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1 丹 酚 酸 B 对 MC3T3-E1 细 胞 Cbfa1 基 因 表 # 达 的 影 响 及 Cbfa1 启 动 子 活 性 的 调 节 郑 纺 1, 王 洪 武 1, 鲍 丽 颖 1, 赵 舒 武 1, 庞 晓 丽 (1. 天 津 中 医 药 大 学 中 医 学 院, 天 津 ; 2. 天 津 中 医 药 大 学 护 理 学 院, 天 津 ) 摘 要 : 目 的 探 讨 丹 酚 酸 B 对 小 鼠 MC3T3-E1 细 胞 核 结 合 因 子 a1(cbfa1) 基 因 mrna 表 达 和 Cbfa1 启 动 子 活 性 的 影 响 方 法 分 别 采 用 不 同 浓 度 丹 酚 酸 B 干 预 小 鼠 MC3T3-E1 前 成 骨 细 胞 系 24 和 48 小 时,real-time PCR 检 测 丹 酚 酸 B 对 细 胞 中 Cbfa1 基 因 mrna 表 达 的 影 响 ; 构 建 小 鼠 Cbfa1 基 因 启 动 子 荧 光 素 酶 报 告 基 因 载 体 并 转 染 MC3T3-E1 细 胞, 通 过 检 测 荧 光 素 酶 活 性 观 察 丹 酚 酸 B 对 Cbfa1 启 动 子 活 性 的 调 节 结 果 1μM 和 10μM 的 丹 酚 酸 B 分 别 处 理 MC3T3-E1 细 胞 24 小 时 和 48 小 时, 可 上 调 Cbfa1 mrna 的 表 达 (F=23.24,P<0.01), 其 中 以 1μM 丹 酚 酸 B 处 理 48 小 时 上 调 效 应 最 显 著, 约 为 对 照 组 的 1.71 倍 (t=10.36,p<0.01) 1μM 和 10μM 的 丹 酚 酸 B 干 预 MC3T3-E1 细 胞 后,Cbfa1 启 动 子 活 性 升 高, 分 别 为 对 照 组 的 倍 (F=13.27,t 分 别 为 ,P<0.01) 结 论 丹 酚 酸 B 可 促 进 MC3T3-E1 细 胞 中 Cbfa1 基 因 表 达 并 上 调 Cbfa1 启 动 子 活 性 关 键 词 : 中 西 医 结 合 医 学 ; 丹 酚 酸 B; 核 结 合 因 子 a1; 基 因 表 达 ; 启 动 子 中 图 分 类 号 :R34 Action of Salvianolic Acid B on Cbfa1 Gene Expression in MC3T3-E1 Cells and Activity of Cbfa1 Promoter ZHENG Fang 1, WANG Hongwu 1, BAO Liying 1, ZHAO Shuwu 1, Pang Xiaoli 2 (1. Traditional Chinese Medicine School,Tianjin University of Tradtional Chinese Medicine, TianJin ; 2. Nursing School, Tianjin University of Tradtional Chinese Medicine, TianJin ) Abstract: Objective Explore the effects of salvianolic acid B(SalB) on the mrna expression of Cbfa1 gene in MC3T3-E1 cell line and the activity of Cbfa1 promoter. Methods The mouse MC3T3-E1 cells were treated for 24hours or 48hours with SalB of different concentration respectively. The mrna expression of Cbfa1 gene were examined by using real-time RT-PCR. Luciferase reporter vector of mice Cbfa1 promoter was constructed and then