中 文 摘 要 Apocynum venetum 羅 布 麻 在 中 國 用 來 當 作 單 方 的 抗 高 血 壓 茶 在 先 前 大 鼠 離 體 主 動 脈 血 管 研 究, 顯 示 羅 布 麻 葉 萃 取 物 (AVLE) 會 引 起 大 鼠 主 動 脈 血 管 內 皮 依 存 性 舒 張 的

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1 中 國 醫 藥 大 學 基 礎 醫 學 研 究 所 碩 士 學 位 論 文 羅 布 麻 葉 萃 取 物 對 大 鼠 胸 主 動 脈 血 管 張 力 效 應 之 研 究 Vascular effects of Apocynum venetum leaf extract in rat thoracic aorta 指 導 教 授 : 關 超 然 教 授 共 同 指 導 教 授 : 謝 文 聰 副 教 授 研 究 生 : 顧 澤 承 中 華 民 國 一 百 年 元 月

2 中 文 摘 要 Apocynum venetum 羅 布 麻 在 中 國 用 來 當 作 單 方 的 抗 高 血 壓 茶 在 先 前 大 鼠 離 體 主 動 脈 血 管 研 究, 顯 示 羅 布 麻 葉 萃 取 物 (AVLE) 會 引 起 大 鼠 主 動 脈 血 管 內 皮 依 存 性 舒 張 的 作 用 但 本 研 究 室 發 現 高 劑 量 之 AVLE 反 而 會 引 起 之 血 管 收 縮 作 用 所 以 本 研 究 希 望 探 索 AVLE 對 離 體 大 鼠 主 動 脈 之 血 管 舒 張 與 收 縮 截 然 不 同 張 力 的 機 理, 希 望 釐 清 羅 布 麻 用 來 抗 高 血 壓 茶 的 作 用 評 估 投 與 低 劑 量 AVLE 10 µg/ml 能 引 起 作 用 時 間 長 的 內 皮 依 存 性 之 血 管 舒 張 作 用, 其 血 管 舒 張 作 用, 能 被 L-NAME ( 一 氧 化 氮 合 成 酶 抑 制 劑 ) 所 逆 轉 而 高 劑 量 30 µg/ml 以 上 之 AVLE, 能 逆 轉 低 劑 量 AVLE 產 生 的 長 時 間 血 管 舒 張 作 用, 此 現 象 能 被 併 用 之 超 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD) 和 過 氧 化 氫 歧 化 酶 (catalase) 所 抑 制 綜 合 本 研 究 結 果 推 測 : 在 離 體 大 鼠 主 動 脈 血 管 中, 低 劑 量 AVLE 之 血 管 舒 張 作 用 與 血 管 內 皮 依 存 性 NO 產 生 有 關 高 劑 量 AVLE 使 血 管 逆 轉 其 舒 張 作 用, 可 能 與 產 生 超 氧 陰 離 子 (superoxide anions) 有 關 Key words: 羅 布 麻,AVLE, 抗 高 血 壓 茶, 主 動 脈, 血 管 內 皮 依 存 性 舒 張, 血 管 收 縮, L-NAME, SOD, catalase, NO, 超 氧 陰 離 子 I

3 Abstract Apocynum venetum, also known as luobuma, has been used as the sole ingredient in antihypertensive tea in China. In our preliminary study, we found Apocynum venetum leaf extract (AVLE) could elicit vasorelaxation but at high dosage of AVLE could reverse the AVLEevoked vasorelaxation. In this study, we investigate the vascular tension effect of this herb extract in isolated rat thoracic aorta. AVLE 10 µg/ml and carbachol (CCh) could elicit endothelium- dependent vasorelaxation. AVLE has shown the long-lasting vasodilatation which that effect could inhibit the phenylephrine (α 1 -adrenergic receptor agonist; PE)-evoked vasoconstriction but could not inhibit potassium cholride-evoked vasoconstriction. The AVLE-evoked long-lasting vasodilatation could be reversed by L-NAME (nitric oxide synthase inhibitor). The concentration above AVLE 30 µg/ml (high dosage) could reverse AVLE evoked long-lasting vasorelaxation. Combined SOD and catalase could inhibit the reverse AVLE evoked vasorelaxation, but less inhibits effect by catalase only. In summary, our results indicate the mechanism of relaxative effect on vascular muscle might be related to endothelium-dependent NO mediated and the high dosage of AVLE evoked vasoconstriction might be mediated by superoxide anions in isolated rat aorta. Key words: luobuma, AVLE, antihypertensive tea, aorta, EDRF, vasoconstriction, L-NAME, SOD, catalase, NO, superoxide anions. II

4 序 言 與 誌 謝 辭 首 先 要 感 謝 家 人 平 時 對 我 的 支 持 與 鼓 勵, 沒 有 你 們 的 栽 培, 就 沒 有 今 日 的 我 也 要 感 謝 關 教 授 和 謝 老 師, 平 時 耐 心 的 教 導 與 督 促, 讓 我 能 夠 順 利 完 成 碩 士 學 業 與 學 位 ; 在 這 些 日 子 和 過 程 當 中, 無 論 是 生 活 上 學 業 上 人 際 關 係 的 經 驗, 我 都 學 到 很 多 最 後, 感 謝 實 驗 室 的 成 員 : 梁 老 師 家 佳 昌 鑫 peter 和 其 他 人 的 關 心 ; 有 你 們 陪 伴, 使 我 生 活 更 精 采 不 少! 感 恩, 謝 謝 你 們! III

5 目 錄 第 一 章 前 言 第 一 節 研 究 背 景 頁 數 一 高 血 壓 之 流 行 病 學 1 二 高 血 壓 之 治 療 1 三 近 年 來 降 壓 中 草 藥 作 用 在 血 管 上 的 機 制 研 究 1 四 中 草 藥 羅 布 麻 對 高 血 壓 之 應 用 現 況 2 (1) 基 源 與 分 布 2 (2) 中 醫 記 載 用 法 2 (3) 羅 布 麻 葉 的 成 分 3 (4) 現 代 科 學 研 究 3 五 AVLE 的 血 管 舒 張 因 子 4 六 血 管 內 皮 在 血 管 張 力 調 控 之 角 色 4 七 血 管 平 滑 肌 在 血 管 張 力 調 控 之 角 色 7 第 二 節 研 究 目 的 9 第 二 章 研 究 方 法 9 第 一 節 研 究 材 料 9 一 實 驗 試 劑 9 二 實 驗 儀 器 11 三 實 驗 動 物 14 第 二 節 研 究 設 計 16 一 實 驗 控 制 組 流 程 16 二 大 鼠 血 管 內 皮 與 去 內 皮 實 驗 設 計 17 三 AVLE 低 劑 量 舒 張 血 管 實 驗 17 IV

6 頁 數 四 AVLE 高 劑 量 逆 轉 舒 張 血 管 實 驗 17 五 AVLE 高 劑 量 逆 轉 舒 張 之 機 轉 17 六 AVLE 長 時 間 培 育 時 對 內 皮 及 平 滑 肌 作 用 完 整 之 影 響 18 第 三 節 統 計 方 法 18 第 三 章 研 究 結 果 19 一 低 濃 度 AVLE 對 內 皮 依 存 性 及 對 於 大 鼠 主 動 脈 血 管 環 舒 張 之 影 響 19 二 去 內 皮 與 完 整 內 皮 之 狀 態 下 ;AVLE 濃 度 累 加 至 高 劑 量 逆 轉 舒 張 之 作 用 22 三 AVLE 與 血 管 培 育 時 間 對 血 管 收 縮 及 舒 張 之 影 響 28 四 高 劑 量 AVLE 對 內 皮 和 血 管 平 滑 肌 作 用 後, 完 好 程 度 之 統 計 32 五 AVLE 高 劑 量 收 縮 之 機 轉 32 第 四 章 討 論 35 第 一 節 低 濃 度 AVLE 於 大 鼠 主 動 脈 血 管 環 產 生 內 皮 依 存 性 舒 張 之 探 討 35 第 二 節 AVLE 雙 效 反 應 之 探 討 36 第 三 節 AVLE 高 劑 量 影 響 超 氧 陰 離 子 恢 復 收 縮 之 機 轉 37 第 四 節 AVLE 之 時 間 依 存 性 和 劑 量 依 存 性 38 第 五 節 AVLE 在 靜 置 張 力 之 影 響 39 第 六 節 其 他 相 關 性 討 論 39 第 七 節 研 究 限 制 41 第 五 章 結 論 與 建 議 42 第 一 節 結 論 42 V

7 第 二 節 對 未 來 研 究 方 向 的 建 議 42 參 考 文 獻 43 VI

8 圖 目 錄 頁 數 圖 一 血 管 平 滑 肌 舒 張 機 轉 圖 6 圖 二 血 管 平 滑 肌 收 縮 機 轉 圖 8 圖 三 離 體 動 物 血 管 等 長 張 力 儀 圖 11 圖 四 tranducer 圖 12 圖 五 器 官 槽 圖 12 圖 六 紀 綠 器 圖 12 圖 七 amplifier 圖 13 圖 八 離 體 大 白 鼠 主 動 脈 組 織 圖 14 圖 九 紀 錄 器 按 鍵 圖 15 圖 十 物 理 方 法 去 內 皮 圖 17 圖 十 一 化 學 方 法 去 內 皮 圖 17 圖 十 二 AVLE 導 致 大 白 鼠 主 動 脈 血 管 環 舒 張 結 果 圖 20 圖 十 三 高 劑 量 AVLE 影 響 大 白 鼠 主 動 脈 血 管 環 恢 復 收 縮 結 果 圖 23 圖 十 四 高 劑 量 AVLE 在 前 置 低 劑 量 收 縮 劑 PE 狀 態 下 響 影 大 白 鼠 主 動 脈 血 管 環 恢 復 收 縮 結 果 圖 25 圖 十 五 高 劑 量 AVLE 在 大 白 鼠 主 動 脈 血 管 環 靜 置 張 力 狀 態 下 之 刺 動 反 應 結 果 圖 27 圖 十 六 高 劑 量 AVLE 對 大 白 鼠 主 動 脈 血 管 環 之 損 傷 作 用 結 果 圖 29 圖 十 七 SOD 取 消 高 劑 量 AVLE 在 大 白 鼠 主 動 脈 血 管 環 恢 復 收 縮 作 用 之 結 果 圖 33 VII

