破 骨 细 胞 (osteoclast,oc) 是 由 骨 髓 中 的 造 血 干 细 胞 前 体 融 合 形 成 的 多 核 细 胞 破 骨 细 胞 前 体 细 胞 (OC precursor,ocp) 在 趋 化 因 子 作 用 下 进 入 血 循 环, 当 到 达 处 于 吸 收 状 态 的

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1 人 类 骨 骼 形 成 及 分 子 机 制 邹 海 玥 13 级 生 物 基 地 班 一 成 骨 细 胞 与 骨 形 成 成 骨 细 胞 是 骨 形 成 过 程 中 的 重 要 功 能 细 胞, 其 主 要 功 能 是 分 泌 骨 基 质 ( 包 括 胶 原 及 糖 蛋 白 ) 及 进 行 合 成 成 骨 细 胞 还 参 与 破 骨 细 胞 性 骨 吸 收 的 调 节, 两 者 是 骨 代 谢 过 程 中 的 重 要 核 心 细 胞 1 形 态 及 生 化 特 点 成 骨 细 胞 起 源 于 多 能 的 骨 髓 基 质 的 间 质 细 胞 在 形 态 学 上, 活 跃 的 成 骨 细 胞 位 于 骨 形 成 表 面, 因 其 具 有 典 型 的 蛋 白 质 合 成 结 构, 如 胞 质 内 富 含 线 粒 体 和 发 达 的 高 尔 基 体 等 而 可 以 和 其 他 的 骨 细 胞 成 分 相 区 别 成 骨 细 胞 可 被 不 同 种 类 的 激 素 和 生 长 因 子 激 活, 刺 激 DNA 和 胶 原 的 合 成, 目 前 已 知 这 些 激 素 和 细 胞 因 子 是 通 过 其 在 成 骨 细 胞 上 特 异 性 的 受 体 而 起 作 用 的 根 据 受 体 存 在 的 部 位 可 将 其 分 为 两 类, 即 细 胞 膜 受 体 和 细 胞 内 受 体 细 胞 膜 受 体 是 细 胞 膜 上 的 结 构 成 分, 一 般 为 糖 蛋 白 脂 蛋 白 或 糖 脂 蛋 白 此 类 受 体 种 类 繁 多 一 旦 这 些 激 素 或 细 胞 因 子 与 成 骨 细 胞 膜 上 相 应 的 受 体 结 合, 则 可 通 过 不 同 的 信 号 传 递 途 径 调 节 细 胞 的 反 应 细 胞 内 受 体 位 于 细 胞 液 内, 已 知 成 骨 细 胞 内 的 此 类 受 体 有 雌 激 素 受 体 孕 激 素 受 体 和 维 生 素 D 受 体 等 当 这 些 激 素 与 细 胞 液 内 的 受 体 结 合, 形 成 激 素 受 体 复 合 物, 进 而 转 入 细 胞 核 与 DNA 结 合, 改 变 DNA 活 性, 影 响 基 因 转 录, 从 而 发 挥 代 谢 调 节 作 用 2 成 骨 细 胞 发 展 阶 段 及 骨 形 成 机 制 成 骨 细 胞 在 骨 形 成 过 程 中 要 经 历 成 骨 细 胞 增 殖, 细 胞 外 基 质 成 熟, 细 胞 外 基 质 矿 化 和 成 骨 细 胞 凋 亡 四 个 阶 段 很 多 因 素 可 调 节 这 几 个 阶 段, 从 而 最 终 调 控 骨 形 成 成 骨 细 胞 增 殖 期 成 骨 细 胞 数 量 增 加, 以 形 成 多 层 细 胞, 并 合 成 分 泌 I 型 胶 原 以 便 最 终 可 以 矿 化 形 成 骨 结 节 对 成 骨 细 胞 增 殖 的 调 控 具 体 来 说 即 是 对 细 胞 周 期 的 调 控, 抑 制 与 细 胞 周 期 调 节 相 关 的 基 因 会 导 致 增 殖 的 停 止 与 增 殖 激 活 有 关 的 基 因 有 c-myc cfos 和 f-jun; 与 细 胞 周 期 有 关 的 基 因 有 组 蛋 白 细 胞 周 期 蛋 白 基 因 在 成 骨 细 胞 增 殖 期, 同 时 还 能 表 达 的 基 因 有 EGF IGF TGF-β 和 I 型 胶 原 等 基 因 在 细 胞 增 殖 晚 期, 与 细 胞 周 期 及 细 胞 增 殖 相 