转 移 多 次 反 复 杂 交 核 酸 点 / 狭 缝 杂 交 克 隆 / 噬 菌 体 挑 选 影 印 培 养 DNA 指 纹 高 灵 敏 低 背 景 带 正 电 疏 水 和 静 电 反 向 点 杂 交 蛋 白 固 定 亲 和 纯 化 ELISA 在 很 宽 的 PH 值 内 带 负 点 表 面 的 羟 基 可 以 衍 生 疏 水 和 静 电 衍 生 后 共 价 结 合 - 2 -

6 核 酸 固 定 烘 烤 和 紫 外 交 联 衍 生 后 不 需 要 检 测 方 法 放 射 性 标 记 探 针 酶 联 抗 体 化 学 发 光 和 色 原 底 物 酶 联 抗 体 化 学 发 光 和 色 原 底 物 BioTrace NT BioTrace PVDF 描 述 纯 硝 酸 纤 维 素 膜 PVDF 膜 最 佳 用 途 蛋 白 转 移 蛋 白 转 移 同 样 适 用 于 核 酸 检 测 蛋 白 点 / 狭 线 杂 交 优 点 高 灵 敏 低 背 景 结 合 作 用 疏 水 和 静 电 疏 水 固 定 方 法 检 测 方 法 Western 转 移 点 / 狭 线 杂 交 烘 烤 和 紫 外 交 联 ( 对 于 核 酸 ) 放 射 性 标 记 探 针 直 接 染 色 荧 光 检 测 酶 联 抗 体 化 学 发 光 色 原 底 物 极 高 灵 敏 低 背 景 化 学 兼 容 性 好 高 强 度 Western 转 移 点 / 狭 线 杂 交 直 接 染 色 酶 联 抗 体 化 学 发 光 色 原 底 物 FluoroTrans FluoroTrans W 描 述 PVDF PVDF 最 佳 用 途 N 端 蛋 白 测 序 蛋 白 转 移 同 样 适 用 于 免 疫 检 测 的 蛋 白 转 移 蛋 白 点 / 狭 线 杂 交 优 点 高 结 合 力 低 熔 穿 化 学 兼 容 性 好 高 强 度 结 合 作 用 疏 水 疏 水 极 高 灵 敏 低 背 景 低 熔 穿 高 结 合 力 化 学 兼 容 性 好 高 强 度 - 3 -

7 固 定 方 法 检 测 方 法 Western 转 移 点 / 狭 线 杂 交 酶 联 抗 体 化 学 发 光 色 原 底 物 Western 转 移 点 / 狭 线 杂 交 直 接 染 色 酶 联 抗 体 化 学 发 光 色 原 底 物 描 述 最 佳 用 途 同 样 适 用 于 优 点 结 合 作 用 固 定 方 法 检 测 方 法 UltraBind 改 性 聚 醚 砜 膜 ELISA 亲 和 分 离 杂 交 瘤 筛 选 高 结 合 力 不 需 预 活 化 处 理 共 价 结 合 点 / 狭 线 杂 交 酶 联 抗 体 化 学 发 光 色 原 底 物 膜 处 理 的 普 遍 建 议 为 了 避 免 污 染, 处 理 膜 时 戴 手 套, 用 平 端 的 镊 子 ( 颇 尔 产 品 货 号 51147) 如 有 需 要, 把 滤 膜 切 割 成 交 错 放 置 的 材 料 的 大 小 需 要 用 锐 利 的 剪 刀 或 者 解 剖 刀 来 剪 切 膜 Pall 的 PVDF 膜 和 NT( 硝 酸 纤 维 素 ) 膜 使 用 前 要 湿 润 硝 酸 纤 维 素 膜 BioTrace NT: 从 一 端 开 始, 以 45 角, 慢 慢 地 放 低 膜 至 湿 润 缓 冲 液, 使 之 慢 慢 完 全 湿 透 ( 不 要 把 膜 快 速 浸 入 缓 冲 液, 那 样 会 导 致 不 完 全 润 湿 ), 轻 轻 搅 动 5-10 分 钟 如 果 膜 没 有 完 全 润 湿, 加 入 足 够 的 甲 醇 到 润 湿 缓 冲 液 中, 达 到 20%( 体 积 比 ) 的 终 浓 度 (20ml 的 甲 醇 /80ml 的 湿 润 缓 冲 液 ) PVDF 膜 (FluoroTrans,FluoroTrans W 和 BioTrace PVDF 膜 ): 慢 慢 地 把 膜 浸 入 80% 到 100% 的 甲 醇 或 者 乙 醇 中, 轻 轻 地 搅 动 湿 润 时, 膜 将 变 得 半 透 明 然 后 用 蒸 馏 水 冲 洗 几 次, 之 后 使 用 前 用 转 膜 液 平 衡 5 分 钟, 滤 膜 不 能 干 燥 (Biodyne 尼 龙 膜 使 用 前 不 需 要 润 湿 ) - 4 -

8 核 酸 转 移 用 溶 液 脱 嘌 呤 溶 液 0.25M HCl(19mL 13.3 M HCl/L H 2 O) 高 盐 脱 嘌 呤 溶 液 0.5M NaOH,1.5 M NaCl (20g NaOH,87.7g NaCl/L H 2 O) 碱 性 转 移 缓 冲 液 0.4N NaOH(16g/L H 2 O, 使 用 前 过 滤 ) 中 和 溶 液 20 SSC 10 SSC 0.5M Tris-HCl ph7.4,1.5 M NaCl 3M NaCl,0.3M 柠 檬 酸 钠,pH7.0 (175.3g NaCl, 88.2g 柠 檬 酸 钠, 溶 于 800mL 水, 然 后 用 NaOH 或 HCl 调 ph 到 7.0, 加 水 到 1 升 ) 1.5M NaCl,0.15M 柠 檬 酸 钠,pH7.0 (1:2 稀 释 20 SSC) 20 SSPE 3.6M NaCl,0.2M 磷 酸 钠 盐,pH7.7,0.02M EDTA( 把 174g NaCl,27.6g NaH 2 PO 4.H 2 O 和 7.4g EDTA 溶 于 800mL 水 中, 用 NaOH 调 ph 值 到 7.7, 加 水 到 1 升 ) 50%PEG 20%SDS 聚 乙 二 醇, 分 子 量 8000,10g 溶 于 20mL 灭 菌 水 中 20g 十 二 烷 基 磺 酸 钠 (SDS) 溶 于 100mL 灭 菌 水 中 消 化 溶 液 50mM Tris/HCl, ph7.6, 0.1% SDS, 50mM NaCl,100ug/mL 蛋 白 酶 K(50mL 1M Tris, 10mL 10% SDS, 2ml 5M NaCl, 使 用 前 加 蛋 白 酶 K) 核 酸 转 移 的 流 程 用 Biodyne 膜 进 行 DNA 点 杂 交 我 们 推 荐 用 80 烘 烤 30 分 钟, 之 后 用 紫 外 线 把 DNA 和 RNA 固 定 到 Biodyne 膜 上 ( 参 见 下 面 Biodyne 膜 的 固 定 程 序 ) 1 变 性 DNA: 把 DNA 溶 于 6 SSC 中, 加 热 到 分 钟, 然 后 迅 速 在 冰 上 冷 却 ( 也 可 以 把 DNA 溶 于 0.4N NaOH 中 变 性 ); 2 把 DNA(0.1pg-1ng 每 点 / 线 ) 加 到 膜 上, 根 据 生 产 商 的 说 明 使 用 点 / 线 点 样 多 管 吸 印 仪 如 果 每 一 个 点 总 的 体 积 2μL, 可 以 用 微 量 移 液 器 点 样 ; 如 果 用 多 管 吸 印 仪, 每 孔 50 到 75μL 效 果 最 好 ( 为 了 能 够 出 现 正 信 号, 每 个 样 品 孔 至 少 要 有 1pg 的 样 品, 尽 管 许 多 系 统 可 以 检 测 到 30fg 的 样 品 ); 3 80 下 烘 烤 30 分 钟 使 DNA 固 定, 然 后 用 80 到 150mJ 的 紫 外 光 照 射 ( 如 果 紫 外 光 源 没 有 校 正 好, 做 一 个 预 试 验 来 决 定 最 佳 的 曝 光 ) 过 度 曝 光 会 导 致 灵 敏 度 损 失 ; 4 在 室 温 下 浸 泡 于 2 SSC(0.5ml/cm 2 ) 中 5 分 钟, 重 新 湿 润 膜 ; 5 杂 交 和 检 测 条 件 见 下 面 有 关 章 节 注 意 : 点 杂 交 可 以 不 用 多 管 吸 印 仪 ;DNA 可 以 用 微 量 加 液 器 或 者 转 移 针 具 加 到 膜 上 - 5 -