9 [Ca +2 ] i Ang Ⅱ AVLE BH 4 CaM CCh cgmp cnos EDCF EDHF EDRF enos ER ET-1 GC GTP inos IP 3 IP 3- R KCl L-NAME MLCK nnos NO NOS O 2 - OH - Abbreviation Cytosolic free Ca +2 concentration Angiotensin Ⅱ Apocynum Venetum leaf extract Tetrahydrobiopterin Calcium binding protein calmodulin Carbacol Cyclic guanosine monophosphate Constitutive nitric oxide synthase Endothelium-derived contractive fator Endothelium-derived hyperpolarizing factor Endothelium-derived relaxing factor Endothelial nitric oxide synthase Endoplasmic Reticulum Endothelin-1 Guanylate cyclase Guanosine triphosphate Inducible nitric oxide synthase Inositol 1,4,5-triphosphate Inositol 1, 4, 5-triphosphate receptor Potassium chloride N G -nitro-l-arginine methyl ester Myosin light chain kinase Neuronal nitric oxide synthase Nitric oxide Nitric oxide synthase Superoxide anion Hydroxyl radical VIII

10 ONOO - PE Peroxynitrite Phenylephrine PGI 2 Prostacyclin I 2 ROS Reactive oxygen species SOD Superoxide dismutase SR Sarcoplasmic reticulum TXA 2 Thromboxane A 2 IX

11 第 一 節 研 究 背 景 第 一 章 前 言 一 高 血 壓 之 流 行 病 學 正 常 人 之 血 壓 值, 收 縮 壓 小 於 120 mmhg, 舒 張 壓 小 於 80 mmhg 一 旦 血 壓 值 收 縮 壓 大 於 140 mmhg, 舒 張 壓 大 於 90 mmhg 之 範 圍, 即 稱 為 高 血 壓 根 據 JNC 7 報 告, 美 國 有 五 千 萬 之 人 口, 患 有 高 血 壓 全 球 有 十 億 人 口 患 有 高 血 壓 而 台 灣 在 年 之 健 康 調 查, 患 有 高 血 壓 的 人 口 比 率, 成 年 人 男 性 為 26%, 女 性 19 為 % 二 高 血 壓 之 治 療 高 血 壓 藥 理 上 之 治 療, 包 括 了 : 利 尿 劑 α- 阻 斷 劑 血 管 張 力 素 酶 抑 制 劑 血 管 張 力 素 受 體 阻 斷 劑 和 鈣 離 子 抑 制 劑 (Lee &Oh, 2010) 其 中 造 成 高 血 壓 之 因 素 為 血 管 硬 化, 如 減 少 了 動 脈 順 應 性, 便 會 增 加 心 臟 之 後 負 荷, 引 起 快 速 的 血 壓 上 升 內 皮 失 能, 為 造 成 血 管 硬 化 之 重 要 因 素, 同 時 為 血 管 老 化 之 表 徵 因 此, 治 療 高 血 壓 可 從 改 善 血 管 內 皮 功 能 著 手 ; 因 減 少 了 動 脈 血 管 硬 化, 增 加 動 脈 血 管 彈 性,, 進 而 達 到 增 加 血 管 動 脈 順 應 性, 而 達 到 治 療 高 血 壓 之 效 果 (Correia & Haynes, 2007; Lee, Karam, Hussain & Winer, 2008; Takumi et al., 2010) 三 近 年 來 降 壓 中 草 藥 作 用 在 血 管 上 的 機 制 研 究 中 草 藥 藉 由 促 進 血 液 循 環, 引 起 血 管 舒 張 ; 以 達 到 去 血 化 瘀 和 治 療 高 血 壓 之 功 效 例 如 : 粉 防 己 (Tetrandra stephania ), 含 有 成 份 tetrandrine, 藉 由 抑 制 在 平 滑 肌 細 胞 上 之 電 壓 活 化 鈣 離 子 通 道, 達 到 血 管 平 滑 肌 舒 張 的 效 果 (Kwan, 1994; Wang, Lemos & Iadecola, 2004) 川 芎 (Ligustrium wallichi), 含 有 成 份 tetramethylpyazine(kwan, 1994), 1

12 可 經 由 抑 制 α- 腎 上 腺 受 體 活 化 ATP- 敏 感 性 鉀 離 子 通 道 和 活 化 鈣 離 子 依 存 性 鉀 離 子 通 道 (Tsai, Lai, Huang, Liu & Cheng, 2002) 鉤 藤 (Uncaria rhychophylla), 可 藉 由 抑 制 L- 型 鈣 離 子 通 道, 達 到 降 血 壓 的 效 果 (Zhang, Chen, Sim & Kwan, 2004) 其 它 像 : 人 參 (Panax ginseng) 杜 仲 (Eucommia ulmoides) 刺 五 加 (Eleutherococcus senticosus), 則 可 藉 由 內 皮 依 存 性 舒 張 因 子 產 生 一 氧 化 氮 (NO), 和 活 化 鉀 離 子 通 道 之 方 法, 來 達 到 降 血 壓 之 效 果 (Chen, 1996; Kwan, Chen, Deyama & Nishibe, 2003; Kwan, Zhang, Deyama & Nishibe, 2004; Kwan, Zhang, Nishibe & Seo, 2005; Kwan, Zhang, Sim, Deyama & Nishibe, 2004) 四 中 草 藥 羅 布 麻 對 高 血 壓 之 應 用 現 況 (1) 基 源 : 羅 布 麻 Apocynum venetum L., 一 種 廣 泛 生 長 在 中 國 中 部 至 西 北 部 區 域 的 野 生 植 物, 屬 夾 竹 桃 科 (Apocynaceae) 在 中 國 泛 稱 為 羅 布 麻 (Loubuma)(Kamata, Seo & Nakajima, 2008), 在 日 本 則 稱 為 Rafuma (Kim, Yokozawa, Hattori, Kadota & Namba, 2000a); 在 中 國 和 日 本 當 地, 羅 布 麻 的 葉 子 通 常 用 來 泡 茶 飲 用, 具 有 健 康 養 生 的 作 用 (2) 中 醫 記 載 用 法 : 遠 從 中 國 古 代, 羅 布 麻 葉 泡 茶 飲 即 是 傳 統 用 藥 動 物 研 究 顯 示 有 顯 著 的 利 尿 作 用 (Qian et al., 1988); 羅 布 麻 葉 對 於 心 悸 失 眠 肝 陽 暈 眩 治 療 高 血 壓 (Kim et al., 2000a; Kwan et al., 2005; Ma & Chen, 1989; Tagawa, Kagawa, Nakazawa, Onizuka, Nishibe & Kawasaki, 2004) 腎 腫 發 炎 和 神 經 衰 弱 等 疾 病 症 狀 有 良 好 的 治 療 功 效 2

13 (3) 羅 布 麻 葉 的 成 份 : 目 前, 從 羅 布 麻 葉 分 離 出 的 16 種 成 分 有 :adhyperforin, hyperforin, amentoflavone, biapigenin, quercetin, avicularin, acetylated isoquercetin, acetylated hyperoside, astragalin, trifolin, isoquercetin, hyperoside, querciturone, rutin, chlorogenic acid and quercetin-3-o-β- d-glucosyl-β-d-glucopyranoside (Zhang, Liu, Zhang, Wang, Wu & Li, 2010) (4) 現 代 科 學 研 究 : 科 學 家 研 究 發 現, 從 羅 布 麻 葉 中 萃 取 出 來 的 萃 取 物, 具 有 利 尿 (Qian et al., 1988) 抗 脂 質 過 氧 化 (Yokozawa, Dong & Kashiwagi, 1997) 保 護 肝 臟 (Xiong et al., 2000) 以 及 抗 氧 化 的 功 能 (Kim, Yokozawa, Hattori, Kadota & Namba, 2000b; Ma et al., 1989; Takako Yokozawa, 2004; Yokozawa, Kashiwada, Hattori & Chung, 2002) 而 氧 化 壓 力 常 與 神 經 退 化 性 疾 病 相 關 (Shirai, Kawai, Yamanishi & Terao, 2005) 科 學 研 究 也 在 十 字 迷 宮 測 驗 中 發 現, 老 鼠 在 口 服 AVLE mg/kg 明 顯 地 增 加 出 現 在 開 放 區 域 的 時 間 比 例, 增 強 了 抗 焦 慮 的 功 能 (Grundmann, Nakajima, Seo & Butterweck, 2007) 而 在 強 迫 式 游 泳 測 驗 中 ( 註 :Porsolt 在 1978 年 所 提 出 的 方 法 : 將 大 鼠 或 小 鼠 丟 在 有 水 的 透 明 壓 克 力 圓 柱 桶 裡, 老 鼠 會 在 水 裡 掙 扎 試 圖 逃 脫, 努 力 無 效 之 後 會 放 棄 掙 扎 而 漂 浮 在 水 面 上 呈 現 靜 止 不 動 的 姿 勢 此 方 法 可 用 來 作 為 篩 選 抗 憂 鬱 藥 劑 之 藥 理 學 測 驗 ), 大 鼠 在 口 服 羅 布 葉 萃 取 物 30 ~ 125 mg/ kg 明 顯 地 縮 短 在 測 驗 中 游 泳 不 動 的 時 間, 顯 示 了 抗 憂 鬱 的 功 能 (Butterweck, Nishibe, Sasaki & Uchida, 2001; Grundmann, Nakajima, Kamata, Seo & Butterweck, 2009; Grundmann et al., 2007) 3