关 的 基 因 表 达 下 降, 而 编 码 细 胞 外 基 质 成 熟 的 蛋 白 质 基 因 开 始 表 达, 在 分 化 早 期 主 要 是 ALP 表 达 成 骨 细 胞 分 泌 ALP 和 钙 盐 结 晶 体 至 细 胞 外 基 质 中,ALP 使 局 部 磷 酸 含 量 增 高, 促 使 基 质 矿 化 在 细 胞 外 基 质 成 熟 期, 胶 原 继 续 合 成 并 相 互 交 联 成 熟 在 成 骨 细 胞 分 化 晚 期, 细 胞 进 入 矿 化 期, 细 胞 内 的 ALP 活 性 下 降, 而 与 细 胞 外 基 质 中 羟 磷 灰 石 沉 积 相 关 的 基 因 表 达 达 到 高 峰, 如 骨 桥 蛋 白 骨 钙 素 等 基 因 骨 钙 素 等 非 胶 原 蛋 白 分 泌 至 细 胞 外 基 质 中, 与 钙 磷 结 合, 然 后 形 成 羟 磷 灰 石 结 晶 此 后, 骨 钙 素 逐 渐 降 低, 与 此 同 时, 可 观 察 到 胶 原 酶 增 加, 成 骨 细 胞 开 始 凋 亡, 并 出 现 代 偿 性 细 胞 增 殖 和 胶 原 合 成 二 破 骨 细 胞 形 成 和 功 能 调 节

2 破 骨 细 胞 (osteoclast,oc) 是 由 骨 髓 中 的 造 血 干 细 胞 前 体 融 合 形 成 的 多 核 细 胞 破 骨 细 胞 前 体 细 胞 (OC precursor,ocp) 在 趋 化 因 子 作 用 下 进 入 血 循 环, 当 到 达 处 于 吸 收 状 态 的 骨 组 织 部 位, 即 骨 重 建 单 位 (bone remodeling unit,bru) 时, 便 在 一 系 列 趋 化 因 子 和 细 胞 因 子 作 用 下 进 入 骨 组 织 并 分 化 成 OC 巨 噬 细 胞 集 落 刺 激 因 子 (macrophage colony stimulating factor,m-csf) 和 NF-κB 受 体 活 化 因 子 配 基 (receptor activator of NFκB ligand,rankl) 是 由 BRU 及 其 周 围 细 胞 表 达 的 两 种 重 要 因 子, 它 们 通 过 调 节 OCP 的 形 成 和 分 化 来 促 进 正 常 或 病 理 性 骨 重 建 过 程 中 整 体 或 局 部 的 骨 吸 收 OC 一 直 被 认 为 是 骨 吸 收 细 胞, 除 了 参 与 骨 吸 收 过 程, 几 乎 无 其 他 功 能, 但 近 年 对 小 鼠 的 遗 传 学 研 究 发 现,OC 及 OCP 还 具 有 其 他 作 用, 包 括 调 节 成 骨 细 胞 (osteoblast,ob) 的 形 成 和 参 与 免 疫 应 答 ; 在 一 些 病 理 条 件 ( 如 肿 瘤 ) 下,OC 还 存 在 于 除 骨 组 织 外 的 其 他 组 织 中 几 个 主 要 细 胞 功 能 调 节 途 径, 如 NF- κb Wnt/β-catenin 和 Notch, 均 对 OC 和 OB 的 形 成 及 功 能 起 着 重 要 作 用 1 OCP 向 骨 表 面 的 募 集 在 正 常 生 理 条 件 下,OCP 在 趋 化 因 子 如 基 质 衍 生 因 子 1(stroma-derived factor 1, SDF-1) 作 用 下 被 维 持 在 骨 髓 中 当 处 于 炎 性 条 件 时, 高 水 平 的 TNF 通 过 抑 制 骨 髓 细 胞 中 SDF-1 的 表 达 将 OCP 动 员 至 血 液 中 ; 此 外, 血 液 中 红 细 胞 和 血 小 板 分 泌 的 一 种 具 有 生 物 活 性 的 鞘 脂 类 化 合 物 鞘 氨 醇 -1 磷 酸 (sphingosine-1 phosphate,s1p), 也 能 吸 引 OCP 进 入 血 液 OCP 表 达 的 两 种 S1P 受 体 S1PR-1 和 S1PR-2 分 别 具 