9 用 Biodyne 膜 转 移 DNA ( Southern Blot ) 大 多 数 检 测 系 统 用 Biodyne 膜 按 照 如 下 流 程 ( 颇 尔 改 进 碱 转 移 法 ) 能 够 得 到 较 好 的 结 果 它 与 标 准 流 程 的 不 同 之 处 在 于 : 变 性 步 骤 后 胶 不 需 要 中 和 因 此, 转 移 的 开 始 步 骤 发 生 在 高 ph 条 件 下, 提 高 了 DNA 与 膜 的 结 合 效 率 ; 而 后 使 用 中 性 转 移 缓 冲 液, 在 转 移 过 程 中 一 步 步 降 低 ph, 使 膜 上 固 定 的 DNA 更 加 牢 固 用 已 经 发 表 的 标 准 流 程 也 可 以 得 到 良 好 结 果 电 泳 准 备 转 移 的 凝 胶 1 把 限 制 性 酶 切 的 DNA 加 到 含 有 溴 酚 兰 的 样 品 缓 冲 液 中, 然 后 在 琼 脂 糖 胶 中 电 泳 ; 2 当 电 泳 完 成 后, 把 胶 浸 入 2 个 体 积 的 0.25M HCl 中 ( 短 于 20 分 钟 ) 脱 嘌 呤 ( 短 暂 的 浸 泡 可 降 低 DNA 的 大 小, 使 转 移 方 便 ; 过 度 浸 泡 则 使 DNA 片 断 太 小, 不 能 与 探 针 结 合 ; 若 DNA 片 断 小 于 4Kb, 不 需 要 此 步 骤 ); 3 在 蒸 馏 水 中 冲 洗 胶, 除 去 多 余 的 HCl; 4 把 胶 浸 入 2 体 积 的 高 盐 变 性 溶 液 中 溴 酚 兰 染 料 变 成 蓝 色 ; 如 果 没 有, 用 新 鲜 的 变 性 溶 液 重 复 此 步 骤 颇 尔 改 进 碱 转 移 法 1 把 胶 从 高 盐 变 性 溶 液 中 取 出, 把 它 放 在 固 定 的 吸 水 纸 上 ( 见 图 1) 保 证 吸 水 纸 的 边 缘 浸 在 转 移 缓 冲 液 中 ; 2 把 一 张 干 燥 的 Biodyne 膜 直 接 放 到 胶 上 ; 3 用 三 张 杂 交 纸 和 一 叠 杂 交 衬 垫 盖 在 膜 上 ( 注 意 与 普 通 纸 巾 相 比, 衬 垫 能 够 保 证 液 流 更 加 平 缓 ); 4 在 衬 垫 上 加 一 个 盖 ( 玻 璃 或 塑 料 的 均 可 ), 然 后 放 一 个 小 的 重 物 到 盖 上 ( 300g); 5 让 转 移 过 程 进 行 4-18 小 时 尽 管 不 到 4 小 时 左 右 大 部 分 的 片 断 都 已 经 转 移, 但 最 小 的 转 移 时 间 还 需 要 通 过 经 验 来 决 定, 可 能 会 因 胶 浓 度 和 DNA 片 断 的 大 小 不 同 而 不 同 图 1-6 -

10 用 Biodyne 膜 转 移 RNA(Northern Blot) 下 面 的 操 作 流 程 适 合 于 Biodyne A,B 和 Plus 膜 Biodyne B 膜 建 议 用 于 使 用 32P 标 记 探 针 的 检 测 系 统 注 意 : 当 处 理 RNA 时, 设 备 和 试 剂 避 免 RNA 酶 污 染 是 很 重 要 的 建 议 除 了 20 SSC 转 移 缓 冲 液 外, 所 有 溶 液 都 需 含 0.1% 的 SDS 用 于 配 置 溶 液 的 水 也 可 以 用 0.1% 的 焦 碳 酸 二 乙 酯 处 理, 使 RNA 酶 失 活 1 在 甲 醛 变 性 胶 中 分 离 甲 酰 胺 变 性 的 RNA; 2 把 胶 浸 入 2 SSC 中 10 分 钟, 中 和 胶 ; 3 按 上 面 的 图 ( 图 1) 组 装 毛 细 转 移 装 置 用 20 SSC 当 作 转 移 缓 冲 液, 根 据 颇 尔 改 进 碱 转 移 方 法 ( 第 五 页 1~4 步 ) 的 说 明 操 作 建 议 转 移 过 夜, 保 证 大 分 子 RNA 的 转 移 效 率 ; 4 把 膜 从 胶 面 上 取 下 ( 不 要 冲 洗 膜 ); 5 80 下 烘 烤 30 分 钟 使 DNA 固 定, 然 后 用 80 到 150mJ 的 紫 外 光 照 射 ( 如 果 紫 外 光 源 没 有 校 正 好, 做 一 个 预 试 验 来 决 定 最 佳 的 曝 光 ) 过 度 曝 光 会 导 致 灵 敏 度 损 失 用 Biodyne A 膜 影 印 培 养, 克 隆 挑 选 和 噬 菌 斑 挑 选 推 荐 1.2μm 的 Biodyne A 膜 用 于 克 隆 和 噬 菌 斑 的 挑 选,0.2μm 的 Biodyne A 膜 用 于 影 印 培 养 为 防 止 污 染, 请 按 如 下 步 骤 准 备 膜 : 1 用 1mM 的 EDTA 煮 膜 5 分 钟, 蒸 馏 水 彻 底 冲 洗 ; 2 把 膜 插 入 层 析 滤 纸 中, 用 铝 箔 纸 包 裹 高 温 高 压 灭 菌 20 分 钟, 真 空 干 燥 用 Biodyne A 膜 挑 选 克 隆 和 噬 菌 斑 1 让 细 菌 克 隆 或 噬 菌 斑 在 琼 脂 糖 平 板 上 生 长, 直 至 合 适 大 小 ( 通 常 肉 眼 可 见 即 可 ), 防 止 细 菌 克 隆 和 噬 菌 斑 过 度 生 长 极 为 关 键 ; 2 在 4 冷 却 平 板 30 分 钟 ; 3 用 镊 子 钝 端 ( 颇 尔 公 司 产 品 货 号 51147) 夹 住 膜, 小 心 地 把 膜 放 到 琼 脂 糖 胶 的 表 面 ; 4 用 笔 或 针 标 记 膜 的 方 向 ; 5 准 备 二 个 装 有 吸 水 纸 的 碟 子 : 分 别 用 高 盐 变 性 液 和 中 和 溶 液 饱 和 ; 6 小 心 地 一 次 性 将 膜 揭 下 来, 置 于 用 高 盐 变 性 溶 液 饱 和 的 滤 纸 上 5 分 钟 ( 克 隆 / 噬 菌 斑 朝 上 ); 7 把 膜 取 出, 轻 轻 置 于 干 的 滤 纸 上 以 除 去 过 多 的 液 体 ; 把 膜 放 在 中 和 溶 液 饱 和 的 滤 纸 上 中 和 15 分 钟 ; 8 固 定 DNA 到 膜 上 ; 9 固 定 之 后, 让 膜 在 37 消 化 液 中 温 浴 6-12 小 时, 去 除 蛋 白 质 黄 色 克 隆 将 在 消 化 的 时 候 消 失 ; 10 用 2 SSC 冲 洗 膜, 然 后 继 续 杂 交 和 检 测 过 程 用 Biodyne A 膜 影 印 培 养 和 扩 增 细 菌 克 隆 可 以 直 接 生 长 在 按 上 述 方 案 预 处 理 和 高 温 高 压 灭 菌 后 的 Biodyne A 膜 上 膜 影 印 可 以 冷 冻 储 存 很 长 时 间 1 使 用 无 菌 技 术, 小 心 地 把 膜 置 于 琼 脂 糖 平 板 上, 保 证 膜 和 平 板 之 间 没 有 气 泡 产 生 ; - 7 -