14 五 AVLE 的 血 管 舒 張 因 子 羅 布 麻 葉 純 萃 取 物 Venetron 的 主 要 兩 種 成 份 :Hyperoside 和 Isoquercitrin, 主 要 有 抗 焦 慮 抗 氧 化 和 降 血 壓 等 作 用 (Butterweck et al., 2001; Tagawa et al., 2004) Hyperoside 之 化 學 式 :quercetin 3-O-β-D-gatactose Isoquercetin 之 化 學 式 :quercetin 3-O-β-D-glucoside (Kamata et al., 2008) 六 血 管 內 皮 在 血 管 張 力 調 控 之 角 色 動 脈 血 管 的 生 理 構 造 組 成 基 本 上 可 分 為 三 層 : (1) 內 皮 層 intima layer, 主 要 為 單 層 的 endothelial cells (2) 平 滑 肌 層 medial layer, 主 要 為 smooth muscle cells (3) 動 脈 外 膜 adventitial layer, 主 要 為 由 膠 原 纖 維 (collagen) 所 組 成, 此 膠 原 纖 維 層 俱 有 固 定 和 穩 定 血 管 與 附 近 之 器 官 之 作 用 內 皮 是 由 一 層 許 多 單 一 個 內 皮 細 胞 所 組 成 在 血 管 組 織 系 統 中, 內 皮 對 於 血 管 張 力 之 調 節 使 血 管 及 分 泌 內 分 泌 素, 對 平 滑 肌 產 生 收 縮 或 舒 張 佔 有 很 重 要 功 能 與 地 位 動 脈 血 管 內 皮 失 去 功 能, 是 導 致 動 脈 硬 化 主 要 原 因 之 一 因 此, 血 管 收 縮 抑 制 劑, 血 管 舒 張 作 用 劑, 可 恢 復 動 脈 順 應 性, 減 少 動 脈 硬 化 導 致 的 高 血 壓 (Glasser, 2000; Lee et al., 2008) 內 皮 會 分 泌 以 下 因 子 : 內 皮 依 存 性 舒 張 因 子 (EDRF) (Furchgott RF, 1980): 一 氧 化 氮 (NO) 前 列 素 I 2 (PGI 2 ) 以 及 內 皮 依 存 性 過 極 化 因 子 (Endothelium-Derived Hyperpolarizing Factor ; EDHF) (Feletou & Vanhoutte, 2009) 當 小 血 管 動 脈 有 EDRF ( 一 氧 化 氮, NO) 產 生 時, EDHF 也 會 功 能 性 的 增 加 更 多 活 性 然 而, 在 KCl mm 的 低 濃 度 下,KCl 會 引 起 較 小 的 或 沒 有 的 收 縮 反 應 現 象 然 4

15 而, 在 此 低 濃 度 下 (KCl) 卻 能 夠 抑 制 小 動 脈 血 管 的 EDHF 的 現 象 (Adeagbo & Triggle, 1993; Luksha, Agewall & Kublickiene, 2009; Shimokawa et al., 1996) 根 據 文 獻 內 皮 不 只 產 生 舒 張 因 子, 另 一 方 面 也 會 產 生 收 縮 因 子, 例 如 內 皮 依 存 性 收 縮 因 子 (EDCF): 內 皮 素 (ET-1) 血 栓 素 (TXA 2 ) 血 管 張 力 素 (Ang Ⅱ ) O 2 - (superoxide anion) 等 (Edgaras Stankevičius, 2003) 細 胞 血 管 舒 張 因 子 : 一 氧 化 氮 NO (nitric oxide) 1980 年,Robert F. Furchgott, Louis J. Ignarro 和 Ferid Murad 發 現 血 管 內 皮 依 存 性 舒 張 因 子 之 物 質 : 一 氧 化 氮, 因 而 獲 得 諾 貝 爾 獎 (Furchgott & Zawadzki, 1980) 一 氧 化 氮 可 作 為 生 物 體 內 的 訊 息 傳 遞 者 (Nathan & Xie, 1994), 在 生 物 體 內 適 量 產 生 時, 有 保 護 組 織 器 官 之 作 用, 例 如 高 血 壓 之 病 人, 血 管 舒 張 之 效 應 然 而 持 續 性 產 生 時, 反 而 會 產 生 細 胞 組 織 毒 害 之 作 用 (Gross & Wolin, 1995), 例 如 : 敗 血 症 一 氧 化 氮 合 成 酶 nitric oxide synthase( 簡 寫 為 :NOS) 共 存 在 三 種 形 態 : 分 成 誘 導 型 (inos) 體 質 內 皮 型 (enos) 和 體 質 神 經 型 (nnos)(forstermann, Nakane, Tracey & Pollock, 1993) cnos (constitutive NOS 包 括 了 enos and nnos, 稱 為 體 質 型 ) 在 體 質 型 細 胞 內, 當 Ca +2 濃 度 上 升, 和 calmodulin, 形 成 Ca +2 -calmodulin 複 合 體, 接 著 活 化 一 氧 化 氮 合 成 酶 (NOS), 再 將 精 胺 酸 (arginine) 和 O 2, 裂 解 為 citrulline 和 NO NO 在 平 滑 肌 細 胞 中 再 活 化 GC (Guanylate cyclase),gc 將 GTP 催 化 成 cgmp, cgmp 造 成 平 滑 肌 細 胞 舒 張 的 現 象 5

16 方 程 式 : Arginine + O 2 NO S Citrulline + NO Ca 2+, BH4 圖 1. 血 管 平 滑 肌 舒 張 機 轉 精 胺 酸 (arginine) 和 氧 氣 經 NOS 活 化 產 生 NO (nitric oxide),no 從 內 皮 擴 散 至 平 滑 肌 細 胞 並 活 化 GC. 活 化 GC 後, 累 積 產 生 cgmp 而 後 cgmp 使 平 滑 肌 舒 張 而 NO 影 響 血 管 的 功 能 : 可 分 為 直 接 作 用 血 管 產 生 舒 張, 或 靠 著 抑 制 收 縮 物 質 ( 如 : 血 管 張 力 素 和 交 感 神 經 之 作 用 ) 影 響, 間 接 作 用 血 管 產 生 舒 張 此 外,NO 還 有 抗 血 栓 凝 集 抗 發 炎 以 及 抗 血 管 平 滑 肌 增 植 肥 大 的 作 用 (Forstermann, 2008; Forstermann & Munzel, 2006; 6

17 Forstermann et al., 1993) 在 離 體 大 鼠 主 動 脈 血 管 環 內 皮 完 整 狀 態 之 下, 施 予 L-NAME 或 者 血 管 去 內 皮 的 狀 態 下, 會 完 全 抑 制 AVLE 10 µg/ml 之 舒 張 效 果 ; 判 定 此 作 用 在 血 管 的 物 質 為 EDRF 之 物 質 : 一 氧 化 氮 (nitric oxide, NO) (Kwan et al., 2005) 七 血 管 平 滑 肌 在 血 管 張 力 調 控 之 角 色 血 管 平 滑 肌 的 收 縮, 為 反 應 血 壓 變 化 而 維 持 血 管 肌 肉 長 時 間 之 等 長 張 力 之 作 用 血 管 平 滑 肌 的 肌 肉 收 縮, 會 被 平 滑 肌 細 胞 質 內 的 內 鈣 濃 度 上 升 所 引 起 當 平 滑 肌 細 胞 內 鈣 濃 度 上 升 時, 和 攜 鈣 素 ( CaM ) 形 成 Ca +2 -CaM 複 合 體, 此 複 合 體 會 活 化 肌 原 蛋 白 輕 鏈 磷 酸 酶 (MLCK), 並 使 肌 原 蛋 白 磷 酸 化, 使 平 滑 肌 產 生 收 縮 而 平 滑 肌 內 鈣 濃 度 之 上 升 之 原 因 有 : 被 L- 型 鈣 離 子 通 道 和 配 位 子 陽 離 子 通 道 所 引 起 之 細 胞 質 外 鈣 流 入, 以 及 受 到 位 於 ER 上 的 IP 3 -R 結 合 IP 3 之 活 化 釋 放 內 鈣 所 影 響 (Rembold, 1992; Webb, 2003) 7