有 趋 化 吸 引 和 趋 化 排 斥 功 能, 后 者 能 将 其 送 回 BRU 部 位 的 骨 髓 中 OC 本 身 也 能 表 达 S1P, 从 而 吸 引 OCP 与 之 融 合 Lotinun 等 发 现 OC 中 S1P 的 表 达 受 到 组 织 蛋 白 酶 K, 一 种 主 要 的 胶 原 基 质 降 解 酶 的 抑 制, 而 S1P 能 促 进 OB 前 体 细 胞 分 化, 提 示 组 织 蛋 白 酶 K 抑 制 剂 可 能 会 刺 激 骨 生 成 2 OC 形 成 的 调 节 骨 髓 前 体 细 胞 在 多 种 转 录 因 子 ( 如 PU.1 和 MITF/Tfe3 复 合 物 ) 的 诱 导 下 分 化 成 OCP Mellis 等 研 究 表 明 PU.1 和 MITF 能 激 活 M-CSF 受 体 的 表 达, 缺 失 其 中 任 一 蛋 白 编 码 基 因 的 小 鼠, 均 会 因 骨 髓 腔 中 骨 小 梁 吸 收 过 程 受 阻 而 发 生 软 骨 内 成 骨, 从 而 导 致 骨 硬 化 症 M-CSF 在 OC 形 成 早 期 的 作 用 主 要 是 促 进 骨 髓 前 体 细 胞 中 NF-κB 受 体 活 化 因 子 ( receptor activator of NF-κB,RANK) 的 表 达, 并 与 TNF 协 同 作 用, 使 细 胞 对 RANKL 作 出 响 应 M-CSF 与 其 受 体 结 合 后, 吸 引 由 DAP12 和 非 受 体 型 酪 氨 酸 激 酶 Syk 组 成 的 信 号 复 合 物, 从 而 激 活 ERK/Grb-2 和 Akt/PI3K 信 号 通 路, 调 节 OC 及 其 前 体 细 胞 的 各 种 生 物 学 行 为, 包 括 增 殖 凋 亡 和 存 活 骨 诱 裂 发 生 过 程 依 赖 NF-κB 信 号 的 参 与,NF-κB p50/p52 双 基 因 敲 除 小 鼠 由 于 OC 形 成 受 阻 会 导 致 骨 硬 化 症 这 种 双 基 因 敲 除 小 鼠 以 及 RANKL 和 RANK 敲 除 小 鼠 均 会 出 现 B 细 胞 和 淋 巴 结 发 育 受 阻 及 T 细 胞 成 熟 过 程 缺 陷, 提 示 采 用 药 物 如 地 诺 单 抗 ( 一 种 RANKL 单 克 隆 抗 体 ) 等 抑 制 RANK 信 号 通 路 可 能 对 免 疫 应 答 产 生 副 作 用 值 得 注 意 的 是, 尽 管 地 诺 单 抗 和 双 磷 酸 盐 类 药 物 的 作 用 机 制 不 同, 但 和 双 磷 酸 盐 类 药 物 相 似, 少 数 服 用 地 诺 单 抗 治 疗 转 移 性 骨 疾 病 的 患 者 可 出 现 下 颌 骨 坏 死, 说 明 这 两 种 药 物 可 能 干 扰 相 似 细 胞 的 功 能, 包 括 OC 或 其 他 免 疫 细 胞 系 3 OC 功 能 的 调 节 骨 吸 收 过 程 开 始 于 OC 通 过 整 合 素 玻 连 蛋 白 受 体 αvβ3 与 骨 表 面 接 触, 引 起 细 胞 外 的 Src 酪 氨 酸 激 酶 向 细 胞 内 募 集, 从 而 导 致 多 条 依 赖 Src 的 信 号 通 路 被 激 活 例 如,Src

3 磷 酸 化 Syk 和 Slp-76, 使 二 者 形 成 一 种 衔 接 蛋 白 复 合 物, 从 而 激 活 小 型 Rho 蛋 白 家 族 成 员 Rac 参 与 的 信 号 通 路 αvβ3 与 M-CFSR 结 合 后, 能 通 过 由 内 而 外 的 信 号 传 递 使 整 合 素 活 化 与 αvβ3/src 相 互 作 用 相 似,RANK 在 Src 作 用 下 也 能 与 αvβ3 形 成 复 合 物, 从 而 激 活 Syk Slp-76 Vav3 和 Rac 信 号 这 些 交 互 作 用 导 致 溶 酶 体 分 泌 小 泡 与 胞 质 膜 融 合 形 成 