540 中 国 药 理 学 通 报 ChinesePharmacologicalBuletin 2010Apr;26(4) 1.4 腰 椎 生 物 力 学 参 数 的 测 定 取 第 4 腰 椎 进 行 椎 体 压 缩 试 验, 加 载 速 度 为 0 01mm/s, 跨 距 (L) 为 15mm,
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1 ChinesePharmacologicalBuletin 2010Apr;26(4):539~ 维 甲 酸 致 大 鼠 骨 质 疏 松 模 型 探 讨 及 丹 参 骨 宝 的 预 防 作 用 许 碧 莲 1,2, 崔 燎 1,2, 陈 文 双 2, 魏 天 佑 1 1, 吴 铁 ( 广 东 医 学 院 1. 药 理 学 教 研 室 2. 广 东 天 然 药 物 研 究 与 开 发 重 点 实 验 室, 广 东 湛 江 ) 中 国 图 书 分 类 号 :R 332;R282.71;R323.72;R ; R 文 献 标 识 码 :A 文 章 编 号 : (2010) 摘 要 : 目 的 探 讨 维 甲 酸 (RA) 致 大 鼠 骨 质 疏 松 模 型 特 点 及 丹 参 骨 宝 的 预 防 作 用 方 法 4mon SD 大 鼠 灌 服 RA70 mg kg -1 d -1 造 模, 然 后 给 予 丹 参 骨 宝 进 行 预 防, 用 药 时 间 为 28d 用 骨 组 织 形 态 计 量 学 方 法 测 定 大 鼠 第 5 腰 椎 松 质 骨 静 态 动 态 参 数 和 观 察 胫 骨 中 段 皮 质 骨 的 动 态 变 化 情 况, 大 鼠 第 4 腰 椎 用 骨 生 物 力 学 方 法 作 椎 体 压 缩 试 验 结 果 与 空 白 对 照 组 比 较,RA 组 大 鼠 腰 椎 生 物 力 学 参 数 下 降, 腰 椎 松 质 骨 静 态 参 数 ( 骨 组 织 总 面 积 骨 小 梁 面 积 骨 小 梁 周 长 ) 和 动 态 参 数 均 降 低, 皮 质 骨 骨 外 膜 的 骨 形 成 减 弱 而 骨 内 膜 的 骨 形 成 增 强 与 RA 组 比 较, 低 中 剂 量 丹 参 骨 宝 使 腰 椎 生 物 力 学 参 数 增 加 结 论 RA 使 大 鼠 椎 骨 的 几 何 形 状 缩 小 和 生 物 力 学 性 能 降 低, 但 骨 小 梁 面 积 百 分 数 无 明 显 改 变 其 机 制 可 能 与 RA 抑 制 松 质 骨 的 骨 形 成, 抑 制 皮 质 骨 骨 外 膜 的 骨 建 造 而 增 强 骨 内 膜 的 骨 重 建 有 关 丹 参 骨 宝 对 RA 致 大 鼠 椎 骨 生 物 力 学 状 况 有 改 善 作 用 关 键 词 : 骨 质 疏 松 ; 维 甲 酸 ; 丹 参 ; 骨 组 织 形 态 计 量 学 ; 骨 生 物 力 学 ; 大 鼠 维 甲 酸 所 导 致 的 骨 质 疏 松 动 物 模 型 由 邵 金 莺 [1] 等 在 1989 年 首 创, 其 后 有 不 同 的 研 究 者 对 其 进 行 [2] 了 机 制 研 究 和 方 法 改 进 吴 波 等 发 现 该 模 型 导 致 骨 质 疏 松 的 特 点 是 维 甲 酸 可 以 激 活 破 骨 细 胞 的 活 性, 促 进 骨 吸 收, 但 不 抑 制 成 骨 细 胞 的 活 性, 使 骨 吸 收 大 于 骨 形 成 而 引 起 骨 质 疏 松 ; 但 是 胡 彬 和 许 鹏 [3,4] 等 等 得 出 的 结 论 却 与 吴 波 的 不 完 全 相 同, 他 们 发 现, 维 甲 酸 不 仅 可 以 激 活 破 骨 细 胞 的 活 性, 同 时 也 可 以 增 加 成 骨 细 胞 的 活 性, 形 成 一 种 类 似 于 高 转 换 型 骨 质 疏 松 动 物 模 型 维 甲 酸 所 导 致 的 骨 质 疏 松 究 竟 有 何 特 点, 本 文 对 此 进 行 进 一 步 探 讨 收 稿 日 期 : , 修 回 日 期 : 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 (No , ); 东 莞 市 科 技 计 划 项 目 (No ) 作 者 简 介 : 许 碧 莲 (1970-), 女, 硕 士, 副 教 授, 硕 士 生 导 师,Tel: ,E mail:gdmcxu@126.com; 崔 燎 (1962-), 女, 博 士, 教 授, 硕 士 生 导 师, 研 究 方 向 : 骨 质 疏 松 的 药 物 防 治,Tel: ,Fax: ,E mail:cuiliao@163.com 丹 参 骨 宝 是 本 课 题 组 正 在 研 发 的 抗 骨 质 疏 松 药, 其 核 心 