18 圖 2. 血 管 平 滑 肌 收 縮 機 轉 IP 3 之 活 化 使 SR 中 的 內 鈣 大 量 釋 放 配 位 子 鈣 離 子 通 道 以 及 L 型 鈣 離 子 通 道 的 開 啟, 使 外 鈣 流 入 細 胞 質 內 細 胞 內 內 鈣 濃 度 的 上 升, 與 CaM 形 成 Ca +2 -CaM 複 合 體, 活 化 MLCK, 磷 酸 化 肌 原 蛋 白, 使 平 滑 肌 產 生 收 縮 PE 為 α- 腎 上 腺 受 體 致 效 劑, 與 受 體 結 合 後 經 由 PLC 活 化 IP 3 和 DAG, 而 後 IP 3 作 用 在 肌 漿 網 受 體, 活 化 肌 漿 網 釋 放 內 鈣 流 DAG 則 是 活 化 PKC, 接 著 磷 酸 化 肌 凝 蛋 白 輕 鏈, 產 生 平 滑 肌 之 收 縮 (Rembold, 1992; Webb, 2003) KCl 則 是 藉 由 平 滑 肌 細 胞 產 生 興 奮 去 極 化 之 作 用, 活 化 電 壓 調 控 鈣 離 子 通 道 之 開 啟, 進 而 使 外 鈣 離 子 進 入 細 胞 中, 直 接 致 使 收 縮 (Rembold, 1992; Webb, 2003) 8

19 L-NAME (N G -nitro-l-arginine methyl ester) 為 一 氧 化 氮 合 成 酶 抑 制 劑 在 本 實 驗 中 用 來 檢 視 逆 轉 NO 之 收 縮 作 用 SOD (superoxide dismutase): 超 氧 化 物 歧 化 酶 ; 能 將 超 氧 陰 離 子 催 化 為 氧 (O 2 ) 和 過 氧 化 氫 (H 2 O 2 ) 可 分 為 作 用 於 細 胞 質 中 的 SOD 1 (Cu-Zn-SOD), 作 用 於 粒 腺 體 中 的 SOD 2 (Mn-SOD), 和 作 用 於 細 胞 外 的 SOD 3 (Cu-Zn-SOD) (Forstermann, 2010) 第 二 節 研 究 目 的 根 據 前 學 者 之 研 究 (Kwan et al., 2005),AVLE 10 μg/ml 對 離 體 大 鼠 主 動 脈 環, 有 血 管 舒 張 之 效 應 而 在 後 續 AVLE 離 體 大 鼠 實 驗 中, 發 現 AVLE 累 積 至 30 μg/ml 高 劑 量 時, 有 逆 轉 舒 張 之 現 象 因 此, 本 研 究 目 的 在 於 : 探 討 高 劑 量 AVLE 對 離 體 大 鼠 主 動 脈 血 管 引 起 逆 轉 舒 張 (restored- contraction) 之 現 象 及 機 轉 第 二 章 研 究 方 法 第 一 節 研 究 材 料 一 實 驗 試 劑 1. 以 下 藥 物 皆 以 二 次 蒸 餾 水 (double distilled water) 配 製 : phenylephrine (PE): 配 製 2.03 mg / ml = 10-2 M 之 後, 再 稀 釋 十 倍 為 10-3 M, 再 稀 釋 10 倍 為 10-4 M, 然 後 取 50 μl 加 入 器 官 槽 (organ bath) 當 中, 其 容 量 5 ml; 所 以 最 終 濃 度 為 10-6 M ( 當 50 μl 之 藥 物 投 入 5 ml 之 器 官 槽 中, 藥 物 濃 度 會 被 稀 釋 100 倍 ) carbachol (CCh): 配 製 5.49 mg/ml = M, 然 後 稀 釋 十 倍 為 M, 再 稀 釋 十 倍 為 M, 取 50 μl 加 入 器 官 槽 (organ bath) 9

20 5 ml 中, 所 以 最 終 濃 度 為 M potassium cholride (KCl) 80 mm: 分 子 量 :74.55 取 22.4g KCl 溶 入 0.1 L 之 二 次 蒸 餾 水 中, 配 成 濃 度 為 3 M 之 KCl 之 溶 液 而 後, 取 130 μl 加 入 5 ml 之 器 官 槽 中, 所 以 最 終 濃 度 為 80 mm N G -nitro-l-arginine methyl ester ( L-NAME): 分 子 量 :269.7 配 製 2.69 mg/ml = 10-2 M, 然 後 取 150 μl 加 入 器 官 槽 5ml 中, 所 以 最 終 濃 度 為 M 註 : 以 上 藥 物 購 買 自 Sigma chemical 公 司 (St. Louis, Mo USA ) Apocynum venetum leaf extract (AVLE): 取 1 mg 的 AVLE 溶 於,1 ml 之 二 次 水 中, 濃 度 為 1 mg / ml 然 後 取 50 μl 加 入 器 官 槽 5 ml 中, 最 終 稀 釋 100 倍, 濃 度 為 10 μg/ml 藥 品 來 源 :Tokiwa 製 藥 廠 Kreb s solution 所 含 成 分 之 濃 度 (mm): NaCl 119 mm, NaHCO 3 25 mm, D-glucose 11 mm, KH 2 PO mm, KCl 4.7 mm, MgSO 4 7H 2 O 1.2 mm, CaCl 2H 2 O 2.4 mm Kreb s solution 溫 度 保 持 36.5 C 在 充 氣 (carboxigen) 之 狀 況 下 維 持, 酸 鹼 值 ph 藥 物 配 製 注 意 事 項 : (1) 秤 藥 用 具 : 使 用 藥 秤, 單 位 至 mg 小 數 點 後 一 位 一 支 鐵 製 藥 枃, 一 支 小 細 調 節 輪 藥 枃 秤 藥 之 小 塑 膠 盤 數 張 擦 手 紙 ; 秤 完 藥 後 用 擦 手 紙 清 理 器 具 10

21 (2) 將 裝 有 2 公 升 之 一 次 水 的 大 量 筒, 放 至 電 磁 攪 拌 加 熱 爐 上, 放 入 磁 棒 電 磁 攪 拌 強 度 調 整 至 6 ~ 8 之 強 度, 使 磁 棒 攪 拌 轉 速 至 最 大, 加 速 溶 解 藥 物 1. 使 用 儀 器 項 目 二 實 驗 儀 器 : Gross isometric displacement tranducer FT03 Gould transducer amplifier 器 Gould 2600s 紀 錄 圖 3. 離 體 動 物 血 管 等 長 張 力 儀, 紀 錄 血 管 收 縮 和 舒 張 之 情 形 11

22 2. 準 備 與 校 正 儀 器 : (1). 準 備 肥 皂 水 和 小 刷 子, 刷 洗 器 官 槽 ( organ bath ) 刷 洗 後, 用 一 次 水 沖 洗 器 官 槽 圖 4.,tranducer 一 座, 加 上 器 官 槽 圖 5., 器 官 槽 ( organ bath ) (2). 調 整 血 管 張 力 紀 錄 器, 按 電 源 按 鈕 啟 動 ; 開 關 扳 鈕 measure zero ; 在 measure 時, 調 整 轉 鈕 position 將 墨 水 筆 頭 各 調 至 基 準 線 若 先 調 position 無 用 ; 後 調 balance 圖 6. 如 下 : 12

23 (3). 掛 一 克 砝 碼, 做 張 力 克 數 定 量 若 墨 水 筆 頭 沒 到 砝 碼 一 克 重 之 標 準 格 數 線 : 調 整 amplifier ( 如 下 圖 ) 上 的 calibrate 轉 至 砝 碼 一 克 重 之 格 數 線 後, 拿 起 砝 碼, 看 有 無 退 回 基 準 線, 若 無 則 調 balance 轉 鈕 至 基 準 線 ; 放 一 克 砝 碼 看 有 無 至 砝 碼 一 克 重 之 格 數 線, 再 調 calibrate 轉 鈕 至 基 準 線 而 後 程 序 反 覆 試 之 ; 到 定 量 皆 標 準 無 誤 差 為 止 圖 7. Amplifier 和 Calibrate 與 balance 轉 鈕 13

24 三 實 驗 動 物 (1) Male Sprague-Dawley rat, 體 重 :350±80 克 ( gm ) 用 具 準 備 : 報 紙 大 骨 剪 ( 剪 皮 骨 ) 小 剪 ( 剪 組 織 器 官 ) 攝 子 等 (2) 使 用 CO 2 犧 牲 老 鼠, 取 下 老 鼠 主 動 脈 ( 如 下 圖 ) 後, 先 用 攝 子 夾 住 主 動 脈 末 端, 在 裝 有 Kreb s solution 之 圓 底 盤 中 浸 洗 迅 速 圖 8.: 白 色 組 織 為 清 理 完 結 締 組 織 之 離 體 大 鼠 主 動 脈, 與 紅 色 組 織 ( 剛 取 出 之 離 體 大 鼠 主 動 脈 ) 圖 容 器 中 盛 裝 之 克 氏 生 理 溶 液 (Kreb s solution), 每 十 分 鐘 換 一 次 新 溶 液 以 保 持 溶 液 溫 度, 以 及 組 織 所 需 之 養 分 ; 溶 液 中 氧 氣 氣 泡 管 需 全 程 供 應 搖 洗, 將 表 面 血 液 大 致 洗 浸 過 後, 放 至 第 二 盤 Kreb s solution ( 放 入 氧 氣 管 ) 用 大 頭 釘 和 塑 膠 底 盤 固 定 主 動 脈 兩 端 之 connective tissue ( 結 締 組 織 ), 用 兩 支 攝 子 並 用 夾 剪 之 方 法, 清 除 主 動 脈 表 面 結 締 組 織 之 和 殘 餘 血 塊 ( 注 意 在 解 剖 主 動 脈, 和 清 理 結 締 組 織 時 儘 量 不 要 拉 扯 到 主 動 脈 血 管, 避 免 破 壞 血 管 內 皮 之 作 用 活 性 ) 清 理 結 締 組 織 時, 需 要 每 十 分 鐘 換 一 次 Kreb s solution, 14