11 2 准 备 合 适 的 稀 释 倍 数 的 细 菌 培 养 液 直 接 涂 到 膜 上 (82mm 的 圆 形 膜 用 0.5mL,132mm 的 圆 形 膜 用 1.2m); 3 37 培 养, 直 至 看 见 菌 落 (<0.5mm); 4 把 膜 取 下, 放 在 玻 璃 皿 中 灭 过 菌 的 滤 纸 上 ( 克 隆 朝 上 ); 5 使 第 二 张 膜 恰 好 盖 住 第 一 张 膜, 一 次 性 快 速 放 下, 不 要 重 新 调 整 两 张 膜 的 位 置, 否 则 克 隆 会 被 破 坏 ; 6 盖 上 另 一 张 灭 菌 的 滤 纸 和 玻 璃 平 板, 然 后 用 手 使 劲 压 上 面 的 平 板 ; 7 用 一 个 热 的 针 来 标 记 膜 方 向, 刺 穿 两 张 相 叠 的 膜 ; 8 小 心 地 将 两 张 膜 分 开, 克 隆 朝 上 分 别 放 在 干 净 的 琼 脂 糖 平 板 上 ; 9 源 初 的 克 隆 重 新 在 第 一 张 膜 上 生 长, 此 平 板 于 4 保 存 ; 在 新 的 影 印 膜 上 克 隆 需 要 较 长 的 生 长 时 间 (4-6 小 时 ); 10 一 旦 影 印 膜 上 的 克 隆 长 到 合 适 的 大 小, 用 此 膜 来 继 续 做 克 隆 / 噬 菌 斑 的 挑 选 ( 见 上 ); 此 技 术 使 用 针 点 样 工 具 可 以 用 来 做 微 阵 列 Biodyne 膜 的 固 定 过 程 所 有 Biodyne 膜 都 应 该 在 80 下 烘 烤 30 分 钟, 然 后 用 80 到 150mJ 的 紫 外 光 照 射 ( 如 果 紫 外 光 源 没 有 校 正 好, 做 一 个 预 试 验 来 决 定 最 佳 的 曝 光 ) 过 度 曝 光 会 导 致 灵 敏 度 损 失 固 定 之 后 继 续 杂 交 和 检 测 Biodyne 膜 的 杂 交 过 程 颇 尔 生 命 科 学 的 膜 产 品 已 经 成 功 地 与 商 业 化 的 DNA 检 测 试 剂 盒 联 合 使 用 应 该 遵 照 生 产 商 的 建 议 使 用 试 剂 盒 更 多 的 信 息 可 以 从 试 剂 盒 生 产 商 的 技 术 服 务 人 员 或 者 颇 尔 生 命 科 学 获 得 预 杂 交 预 杂 交 和 杂 交 过 程 将 因 DNA 探 针 的 类 型 和 来 源 不 同 而 不 同 预 杂 交 ( 封 闭 膜 上 非 特 异 性 结 合 位 点 ) 并 不 是 所 有 的 检 测 系 统 里 都 必 须 颇 尔 公 司 的 测 试 表 明, 预 杂 交 溶 液 中 的 成 分 最 重 要 的 是 SDS( 十 二 烷 基 磺 酸 钠 ) 和 Casein( 酪 蛋 白,BDH 公 司, 货 号 44020) 预 杂 交 能 够 进 行 30 分 钟 到 几 个 小 时 一 般 来 说, 高 温 ( 达 到 68 ) 将 获 得 更 快 更 好 的 预 杂 交 效 果 杂 交 和 预 杂 交 一 样, 杂 交 也 是 随 着 探 针 DNA 的 性 质 和 检 测 系 统 的 不 同 而 变 化 经 常 用 于 32P 标 记 探 针 检 测 系 统 的 流 程 叙 述 如 下 以 下 的 溶 液 和 操 作 流 程 是 参 照 FBI( 美 国 联 邦 调 查 局 ) 的 建 议 制 订 的 不 需 要 预 杂 交 步 骤 杂 交 溶 液 20.4mL 灭 菌 水 12.0mL 50% PEG( 聚 乙 二 醇 )( 分 子 量 8000) 4.5 ml 20 SSPE 21.0 ml 20% SDS 57.9 ml 总 体 积 - 8 -

12 1 加 入 探 针, 加 灭 菌 水 使 总 体 积 达 到 60mL 使 用 终 浓 度 为 dpm/ml 的 标 记 探 针 ; 2 加 入 0.1ml/cm 2 的 杂 交 液 到 膜 里 然 后 轻 微 振 荡,65 温 浴 过 夜 ( 如 果 杂 交 在 瓶 中 进 行, 保 证 杂 交 液 体 积 足 够 使 膜 湿 润, 一 般 来 说 10-15mL/ 瓶 ) 1 膜 通 过 放 置 在 含 杂 交 液 的 塑 料 袋 中 进 行 预 杂 交 (2-4mL/100cm 2 膜 ),DNA 转 移 时 在 65 温 浴 30 分 钟,RNA 转 移 时 在 42 温 浴 30 分 钟 ; 2 煮 沸 5 分 钟 变 性 标 记 的 探 针, 之 后 骤 冷 1 分 钟 ; 3 加 入 足 够 的 变 性 的 标 记 探 针 得 到 每 100cm 2 膜 2ml 的 杂 交 溶 液, 最 后 探 针 的 浓 度 达 到 1-10pg/mL; 4 把 膜 从 预 杂 交 袋 中 取 出 置 于 新 的 杂 交 袋 中, 杂 交 溶 液 中 含 有 变 性 的 探 针 ( 在 瓶 中 杂 交 也 可 以 使 用 Church 缓 冲 液 :7%( 体 积 : 体 积 ) SDS,250mM 磷 酸 盐 溶 液 ph7.4); 5 65 (DNA) 或 者 42 (RNA) 温 浴 4 小 时 或 过 夜 杂 交 后 的 漂 洗 把 膜 放 入 新 的 袋 子 或 者 容 器 中, 然 后 用 2mL/cm 2 的 溶 液 洗 膜 1 室 温 下 用 2 SSC,0.1% SDS 洗 15 分 钟 ; 2 室 温 下 用 1 SSC,0.1% SDS 洗 15 分 钟 ; 3 65 用 0.1 SSC,0.1% SDS 洗 20 分 钟 ( 使 用 前 预 热 溶 液 ); 4 用 杂 交 膜 轻 轻 地 沾 杂 交 纸 以 除 去 多 余 的 液 体, 不 要 让 膜 完 全 干 透 该 漂 洗 主 要 用 于 初 次 使 用 不 同 的 探 针 可 能 需 要 对 漂 洗 时 间 次 数 等 进 行 优 化 注 意 : 漂 洗 过 度 可 能 降 低 灵 敏 度 如 果 膜 需 要 用 来 再 次 杂 交, 不 要 让 膜 在 任 何 时 候 干 透 膜 在 短 期 内 (<1 个 月 ) 可 以 夹 在 层 析 纸 中 保 存 于 4 放 射 自 显 影 1 把 湿 的 膜 包 在 干 净 的 塑 料 膜 中 ; 2 在 暗 房 中, 把 膜 装 入 放 射 自 显 影 片 夹 中, 让 膜 与 凝 胶 接 触 的 那 一 面 与 X 光 片 或 者 自 显 影 胶 片 ( 如 : 柯 达 XAR) 相 对, 让 片 夹 保 存 在 -80 中, 一 般 曝 光 时 间 是 小 时 重 新 杂 交 Biodyne 系 列 膜 可 以 容 易 地 再 次 杂 交 用 于 32P 标 记 的 探 针 的 流 程 如 下 ( 此 方 法 遵 从 F.B.I 建 议, 同 样 可 以 应 用 于 非 放 射 性 的 技 术 ): 在 一 些 预 杂 交 杂 交 或 封 闭 等 包 含 蛋 白 质 体 系 的 步 骤 中, 可 能 需 要 用 蛋 白 酶 (0.5mg/mL 蛋 白 酶 K,0.1%SDS,65 60 分 钟 ) 预 处 理, 让 洗 脱 试 剂 能 够 接 触 到 杂 交 的 DNA 甲 酰 胺 洗 脱 (DNA 转 移 ) 甲 酰 胺 是 一 种 危 险 的 化 学 试 剂, 其 健 康 威 胁 包 括 对 接 触 的 皮 肤 眼 睛 或 黏 膜 的 刺 激, 可 造 成 肝 损 伤 ; 摄 入 会 导 致 头 痛 头 晕 和 呕 吐 甲 酰 胺 应 储 存 于 阴 冷 干 燥 和 远 离 火 源 的 区 域, 并 且 只 能 在 通 风 橱 里 操 作, 并 使 用 防 化 学 的 手 套 和 安 全 的 吸 取 设 备 在 操 作 前 请 仔 细 阅 读 生 产 商 的 物 质 安 全 资 料 (MSDS,Material Safety Data Sheet) 这 个 流 程 被 F.B.I 建 议 用 来 使 用 32P 标 记 的 探 针 杂 交 转 移 的 DNA 1 在 下 面 的 溶 液 (20ml 每 cm 2 膜 ) 中 65 温 浴 杂 交 膜 60 分 钟 : - 9 -