褶 皱 缘 细 胞 内 的 H+ 穿 过 褶 皱 缘 被 泵 出 细 胞 外, 与 Cl- 形 成 HCl 使 骨 组 织 脱 矿 ; 同 时, 组 织 蛋 白 酶 K 分 泌 水 平 增 加, 使 骨 基 质 被 降 解 在 骨 形 成 过 程 中, 大 量 蛋 白 随 着 胶 原 一 起 被 装 配, 包 括 TGF-β BMP FGF 和 IGF; 在 骨 吸 收 过 程 中, 这 些 蛋 白 会 被 OC 释 放 出 来 并 被 活 化, 参 与 正 常 或 病 理 状 态 下 的 骨 吸 收 过 程 例 如 直 接 或 通 过 调 节 RANKL 或 骨 保 护 素 (osteoprotegerin,opg) 的 表 达 间 接 诱 导 OC 的 形 成 TGF-β 还 能 吸 引 OB 至 骨 吸 收 部 位, 使 其 充 当 偶 联 因 子 的 角 色 4 OC 形 成 和 功 能 的 负 调 控 OC 的 形 成 和 功 能 受 到 多 种 机 制 的 负 调 控, 如 甲 状 腺 C 细 胞 分 泌 的 降 钙 素 等, 但 这 些 机 制 在 RANKL 被 发 现 之 前 几 乎 均 未 被 确 定 RANKL 的 发 现 使 研 究 者 能 够 获 得 足 够 数 量 的 高 纯 度 OCP 进 行 基 因 表 达 谱 研 究 OPG 是 整 个 骨 吸 收 过 程 中 最 主 要 的 负 调 节 物, 它 通 过 与 RANKL 结 合 来 竞 争 性 抑 制 RANK 与 RANKL 的 相 互 作 用 大 多 数 青 少 年 佩 吉 特 病 都 是 因 OCP 的 编 码 基 因 发 生 功 能 缺 失 突 变 引 起 的, 患 者 体 内 过 量 的 RANKL 表 达 引 起 骨 质 疏 松, 这 与 OPG 基 因 敲 除 小 鼠 的 表 型 相 似 三 骨 形 成 过 程 中 两 条 重 要 的 信 号 传 导 通 路 Wnt 信 号 通 路 与 BMP-2 信 号 通 路 能 够 促 进 成 骨 细 胞 的 分 化 和 成 骨 细 胞 分 泌 的 胞 外 基 质 的 生 物 矿 化, 在 这 一 过 程 中 起 着 极 其 重 要 的 作 用 1 Wnt 信 号 通 路 Wnt 基 因 编 码 产 物 所 介 导 的 信 号 传 导 通 路 称 为 Wnt 信 号 通 路, 是 一 条 保 守 的 信 号 传 导 途 径, 其 成 员 具 有 高 度 同 源 性 目 前 认 为 Wnt 信 号 通 路 的 主 要 组 分 包 括 细 胞 外 因 子 (Wnt) 跨 膜 受 体 ( frizzled) 胞 质 蛋 白 ( β-catenin) 及 核 内 转 录 因 子 ( TCFS /LEF) 等 一 系 列 蛋 白, 亦 有 其 他 成 分 参 加, 例 如 LRP5,DKKS,sfrps,GSK3β 等 首 先 细 胞 外 因 子 与 受 体 结 合 后, 通 过 一 系 列 胞 质 蛋 白 的 相 互 作 用 使 β-catenin 蛋 白 在 胞 质 内 累 积, 进 而 进 入 细 胞 核 与 转 录 因 子 TCFS /LEF 共 同 作 用 激 活 靶 基 因 的 转 录 Wnt 通 路 的 下 游 靶 基 因 多 数 是 参 与 细 胞 增 生 与 凋 亡 的 基 因 越 来 越 多 的 研 究 结 果 表 明,Wnt 信 号 通 路 在 胚 胎 发 育 及 骨 重 建 过 程 中 起 着 至 关 重 要 的 作 用 Wnt 蛋 白 可 被 分 为 两 类 : 第 一 类 是 激 活 经 典 的 Wnt 蛋 白 合 成 物 ( FZD) 和 低 密 度 脂 蛋 白 ( LDL) 受 体 相 关 蛋 白 LRP5 或 LRP6 的 形 成 ; 非 经 典 的 Wnt5a 结 合 FZD 蛋 白 激 活 异 源 性 三 聚 体 G- 蛋 白, 增 加 了 细 胞 内 蛋 白 激 酶 C 依 赖 机 制 的 胞 