transfected into MC3T3-E1 cells. The action of SalB on the activity of Cbfa1 promoter were evaluated by monitoring the expression of luciferase. Results We demonstrated in MC3T3-E1cells, 0.1μM and 10μM SalB increased Cbfa1 mrna expression after treatment for 24hours and 48hours(F=23.24, P<0.01). The maximum increase of Cbfa1mRNA level is 1.71-fold greater than that of contol under intervention of 0.1μM SalB for 48hours(t=10.36,P<0.01). Compared with the control, the promoter activity of Cbfa1 gene were upregulated to 2.63-fold and 1.89-fold respectively after treating with 0.1μM and 10μM SalB(F=13.27,t= ,P<0.01). Conclusions SalB can increase Cbfa1 gene expression and promote Cbfa1 promoter activity in MC3T3-E1 cells. Keywords: Integrated TCM and Western Medicine; salvianolic acid B; core binding factor a1; gene expression; promoter 2 0 引 言 丹 参 (Salvia miltiorrhiza Bge.) 又 名 赤 参, 紫 丹 参, 红 根 等, 为 双 子 叶 植 物 唇 形 科 鼠 尾 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( ) 教 育 部 高 等 学 校 博 士 学 科 点 专 项 科 研 基 金 ( ), 天 津 市 高 等 学 校 科 技 发 展 基 金 计 划 项 目 ( ) 作 者 简 介 : 郑 纺,(1979-), 女, 副 教 授, 骨 质 疏 松 发 病 机 制 及 中 医 药 防 治 骨 质 疏 松 的 治 疗 学 研 究 zhengfang_1979@163.com - 1 -

2 45 50 草 属 植 物 丹 参 的 干 燥 根 及 根 茎, 日 华 子 本 草 中 记 载 其 通 利 关 脉, 治 冷 热 劳, 骨 节 疼 痛, 四 肢 不 遂 体 内 外 研 究 表 明 [1,2], 丹 参 及 其 水 提 物 提 高 改 善 糖 皮 质 激 素 诱 导 的 骨 质 疏 松 大 鼠 的 骨 量, 提 高 成 骨 细 胞 活 性, 促 进 骨 基 质 合 成, 用 于 糖 皮 质 激 素 性 骨 质 疏 松 (Glucocorticoid-induced osteoporosis, GIOP) 的 防 治, 但 具 体 机 制 目 前 尚 不 十 分 清 楚 核 结 合 因 子 a1(core binding factor a1, Cbfa1) 是 成 骨 细 胞 分 化 成 熟 必 不 可 少 的 转 录 因 子, 在 骨 形 成 过 程 中 发 挥 着 重 要 的 分 子 开 关 作 用 本 研 究 通 过 探 讨 丹 参 的 活 性 单 体 丹 酚 酸 B 对 小 鼠 MC3T3-E1 前 成 骨 细 胞 Cbfa1 基 因 mrna 表 达 和 Cbfa1 启 动 子 活 性 的 影 响, 以 期 为 揭 示 丹 参 防 治 GIOP 的 分 子 机 制 提 供 一 定 的 理 论 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 