25 以 保 持 溫 度 及 養 分, 必 免 血 管 組 織 失 去 活 性 (3) 將 主 動 脈 末 端 夾 子 夾 過 的 地 方 和 大 頭 釘 釘 過 的 地 方, 用 刀 鋒 銳 利 之 小 剪, 一 刀 到 底 剪 下, 接 下 來 以 二 分 之 一 等 分 法, 將 主 動 脈 血 管 分 配 等 分 剪 成 為 2.5 ~ 3.0 mm 的 主 動 脈 血 管 環 (aortic rings ) (4) 將 主 動 脈 血 管 環 小 心 仔 細 穿 過 綁 線 鐵 鈎 和 塑 膠 棒 鐵 鈎 ; 架 設 張 力 傳 導 器 必 需 注 意 : 鐵 鈎 刺 傷 內 皮 ; 架 設 時 用 手 指 捏 住 線 和 塑 膠 棒 上 端 作 固 定 ( 避 免 血 管 環 組 織 的 拉 扯, 以 及 鐵 鈎 和 塑 膠 棒 鐵 鈎 互 相 卡 住, 也 會 傷 害 內 皮 ), 再 將 線 圈 掛 在 張 力 傳 導 儀 的 掛 鈎 上 (5) 將 張 力 傳 導 器 之 粗 調 節 輪 往 上 拉 2 克 張 力, 兩 手 並 用 將 後 面 的 鎖 轉 轉 緊 (6) 啟 動 機 器 150 mm / h, 等 參 數 按 鈕 讓 張 力 紀 錄 器 裡 的 紀 錄 紙 開 始 啟 動 紀 錄 圖 9. 如 下 : 註 : 動 物 實 驗 參 考 指 引 (Sammut et al., 1998) 15

26 第 二 節 研 究 設 計 一 實 驗 控 制 組 流 程 : (1) 張 力 靜 置 期 equilibration: 開 始 90 分 鐘 之 靜 置 期 equilibration; 每 十 五 鐘 wash 一 次 共 6 次 (2) 張 力 建 立 期 stabilization: 靜 置 期 equilibration 之 後, 加 KCl (80 mm 共 3 次 ) 建 立 標 準 張 力 一 次 KCl, 作 用 收 縮 期 間 約 30~40 分 鐘 30~40 分 鐘 後, 每 五 分 鐘 wash 一 次 ; 共 wash 五 次, 約 20 分 鐘 兩 個 KCl 之 間 要 相 隔 20 ~30 分 的 恢 復 期 (recovering) (3) 實 驗 藥 物 作 用 期 experimentation:kcl 加 完 後, 先 加 phenylephrine (PE) 10-6 M 約 20 分 後, 後 加 cabarcol (CCh) M, 測 試 內 皮 活 性 之 良 好 程 度, 實 驗 採 用 內 皮 活 性 良 好 的 血 管 環, 使 PE 收 縮 張 力 曲 線 下 降 60~80%, 最 高 完 整 張 力 曲 線 下 降 100% 至 水 平 基 線 carbacol (CCh) 作 用 完 後, 每 隔 5 分 鐘 換 洗 Kreb s solution, 5 次 之 後 開 始 實 驗 藥 物 藥 程 (4) 標 準 化 期 standardization: 最 後, 實 驗 藥 程 結 束 後, 加 最 後 一 次 KCl; 比 較 實 驗 前 後 KCl 之 活 性 差 異 ( 註 :KCl 實 驗 前 後 張 力 大 小 正 常 不 超 過 10%) 16

27 二 大 鼠 血 管 內 皮 與 去 內 皮 實 驗 設 計 圖 10. 物 理 去 內 皮 方 法 : 使 用 棉 花 細 棒 摩 擦 去 內 皮 圖 11. 化 學 去 內 皮 方 法 : 皂 素 (saponin 100~200 µg/ml) 除 去 大 鼠 血 管 環 內 皮 (Kwan et al., 2003) 內 皮 好 壞 取 捨 決 定 於 :CCh 舒 張 程 度 和 PE 張 力 收 縮 程 度 之 比 例, 到 達 60 % 以 上 者 為 內 皮 活 性 良 好 者 ; 低 於 20 % 者 可 自 動 作 為 去 內 皮 之 實 驗 設 計 三 AVLE 低 劑 量 舒 張 血 管 實 驗 : 實 驗 中,AVLE 低 劑 量 累 加 為 μg / ml 四 AVLE 高 劑 量 逆 轉 舒 張 血 管 實 驗 : 實 驗 中,AVLE 高 劑 量 累 加 為 μg / ml 五 AVLE 高 劑 量 逆 轉 舒 張 之 機 轉 : 17

28 ROS 阻 斷 劑, 測 定 內 皮 和 血 管 平 滑 肌, 測 定 逆 轉 舒 張 之 詳 細 機 轉 六 AVLE 長 時 間 培 育 時 對 內 皮 及 平 滑 肌 作 用 完 整 之 影 響 : 羅 布 麻 高 劑 量 使 用 過 後,CCh KCl 張 力 統 計 比 較 一 般 正 常 CCh KCl 之 張 力 值 其 它 注 意 事 項 : (1) 藥 物 配 製 完 成 後, 器 具 藥 品 需 收 拾 乾 淨 (2) 將 泡 好 之 Kreb s solution 先 倒 入 大 燒 瓶 中 (3) 將 裝 有 Kreb s solution 之 水 瓶 放 入 水 循 環 保 溫 機 中, ( 注 意 若 水 面 太 低, 請 先 加 一 次 水 ) 並 啟 動 循 環 保 溫 器 電 源, 讓 水 循 環 保 溫 (4) 在 organ bath 和 兩 平 底 圓 盤 中, 加 入 Kreb s solution 都 加 入 Kreb s solution 後, 再 開 氧 氣 瓶 ( 實 驗 中, 需 注 意 每 個 organ bath 裡 的 輸 氣 管 之 氧 氣 有 無 阻 塞 中 斷 ) 註 : 原 因 是 若 有 其 中 一 氣 泡 管, 沒 有 浸 入 液 體 曝 露 在 空 氣 中, 會 使 此 氣 泡 管 加 速 流 出 好 幾 倍 ( 壓 力 差 ) 的 氣 體 流 量 ; 所 以 若 有 氣 泡 管 曝 露 空 氣 中, 必 頇 關 掉 它 的 此 氣 管 之 閥 門 (5) 注 意 氧 氣 筒 上 的 指 針 標 示, 若 指 針 標 示 低 至 30~20 刻 度 之 間, 必 需 準 備 更 換 氧 氣 筒 第 三 節 實 驗 統 計 實 驗 結 果 統 計 使 用 mean ± S.D. 表 示 平 均 值 及 誤 差, 以 Student s t test 或 ANOVA test 等 統 計 方 法 分 析 其 差 異 顯 著 性, 當 P 值 小 於 0.05, 其 值 認 為 具 有 統 計 上 的 意 義 18

29 第 三 章 研 究 結 果 一 低 濃 度 AVLE 對 內 皮 (endothelium) 依 存 性 及 對 於 大 鼠 主 動 脈 血 管 環 舒 張 (relaxation) 之 影 響 在 內 皮 完 整 狀 態 下 ( 使 用 CCh M 測 定 內 皮 作 用 活 性 ) 的 離 體 大 鼠 主 動 脈 血 管 環 中, 給 予 前 置 收 縮 劑 PE 10-6 M, 後 給 AVLE 10 μg/ ml, 離 體 大 鼠 主 動 脈 血 管 環 能 行 使 舒 張 的 效 應 如 結 果 圖 12 B. 在 去 內 皮 的 狀 態 下, ( 使 用 皂 素 saponin 100 μg/ ml ; 將 離 體 大 鼠 主 動 脈 血 管 環 去 內 皮 ), 會 使 AVLE 10 μg/ ml 的 舒 張 效 應 消 失, 如 圖 12 D. 與 在 PE 10-6 M 之 前 使 用 一 氧 化 氮 合 成 酶 抑 制 劑 L-NAME M, 則 會 取 消 低 劑 量 AVLE 舒 張 之 效 應 如 圖 12 C. 統 計 如 ( 圖 12 E.) 19

30 Fig g A. C. 10 min +E +E B. +E D. -E E. Tension % *** *** PE CCh AVLE d.e +AVLE 20

31 Fig. 12 AVLE- induced vaso-relaxation in rat aortic rings. A. PE control. Tracing of phenylephrine ( PE ) 10-6 M. B. The tracing showing the effect of AVLE 10 µg/ml on contractile responses of rat aortic rings with intact endothelium in response to phenylephrine 10-6 M (PE; n= 11, from 3 rats). The CCh M, the endothelium functional test of the control in experiment in response to pretreated PE 10-6 M. C. Tracings showing that L-NAME prevented the relaxant effect of AVLE 10 µg/ml on PE 10-6 M contracted rat aortic rings. D. Tracing of endothelium denuded aortic contraction with compared to that endothelium intact when they were contracted with PE 10-6 M followed by addition of AVLE 10 μg/ml. E. Data summary of the relaxant effect of AVLE 10 µg/ml on the contractile responses of rat aortic rings with intact endothelium in response to phenylephrine 10-6 M (PE; n = 11). And with denuded endothelium (abbreviated as d.e) of rat aortic rings abolished the AVLE 10 µg/ml relaxation effect on phenylephrine 10-6 M contractile response. The result were compared to the relaxant effect of CCh M under the same experimental condition. *** Statistically significant ( P < 0.001) compared to PE control. 21