成 分 为 丹 参 水 溶 性 成 分 丹 参 素 本 课 题 组 前 期 的 动 物 实 验 研 究 显 示, 丹 参 骨 宝 可 以 预 防 去 卵 巢 糖 皮 质 激 素 环 磷 酰 胺 等 所 诱 发 的 大 鼠 骨 质 疏 松 [5~7], 但 对 维 甲 酸 诱 发 骨 质 疏 松 是 否 也 有 预 防 作 用, 尚 未 进 一 步 研 究 故 本 文 探 讨 丹 参 骨 宝 对 维 甲 酸 诱 发 大 鼠 骨 质 疏 松 的 影 响, 为 把 丹 参 骨 宝 开 发 成 抗 骨 质 疏 松 的 中 药 五 类 提 供 实 验 依 据 1 材 料 与 方 法 [7] 1.1 丹 参 骨 宝 的 制 备 按 本 课 题 组 提 取 工 艺 制 备 得 到 的 丹 参 骨 宝, 配 制 成 实 验 所 需 的 高 中 低 3 种 不 同 的 剂 量 : 每 1ml 提 取 液 分 别 含 丹 参 素 2mg ( 高 剂 量 ) 1mg( 中 剂 量 ) 0 5mg( 低 剂 量 ), 密 封 消 毒,4 冰 箱 保 存 备 用 1.2 试 剂 及 仪 器 全 反 式 维 甲 酸 原 药 粉 购 自 东 北 制 药 总 厂, 盐 酸 四 环 素 钙 黄 绿 素 Goldner s 染 料 购 自 美 国 Sigma 公 司, 血 清 碱 性 磷 酸 酶 (ALP) 和 抗 酒 石 酸 酸 性 磷 酸 酶 (TRACP) 试 剂 盒 购 自 南 京 建 成 生 物 工 程 研 究 所 低 速 锯 (BuehlerLTD,USA); 硬 组 织 切 片 机 ( 德 国 Leica2155); 碳 化 钨 刚 刀 ( 德 国 Lei ca); 自 动 化 图 像 数 字 化 分 析 仪 包 括 光 镜 和 荧 光 显 微 镜 (Nikon, 日 本 ); 骨 组 织 形 态 计 量 学 测 量 软 件 (KSS ScientificConsultants,USA) 1.3 动 物 及 其 分 组 4mon 未 交 配 SD 大 鼠 共 40 只 (SPF 级, 广 东 医 学 院 实 验 动 物 中 心 提 供 ), 体 重 (270±15)g 大 鼠 随 机 分 成 5 组 : 空 白 对 照 (Con trol,con) 组 RA 组 丹 参 骨 宝 高 剂 量 (DS H ) 组 中 剂 量 (DS M ) 组 低 剂 量 (DS L ) 组, 每 组 8 只 CON 组 给 予 溶 剂 对 照 溶 液, 其 它 4 组 上 午 先 用 维 甲 酸 70 mg kg -1 d -1 造 模, 然 后 同 时 下 午 给 予 不 同 药 物 预 防,RA 组 给 予 溶 剂 对 照 溶 液,DSH DSM DSL 组 分 别 给 予 含 丹 参 素 mg kg -1 d -1 的 丹 参 骨 宝 大 鼠 每 次 按 5ml kg -1 灌 胃 给 药, 连 续 给 药 28d 每 周 称 体 重 1 次, 并 按 体 重 变 化 调 整 给 药 量 所 有 动 物 在 处 死 前 d14 13 和 d4 3 分 别 皮 下 注 射 盐 酸 四 环 素 30mg kg -1 和 钙 黄 绿 素 5mg kg -1 进 行 体 内 荧 光 标 记 实 验 结 束 时, 大 鼠 麻 醉 后 心 脏 抽 血 处 死, 迅 速 取 出 左 侧 胫 骨 及 第 4 5 腰 椎, 以 备 进 行 下 列 各 项 指 标 的 测 定
2 540 中 国 药 理 学 通 报 ChinesePharmacologicalBuletin 2010Apr;26(4) 1.4 腰 椎 生 物 力 学 参 数 的 测 定 取 第 4 腰 椎 进 行 椎 体 压 缩 试 验, 加 载 速 度 为 0 01mm/s, 跨 距 (L) 为 15mm, 仪 器 自 动 记 录 每 个 时 刻 点 的 载 荷 (F) 和 桡 度 (d) 变 化 值, 再 进 一 步 换 算 得 每 个 时 刻 点 的 应 力 和 应 变 值, 绘 制 应 力 - 应 变 曲 线, 从 曲 线 上 计 算 出 弹 性 载 荷 (N) 最 大 载 荷 (N) 断 裂 载 荷 (N) 刚 度 (N mm -1 ) 等 参 数 1.5 骨 组 织 形 态 计 量 学 测 定 取 第 5 腰 椎, 用 低 速 [8] 锯 暴 露 骨 髓 腔, 进 行 固 定 脱 水 包 埋, 按 文 献 制 成 5μm 和 8μm 切 片,5μm 骨 薄 片 采 用 Mason Goldner Trichrome 染 色, 染 色 后 测 量 破 骨 细 胞 数 (Oc.N) 和 破 骨 细 胞 贴 壁 周 长 (Oc.S.Pm),8μm 骨 [9] 厚 片 直 接 封 片 测 量 有 关 动 静 态 参 数, 然 