主 要 试 剂 丹 酚 酸 B( 中 国 药 品 生 物 制 品 检 定 所 ) pgl3-basic 和 prl-sv40 载 体 Dual-Luciferase 双 荧 光 素 酶 报 告 基 因 检 测 系 统 MMLV 逆 转 录 酶 (promega 公 司 ) DMEM 高 糖 培 基 (Hyclone 公 司 ) 胎 牛 血 清 (FBS,Gibico 公 司 ) Trizol SYBR Green PCR Mix 购 自 Toyobo (Japan) 1.2 小 鼠 Cbfa1 启 动 子 萤 光 素 酶 报 告 载 体 的 构 建 [3] 根 据 文 献 策 略, 使 用 巢 式 PCR 扩 增 小 鼠 Cbfa1 启 动 子 区 bp~+200 bp 区 域 片 段, 并 将 该 片 段 通 过 XhoI 和 MluI 酶 引 入 无 启 动 子 的 报 告 基 因 载 体 pgl3-basic, 构 建 小 鼠 报 告 基 因 载 体 pgl3-cbfa1 1.3 MC3T3-E1 细 胞 的 培 养 65 冻 存 的 MC3T3-E1 细 胞 复 苏 后, 用 含 有 10%FBS 100u/mL 青 霉 素 100u/mL 链 霉 素 的 α-mem 培 养 基 重 悬 细 胞, 接 种 于 75cm2 培 养 瓶 中, 在 37 5%CO2 条 件 下 培 养 每 隔 2~ 3 天 细 胞 换 液, 待 细 胞 生 长 至 80~90% 汇 合 时, 消 化 细 胞 换 用 无 抗 生 素 的 α-mem( 含 5% FBS) 培 养 基 继 续 培 养 24 小 时, 然 后 对 细 胞 进 行 不 同 处 理 1.4 细 胞 总 RNA 的 提 取 和 cdna 的 逆 转 录 合 成 70 分 别 使 用 10nM 0.1μM 1μM 和 10μM 的 丹 酚 酸 B 干 预 MC3T3-E1 细 胞 小 时, 收 获 细 胞,TRIZOL 法 提 取 细 胞 总 RNA, 测 定 样 品 OD260 OD280 和 OD230, 根 据 OD260 值 计 算 RNA 样 品 的 浓 度 ; 根 据 OD260/OD280 和 OD260/OD230 的 比 值 鉴 定 总 RNA 纯 度 甲 醛 变 性 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 鉴 定 总 RNA 完 整 性 根 据 MMLV 逆 转 录 酶 的 说 明 书 将 2μg 的 总 RNA 逆 转 录 合 成 cdna 第 一 链 1.5 real-time PCR 检 测 Cbfa1 基 因 的 表 达 引 物 设 计 75 引 物 设 计 参 照 Genebank 发 表 的 小 鼠 Cbfa1 和 β-actin 的 cdna 序 列, 采 用 generunner3.05 软 件 自 行 设 计, 由 北 京 奥 科 鼎 盛 生 物 科 技 有 限 公 司 合 成 引 物 序 列 见 表

3 表 1 实 时 荧 光 定 量 PCR 引 物 Table1 Primer for real-time PCR 基 因 名 称 引 物 序 列 扩 增 片 段 长 度 (bp) Cbfa1 上 游 : 5 -GCGCATTCCTCATCCCAGTA 下 游 : 5 -CTGGCTCAGATAGGAGGGGT-3 β-actin 上 游 : 5 -TCAGGTTACTGGTTCGGTCTG-3 下 游 : 5 -ACCAGAGGCATACAGGGACAG 实 时 荧 光 定 量 PCR 反 应 体 系 和 循 环 参 数 定 量 PCR 总 扩 增 体 系 为 25μL, 包 括 cdna 模 板 5μL, 上 下 游 引 物 (10μM) 各 1μL, 2 SYBR Green Master Mix 12.5μL,ddH 2 O 7.5μL PCR 循 环 参 数 为 :95 预 变 性 5min,94 10sec,60 10sec,72 10sec, 进 行 40(Cbfa1) 或 30(β-actin) 个 循 环 随 后 绘 制 PCR 产 物 的 融 解 曲 