32 二 去 內 皮 與 完 整 內 皮 之 靜 置 張 力 下 ;AVLE 濃 度 累 加 至 高 劑 量 恢 復 收 縮 之 作 用 低 劑 量 AVLE 10 µg/ml 時 能 產 生 最 大 的 內 皮 調 節 產 生 NO 血 管 舒 張 作 用 效 應 ( NO-mediated and Endothelium-depend manner ) 而 當 實 驗 繼 續 累 積 至 高 劑 量 30 µg/ml 90 µg/ml 以 上 時, 血 管 舒 張 的 效 應 減 弱 了, 反 而 出 現 逆 轉 舒 張 ; 逆 轉 舒 張 之 現 象 ( 圖 13 B., C.) 當 累 積 劑 量 至 90 µg/ml, 甚 至 超 過 90 µg/ml 時,AVLE 會 減 少 離 體 大 鼠 血 管 環 舒 張 之 效 應, 使 張 力 水 平 恢 復 至 前 置 血 管 收 縮 劑 PE 10-6 M 之 收 縮 高 度 在 離 體 大 鼠 主 動 脈 血 管 環 去 內 皮 的 狀 態 下 ( 圖 13 D.), 則 看 不 出 此 逆 轉 舒 張 之 現 象 因 為 低 劑 量 舒 張 的 作 用 被 取 消 了, 因 此 看 不 出 逆 轉 舒 張 之 反 應 高 度 因 此, 實 驗 中 以 去 內 皮 與 否 之 離 體 大 鼠 主 動 脈 血 管 環 ; 前 置 低 劑 量 血 管 收 縮 劑 PE M, 後 累 加 AVLE 至 高 劑 量, 作 為 觀 察 逆 轉 舒 張 ; 逆 轉 舒 張 反 應 的 張 力 程 度 之 實 驗 設 計 ( 圖 14 A., B.) 以 及 前 置 使 用 L-NAME M 作 為 觀 察 AVLE 高 劑 量 之 逆 轉 舒 轉 ; 逆 轉 舒 張 反 應 之 張 力 現 象 ( 圖 14 C.) 統 計 圖 如 圖 14.E 在 實 驗 中, 在 靜 置 水 平 張 力 下 之 離 體 大 鼠 血 管 環, 給 予 AVLE 以 劑 量 累 加 之 方 法 至 高 劑 量 結 果 顯 示 十 個 離 體 大 鼠 動 脈 血 管 環 中 占 有 四 成 比 例 之 血 管 環 數 量, 具 有 spike activity 跳 動 活 性 之 現 象, 而 且 具 有 重 複 性 ( 如 圖 15.) 22

33 0.5 g Fig. 13 A. +E 10 min B. +E C. +E D. -E E. 23

34 Fig. 13 High dose AVLE restored- contraction effect in rat aortic rings. A. PE control. Tracing of PE 10-6 M. B. Typical tracing of concentration-dependence of AVLE 10, 30 μg/ml on PE contractions compared with control. C. Typical tracing of concentration-dependence of AVLE 10, 30, 90 μg/ml on PE contractions compared with control. D. tracing of concentration-dependence of AVLE 10, 30, 90 μg/ml on PE contractions with endothelium-denuded aortic rings. Typical tracing of concentration-dependence of AVLE on PE 10-6 M contracted aortic rings (-E, endothelium-denuded; +E, endothelium intact ). Removal of endothelium was achieved by incubating the aortic ring with Saponin 200 μg/ml for 5 minutes and assessed as the diminishment of relaxation induced by CCh M. E. Summary of data obtained under conditions as described in the legend of B. (statistically significant *, P < 0.05 ; ***, P < 0.01)(n = 5, from 3 rats) 24

35 +E Fig. 14 A. 0.5 g 10 min -E B. +E C. D. 25

36 Fig. 14 High dose AVLE restored- contraction effect on pretreated low dose PE in rat aortic rings A. Typical tracing of concentrationdependent of AVLE 10, 30, 90 μg/ml on PE-induced contraction in rat aorta with endothelium (+E). B. compared with that in denuded endothelium (-E) at low dose PE M. The restoration of PE-contraction remains below the plateau PE response after introduction of AVLE 90 μg/ml. C. Experiment condition remains the same as in the about protocol except that L-NAME M was used to inhibit the NO formation. D. Data summary of experiment as described in legend of Fig 14 A, B. (** P < 0.01, *** P < 0.001) (+E, n=6, from 3 rats) (-E, n=6, from 2 rats) 26

37 Fig g 10 min Fig. 15 Spike activity of high dose AVLE effect on resting tesion in rat aortic rings Spike activity of high dose AVLE 30, 90 μg/ml on resting tension level of rat aortic rings. Upon Two tracings are control and high dose of AVLE stored contractile effect. 27

38 三 AVLE 與 血 管 培 育 時 間 對 血 管 收 縮 及 舒 張 之 影 響 單 劑 量 AVLE 10 μg/ml 和 單 劑 量 30μg/ml 有 著 舒 張 血 管 之 效 應 ( 圖 16 A., 16 B.), 而 單 劑 AVLE 10 μg/ml 可 以 重 複 數 次 而 不 影 響 血 管 內 皮 活 性 單 劑 30 μg/ml 卻 不 能 重 複 第 二 次 ( 圖 16 B.) ( 第 二 次 作 用 下, 便 無 舒 張 血 管 之 效 應 ), 經 CCh M 作 用 內 皮 顯 示, 當 AVLE 30 μg/ml 重 複 時 ( 固 定 浸 浴 在 器 官 槽 10 分 鐘 ), 內 皮 活 性 也 會 逐 次 減 少 20% 在 低 劑 量 AVLE 10 μg/ml 長 時 間 浸 浴 在 器 官 槽 中 ( 約 40 mins), 則 無 法 再 重 覆 單 劑 低 劑 量 10 μg/ml 之 舒 張 作 用 ( 圖 16 C.), 而 且 CCh 內 皮 作 用 活 性 測 定 中, 與 後 加 的 PE, 測 定 活 性 作 用 皆 會 有 減 少 20 % 之 現 象 如 圖 16 E. 與 圖 16 F. 顯 示 出 AVLE 在 離 體 器 官 槽 中, 低 劑 量 長 時 間, 與 高 劑 量 短 時 間, 皆 會 對 離 體 大 鼠 主 動 脈 產 生 損 害 之 作 用 結 果 顯 示 AVLE 之 功 能 活 性 有 劑 量 依 存 性 和 時 間 依 存 性 之 特 徵 28

39 +E Fig. 16 A. 0.5 g 10 min +E B. +E C. D. Contraction to PE (%) Control *** AVLE 10 ug/ml Control 10 ug/ml AVLE 90 ug/ml AVLE ** AVLE 90 ug/ml 29

40 E. Contraction to PE (%) ** Control CCh AVLE 10 ug/ml Control CCh 10 ug/ml AVLE 30 ug/ml AVLE *** AVLE 30 ug/ml F. Control 10 ug/ml AVLE 90 ug/ml AVLE Contraction to KCl (%) Control ** *** AVLE AVLE 10 ug/ml 90 ug/ml Fig. 16 Damaged effect of high dose and low dose long time incubation of AVLE in rat aortic rings. A. Tracing of the effect high AVLE (90μg/ml) on the subsequent contraction to PE 10-6 M, CCh-induced relaxation and contraction to KCl 80 mm. B. Tracing of CCh after AVLE 30 μg/ml three times repeat on PE 10-6 M and 10-7 M. C. Tracing of low AVLE (10 μg/ml) in time control manner ( incubation for 30

41 40 mins ), and repeat CCh test. D. Statistics of pretreated high dose and low dose long time incubation of AVLE effect on PE. Black bar: Control contractions to PE 10-6 M. ( n=5, from 3 rats ) Gray bar: Contraction to PE 10-6 M after incubation with low AVLE 10 μg/ml for 40 minutes on rat aortic rings. ( n= 7 rings, from 2 rats ) Black gray bar : Contraction to PE 10-6 M after incubation with AVLE 30 μg/ml for 10 minutes on rat aortic rings. ( n= 6 rings, from 3 rats ) E. Statistics of pretreated high dose and low dose long time incubation of AVLE effect on CCh. Black bar: Control contractions to PE 10-6 M. ( n=7, from 3 rats) Gray bar: The statistics of normal CCh control. ( n=5, from 3 rats) Black gray bar: The statistics of low AVLE 10 μg/ml incubation in organ bath for 40 minutes compared with control of CCh. ( n= 7 rings, from 2 rats ) White gray bar: Statistics of CCh after high AVLE 30 μg/ml ( each incubation for 10 mins repeat two or three times ) compared with control with CCh. ( n= 5 rings, from 3 rats) F. Statistics of pretreated high dose and low dose long time incubation of AVLE effect on KCl. Black bar: KCl control response. (n=5, from 3 rats) Gray bar: Control of KCl and low dose AVLE 10 μg/ml incubation in organ bath for 30~ 40 mins on rat aortic rings. (n=7, from 3 rats) Black gray bar: Control of KCl and KCl after high AVLE 30~ 90 μg/ml throµgh the (once high dose AVLE incubation in organ bath more than 30 minutes ) experiment. (n=6, from 3 rats) (** P < 0.01, *** P < 0.001) 31