后 按 公 式 计 算 出 相 应 的 参 数 取 胫 骨 中 段 先 进 行 Vilanueva [10] 染 色, 然 后 进 行 固 定 脱 水 包 埋, 按 文 献 制 成 40 μm 左 右 的 骨 片, 在 荧 光 显 微 镜 下 观 察 皮 质 骨 的 动 态 变 化 情 况 1.6 血 清 学 指 标 的 测 定 心 脏 取 血 分 离 血 清 后, 检 测 血 清 ALP TRACP 的 含 量, 具 体 操 作 按 试 剂 盒 说 明 书 进 行 1.7 统 计 学 方 法 计 量 资 料 以 x±s 珋 表 示,SPSS 11 5 软 件 行 方 差 分 析 并 行 组 间 比 较 2 结 果 2.1 维 甲 酸 及 丹 参 骨 宝 对 大 鼠 腰 椎 生 物 力 学 参 数 的 影 响 与 CON 组 比 较,RA 组 大 鼠 腰 椎 弹 性 载 荷 (Elasticload) 最 大 载 荷 (Maximumload) 断 裂 载 荷 (Breakload) 刚 度 (Stifnes) 均 明 显 下 降 (P< 0 01) 与 RA 组 比 较, 丹 参 骨 宝 低 剂 量 组 刚 度 增 加 (P<0 01), 中 剂 量 组 弹 性 载 荷 最 大 载 荷 断 裂 载 荷 刚 度 增 加 (P<0 05&P<0 01), 但 高 剂 量 组 各 项 指 标 都 无 变 化 见 Tab1 2.2 维 甲 酸 及 丹 参 骨 宝 对 大 鼠 腰 椎 松 质 骨 的 影 响 维 甲 酸 及 丹 参 骨 宝 对 大 鼠 腰 椎 静 态 参 数 的 影 响 与 CON 组 比 较,RA 组 大 鼠 腰 椎 骨 组 织 总 面 积 (T.Ar) 骨 小 梁 面 积 (Tb.Ar) 骨 小 梁 周 长 (Tb.Pm) 均 降 低 (P<0 01), 但 骨 小 梁 面 积 百 分 数 (%Tb.Ar) 骨 小 梁 数 量 (Tb.N) 骨 小 梁 厚 度 (Tb.Th) 骨 小 梁 分 离 度 (Tb.Sp) 无 明 显 变 化 (P>0 05) 与 RA 组 比 较, 丹 参 骨 宝 3 个 剂 量 组 均 无 变 化 见 Tab 维 甲 酸 及 丹 参 骨 宝 对 大 鼠 腰 椎 吸 收 参 数 和 动 态 参 数 的 影 响 与 CON 组 比 较,RA 组 大 鼠 腰 椎 标 记 周 长 百 分 数 (% L.Pm) 骨 形 成 率 (BFR/TV BFR/BV BFR/BS) 均 明 显 降 低 (P<0 05& P< 0 01), 但 吸 收 参 数 Oc.N Oc.S.Pm 无 明 显 变 化 (P >0 05) 与 RA 组 比 较, 丹 参 骨 宝 3 个 剂 量 组 均 无 明 显 变 化 见 Tab3 Tab1 TheefectsofRAandDanshengubaoonbiomechanicalpropertiesofLV4inrats( 珋 x±s,n=8) Group Elasticload/N Maximumload/N Breakload/N Stifnes/N mm -1 Control ± ± ± ± RA ± ± ± ± DS L ± ± ± ± DS M ± ± ± ± DS H ± ± ± ±62.97 P<0 01vscontrol; P<0 05, P<0 01vsRA Tab2 TheefectsofRAandDanshengubaoonstaticparametersofLV5inrats( 珋 x±s,n=8) Group T.Ar/mm 2 Tb.Ar/mm 2 Tb.Pm/mm %Tb.Ar/% Tb.N/# mm -1 Tb.Th/μm Tb.Sp/μm Control 9.5± ± ± ± ± ± ±19.4 RA 7.2± ± ± ± ± ± ±17.0 DS L 7.5± ± ± ± ± ± ±27.0 DS M 7.5± ± ± ± ± ± ±20.7 DS H 7.4± ± ± ± ± ± ±15.7 P<0 01vscontrol Tab3 TheefectsofRAandDanshengubaoonabsorptionanddynamicparametersofLV5inrats( 珋 x±s,n=8) Group Oc.N/No mm -1 Oc.S.Pm/% %L.Pm/% BFR/TV/% year -1 BFR/BV/% year -1 BFR/BS/% year -1 Control 0.17± ± ± ± ± ±0.42 RA 0.18± ± ± ± ± ±0.25 DS L 0.16± ± ± ± ± ±0.21 DS M 0.18± ± ± ± ± ±0.13 DS H 0.16± ± ± ± ± ±0.16 P<0 05, P<0 01vscontrol