13 110mL 甲 酰 胺 ( 离 子 交 换 树 脂 去 离 子 ) 20mL 20 SSPE 10mL 20% SDS 60mL 灭 菌 水 2 室 温 下 用 0.1 SSC,0.1% SDS (20 ml/cm 2 面 积 的 膜 ) 冲 洗 膜 1 分 钟 ; 3 把 膜 置 于 滤 纸 30 秒 钟, 除 去 多 余 的 液 体 ; 4 如 果 在 洗 脱 和 冲 洗 之 后 需 要 保 存, 包 入 塑 料 袋 中, 置 于 -80 ; 5 用 新 的 探 针 重 复 预 杂 交 和 杂 交 步 骤 用 煮 沸 的 SDS 洗 脱 1 倒 煮 沸 的 0.1%SDS 水 溶 液 到 膜 上, 轻 轻 地 搅 动 数 分 钟 注 意 : 如 果 膜 需 要 洗 脱 重 新 杂 交 数 次, 则 应 将 SDS 加 热 到 90 而 不 是 煮 沸, 这 样 可 以 使 结 合 的 核 酸 的 损 失 最 小 ; 2 丢 弃 溶 液, 马 上 加 入 新 煮 沸 的 0.1% 的 SDS 溶 液, 使 其 冷 却 至 室 温 碱 法 洗 脱 这 一 技 术 不 适 用 于 转 移 RNA 在 其 它 条 件 下 不 能 洗 脱 的 探 针 推 荐 使 用 这 种 方 法 使 用 这 种 方 法 会 有 一 些 目 标 DNA 的 损 失 1 在 0.4M NaOH 中, 45 温 浴 膜 30 分 钟 ; 2 用 0.1 SSC,0.1% SDS 洗 膜 分 钟 甲 酰 胺 洗 脱 (RNA 转 移 ) 请 见 关 于 使 用 甲 酰 胺 的 警 告 1 湿 润 的 膜 在 75%( 体 积 : 体 积 ) 的 去 离 子 甲 酰 胺 10mM 的 磷 酸 盐 缓 冲 液 (ph7.5) 中 65 温 浴 1 小 时 ; 2 室 温 下 用 0.1 SSC,0.1% SDS 洗 膜 15 分 钟 ; 3 检 查 探 针 去 除 效 果, 然 后 像 原 初 的 探 针 那 样 重 新 杂 交

14 问 题 解 答 指 南 - 核 酸 有 正 对 照 的 膜 试 验 将 有 助 于 决 定 问 题 的 所 在 如 果 使 用 了 检 测 试 剂 盒, 参 考 内 附 的 问 题 解 答 建 议 低 灵 敏 度 ( 信 号 强 度 ) 标 记 效 率 低 探 针 浓 度 低 洗 脱 条 件 太 严 紧 DNA 转 移 效 率 低 DNA 没 有 截 留 在 膜 上 探 针 变 性 不 完 全 - 用 新 标 记 的 探 针 重 新 杂 交 - 用 高 活 力 的 核 酸 - 增 加 杂 交 溶 液 中 探 针 的 浓 度 - 提 高 漂 洗 溶 液 的 离 子 强 度 或 者 降 低 漂 洗 温 度 - 在 胶 上 走 一 道 特 殊 的 样, 用 溴 乙 锭 检 测 DNA 转 移 - 检 查 固 定 过 程 是 正 确 的 ( 也 就 是 说, 没 有 紫 外 光 的 过 度 照 射 ) - 保 证 探 针 完 全 加 热 变 性, 并 快 速 冷 却 检 测 / 暴 光 时 间 太 短 - 增 加 放 射 自 显 影 ( 或 者 颜 色 生 成 ) 的 时 间 或 者 增 加 酶 联 的 浓 度 ( 非 放 射 性 方 法 ) 背 景 污 点 缓 冲 液 中 的 颗 粒 - 在 使 用 前 过 滤 试 剂 探 针 的 浓 度 太 高 - 降 低 探 针 的 浓 度 封 闭 / 预 杂 交 效 率 低 - 增 加 封 闭 试 剂 ( 酪 蛋 白 和 SDS) 的 浓 度 或 者 增 加 预 杂 交 时 间 在 操 作 过 程 中 膜 完 全 干 了 - 在 所 有 的 步 骤 里 都 保 持 膜 湿 润 高 背 景 探 针 污 染 ( 存 在 游 离 的 核 酸 ) - 用 Nanesep 柱 子 纯 化 探 针 ( 向 颇 尔 公 司 吉 尔 曼 实 验 室 技 术 服 务 部 询 问 方 案 ) 重 复 杂 交 的 高 背 景 探 针 不 能 洗 脱 重 新 杂 交 缺 乏 灵 敏 度 膜 上 的 一 些 区 域 没 有 信 号 洗 脱 严 紧 度 太 低 杂 交 液 中 有 颗 粒 存 在 膜 完 全 干 了 膜 没 有 完 全 有 效 地 封 闭 和 预 杂 交 膜 完 全 干 了 洗 脱 过 程 不 够 严 紧 转 膜 后 固 定 效 率 低 低 ( 二 次 ) 探 针 活 性 膜 和 胶 之 间 的 气 泡 - 提 高 洗 脱 温 度, 降 低 离 子 强 度 - 使 用 前 过 滤 溶 液 - 穿 戴 没 有 粉 末 的 手 套 - 在 所 有 的 步 骤 里 都 保 持 膜 湿 润 在 每 次 杂 交 前 都 封 闭 或 预 杂 交 - 如 果 膜 完 全 干 透, 探 针 不 能 完 全 从 膜 上 洗 脱 - 保 持 膜 湿 润 - 增 加 洗 脱 温 度 和 时 间, 或 者 增 加 去 污 剂 甲 酰 胺 的 浓 度 - 确 定 使 用 了 所 使 用 膜 的 固 定 方 法 - 使 用 Biodyne B 型 膜 - 使 用 前 确 认 所 有 探 针 的 特 定 活 性 - 用 移 液 器 轻 轻 地 在 表 面 滚 动, 除 去 胶 和 膜 之 间 的 气 泡

15 蛋 白 的 转 移 和 固 定 用 BioTrace NT 膜 和 PVDF 膜 蛋 白 转 移 (Western 杂 交 ) Pall PVDF 和 硝 酸 纤 维 素 膜 可 用 于 蛋 白 的 转 移 和 检 测, 下 面 略 述 的 流 程 目 的 是 作 为 使 用 BioTrace NT 和 PVDF 膜 的 一 般 使 用 指 南 当 安 装 转 移 槽 的 时 候, 应 该 按 照 转 移 设 备 生 产 商 的 说 明 书 进 行 按 照 试 剂 盒 生 产 商 的 方 案, 这 些 膜 可 以 跟 很 多 商 业 化 的 非 放 射 性 检 测 的 试 剂 盒 一 起 使 用 蛋 白 转 移 和 固 定 使 用 的 溶 液 Towbin 转 移 缓 冲 溶 液 CAPS 转 移 缓 冲 液 TBS 25 mm Tris-HCl ph 8.3, 192 mm 甘 氨 酸,20%( 体 积 : 体 积 ) 甲 醇 溶 液 把 2.2g CAPS(3- 环 己 基 -1- 丙 磺 酸 ) 溶 于 100mL 的 甲 醇 里 加 900mL 的 蒸 馏 水, 然 后 混 合 好 调 ph 到 mm Tris-HCl ph 8.0, 150 mm NaCl TBS-T 10 mm Tris-HCl ph 8.0, 150 mm NaCl, 0.12% Tween 20 反 应 缓 冲 液 I 10 mm Tris-HCl ph 9.5, 100 mm NaCl, 5 mm MgCl 2 BCIP/NBT( 溴 氯 吲 哚 磷 酸 / 硝 基 四 氮 唑 蓝 ) 底 物 把 82.5mg 的 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲 哚 基 磷 酸,42.5mg 的 硝 基 四 氮 唑 蓝 溶 于 1mL 的 二 甲 基 甲 酰 胺 加 入 250 ml 的 反 应 缓 冲 液 I, 并 搅 动 避 光 保 存 反 应 缓 冲 液 II 10 mm Tris-HCl, ph 8.0, 150 mm NaCl, 0.1% Tween 20 DAB(3,3 - 二 氨 基 联 苯 胺 盐 酸 ) 底 物 DAB 溶 于 反 应 缓 冲 液 II 中, 浓 度 0.05%, 使 用 前 新 鲜 配 置 30% 过 氧 化 氢 30%( 体 积 : 体 积 )H 2 O 2 水 溶 液 CN(4- 氯 -1- 萘 酚 ) 酰 胺 黑 染 料 脱 色 溶 液 PBS-T 胶 体 金 溶 液 Ponceau S solution 4- 氯 -1- 萘 酚 溶 于 甲 醇, 每 ml 溶 解 100mg 加 45 ml 的 甲 醇,2 ml 的 乙 酸,53 ml 的 蒸 馏 水,0.1g 的 酰 胺 黑 加 180 ml 的 甲 醇,4 ml 的 乙 酸,16 ml 的 蒸 馏 水 10mM 的 磷 酸 盐 溶 液 ph 7.4, 120 mm NaCl, 2.7 mm KCl, 0.3% Tween 20 例 如 :Nanogold 标 记 试 剂,Nanoprobes 公 司 有 售 (Stony Brook, 纽 约 ) 溶 解 0.5 g Ponceau S 到 1mL 的 冰 乙 酸, 加 水 至 100mL