42 四 高 劑 量 AVLE 對 內 皮 和 血 管 平 滑 肌 作 用 後, 完 好 程 度 之 統 計 圖 16 A.: 正 常 控 制 組, 比 較 圖 16 B.: 高 劑 量 AVLE 短 時 間 浸 浴 在 器 官 槽 中 和 圖 16 C.: 低 劑 量 AVLE 長 時 間 浸 浴 在 器 官 槽 中 ; 使 用 CCh 檢 測 內 皮 活 性 作 用 其 中, 高 劑 量 短 時 間 浸 浴 在 器 官 槽 和 低 劑 量 長 時 間 浸 浴 在 器 官 槽, 內 皮 功 能 活 性 與 PE 活 性 與 正 常 控 制 組 比 較, 皆 減 少 20 % 而 高 劑 量 長 時 間 則 對 KCl 有 30 % 損 害 影 響 之 現 象 ( 圖 16 F. : Black gray bar ) 五 AVLE 高 劑 量 收 縮 之 機 轉 高 劑 量 AVLE 逆 轉 舒 張 之 作 用 會 被 超 氧 化 物 歧 化 酶 (superoxide dismutase, SOD)200 U 結 合 過 氧 化 氫 歧 化 酶 (catalase)200u, 取 消 了 AVLE 累 加 30 μg/ml 90 μg/ml 逆 轉 舒 張 ; 逆 轉 舒 張 之 作 用 單 劑 量 之 SOD ( 200 U ), 也 可 單 獨 取 消 高 劑 量 AVLE 逆 轉 舒 張 (restored- contraction ) 之 反 應 如 圖 17. A 與 統 計 圖 17. B 32

43 0.5 g Fig. 17 A. 10 min B. Tension % * ** Control SOD +CAT SOD CAT 33

44 Fig. 17 SOD and catalase each 200 units abolished the restored contractile response of 10, 30 and 90 μg/ml of AVLE. A. The third and fourth tracing is normal control and AVLE dose control. The lowest tracing is SOD combined catalase each 200 units abolished the restored contractile response of 10, 30 and 90 μg/ml AVLE. B. Data summary of AVLE 90 μg/ml compared with plateau of PE. Single dose of SOD 200 units, single dose of catalase 200 units and SOD combined catalase abolished the restored contractile response of high dose AVLE. ( * P < 0.05, ** P <0.01 ) ( n= 5, from 3 rats ) 34

45 第 四 章 討 論 第 一 節 低 濃 度 AVLE 於 大 鼠 主 動 脈 血 管 環 產 生 內 皮 依 存 性 舒 張 之 探 討 羅 布 麻 葉 在 中 國 及 日 本 等 地, 通 常 用 來 泡 茶 飲 用 而 在 中 國 古 代, 羅 布 麻 葉 泡 茶 飲 即 是 傳 統 用 藥 羅 布 麻 葉 對 於 心 悸 失 眠 肝 陽 暈 眩 治 療 高 血 壓 腎 腫 發 炎 和 神 經 衰 弱 等 疾 病 症 狀 有 良 好 之 功 效 (China, 2000) 羅 布 麻 有 降 血 壓 保 肝 以 及 抗 焦 慮 保 護 神 經 等 功 能 (Butterweck et al., 2001; Grundmann et al., 2009; Grundmann et al., 2007; Kim et al., 2000a; Kwan et al., 2005; Ma et al., 1989; Tagawa et al., 2004; Xiong et al., 2000) 本 研 究 發 現 高 劑 量 AVLE 有 逆 轉 舒 張, 恢 復 收 縮 之 現 象 因 此 本 研 究 方 法 及 目 的 在 於, 離 體 大 鼠 主 動 脈 血 管 環 之 實 驗 模 式, 使 用 前 置 收 縮 劑 PE 和 KCl 為 不 同 之 收 縮 機 轉 之 藥 物, 探 討 低 劑 量 與 高 劑 量 AVLE 對 老 鼠 主 動 脈 之 影 響 與 研 究 PE 為 α- 腎 上 腺 受 體 致 效 劑, 與 受 體 結 合 後 經 由 PLC 活 化 IP 3 和 DAG, 而 後 IP 3 作 用 在 肌 漿 網 受 體, 活 化 肌 漿 網 釋 放 內 鈣 流 DAG 則 是 活 化 PKC, 接 著 磷 酸 化 肌 凝 蛋 白 輕 鏈, 產 生 平 滑 肌 之 收 縮 (Rembold, 1992; Webb, 2003) KCl 則 是 藉 由 平 滑 肌 細 胞 產 生 興 奮 去 極 化 之 作 用, 活 化 電 壓 調 控 鈣 離 子 通 道 之 開 啟, 進 而 使 外 鈣 離 子 進 入 細 胞 中, 直 接 致 使 平 滑 肌 細 胞 收 縮 (Rembold, 1992; Webb, 2003) AVLE 對 於 離 體 大 鼠 之 主 動 脈 與 腸 繫 膜 動 脈 舒 張 作 用 (Kwan et al., 2005), 在 離 體 大 鼠 主 動 脈 實 驗 中,AVLE 10 µg/ml 對 於 PE 和 U46619 誘 發 的 血 管 收 縮, 有 著 舒 張 作 用 (Kwan et al., 2005) 大 鼠 主 動 脈 血 管 環 去 內 皮 之 狀 態 下, 會 抑 制 AVLE 10 µg/ml 之 35

46 舒 張 作 用 ( 圖 12 D. ); 使 用 一 氧 化 氮 合 成 酶 抑 制 劑 :L-NAME, 可 完 全 抑 制 AVLE 10 µg/ml 之 舒 張 作 用 ( 圖 12 B. 比 較 圖 12 C.) 在 離 體 大 鼠 腸 繫 膜 動 脈 實 驗 中, 經 由 鉀 離 子 通 道 阻 斷 劑 能 阻 斷 AVLE 產 生 腸 繫 膜 動 脈 舒 張 作 用 所 以 AVLE 10 µg/ml 對 於 大 鼠 血 管 之 舒 張 作 用, 不 僅 為 內 皮 依 存 性 NO 調 節 (EDRF) 之 作 用, 且 為 內 皮 依 存 性 過 極 化 之 因 子 (EDHF) 之 作 用 (Kwan et al., 2005; Luksha et al., 2009) 第 二 節 AVLE 雙 效 反 應 之 探 討 在 本 實 驗 中,AVLE 之 雙 效 反 應 : 高 劑 量 AVLE 之 逆 轉 舒 張 之 作 用, 本 實 驗 AVLE 之 高 劑 量 為 30 至 90 µg/ml 與 低 劑 量 AVLE 10 µg/ml 為 區 別 ; 低 劑 量 AVLE 10 µg/ml 為 內 皮 依 存 性 之 舒 張 效 應 (Kwan et al., 2005), 然 而 累 加 劑 量 到 達 30 µg/ml 90 µg/ml 以 上 時, 會 顯 示 出 逆 轉 舒 張, 恢 復 前 置 收 縮 劑 PE 之 血 管 張 力 水 平 高 度 之 現 象 ( 見 圖 13 B.,13 C.) 在 離 體 大 鼠 主 動 脈 血 管 環 去 內 皮 的 狀 態 下, 則 看 不 出 此 逆 轉 舒 張 之 現 象 因 為 低 劑 量 舒 張 的 作 用 被 取 消 了, 因 此 看 不 出 逆 轉 舒 張 之 反 應 高 度 因 此, 實 驗 中 以 去 內 皮 與 否 之 離 體 大 鼠 主 動 脈 血 管 環, 使 用 前 置 低 劑 量 之 血 管 收 縮 劑 PE M, 後 累 加 AVLE 至 高 劑 量 ( 90 μg/ml ) 之 實 驗 方 法, 作 為 觀 察 逆 轉 舒 張 ; 恢 復 收 縮 反 應 的 張 力 實 驗 設 計 實 驗 結 果 顯 示, 完 整 內 皮 狀 態 下, 離 體 大 鼠 血 管 環 之 前 置 低 劑 量 血 管 收 縮 劑 PE M, 後 累 加 AVLE 由 低 劑 量 至 高 劑 量 ( 10 μg/ml 30 μg/ml 90 μg/ml ) ( 見 圖 14 A.) 低 劑 量 AVLE 10 μg/ml, 對 於 離 體 大 鼠 主 動 脈 血 管 環, 行 使 血 管 舒 張 效 應 ; 而 高 劑 量 30 μg/ml 90 μg/ml 一 樣 產 生 逆 轉 舒 張, 恢 復 收 縮 之 現 象, 張 力 水 平 高 度 恢 復 至 36