3 ChinesePharmacologicalBuletin 2010Apr;26(4) 541 Fig1 Micrographsshowingthedynamicchangesofthetibialshaft(Tx)indiferentgroupsinrats( 40) A:Control;B:RA;C:DS L ;D:DS M ;E:DS H.Imageswerescannedbyfluorescencemicroscope.Yelowlinesindicatetetracycline,greenlinesindicate calcein,andredlinesindicateosteoid.thelabeledcouldbeseenclearlyinperiostealsurfacesbutnotbeseeninendocorticalsurfacesincontrolgroup. ThelabeledandosteoidcouldbeseenclearlyinendocorticalsurfacesbutnotbeseeninperiostealsurfacesinRAandDanshengubaogroups 2.3 维 甲 酸 及 丹 参 骨 宝 对 大 鼠 胫 骨 中 段 皮 质 骨 动 态 变 化 的 影 响 与 CON 组 比 较,RA 组 皮 质 骨 骨 外 膜 的 骨 形 成 减 弱 而 骨 内 膜 的 骨 形 成 增 强 与 RA 组 比 较, 丹 参 骨 宝 3 个 剂 量 组 均 无 明 显 变 化 见 Fig 维 甲 酸 及 丹 参 骨 宝 对 大 鼠 血 清 ALP 和 TRACP 的 影 响 与 CON 组 比 较,RA 组 大 鼠 血 清 ALP 增 加 (P<0 05), 但 TRACP 无 明 显 变 化 与 RA 组 比 较, 丹 参 骨 宝 3 个 剂 量 组 均 无 明 显 变 化 见 Tab4 Tab4 TheefectsofRAandDanshengubaoon serum ALPandTRACPinrats( x±s,n=8) 珋 Group ALP/U L -1 TRACP/U L -1 Control 57.4± ±7.96 RA 213.2± ±10.63 DS L 244.2± ±10.68 DS M 311.7± ±17.47 DS H 394.9± ±23.26 P<0 05vscontrol 3 讨 论 由 Tab1 结 果 可 见, 维 甲 酸 可 以 降 低 大 鼠 腰 椎 弹 性 载 荷 最 大 载 荷 断 裂 载 荷 刚 度 提 示 维 甲 酸 降 低 大 鼠 腰 椎 的 生 物 力 学 性 能, 能 够 影 响 大 鼠 骨 骼 的 结 构 力 学 特 性 和 材 料 力 学 性 能, 使 其 在 遭 受 外 力 的 情 况 下 本 身 的 抵 抗 性 能 减 弱, 容 易 发 生 骨 折 由 Tab2 结 果 可 见, 维 甲 酸 可 以 降 低 大 鼠 腰 椎 松 质 骨 骨 组 织 总 面 积 和 骨 小 梁 面 积, 但 骨 小 梁 面 积 百 分 数 单 位 面 积 骨 小 梁 数 量 变 化 不 明 显 可 能 是 由 于 维 甲 酸 引 起 骨 组 织 总 面 积 绝 对 骨 小 梁 面 积 和 骨 小 梁 周 长 总 量 下 降, 使 骨 骼 的 几 何 形 状 整 个 缩 小 因 此, 导 致 了 单 位 面 积 的 骨 小 梁 数 量 并 没 有 发 生 明 显 的 改 变, 也 就 是 说, 骨 小 梁 的 绝 对 数 量 减 少 了, 但 是 相 对 百 分 比 并 没 有 发 生 改 变 由 Fig1 的 结 果 可 见, 空 白 对 照 组 大 鼠 皮 质 骨 骨 外 膜 荧 光 标 记 清 晰 可 见 而 骨 内 膜 很 少, 提 示 骨 外 膜 的 骨 形 成 明 显 而 骨 内 膜 不 明 显, 说 明 大 鼠 正 在 处 于 成 熟 前 的 骨 建 造 期, 而 骨 内 膜 的 重 建 并 不 明 显 维 甲 酸 组 骨 内 膜 荧 光 标 记 和 类 骨 质 清 晰 可 见, 但 是 骨 外 膜 很 少 类 骨 质 是 在 骨 的 形 成 过 程 中 所 必 需 的 一 种 物 质, 其 由 成 骨 细 胞 分 泌 后 吞 并 成 骨 细 胞, 将 成 骨 细 胞 包 裹 进 其 中 而 形 成 骨 细 胞, 骨 细 胞 进 而 钙 化 沉 积 形 成 骨 基 质, 进 而 形 成 骨 组 织 结 果 提 示 维 甲 酸 使 大 鼠 皮 质 骨 骨 外 膜 的 骨 形 成 减 弱 而 使 骨 内 膜 的 骨 形 成 增 强, 说 明 维 甲 酸 可 以 抑 制 大 鼠 皮 质 骨 骨 外 膜 的 骨 建 造, 而 