16 转 移 过 程 1 如 果 膜 和 吸 水 垫 纸 没 有 预 先 切 成 合 适 的 大 小, 那 么 把 它 们 切 成 跟 胶 合 适 的 大 小 一 直 戴 着 手 套, 用 钝 端 的 镊 子 接 触 膜, 切 膜 时 让 膜 夹 在 叠 在 一 起 的 纸 之 间 ; 2 按 之 前 提 到 的 方 法 湿 润 膜 ; 3 把 膜 和 胶 一 起 在 转 移 缓 冲 液 中 平 衡 ; 4 在 转 移 缓 冲 液 中 饱 和 六 张 ( 或 者 按 仪 器 生 产 商 的 建 议 决 定 张 数 ) 吸 水 垫 纸 ( 如 果 需 要, 切 成 合 适 的 大 小 ) 放 三 张 垫 纸 到 正 极 ; 5 小 心 地 把 膜 放 在 饱 和 好 的 垫 纸 上 用 玻 璃 移 液 管 在 膜 上 以 一 个 方 向 轻 轻 地 慢 慢 滚 动, 除 去 可 能 存 在 于 垫 纸 和 膜 之 间 的 气 泡 ; 6 把 胶 置 于 膜 的 上 方, 用 玻 璃 移 液 管 在 膜 上 以 一 个 方 向 轻 轻 地 慢 慢 滚 动, 除 去 可 能 存 在 于 胶 和 膜 之 间 的 气 泡 ; 7 放 三 张 吸 水 垫 纸 到 胶 的 上 方, 然 后 把 仪 器 的 负 极 放 在 堆 放 好 的 垫 纸 上 ; 8 把 这 一 摞 纸 ( 夹 着 膜 和 胶 ) 放 入 槽 中, 按 生 产 商 说 明 加 入 转 移 缓 冲 液 ; 9 把 槽 与 电 源 连 接 好, 开 始 转 膜 按 生 产 商 的 说 明 决 定 电 流 一 般 来 说 转 移 将 在 分 钟 内 完 成 ; 10 对 BioTrace NT 膜 来 说 : 转 移 结 束 后, 室 温 下 让 膜 在 空 气 中 干 燥 这 有 助 于 蛋 白 质 与 膜 更 紧 密 地 结 合, 防 止 后 续 的 洗 膜 和 检 测 步 骤 中 损 失 ; 11 对 于 BioTrace PVDF 膜 : 在 检 测 时 不 要 让 膜 完 全 干 燥, 因 为 那 样 会 很 难 完 全 重 新 湿 润 免 疫 检 测 的 一 般 流 程 1 可 以 用 商 业 化 的 封 闭 试 剂 或 者 以 下 的 封 闭 溶 液 封 闭 非 特 异 结 合 10mM Tris-HCl ph7.5, 150mM NaCl, 1-5% BSA( 牛 血 清 白 蛋 白 ) 2% 脱 脂 奶 粉 10mM Tris-HCl ph7.5, 150mM NaCl, 0.5% casein( 酪 蛋 白 ) 10mM Tris-HCl ph7.5, 150mM NaCl, 0.05% Tween20( 只 适 用 于 BioTrace NT 膜 ) 注 意 :BSA (1-5%) 对 于 硝 酸 纤 维 素 膜 可 以 用 于 封 闭 溶 液, 但 是 对 于 PVDF 没 有 效 果,casein( 酪 蛋 白 ) 对 于 所 有 膜 类 型 都 有 较 高 的 封 闭 效 果 2 把 膜 浸 入 封 闭 试 剂 中, 浸 泡 并 且 轻 轻 搅 动 1 小 时 ; 3 在 封 闭 缓 冲 液 中 稀 释 初 级 抗 体 膜 在 此 溶 液 中 浸 泡 1 小 时, 轻 轻 搅 动 ; 4 室 温 下, 用 TBS-T 溶 液 洗 膜 三 次, 每 次 5 分 钟, 除 去 没 有 结 合 的 抗 体 ; 5 在 TBS 中 稀 释 次 级 标 记 抗 体 ( 比 如 放 射 性 或 者 酶 联 ) 室 温 下, 将 膜 在 此 溶 液 中 浸 泡 45 分 钟 -1 小 时, 并 轻 轻 地 搅 动 ; 6 室 温 下, 用 TBS-T 溶 液 洗 膜 三 次, 每 次 5 分 钟, 除 去 没 有 结 合 的 抗 体 ; 7 室 温 下, 用 TBS 洗 膜 三 次, 每 次 5 分 钟 用 碱 性 磷 酸 酶 和 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲 哚 基 磷 酸 / 硝 基 四 氮 唑 蓝 (BCIP/NBT) 检 测 1 室 温 下, 在 反 应 缓 冲 液 I 中 平 衡 膜 5 分 钟 ; 2 除 去 缓 冲 液, 加 入 BCIP/NBT 底 物 当 颜 色 生 成 时, 观 察 反 应 ; 3 当 反 应 完 成 时, 用 反 应 缓 冲 液 洗 膜 两 次 ; 4 用 蒸 馏 水 洗 膜 两 次 用 辣 根 过 氧 化 物 酶 和 二 氨 基 联 苯 胺 检 测 DAB( 二 氨 基 联 苯 胺 ) 是 一 种 致 癌 物 质, 处 理 它 时 应 当 有 正 确 的 安 全 措 施 操 作 前 请 仔 细 阅 读 供 应 商 的 安 全 资 料 表 (MSDS)