内 钙 浓 度, 或 诱 导 肌 动 蛋 白 细 胞 骨 架 中 依 赖 Rho 或 c-jun 氨 基 末 端 激 酶 ( JNK) 的 改 变 目 前 发 现 至 少 有 3 种 信 号 传 递 途 径 :Wnt /β-catenin 途 径 ( 经 典 的 Wnt 信 号 传 导 途 径 ) Wnt /Ca2 + 途 径 和 Wnt / JNK /9 细 胞 骨 架 重 排 途 径 ( planar cell polarity pathway, PCP pathway) Bain 等 发 现 C3H10T1 /2( 一 种 可 以 分 化 为 成 骨 细 胞 脂 肪 细 胞 软 骨 细 胞 等 的 多 潜 能 干 细 胞 系 ) 在 BMP-2 的 作 用 下 可 以 分 化 为 成 骨 细 胞, 在 此 过 程 中,BMP- 2 可 以 上 调 β-catenin, 这 表 明 β-catenin 在 成 骨 前 体 细 胞 及 成 骨 细 胞 增 殖 分 化 过 程 中 发 挥 作 用, 并 受 BMP-2 的 调 节 Wnt /β-catenin 信 号 途 径 对 于 未 分 化 的 间 充 质 干 细 胞 的 作 用 在 于 增 强 其 碱 性 磷 酸 酶 (ALP) 活 性 Gabriel 等 则 认 为,β-catenin 蛋 白 对 于 间 充 质 干

4 细 胞 的 成 骨 分 化 提 供 了 一 种 分 子 诱 导 信 号, 并 且 通 过 实 验 证 实,β-catenin 通 过 增 强 间 充 质 干 细 胞 对 于 BMP-2 的 应 答 来 诱 导 其 向 成 骨 细 胞 分 化 值 得 注 意 的 是, 在 发 挥 成 骨 作 用 过 程 中 β-catenin 起 重 要 作 用, 是 成 骨 细 胞 分 化 及 骨 形 成 中 的 枢 纽 分 子 其 作 用 包 括 更 新 干 细 胞, 刺 激 前 成 骨 细 胞 复 制, 诱 导 成 骨 细 胞 形 成, 及 抑 制 成 骨 细 胞 和 骨 细 胞 凋 亡 等 这 些 不 同 结 果 的 出 现 是 因 为 Wnt /β-catenin 信 号 通 过 生 命 不 同 阶 段 不 同 机 制 调 节 骨 发 育, 大 鼠 模 型 在 成 骨 细 胞 生 成 的 早 期 和 晚 期 定 向 摘 除 β-catenin 的 研 究 结 果 有 力 支 持 这 一 观 点 β-catenin 在 成 骨 细 胞 形 成 早 期 阶 段 是 必 须 的,β-catenin 缺 乏 使 间 充 质 细 胞 前 体 细 胞 的 命 运 转 向 软 骨 形 成 为 了 检 测 β-catenin 在 成 骨 细 胞 发 展 后 期 的 重 要 性,Moon 等 通 过 不 同 的 大 鼠 模 型 证 实 了 β-catenin 通 过 影 响 骨 保 护 素 和 RANKL 的 表 达 来 调 节 成 骨 细 胞 分 化 Fig. 1 Wnt signaling 2 BMP-2 信 号 通 路 BMP 是 一 种 广 泛 存 在 于 骨 基 质 中 的 酸 性 糖 蛋 白, 是 转 化 生 长 因 子 ( TGF-β) 超 家 族 中 最 大 的 一 族, 目 前 已 有 20 余 种 成 员 其 中 BMP-2 是 促 进 骨 形 成 和 诱 导 成 骨 细 胞 分 化 最 重 要 的 细 胞 外 信 号 分 子 之 一, 它 通 过 激 活 Smads 信 号 传 导 和 调 节 成 骨 基 因 转 录 而 发 挥 成 骨 作 用, 可 上 调 66 种 基 因 表 达, 其 中 包 括 Smad6 Smad7 Msx2 等 13 种 相 关 转 录 因 子 Smads 家 族 是 BMP 信 号 传 导 蛋 白, 分 为 Smad1 ~ 9, 其 中 Smad2 和 Smad3 可 传 递 TGF-β / 激 活 素 信 号,Smad1 Smad5 Smad8 和 