促 进 骨 内 膜 的 骨 重 建 同 时, 由 于 大 鼠 骨 骼 的 骨 建 造 作 用 被 抑 制, 导 致 了 大 鼠 骨 骼 的 向 外 生 长 减 慢, 所 以 大 鼠 骨 骼 从 整 体 上 来 说 会 变 得 比 较 细 小, 腰 椎 骨 组 织 总 面 积 和 骨 小 梁 总 面 积 均 减 少 骨 形 态 计 量 学 的 结 果 显 示, 维 甲 酸 降 低 大 鼠 腰 椎 松 质 骨 的 标 记 周 长 百 分 数 和 骨 形 成 率, 提 示 维 甲 酸 抑 制 大 鼠 的 骨 形 成 过 程, 降 低 骨 形 成 率, 从 而 导 致 以 骨 的 质 量 下 降 为 主 的 骨 质 疏 松 体 外 细 胞 培 养 表 明 [11], 维 甲 酸 可 降 低 正 常 人 成 骨 细 胞 的 活 性, 并 抑 制 成 骨 细 胞 增 殖 抑 制 其 产 生 ALP 骨 钙 素 和 IL 6 但 血 清 生 化 指 标 的 结 果 显 示, 维 甲 酸 使 大 鼠 血 清 ALP 升 高 血 清 ALP 活 性 是 由 多 种 来 源 的 酶 复 合, 在 正 常 成 年 人,ALP 主 要 来 自 肝 脏 及 骨, 小 部 分 来 自 小 肠 及 其 他 组 织 骨 型 碱 性 磷 酸 酶 (BALP) 由 成 骨 细 胞 产 生, 其 含 量 反 映 成 骨 细 胞 活 性 成 骨 细 胞 活 跃 时 分 泌 BALP 增 多, 使 血 清 ALP 升 高 但 是 肝 功 能 异 常 也 可 导 致 血 清 ALP 升 高 因 此, 对 于 血 清 碱 性 磷 酸 酶 升 高 的 原 因 还 待 于 进 一 步 研 究 由 Tab1 结 果 可 见, 丹 参 骨 宝 低 剂 量 使 大 鼠 腰 椎 刚 度 增 加, 中 剂 量 使 弹 性 载 荷 最 大 载 荷 断 裂 载 荷 刚 度 均 增 加, 而 高 剂 量 则 无 明 显 变 化 提 示 丹 参 骨 宝 可 以 改 善 维 甲 酸 大 鼠 腰 椎 生 物 力 学 性 能, 增 加 骨 的 抗 变 形 能 力, 减 少 骨 折 风 险 丹 参 骨 宝 核 心 成 分 为 丹 参 水 溶 性 成 分 丹 参 是 著 名 的 传 统 中 药, 具 有 抗 氧 化 改 善 微 循 环 防 止 血 栓 形 成 促 进 骨 愈 合, 预 防 股 骨 头 坏 死 等 多 种 功 能 丹 参 因 提 取 方 法 的 不
4 542 中 国 药 理 学 通 报 ChinesePharmacologicalBuletin 2010Apr;26(4) 同, 可 分 为 脂 溶 性 成 分 和 水 溶 性 成 份, 水 溶 性 成 分 包 括 丹 参 素 儿 茶 醛 A 和 B 等, 其 中 以 丹 参 素 为 最 主 要 的 成 份 动 物 实 验 结 果 显 示 [5~7], 丹 参 水 溶 性 成 分 可 以 促 进 骨 的 矿 化 沉 积 率, 增 加 骨 形 成, 从 而 预 防 去 卵 巢 糖 皮 质 激 素 环 磷 酰 胺 等 所 诱 发 骨 的 丢 失 体 外 实 验 结 果 显 示 [12], 丹 参 水 溶 性 成 分 可 以 促 进 成 骨 细 胞 活 性 抑 制 骨 髓 脂 质 代 谢, 从 而 改 善 骨 结 构 有 研 究 表 明, 丹 参 水 提 物 的 浓 度 在 0 5~10 0g L -1 范 围 可 刺 激 大 鼠 颅 骨 成 骨 细 胞 分 泌 ALP, 但 浓 度 增 加 到 50g L -1 时 可 抑 制 成 骨 细 胞 丹 参 素 的 浓 度 在 0 1~5 0mg L -1 的 范 围 内 可 刺 激 大 鼠 成 骨 细 胞 分 泌 ALP, 但 高 于 10mg L -1 无 作 用 [13] 这 可 以 部 分 解 释 低 中 剂 量 丹 参 骨 宝 可 使 大 鼠 腰 椎 生 物 力 学 参 数 增 加, 而 高 剂 量 则 无 明 显 变 化 但 是, 丹 参 骨 宝 在 体 内 试 验 中 的 剂 量 相 关 性, 还 有 待 于 进 一 步 的 研 究 参 考 文 献 : [1] 邵 金 莺, 尹 钟 珠, 许 哲, 等. 龙 牡 壮 骨 药 对 大 鼠 实 验 性 骨 质 疏 松 的 影 响 [J]. 中 药 药 理 与 临 床,1989,5(4):25. [2] ShaoJM,YinZZ,XuZ,etal.EfectofLongWuZhuangGuPow deronexperimentalosteoporsisofrat[j].pharmacolclinchin MatMed,1989,5(4):25. [2] 吴 波, 徐 冰, 黄 添 友, 等. 维 A 酸 致 大 鼠 骨 质 疏 松 模 型 与 机 理 研 究 [J]. 