线 来 了 解 样 品 扩 增 的 特 异 性, 反 应 参 数 为 :95 0sec,65 15sec,95 0sec 管 家 基 因 β-actin 被 用 来 标 准 化 样 品, 实 验 结 果 数 值 以 Ct 值 表 示, 并 转 换 为 2 Ct 来 表 示 药 物 干 预 组 细 胞 Cbfa1 mrna 相 对 于 对 照 组 细 胞 Cbfa1 mrna 表 达 量 的 倍 数 1.6 丹 酚 酸 B 对 Cbfa1 基 因 启 动 子 活 性 作 用 的 研 究 95 使 用 Lipofectime2000 将 重 组 报 告 载 体 pgl3-cbfa1 瞬 时 转 染 MC3T3-E1 细 胞, 每 孔 均 同 时 转 染 0.1μg prl-sv40 质 粒 作 为 内 参 照 转 染 6 小 时 后, 弃 去 转 染 液, 根 据 上 一 实 验 结 果 换 用 适 宜 浓 度 的 含 药 物 血 清 干 预 细 胞,48 小 时 后 使 用 Dual-Luciferase 双 荧 光 素 酶 报 告 基 因 检 测 系 统 分 别 测 定 萤 火 虫 荧 光 素 酶 活 性 和 海 肾 荧 光 活 性, 取 二 者 比 值 作 为 Cbfa1 启 动 子 荧 光 素 酶 的 相 对 活 性 1.7 统 计 学 分 析 100 实 验 中 所 得 数 据 均 以 x ±s 来 表 示, 多 组 比 较 使 用 单 因 素 方 差 分 析 (one-way ANOVA), 两 两 比 较 采 用 Student-Newman-Keuls t 检 验 统 计 学 检 验 水 准 为 0.05 P<0.05 被 认 为 有 统 计 学 意 义 所 有 统 计 分 析 均 采 用 SPSS19.0 统 计 软 件 完 成 2 结 果 2.1 不 同 浓 度 丹 酚 酸 B 对 MC3T3-E1 细 胞 Cbfa1 基 因 表 达 的 影 响 105 结 果 如 图 1 所 示, 与 对 照 组 相 比,1μM 和 10μM 的 丹 酚 酸 B 作 用 于 MC3T3-E1 细 胞 24 小 时 和 48 小 时 均 能 上 调 Cbfa1 基 因 的 表 达 (F=23.24,P<0.01), 其 中 以 1μM 丹 酚 酸 B 作 用 48 小 时 上 调 效 应 最 明 显, 约 为 control 组 的 1.71 倍 (t=10.36,p<0.01) - 3 -

4 Cbfa1 基 因 表 达 水 平 ( 倍 数 ) h 48h 0 control(0m) 10nM 丹 酚 酸 B 的 浓 度 图 1 丹 酚 酸 B 对 MC3T3-E1 细 胞 Cbfa1 mrna 表 达 的 影 响 与 control 比 较,P<0.05 fig.1 Action of SalB on the expression of Cbfa1 mrna in MC3T3-E1 cells compared with control,p< 丹 酚 酸 B 对 小 鼠 Cbfa1 基 因 启 动 子 活 性 的 调 节 110 根 据 上 一 实 验 结 果, 选 择 1μM 和 10μM 的 丹 酚 酸 B, 作 用 于 转 染 Cbfa1 启 动 子 的 MC3T3-E1 细 胞,48 小 时 后 取 细 胞 裂 解 液 上 清 测 定 萤 火 虫 荧 光 素 酶 活 性 和 海 肾 荧 光 素 酶 活 性, 计 算 两 者 的 比 值 作 为 Cbfa1 启 动 子 的 相 对 荧 光 强 度 荧 光 素 酶 活 性 ( 倍 数 ) control (pgl3- Basic) 1μM 10μM 图 2 丹 酚 酸 B 对 Cbfa1 启 动 子 活 性 的 调 节 与 control 组 比 较,P<0.05 fig.2 Regulation of Cbfa1 promoter by SalB compared with control,p<0.05 结 果 如 图 2 显 示, 与 对 照 组 相 比 ( 对 照 组 相 对 萤 光 素 酶 活 性 设 为 1),1μM 和 10μM 丹 酚 酸 B 分 别 干 预 MC3T3-E1 细 胞 后,Cbfa1 启 动 子 活 性 升 高 (F=13.27,P<0.05), 分 别 为 对 照 组 的 倍 (t 分 别 为 ,P<0.01) 讨 论 GIOP 是 临 床 上 糖 皮 质 激 素 (Glucocorticoids,GCs) 治 疗 的 严 重 并 发 症 之 一 在 各 种 原 因 引 起 的 骨 质 疏 松 症 中,GIOP 的 发 生 率 仅 次 于 绝 经 后 骨 质 疏 松 和 老 年 性 骨 质 疏 松 居 于 第 三 - 4 -