Smad9 调 节 BMP 信 号 传 导 ( Fig. 2) Smads 蛋 白 家 族 可 将 TGF-β 信 号 由 细 胞 膜 传 至 细 胞 核,BMP 激 活 Smads, 从 而 诱 导 核 内 成 骨 基 因 的 表 达 Runx 是 调 控 间 充 质 干 细 胞 向 成 骨 细 胞 分 化 的 特 异 性 转 录 因 子, 包 括 Runx1 Runx2 和 Runx3, 特 别 是 Runx2 是 BMP-2 的 靶 基 因, 是 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 ( BMSCs) 和 OB 分 化 骨 发 育 的 重 要 调 节 因 子, 在 成 骨 细 胞 分 化 过 程 中 起 重 要 作 用 Msx 成 员 包 括 Msx1 Msx2 和 Msx3,Msx2 是 一 种 转 录 因 子 的 同 源 结 构 域, 存 在 于 颅 骨 和 股 骨 成 骨 细 胞 中 ;BMP 诱 导 的 Msx2 在 骨 形 成 和 成 骨 细 胞 分 化 中 起 非 常

5 重 要 的 作 用, 可 刺 激 MSCs 成 骨 性 分 化, 但 其 成 骨 作 用 很 复 杂 BMP 诱 导 p38mapk 直 接 磷 酸 化 转 录 因 子 Runx2 Osterix, 或 间 接 激 活 另 外 一 些 激 酶 使 下 游 基 因 磷 酸 化 来 表 达 成 骨 特 异 性 分 子 Osterix 是 特 殊 蛋 白 转 录 家 族 成 员, 具 有 锌 指 结 构, 成 骨 细 胞 特 异 性 转 录 因 子, 在 所 有 发 育 的 骨 细 胞 和 成 骨 细 胞 中 表 达 Osterix 受 BMP 调 节,BMP-2 通 过 转 录 因 子 Runx2 和 Msx2 调 节 Osterix 的 表 达 Fig. 2 BMP signaling Fig. 3 Wnt signaling and BMP signaling

6 参 考 文 献 [1] Cadigan KM, Nusse R. Wnt signaling: a common theme in animal development,j Genes,1997, 11: [2] Veeman MT,Axelrod RT,Moon. Functions and mechanisms of betacatenin-independent Wnt signaling. J Dev Cell,2003,5: [3] Gabriel M,Shaimin S,Joseph P,et al. β-catenin and BMP-2 Synergize to Promote Osteoblast Differentiation and New Bone Formation. J Celluar Biochemistry,2005,94: 403. [4] 童 安 莉, 陈 璐 璐, 丁 桂 芝, 等. 成 骨 细 胞 骨 形 成 机 制 研 究 进 展. 中 国 骨 质 疏 松 杂 志, 2006, 5(3): [5] Xiong J, O Brien CA. Osteocyte RANKL: new insights into the control of bone remodeling. J Bone Miner Res, 2012, 27(3): [6] Boyce BF, Zuscik MJ, Xing L. Biology of bone and cartilage//thakker RV, Whyte MP, Eisman J, et al.genetics of bone biology and skeletal disease. New York: Elsevier Inc., 2013: 3-24.

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