药 学 学 报,1996,31(4): [2] WuB,XuB,HuangTY,etal.Amodelofosteoporsisinducedby retinoicacidinwistarrats[j].actapharmsin,1996,31(4): [3] 胡 彬, 李 青 南, 李 朝 阳, 等. 维 甲 酸 致 雌 性 大 鼠 骨 代 谢 变 化 的 实 验 研 究 [J]. 中 国 骨 质 疏 松 杂 志,1997,3(3):12-4. [3] HuB,LiQN,LiCY,etal.Experimentalstudyoftretinoin in ducedmetabolicchangesinconicalboneoffemalerats[j].chinj Osteop,1997,3(3):12-4. [4] 许 鹏, 郭 雄, 张 银 刚, 等. 维 甲 酸 诱 导 骨 质 疏 松 模 型 大 鼠 的 效 果 及 机 理 [J]. 四 川 大 学 ( 医 学 版 ),2005,35(2): [4] XuP,GuoX,ZhangYG,etal.Theefectofretinoicacidonin ductionofosteoporoticmodelratsandtheposiblemechanism[j]. JSichuanUniv(MedSciEd),2005,35(2): [5] CuiL,WuT,LiuYY,etal.Tanshinonepreventscancelousbone losinducedbyovariectomyinrats[j].actapharmacolsin,2004, 25(5): [6] 邹 丽 宜, 吴 铁, 崔 燎. 丹 参 抑 制 泼 尼 松 骨 质 丢 失 [J]. 中 成 药,2006,28(4): [6] ZouLY,WuT,CuiL.EfectofSalviamiltiorhizaBgeonglu cocorticoid inducedosteoporoisinrats[j].chintraditpatmed, 2006,28(4): [7] 于 琼, 吴 铁, 崔 燎, 等. 骨 形 态 计 量 学 观 察 丹 参 骨 宝 对 环 磷 酰 胺 大 鼠 胫 骨 上 段 的 影 响 [J]. 中 国 骨 质 疏 松 杂 志,2007,13 (5): [7] YuQ,WuT,CuiL,etal.EfectofDanshenGubaoonbonehisto morphometryincyclophosphamid inducedbonelosofrats[j]. ChinJOsteop,2007,13(5): [8] 刘 钰 瑜, 崔 燎, 姚 卫 民, 等. 前 列 腺 素 衍 生 物 对 去 卵 巢 大 鼠 骨 质 疏 松 的 治 疗 作 用 [J]. 中 国 药 理 学 通 报,2009,25(10): [8] LiuYY,CuiL,YaoW M,etal.Efectsofprostaglandinonoste oporosisinovariectomizedrats[j].chinpharmacolbul,2009,25 (10): [9] ParfitAM,DreznerM K,GlorieuxFH,etal.Bonehistomor phometry:standardizationofnomenclature,symbolsandunits. ReportoftheASBMRHistomorphometryNomenclatureCommitee [J].JBoneMinerRes,1987,2: [10] 许 碧 连, 吴 铁, 崔 燎, 等. 己 烯 雌 酚 对 去 卵 巢 大 鼠 不 同 部 位 骨 骼 的 影 响 [J]. 中 国 老 年 学 杂 志,2004,24(12): [10]XuBL,WuT,CuiL,etal.Theefectsofdiethylstilbestrolondif ferentpartsoftheboneinovariectomizedrats[j].chinjgerontol, 2004,24(12): [11]AhmedN,SammonsJ,KhokherM A,etal.Retinoicacidsuppres sesinterleukin6productioninnormalhumanosteoblasts[j].cyto kine,2000,12(3):289. [12] 孙 宇, 崔 燎, 吴 铁. 盐 酸 水 提 法 制 备 丹 参 水 溶 性 有 效 部 位 群 及 其 对 成 骨 细 胞 活 性 测 定 [J]. 