5 位 GIOP 主 要 以 骨 量 减 少 和 骨 组 织 的 微 细 结 构 破 坏, 骨 脆 性 增 加, 并 容 易 发 生 骨 折 为 特 征 研 究 发 现, 长 期 接 受 GCs 治 疗 的 慢 性 疾 病 患 者 中, 最 终 约 有 30%-50% 会 发 展 为 骨 质 疏 松, 且 这 些 患 者 骨 折 的 发 生 率 也 远 高 于 非 糖 皮 质 激 素 治 疗 患 者 [4] 随 着 GCs 在 临 床 上 的 广 泛 应 用,GIOP 发 生 率 也 在 逐 年 上 升, 严 重 威 胁 人 类 健 康 和 生 活 质 量 因 此, 寻 找 有 效 的 GIOP 防 治 手 段 并 深 入 探 讨 其 防 治 机 制 非 常 必 要 丹 参 是 中 医 临 床 上 常 用 的 活 血 化 淤 药 物, 应 用 历 史 悠 久, 始 载 于 神 农 本 草 经, 列 为 上 品, 具 有 抗 氧 化, 改 善 微 循 环, 防 止 血 栓 形 成 等 作 用 丹 酚 酸 B 为 丹 参 的 水 溶 性 活 性 [5] 单 体, 它 由 三 分 子 丹 参 素 与 一 分 子 咖 啡 酸 缩 合 而 成 现 行 药 典 将 丹 酚 酸 B 的 含 量 作 为 丹 参 的 质 量 评 价 标 准 近 年 来 丹 参 在 GIOP 防 治 方 面 的 潜 力 逐 渐 为 人 们 所 认 识, 然 而 目 前 有 关 丹 酚 酸 B 与 骨 特 异 性 基 因 调 控 关 系 的 研 究 并 不 多 见 在 GIOP 的 发 生 过 程 中 成 骨 细 胞 是 糖 皮 质 激 素 作 用 于 骨 的 主 要 位 点 研 究 表 明, GIOP 的 骨 形 成 减 少 主 要 表 现 为 成 骨 细 胞 活 性 降 低 及 凋 亡 加 速, 从 而 使 骨 形 成 降 低, 最 终 表 现 为 骨 量 减 少 [6] 因 此, 增 强 成 骨 细 胞 活 性 对 于 GIOP 的 防 治 尤 为 重 要 Cbfa1 是 成 骨 细 胞 分 化 和 功 能 的 核 心 调 控 因 子 研 究 发 现,Cbfa1 在 成 骨 细 胞 谱 系 高 表 达, 它 能 与 骨 钙 素 骨 桥 蛋 白 和 I 型 胶 原 等 成 骨 细 胞 下 游 表 征 基 因 启 动 子 区 的 特 异 性 顺 式 作 用 元 件 2(OSE2) 结 合 激 活 这 些 表 征 基 因 的 表 达, 从 而 促 进 成 骨 分 化 ; 同 时 它 还 能 诱 导 多 潜 能 间 充 质 干 细 胞 向 成 骨 细 胞 表 型 分 化, 促 进 骨 小 结 形 成 [7,8] Cbfa1 基 因 敲 除 的 纯 合 子 小 鼠, 成 骨 细 胞 分 化 完 全 受 阻, 骨 组 织 不 能 形 成, 出 生 后 由 于 无 法 自 主 呼 吸 而 死 亡 Cbfa1 基 因 敲 除 的 杂 合 子 小 鼠 出 生 时 骨 组 织 发 育 明 显 受 阻 [9] 基 于 Cbfa1 在 骨 形 成 过 程 中 发 挥 的 关 键 作 用, 从 Cbfa1 与 促 骨 形 成 药 物 的 关 系 入 手 进 行 研 究 将 有 助 于 揭 示 药 物 抗 骨 质 疏 松 的 机 制 本 研 究 首 先 使 用 不 同 浓 度 的 丹 酚 酸 B 干 预 MC3T3-E1 细 胞 24 和 48 小 时,real-time PCR 检 测 丹 酚 酸 B 对 Cbfa1 基 因 mrna 表 达 的 影 响,1μM 和 10μM 的 丹 酚 酸 B 作 用 