17 1 室 温 下, 在 反 应 缓 冲 液 II 中 平 衡 膜 5 分 钟 ; 2 加 3μL 30% 的 H2O2 到 100ml DAB 底 物 中 ; 3 把 膜 从 反 应 缓 冲 液 中 取 出, 加 入 上 述 DAB 溶 液 ; 4 室 温 下 缓 慢 搅 动, 当 颜 色 生 成 时 观 察 反 应 ; 5 用 蒸 馏 水 洗 膜 两 次 用 辣 根 过 氧 化 物 酶 和 氯 奈 检 测 1 室 温 下, 在 反 应 缓 冲 液 II 中 平 衡 膜 5 分 钟 ; 2 加 50μL 的 CN 底 物 到 2ml 的 甲 醇 中 加 8ml 的 TBS, 然 后 混 合 再 加 35μL 的 30% 的 H 2 O 2, 再 混 合 ; 3 从 反 应 缓 冲 液 中 去 除 膜, 在 杂 交 纸 上 短 暂 地 粘 附, 然 后 浸 入 上 述 溶 液 中 ; 4 室 温 下, 轻 轻 地 搅 动, 当 颜 色 生 成 时 观 察 反 应 ; 5 当 需 要 的 亮 度 达 到 后, 用 蒸 馏 水 洗 膜 数 次, 以 中 止 反 应 酰 胺 黑 染 色 (Amido Black Staining) 1 当 转 移 完 成 后, 把 膜 浸 泡 于 装 有 50mL 染 色 液 的 玻 璃 皿 中, 膜 不 要 干 燥 ; 2 室 温 下 在 染 色 液 中 浸 泡 4 分 钟 中 并 轻 轻 地 搅 动 ; 3 倒 出 染 色 液, 加 入 脱 色 液 中, 室 温 下 在 浸 泡 5 分 钟 中 并 轻 轻 地 搅 动 ; 4 在 蒸 馏 水 中 洗 膜 ; 5 在 空 气 中 干 燥 胶 体 金 染 色 1 室 温 下, 把 膜 浸 泡 于 PBS-T 溶 液 中 并 轻 轻 地 搅 动,2 次, 每 次 30 分 钟 ; 2 用 蒸 馏 水 简 单 地 冲 洗 膜 ; 3 把 膜 和 大 约 50ml 的 胶 体 金 封 入 一 个 袋 子 中 ; 4 浸 泡 并 轻 轻 振 荡 1 小 时 ; 5 把 膜 从 袋 子 中 取 出, 用 蒸 馏 水 短 暂 地 冲 洗, 空 气 中 干 燥 考 马 斯 亮 蓝 染 色 FluoroTrans W 和 BioTrace PVDF 膜 1 用 去 离 子 水 冲 洗 滤 膜 ; 2 用 0.2% 考 马 斯 亮 蓝 (R250),40% 甲 醇,10% 乙 酸, 染 色 10 分 钟 ; 3 脱 色 液 I:80% 甲 醇,10% 乙 酸,10 分 钟 ; 4 脱 色 液 II:45% 甲 醇,10% 乙 酸,10 分 钟, 更 换 溶 液, 浸 泡 过 夜 ; 5 空 气 中 干 燥 上 面 的 各 个 流 程 通 过 转 移 结 束 后 对 膜 进 行 染 色 并 用 视 觉 来 判 断 转 移 效 率 另 外, 蛋 白 质 用 考 马 斯 亮 蓝 或 者 其 它 总 蛋 白 染 料 染 色 后 可 以 转 移 到 膜 上 如 果 蛋 白 从 一 块 染 色 的 胶 中 转 移, 在 检 测 步 骤 前, 膜 应 该 脱 色 过 夜, 期 间 换 三 次 甲 醇 Ponceau S Reversible Straining FluoroTrans W, BioTrace PVDF, 和 BioTrace NT 膜 1 室 温 下 将 膜 放 在 0.01% Ponceau S,3% 三 氯 乙 酸 溶 液 中 1 分 钟 (BioTrace NT) 或 5 分 钟 (FluoroTrans W, BioTrace PVDF 膜 ); 2 用 水 冲 洗 膜 2 分 钟 脱 色 ; 3 冲 洗 额 外 10 分 钟 以 去 除 所 有 染 料

18 问 题 解 答 指 南 - 蛋 白 转 移 低 灵 敏 度 或 者 没 有 信 号 整 张 膜 的 高 背 景 背 景 污 点 膜 上 的 假 带 或 者 点 抗 体 活 性 或 者 效 价 低 蛋 白 不 完 全 转 移 ( 转 移 后 染 胶 确 定 ) 蛋 白 质 没 有 结 合 到 膜 上 偶 联 活 性 低 封 闭 试 剂 影 响 抗 体 的 结 合 生 色 反 应 时 间 太 长 抗 体 酶 结 合 质 量 太 差 不 完 全 的 封 闭 封 闭 试 剂 中 存 在 磷 酸 酶 或 者 过 氧 化 物 酶 活 性 溶 液 中 存 在 颗 粒 初 级 抗 体 的 交 叉 反 应 样 品 存 在 磷 酸 酶 或 过 氧 化 物 酶 活 性 ( 检 测 时 不 加 初 级 和 次 级 抗 体 来 确 认 ) - 分 装 抗 体 溶 液, 并 在 -20 保 存, 避 免 反 复 冻 融 - 使 用 更 高 浓 度 的 一 抗 - 增 加 转 移 时 间 - 降 低 转 移 缓 冲 液 中 甲 醇 的 浓 度 ( 如 果 使 用 的 是 PVDF 膜 ) - 加 入 0.1% 的 SDS 有 助 于 大 分 子 蛋 白 的 转 移 - 保 证 在 胶 和 膜 之 间 没 有 气 泡 - 使 用 没 有 SDS 的 转 移 缓 冲 液 - 如 果 使 用 BioTrace NT 膜, 在 转 移 缓 冲 液 中 加 入 甲 醇 - 把 偶 联 物 保 存 于 -4 - 增 加 偶 联 物 的 浓 度 和 浸 泡 时 间 - 使 用 另 一 种 不 同 的 封 闭 试 剂 - 当 所 需 要 的 亮 度 达 到 时 立 即 中 止 反 应 - 使 用 亲 和 层 析 纯 化 的 二 抗 - 增 加 浸 泡 时 间 - 使 用 另 一 种 不 同 的 封 闭 试 剂 - 使 用 一 种 不 同 品 牌 的 封 闭 试 剂 盒 - 使 用 前 过 滤 试 剂 - 进 一 步 纯 化 或 者 预 先 吸 附 抗 体 - 使 用 单 克 隆 抗 体 ( 如 果 有 的 话 ) - 降 低 初 级 抗 体 的 浓 度 - 在 封 闭 前, 用 加 热 器 加 热 到 80 使 其 失 活

19 BiodyneC 型 膜 的 活 化 BiodyneC 型 膜 活 化 要 使 用 氰 尿 酰 氯 (cyanuric chloride), 二 环 己 基 碳 二 亚 胺 (dicyclohexylcarbodiimide) 或 者 戊 二 醛 (glutaraldehyde) 如 果 用 亚 甲 氯 (methylene chloride) 当 作 溶 液, 操 作 必 须 在 通 风 橱 中 进 行 使 用 前, 亚 甲 氯 中 活 化 的 膜 应 该 保 护 膜 不 碰 到 水 或 者 水 蒸 汽 另 外, 戊 二 醛 可 以 加 到 浸 泡 于 水 或 者 PBS 溶 液 的 膜 中 所 有 的 浸 泡 和 漂 洗 过 程 都 需 要 在 玻 璃 的 容 器 或 者 盘 中 进 行 所 有 的 步 骤, 包 括 称 样 品 重 量, 需 要 在 通 风 橱 中 进 行 此 方 案 包 含 在 美 国 专 利 (4,693,985) 中 购 买 颇 尔 生 命 科 学 的 膜 将 提 供 这 个 专 利 的 许 可 需 要 的 试 剂 : 这 些 试 剂 可 能 是 危 险 的, 应 该 在 通 风 橱 中 使 用 使 用 前 查 看 供 应 商 的 物 质 安 全 资 料 表 (MSDS) Cyanuric chloride 氰 尿 酰 氯 (TsT) Methylene chloride 亚 甲 氯 (MeCl2) Triethylamine 三 乙 胺 (TEA) Dicyclohexylcarbodiimide 二 环 己 基 碳 二 亚 胺 (DCCD) Phosphate Buffered Saline 磷 酸 缓 冲 盐 水 (PBS) Glutaraldehyde 戊 二 醛 氰 尿 酰 氯 (cyanuric chloride) 活 化 1 把 膜 切 成 合 适 大 小 ( 处 理 膜 时 始 终 要 戴 手 套, 使 用 钝 端 的 镊 子, 颇 尔 产 品 51147); 2 混 合 4.3mL TEA 和 65mL MeCl2, 在 此 溶 液 中 浸 泡 膜 2 分 钟 ; 3 室 温 下, 加 2g TsT 浸 泡 15 分 钟, 并 轻 轻 搅 动 ; 4 在 MeCl 2 中 洗 膜 4 次, 一 次 50mL, 每 次 5 分 钟 ; 5 膜 在 空 气 中 干 燥 使 用 前 活 化 好 的 膜 放 在 真 空 干 燥 器 中 DCCD 二 环 己 基 碳 二 亚 胺 (dicyclohexylcarbodiimide) 活 化 1 把 膜 切 成 合 适 大 小 ( 处 理 膜 时 始 终 要 戴 手 套, 使 用 钝 端 的 镊 子, 颇 尔 产 品 51147); 2 以 MeCl 2 为 溶 液 制 备 10%( 重 量 : 体 积 )DCCD 溶 液 室 温 下, 让 膜 在 此 溶 液 浸 泡 30 分 钟 ; 3 在 MeCl 2 中 洗 膜 4 次, 一 次 50ml, 每 次 5 分 钟 ; 4 膜 在 空 气 中 干 燥 使 用 前 活 化 好 的 膜 放 在 真 空 干 燥 器 中 戊 二 醛 (glutaraldyhyde) 活 化 1 把 膜 切 成 合 适 大 小 ( 处 理 膜 时 始 终 要 戴 手 套, 使 用 钝 端 的 镊 子, 颇 尔 产 品 51147); 2 把 膜 浸 泡 于 50ml 0.5%-5%( 体 积 : 体 积 ) 的 戊 二 醛 的 PBS 溶 液 中 2 小 时, 并 搅 动 ; 3 在 PBS 中 洗 膜 4 次, 一 次 50ml, 每 次 5 分 钟 ; 4 膜 在 空 气 中 干 燥 使 用 前 活 化 好 的 膜 放 在 真 空 干 燥 器 中