中 国 药 理 学 通 报,2008,24 (3): [12]SunY,CuiL,WuT.PreparationofSalviamiltiorhizautilityaque ousextractbyhydrochloricacidmethodandevaluationonosteo blast[j].chinpharmacolbul,2008,24(3): [13] 崔 燎, 邹 丽 宜, 刘 钰 瑜, 等. 丹 参 水 提 物 和 丹 参 素 促 进 成 骨 细 胞 活 性 和 防 治 泼 尼 松 所 致 大 鼠 骨 质 疏 松 [J]. 中 国 药 理 学 通 报,2004,20(3): [13] CuiL,ZouLY,LiuYY,etal.Preventingcancelousbonelosin steroid treatedratsandstimulatingboneformationbywaterextract ofsalviamiltiorhixaanddanshensu[j].chinpharmacolbul, 2004,20(3): Efectsofretinoicacidoninductionosteroporosis modelratsandpreventiveefectsofdanshengubao XUBi lian 1,2,CUILiao 1,2,CHENWen shuang 2,WEITian you 1,WUTie 1 (1.DeptofPharmacology,GuangdongMedicalColege;2.GuangdongKeyLaboratory forresearchanddevelopmentofnaturaldrugs,guangdongmedicalcolege,zhanjiangguangdong ,China) Abstract:Aim Toinvestigatetheefectsofretinoic acid(ra)oninductionosteroporosismodelratsand
5 ChinesePharmacologicalBuletin 2010Apr;26(4):543~6 543 UPLC MS 法 测 定 大 鼠 血 浆 中 积 雪 草 苷 的 浓 度 及 其 药 代 动 力 学 研 究 刘 子 修 1, 刘 史 佳 1,2, 居 文 政 2, 张 军 2, 陈 玟 2 3, 谈 恒 山 (1. 南 京 中 医 药 大 学 药 学 院, 江 苏 南 京 ;2. 南 京 中 医 药 大 学 附 属 医 院 临 床 药 理 科, 江 苏 南 京 ; 3. 南 京 军 区 总 医 院, 江 苏 南 京 ) 中 国 图 书 分 类 号 :R 332;R282 71;R969 1 文 献 标 识 码 :A 文 章 编 号 : (2010) 摘 要 : 目 的 建 立 测 定 积 雪 草 苷 血 浆 药 物 浓 度 的 超 高 效 液 相 色 谱 - 电 喷 雾 离 子 化 - 质 谱 (UPLC ESI MS) 联 用 的 分 析 方 法, 探 讨 其 在 大 鼠 体 内 的 药 动 学 方 法 SD 大 鼠 8 只, 单 剂 量 静 注 (40mg kg -1 ) 积 雪 草 苷, 用 UPLC MS 法 测 定 给 药 后 的 血 浆 中 药 物 浓 度, 并 用 DAS 软 件 求 算 其 药 代 动 力 学 参 数 结 果 积 雪 草 苷 的 血 药 浓 度 在 0 038~7 6mg L -1 范 围 内 线 性 关 系 良 好, 最 低 检 测 限 为 38μg L -1, 提 取 回 收 率 大 于 95%, 日 间 日 内 RSD 均 小 于 10% 大 鼠 单 剂 量 静 注 积 雪 草 苷 40mg kg -1 后, 血 药 浓 度 - 时 间 曲 线 呈 二 室 模 型 主 要 药 动 学 参 数 AUC (0-t) T1 β CL V d 分 别 为 :( ± )μg L -1 min -1 (23 44±9 60)min (0 19± 0 07)L min -1 kg -1 (8 92±6 68)L kg -1 结 论 该 收 稿 日 期 : , 修 回 日 期 : 基 金 项 目 : 科 技 部 十 一 五 支 撑 计 划 课 题 (No2006BAI14B07); 江 苏 省 中 医 药 领 军 人 才 项 目 作 者 简 介 : 刘 子 修 (1983-), 男, 硕 士 生,E mail:liuzixiu3221@126. com; 居 文 政 (1965-), 男, 主 任 药 师, 博 士 生 导 师, 研 究 方 向 : 中 药 临 床 药 代 动 力 学, 通 讯 作 者,Tel: ,E mail:njwz1008@jlonline.com 方 法 操 作 简 便 快 速 灵 敏 专 属 性 强, 可 用 于 积 雪 草 苷 的 体 内 大 批 量 样 