于 细 胞 24 小 时 和 48 小 时 均 能 上 调 Cbfa1 基 因 的 表 达 接 下 来 借 助 于 前 期 构 建 的 小 鼠 Cbfa1 启 动 子 萤 光 素 酶 报 告 载 体 转 染 MC3T3-E1 细 胞, 采 用 1μM 和 10μM 的 丹 酚 酸 B 干 预 细 胞, 考 察 药 物 对 报 告 基 因 表 达 水 平 的 影 响 研 究 发 现 1μM 和 10μM 丹 酚 酸 B 能 上 调 MC3T3-E1 细 胞 Cbfa1 基 因 启 动 子 活 性, 分 别 是 对 照 组 的 2.63 和 1.89 倍, 说 明 丹 酚 酸 B 能 够 从 启 动 子 水 平 影 响 Cbfa1 基 因 的 表 达 上 述 研 究 结 果 提 示 丹 酚 酸 B 能 够 通 过 增 强 成 骨 特 异 性 基 因 的 表 达 来 发 挥 对 成 骨 细 胞 活 性 和 功 能 的 调 控, 同 时 为 阐 明 丹 参 防 治 GIOP 的 机 制 提 供 实 验 依 据 [ 参 考 文 献 ] (References) [1] 崔 燎, 邹 丽 宜, 刘 钰 瑜, 艾 春 媚, 吴 铁, 吴 怡. 丹 参 水 提 物 和 丹 参 素 促 进 成 骨 细 胞 活 性 和 防 治 泼 尼 松 所 致 大 鼠 骨 质 疏 松 [J]. 中 国 药 理 学 通,2004,20(3): [2] 肖 柳 斌, 刘 国 雄, 王 晖. 丹 参 水 提 液 对 抗 大 鼠 泼 尼 松 性 骨 质 疏 松 的 作 用 研 究 [J]. 中 国 临 床 药 理 学 与 治 疗 学,2008,13(1): [3] 郑 纺, 崔 壮, 王 宝 利, 王 洪 武. 小 鼠 核 结 合 因 子 a1 基 因 启 动 子 报 告 载 体 的 构 建 及 鉴 定 [J]. 天 津 医 药,2011, 39(12): [4] Lane NE,Lukert B. The science and therapy of glucocorticoid-induced bone loss[j]. Endocrinol Metab Clin North Am. 1998, 27(2): [5] 国 家 药 典 委 员 会. 中 华 人 民 共 和 国 药 典 :( 一 部 )[M]. 北 京 : 中 国 医 药 科 技 出 版 社,2010. [6] Beatrice Bouvard, Erick Legrand, Maurice Audran, Daniel Chappard. Glucocorticoid-Induced Osteoporosis: A Review[J]. Clinic Rev Bone Miner Metab, 2010, 8: [7] Jonason JH, Xiao G, Zhang M, Xing L, Chen D. Post-translational Regulation of Runx2 in Bone and Cartilage[J]. J Dent Res, 2009, 88(8): [8] Igarashi M, Kamiya N, Hasegawa M. Inductive effects of dexamethasone on the gene expression of Cbfa1,Osterix and bone matrix proteins during differentiation of cultured primary rat osteoblasts[j]. J Mol Histol, 2004, 35(1):

6 165 [9] Komori T, Yagi H, Nomura S, et al. Targeted disruption of Cbfa1 results in a complete lack of bone formation owing to maturational arrest of osteoblasts[j]. Cell, 1997, 89(5):

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