20 把 蛋 白 质 固 定 到 U l t r a B i n d 膜 UltraBind 膜 上 的 活 性 乙 醛 基 团 跟 自 由 的 氨 基 反 应 使 得 蛋 白 质, 多 肽 和 其 它 含 有 氨 基 的 化 合 物 共 价 固 定 到 膜 上 不 需 要 特 别 的 反 应 条 件, 但 含 有 一 级 胺 和 它 们 的 盐 ( 例 如 Tris 或 甘 氨 酸 缓 冲 液 ) 溶 液 应 该 避 免 使 用, 因 为 它 们 含 有 的 功 能 基 团 能 够 与 膜 上 的 乙 醛 基 团 发 生 反 应, 这 将 影 响 蛋 白 的 连 接 固 定 溶 液 中 会 增 加 溶 液 粘 度 的 内 容 物 ( 例 如 聚 乙 二 醇 ) 同 样 对 固 定 反 应 有 不 利 影 响 湿 点 法 固 定 1 用 微 量 取 液 器 或 者 喷 墨 器 把 蛋 白 质 (2mg/ml 或 者 更 高 浓 度 ) 点 到 膜 上, 每 点 的 体 积 应 该 是 1-5μL( 我 们 建 议 使 用 磷 酸 盐 缓 冲 液 比 如 0.1M PBS,pH7.5, 也 可 以 使 用 ph 的 缓 冲 液 ); 注 意 : 缓 冲 液 必 须 不 含 一 级 胺 和 它 们 的 盐 2 在 室 温 或 者 稍 高 一 点 的 温 度, 让 膜 在 空 气 中 完 全 干 燥 一 般 需 要 1-2 分 钟 进 一 步 操 作 前, 固 定 的 蛋 白 质 完 全 干 燥 到 膜 上 是 很 关 键 的 灌 流 法 固 定 (Slot Blotting) 1 杂 交 液 应 该 包 括 0.1-1mg/mL 蛋 白 ; 2 将 膜 按 照 制 造 商 的 建 议 装 配 到 狭 缝 纸 中 ; 3 总 体 积 应 该 是 0.1ml 或 者 更 多 调 整 体 积, 要 让 液 流 通 过 时 间 是 5 分 钟 或 者 更 长 些 ( 我 们 建 议 使 用 磷 酸 盐 缓 冲 液 比 如 0.1M PBS,pH7.5 也 可 以 使 用 其 它 的 ph 的 缓 冲 液 ); 注 意 : 缓 冲 液 必 须 不 含 一 级 胺 和 它 们 的 盐 4 在 室 温 或 者 稍 高 一 点 的 温 度, 让 膜 在 空 气 中 完 全 干 燥 一 般 需 要 1-2 分 钟 进 一 步 操 作 前, 固 定 的 蛋 白 质 完 全 干 燥 到 膜 上 是 很 关 键 的 封 闭 和 检 测 的 建 议 固 定 和 干 燥 之 后, 膜 上 的 活 性 位 点 必 须 被 封 闭 这 可 以 用 含 有 一 级 胺 的 溶 液 很 好 地 完 成 建 议 的 封 闭 溶 液 ( 预 先 制 备 在 10~100mM,pH~7.0 的 PBS 中 ) 包 括 : 0.5% 酪 蛋 白 (casein) 1% 脱 脂 奶 粉 2% BSA ( 牛 血 清 白 蛋 白 ) 1% 卵 清 蛋 白 1 室 温 下, 在 封 闭 溶 液 中 浸 泡 膜 30 分 钟, 封 闭 完 成 后 不 需 要 冲 洗 膜 ; 2 进 一 步 操 作 前, 让 膜 在 室 温 或 者 稍 高 温 度 下 空 气 中 干 燥 ; 3 以 下 的 能 够 沉 淀 的 色 原 体 已 经 成 功 地 用 于 辣 根 过 氧 化 物 酶 酶 偶 联 物 : Tetramethyl benzidine (TMB) 四 甲 基 联 苯 胺 4-Chloro-1-naphthol (CN) 4- 氯 -1- 萘 酚 Diaminobenzidine (DAB) 二 氨 基 联 苯 胺 Diaminobenzidine 和 NiCl2-17 -

21 4 建 议 不 使 用 辣 根 过 氧 化 物 酶 的 底 物 Animoethylcarbazole (AEC) 氨 基 乙 基 咔 唑 或 者 DAB/CoCl2, 因 为 它 会 产 生 更 高 的 背 景 ; 5 下 面 的 底 物 已 经 成 功 用 于 碱 性 磷 酸 酶 偶 联 物 : 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲 哚 基 磷 酸 (BCIP),BCIP 二 钠 盐 /nitroblue tetrazolium 硝 基 四 氮 唑 蓝 (NBT) 问 题 解 答 指 南 -UltraBind 膜 存 在 太 多 酶 联 物 降 低 酶 联 物 浓 度 高 背 景 膜 封 闭 效 率 低 - 改 变 封 闭 试 剂 - 增 加 浸 泡 时 间 或 者 封 闭 试 剂 的 浓 度 - 封 闭 之 后 用 0.1% 的 Tween20 的 PBS(pH 7.5) 溶 液 背 景 污 点 溶 液 中 存 在 颗 粒 - 使 用 前 过 滤 试 剂 - 不 要 预 先 湿 润 膜 - 使 用 推 荐 的 固 定 缓 冲 液 生 色 反 应 很 弱 酶 联 物 浓 度 低 膜 上 残 留 有 去 污 剂 选 择 合 适 的 底 物 - 增 加 酶 偶 联 物 的 数 量 - 在 加 底 物 前 清 洗 膜 - 使 用 更 加 敏 感 的 底 物 ( 例 如 DAB, 而 不 是 CN)

22 参 考 文 献 1. Budowle, B. and Baechtel, F.S. Modifications to Improve the Effectiveness of Restriction Fragment Length Polymorphism Typing. Appl. Theor. Electrophor. 1, p , Dubitsky, A.; Brown, J.; Brandwein, H. Chemiluminescent Detection of DNA on Nylon Membranes, BioTechniques 13, p , Hames, Ed. And Higgins, S.J. Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach. IRL Press Ltd., Oxford, UK, Maniatis, T.; Fritsch, E.F.; Sambrook, J. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., Meinkoth, J. and Wahl, G. Hybridization of Nucleic Acids Immobilized on Solid Supports, Anal. Biochem. 138, p , Reed, K.C. and Mann, D.A. Rapid transfer of DNA from agarose gels to nylon membranes. Nucleic Acids Research 13, , Wahl, G.M.; Stern, M.; Stark, G.R. Efficient Transfer of Large DNA Fragments from Agarose Gels to Diazobenzyloxymethyl-paper and Rapid Hybridization by Using Dextran Sulfate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, p , 其 他 可 能 用 到 的 产 品 超 滤 离 心 管 提 供 精 确 快 速 的 样 品 处 理, 样 品 体 积 和 相 对 应 装 置 如 下 : uL 500uL-3.5mL 1mL-15mL 15mL-60mL Nanosep Microsep Macrosep Jumbosep AcroWell 96-well and 384-well Filter Plates with BioTrace membranes exhibit high binding capacities for proteins and nucleic acids. AcroPrep 96-well and 384-well Filter Plates can be used for a variety of molecular biology, combinatorial chemistry, and screening applications