品 定 量 分 析 及 药 代 动 力 学 研 究 关 键 词 : 积 雪 草 苷 ; 超 高 效 液 相 色 谱 - 质 谱 联 用 法 ; 药 代 动 力 学 ; 血 药 浓 度 ; 大 鼠 ; 吸 收 积 雪 草 (Centelaasiati cal.urban) 为 伞 形 ( 科 积 雪 草 属 植 物 积 雪 草 的 干 燥 全 草 积 雪 草 中 积 雪 草 苷 (asiaticoside) 具 有 抗 肿 瘤 抗 静 脉 机 能 不 全 抗 溃 疡 促 进 创 伤 愈 合 抗 抑 郁 和 恢 复 神 经 功 能 等 药 理 作 用 [1], 其 临 床 主 要 用 于 治 疗 外 伤 手 术 创 伤 烧 伤 胃 溃 疡 疤 痕 疙 瘩 及 硬 皮 病 [2,3] 有 关 积 雪 草 苷 药 代 动 力 学 研 究 文 献 国 内 未 见 报 道 本 研 究 首 次 采 用 UPLC MS 联 用 技 术, 建 立 简 便 快 速 较 高 灵 敏 度 的 体 内 分 析 方 法, 研 究 积 雪 草 苷 在 大 鼠 体 内 的 药 代 动 力 学 过 程, 为 积 雪 草 苷 在 体 内 的 吸 收 和 代 谢 研 究 提 供 参 考 1 材 料 与 方 法 1.1 药 品 与 试 剂 积 雪 草 苷 对 照 品 ( 中 国 药 品 生 物 制 品 检 定 所, 批 号 : ), 黄 芪 甲 苷 对 照 品 ( 中 国 药 品 生 物 制 品 检 定 所, 批 号 :0781 preventiveefectsofdanshengubao.methods 4 month oldfemalesprague DawleyratsweregivenRA at70mg kg -1 d -1 andweregivendanshengubaoat diferentdosesatthesametime.alratsweretreated byoralgavagedfor28days.thestaticanddynamicpa rametersincancelousboneofthefifthlumbarverte brae(lv5)wereexaminedandthedynamicchanges ofthetibialshaft(tx)wereobservedwithhistomor phometrical analyses; the forth lumbar vertebrae (LV4)wasusedtoperform thecompresiontest.re sults Comparedwithcontrolgroup,biomechanical propertiesoflv4,thestaticparameters(totaltisue area,trabeculararea,trabecularperimeter) andthe dynamic parametersoflv5 were significantly de creasedinra group.comparedwithcontrolgroup, boneformationoftxwasdecreasedinperiostealsur facesbutenhanced in endocorticalsurfacesin RA group.comparedwithra group,thebiomechanical propertiesoflv4wereincreasedsignificantlyinlow andmedium doseofdanshengubaogroups.conclu sions RAcandecreasethesizeandthebiomechani calpropertiesoflv,butitcannotchangethepercent agetrabeculararea.themechanism mayberelatedto theactthatracaninhibitcancelousboneformation, decreasethemodelingofcorticalboneinperiosteal surfacesandenhancetheremoldingofcorticalbonein endocorticalsurfaces.danshengubaocanimprovebio mechanicsoflvinducedbyrainrats. Key words:osteroporosis; retinoic acid; Danshen; bonehistomorphometry;biomechanicalproperties;rat
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