23 Biodyne 转 印 膜 具 有 较 高 的 灵 敏 度 和 较 低 的 本 底, 能 够 增 强 检 测 和 解 析 能 力 非 常 适 用 于 核 酸 检 测 ; 在 多 周 期 杂 交 剥 离 和 重 复 探 测 后 不 会 破 裂 收 缩 或 损 耗 ; 天 然 的 亲 水 性 使 其 便 于 湿 润 ; 在 放 射 (Biodne B 膜 ) 和 非 放 射 (Boidyne A 膜 ) 检 测 系 统 中 有 良 好 的 性 能 应 用 四 种 化 学 成 分 提 供 了 通 用 的 结 合 性 能 : Biodyne A ( 中 性 尼 龙 6,6) 可 以 通 过 改 变 ph 值 来 调 整 膜 电 势 适 用 于 单 探 针 或 多 次 再 杂 交 以 及 存 在 本 底 问 题 的 应 用 场 合 Biodyne B ( 正 荷 电 的 尼 龙 6,6) 通 过 高 密 度 的 季 铵 组 来 增 加 孔 的 表 面 我 们 所 生 产 的 尼 龙 膜 具 有 最 高 的 灵 敏 度, 适 用 于 各 种 核 酸 应 用 Biodyne C ( 负 电 荷 的 尼 龙 6,6) 可 以 通 过 孔 表 面 的 羧 基 组 耦 合 反 应 来 导 出 Biodyne Plus ( 正 电 荷 电 的 尼 龙 6,6, 带 有 一 个 极 高 的 等 电 位 点 ) 在 用 于 特 定 的 非 放 射 性 检 测 系 统 时, 它 比 Biodyne A 膜 的 敏 感 度 更 高, 而 本 底 比 Biodyne B 膜 更 低 技 术 规 格 Biodyne A Biodyne B Biodyne Plus 中 性 尼 龙 6,6 正 电 荷 的 尼 龙 6, 或 者 1.2μm 6.0±0.5mils Biodyne B Biodyne Plus 正 电 荷 的 尼 龙 6,6 能 够 抵 抗 普 通 溶 剂, 比 如 丙 酮 酒 精 氯 化 脂 肪 族 烃 甲 酰 胺 2 摩 尔 氢 氧 化 钠 DMSO 以 及 二 甲 基 甲 酰 胺 与 浓 缩 蚁 酸 (>50%) 盐 酸 (>4mol) 氧 化 剂 不 兼 容, 不 能 长 时 间 ( 数 天 到 数 周 ) 暴 露 于 ph<2 的 环 境 中

24 性 能 Biodyne B Biodyne Plus HindllI 消 化 的 1-DNA(1000-1ng/ 道 ) 稀 释 物 被 分 离 在 一 个 琼 脂 糖 凝 胶 中 并 转 印 到 Biodyne Plus 膜 通 过 一 个 荧 光 素 标 记 探 针 反 荧 光 素 磷 酸 酶 对 以 及 沉 淀 衬 底 来 生 成 信 号 用 Fluormager * 系 统 来 扫 描 斑 点, 从 而 生 成 图 像 Lambda-Hindlll 碎 片 被 分 离 在 一 个 琼 脂 糖 凝 胶 中, 并 通 过 Pall 公 司 生 产 的 改 良 后 Alkaline Transfer 方 法, 转 印 到 Biodyne B 膜 斑 点 被 完 全 剥 离, 并 进 行 四 次 探 测, 在 此 过 程 中 不 会 损 坏 信 号 密 度 通 过 一 个 化 合 光 检 测 系 统 来 检 测 条 带 1A-4A: 再 探 测 之 后 的 斑 点 1B-4B: 剥 离 之 后 和 再 探 测 之 前 的 斑 点 订 购 信 息 Boidyne A Boidyne A 0.45μm Biodyne C 0.45μm Biodyne Plus 0.45μm

25 BioTrace TM NT 纯 硝 酸 纤 维 素 转 印 膜 非 常 适 合 菌 群 / 菌 斑 提 取 和 蛋 白 质 转 印 坚 固 耐 用 : 与 同 类 硝 酸 纤 维 相 比 更 耐 磨, 更 不 容 易 破 裂 ; 对 蛋 白 质 和 核 酸 具 有 良 好 的 接 合 能 力 ; 比 同 类 产 品 的 蛋 白 质 穿 透 率 更 低 应 用 菌 落 / 菌 斑 提 取 蛋 白 穿 透 点 / 条 斑 技 术 规 格 硝 酸 纤 维 性 能 145μm(5.7mils) 0.2μm 209μg/cm 2 BioTrace NT 将 预 先 着 色 的 蛋 白 质 在 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 中 分 离, 并 转 移 到 硝 酸 纤 维 素 膜 在 操 作 中 使 用 了 双 层 膜, 其 中 第 一 层 直 接 放 在 凝 胶 上, 第 二 层 贴 着 第 一 层 第 二 层 的 信 号 密 度 通 过 穿 透 情 况 来 显 示, 穿 透 会 导 致 第 一 层 的 信 号 损 耗 订 购 信 息 BioTrace NT AcroWell TM μl

26 FluoroTrans PVDF 膜 低 本 底 和 极 低 穿 透 率 的 敏 感 蛋 白 质 检 测 理 想 之 选 普 通 疏 水 聚 偏 氟 乙 烯, 适 用 于 多 种 蛋 白 质 分 析 应 用 场 合 ;FluoroTrans 介 质 系 列 是 白 色 多 孔 固 体 支 撑 物 质, 能 够 通 过 疏 水 反 应 牢 固 地 接 合 蛋 白 质 ; 高 蛋 白 接 合 能 力 : 通 常 比 尼 龙 或 者 硝 酸 纤 维 的 吸 附 能 力 高 50%; FluoroTrans 膜 经 过 了 优 化, 能 够 用 于 N- 端 蛋 白 质 排 序 ; FluoroTrans W 膜 经 过 了 优 化, 适 用 于 Western 转 印 应 用 ; 通 过 这 种 膜, 可 以 进 行 低 本 底 和 极 低 蛋 白 质 穿 透 率 的 敏 感 蛋 白 质 检 测 ; 可 以 借 助 Comassie Blue,Amido Black,Ponceau S 和 Colloidal Gold 来 检 测 固 定 蛋 白 质 ; 敏 感 度 很 高, 可 以 用 于 小 肽 段 应 用 FluoroTrans W 膜 : Western 转 印 FluoroTrans 膜 : N- 端 子 蛋 白 质 测 序 FluoroTrans 介 质 具 有 较 高 的 拉 伸 强 度, 在 操 作 过 程 中 不 会 破 开 裂 开 或 卷 曲 这 样 一 来, 在 蛋 白 质 测 序 操 作 中, 就 可 以 很 方 便 地 卸 下 目 标 条 带 技 术 规 格 疏 水 聚 偏 氟 乙 烯 (PVDF) 0.2μm 性 能 127μm(5mils) 参 见 化 学 兼 容 性 表 用 于 Western 转 印 的 FluoroTrans 膜 具 有 非 常 好 的 敏 感 度 信 号 和 本 底 兔 红 血 球 裂 解 液, 被 稀 释 到 和, 通 过 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 后, 蛋 白 转 印 到 膜 上, 用 0.1% 的 氨 基 黑 45% 的 甲 醇 和 2% 的 乙 酸 将 膜 染 色 4 分 钟, 然 后 通 过 90% 的 甲 醇 和 2% 的 乙 酸 对 膜 进 行 退 色 操 作 把 染 色 的 膜 用 水 冲 洗, 然 后 风 干 订 购 信 息 FluoroTrans FluoroTrans W

27 BioTrace T M PVDF 转 印 膜 蛋 白 转 印 膜 对 于 化 学 发 光 检 测 系 统 具 有 低 本 底 ; 与 常 用 的 溶 剂 保 持 兼 容 应 用 Western 印 迹 Southern 印 迹 技 术 规 格 疏 水 聚 偏 氟 乙 稀 147μm(5.8mils) 性 能 28bar(280kPa,410psi) 参 见 化 学 兼 容 性 表 0.45μm BioTrace PVDF Western 将 E.coil 从 10 到 20% 的 梯 度 凝 胶 转 印 到 BioTrace PVDF 和 同 类 的 品 牌 PVDF 膜, 然 后 用 兔 抗 -E.coil 抗 体 进 行 探 测 通 过 过 氧 化 酶 配 对 的 山 羊 抗 兔 抗 体 和 四 氯 一 萘 酚 衬 底 溶 液 观 察 蛋 白 质 订 购 信 息 BioTrace PVDF AcroWell 96 PVDF μl

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