47 前 置 低 劑 量 血 管 收 縮 劑 PE M 之 張 力 高 度 在 去 內 皮 的 狀 態 下, 同 樣 實 驗 方 法, 測 試 高 劑 量 AVLE 逆 轉 舒 張 之 張 力 程 度 結 果 圖 14 A. 顯 示, 無 論 去 內 皮 與 否, 逆 轉 舒 張 之 作 用 均 不 超 過 前 置 收 縮 劑 的 張 力 水 平 高 度 ; 但 去 內 皮 的 狀 態 下, 低 劑 量 AVLE 行 使 的 舒 張 作 用, 皆 會 被 取 消 掉, 圖 14 B. 第 三 節 AVLE 高 劑 量 影 響 超 氧 陰 離 子 恢 復 收 縮 之 機 轉 在 前 學 者 測 試 過, 鈣 離 子 通 道 阻 斷 劑 和 蕈 毒 類 膽 鹼 受 體 阻 斷 劑 之 後 ( 結 果 顯 示,AVLE 不 受 鈣 離 子 通 道 調 控 和 蕈 毒 類 膽 鹼 受 體 之 影 響 (Kwan et al., 2005), 但 缺 乏 高 劑 量 AVLE 對 於 大 鼠 主 動 脈 逆 轉 舒 張, 恢 復 前 置 收 縮 劑 PE 10-6 M 之 收 縮 水 平 高 度 之 機 轉 調 查, 排 除 了 鈣 離 子 通 道 因 素 和 蕈 毒 類 膽 鹼 受 體 之 原 因 外, 但 缺 乏 了 對 於 超 氧 陰 離 子 (superoxide anions) 和 過 氧 化 氫 (hydrogen peroxide) 之 ROS 阻 斷 劑 等 影 響 血 管 收 縮 之 研 究 本 實 驗 中, 超 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD, superoxide dismutase) 過 氧 化 氫 歧 化 酶 (Catalase) 之 單 劑 ROS 阻 斷 劑 之 使 用, 與 SOD 與 Catalase 結 合 之 使 用 ; 作 為 探 討 逆 轉 舒 張, 恢 復 收 縮 之 機 轉 測 試 結 果 顯 示, 單 劑 使 用 SOD 200 units, 對 於 高 劑 量 AVLE 逆 轉 舒 張 反 應 有 較 大 的 抑 制 作 用, 結 合 SOD 與 catalase 各 200 units, 則 和 單 劑 使 用 Catalase 200 units 一 樣 有 較 小 的 抑 制 作 用 詳 見 結 果 圖 17. A 由 此 推 測 知, 高 劑 量 AVLE 對 離 體 大 鼠 主 動 脈 逆 轉 舒 張 之 機 轉 的 主 要 作 用 物 質 為 超 氧 陰 離 子 (superoxide anions), 而 不 是 過 氧 化 氫 (hydrogen peroxide) 離 體 大 鼠 動 脈 環 組 織 在 器 官 槽 中, 長 時 間 浸 泡 在 Kreb s solution ( 克 氏 生 理 溶 液 ), 經 實 驗 證 實 也 會 經 由 NADPH oxidase 自 然 產 生 超 氧 37

48 陰 離 子 (Romero et al., 2009; Zalba et al., 2000) 此 超 氧 陰 離 子 並 非 由 AVLE 之 本 身 作 用, 可 能 是 由 前 置 收 縮 劑 PE 作 用 α-ar 受 體 (Ming-Ho Tsai, 2010), 經 由 NADPH oxidase 產 生 根 據 其 他 科 學 研 究 報 告, 在 老 鼠 尾 動 脈 組 織 中, 經 由 螢 光 顯 示 測 定 使 用 PE 10-5 M 刺 激 超 氧 陰 子 生 成 (Ming-Ho Tsai, 2010), 以 及 使 用 α 1 腎 上 腺 受 體 拮 抗 劑 Prazosin 10-6 M 會 取 消, 由 PE 刺 激 產 生 的 超 氧 陰 子 和 收 縮 反 應 ; 由 此 指 出 PE 在 老 鼠 尾 動 脈 中, 刺 激 超 氧 陰 離 子 之 產 生, 是 具 有 結 合 α 1 腎 上 腺 受 體 專 一 性 的 (Ming-Ho Tsai, 2010) 第 四 節 AVLE 之 時 間 依 存 性 和 劑 量 依 存 性 在 離 體 大 鼠 主 動 脈 血 管 環 實 驗 中,AVLE 對 其 影 響, 可 歸 納 出 : 時 間 依 存 性 和 劑 量 依 存 性 之 特 徵 給 予 AVLE 依 劑 量, 和 90 µg/ml 其 中 µg/ml 對 離 體 大 鼠 主 動 脈 血 管 環, 行 使 舒 張 的 作 用 以 10 µg/ml 有 最 大 之 舒 張 效 應 ; 但 隨 著 組 織 和 藥 物 ( PE ) 浸 泡 在 器 官 槽 的 時 間 以 10 分 鐘 的 間 隔 倍 增, 組 織 會 經 由 NADPH oxidase 導 致 超 氧 陰 離 子 之 產 生 (Ming-Ho Tsai, 2010); 和 劑 量 累 加 至 高 劑 量 (30, 90 µg/ml; 通 常 時 間 已 累 加 30 至 40 分, 產 生 逆 轉 舒 張, 恢 復 收 縮 之 現 象 推 測 此 逆 轉 舒 張, 逆 轉 舒 張 的 現 象, 為 組 織 中 隨 著 時 間 增 加, 產 生 之 超 氧 陰 離 子, 與 AVLE 行 使 一 氧 化 氮 的 作 用 互 相 競 爭 之 結 果, 而 超 氧 陰 離 子 減 損 了 一 氧 化 氮 之 血 管 舒 張 效 應 (Katusic, 1996) 此 時, 再 加 以 CCh M 測 定 內 皮 活 性 和 KCl 80 mm 之 平 滑 肌 活 性 測 試, 由 結 果 圖.16 E, F 可 得 知, 在 AVLE 長 時 間 低 劑 量 和 高 劑 量 狀 態 下, 內 皮 活 性 和 血 管 平 滑 肌 活 性, 38

49 皆 有 減 損 10 至 20 % 之 現 象 以 上 歸 納 時 間 和 劑 量 之 因 素 會 影 響 AVLE, 對 離 體 大 鼠 主 動 脈 血 管 環 之 效 用 第 五 節 AVLE 在 靜 置 張 力 之 影 響 - 在 靜 置 張 力 狀 態 下 之 研 究 : 離 體 大 鼠 主 動 脈 血 管 環, 在 靜 置 張 力 狀 態 下, 給 予 累 加 AVLE 低 劑 量 至 高 劑 量, 見 結 果 圖 15. 顯 示 AVLE 對 靜 置 張 力 沒 有 顯 著 之 影 響, 但 會 有 spike activity 之 現 象 AVLE 雙 重 效 應 之 應 用 : 根 據 之 前 和 現 在 之 研 究, 低 劑 量 AVLE 能 行 使 內 皮 依 存 性 產 生 NO 之 效 應, 與 先 前 學 者 之 研 究,AVLE 也 是 具 有 清 除 超 氧 陰 離 子 能 力 的 抗 氧 化 物 (Kim et al., 2000a; Kwan et al., 2005; Tagawa et al., 2004) 第 六 節 其 他 相 關 性 討 論 承 接 AVLE 能 像 其 他 中 草 藥 一 樣, 在 大 鼠 主 動 脈 血 管 能 以 NO 調 節 EDRF 之 方 法, 行 使 血 管 舒 張 之 作 用 在 大 鼠 腸 繫 膜 動 脈,AVLE 也 能 部 分 行 使 EDRF 和 EDHF 之 血 管 舒 張 因 子 且 低 劑 量 AVLE 萃 取 物, 具 有 清 除 超 氧 陰 離 子 的 抗 氧 化 效 應 (Kim et al., 2000a; Kwan et al., 2005; Tagawa et al., 2004) 其 它 有 關 超 氧 陰 離 子 之 產 生, 相 關 討 論 : 科 學 研 究 顯 示 長 久 的 氧 化 壓 力 會 使 enos 失 能, 而 產 生 的 物 質 不 再 是 NO, 而 是 O 2 - (Forstermann, 2008; Forstermann et al., 2006) ONOO - 此 ROS 物 質, 能 使 enos 失 能 處 於 偶 合 未 完 全 之 狀 態, 進 而 產 生 39

50 超 氧 陰 離 子 (O - 2 ) 之 氧 化 壓 力 (Forstermann, 2010) 血 管 細 胞 中 的 NADPH oxidase 和 未 完 全 偶 合 之 enos; 是 血 管 組 織 中, 超 氧 陰 離 子 主 要 之 來 源 通 常 在 正 常 細 胞 內 之 自 由 基 清 除 酶, 保 持 在 nm 之 濃 度, 可 使 超 氧 陰 離 子 失 去 活 性 (Pryor, 1994) 一 旦, 細 胞 中 自 由 基 清 除 酶 和 NO 之 含 量 和 超 氧 陰 離 子 之 失 去 平 衡 後 (Katusic, 1996), 超 氧 陰 離 子 會 在 細 胞 中 繼 續 衍 生 ONOO - OH 等 (Beckman, Beckman, Chen, Marshall & Freeman, 1990), 會 損 傷 細 胞 的 氧 化 自 由 基 離 子 而 這 些 自 由 基 造 成 的 氧 化 傷 害, 導 致 以 下 心 血 管 疾 病 : 粥 狀 動 脈 硬 化 高 血 壓 血 管 痙 攣 糖 尿 病 和 缺 血 後 灌 流 傷 害 (Frei, 1994) 這 些 超 氧 陰 離 子 ( superoxide anions, O 2 - ), 除 了 由 NADPH oxidase 和 uncoupled enos 產 生 外 ;α 1 -adrenoreceptor 作 用 劑 PE 本 身 也 會 刺 激 血 管 組 織 生 成 超 氧 陰 離 子 (Ming-Ho Tsai, 2010) 本 實 驗 中,AVLE 高 劑 量 所 造 成 大 鼠 主 動 脈 血 管 環, 逆 轉 舒 張, 恢 復 收 縮 之 機 轉 ; 也 是 內 皮 中 NO 和 超 氧 陰 離 子 失 衡 的 關 係 (Katusic, 1996) 除 了 血 管 前 置 收 縮 劑 PE 10-6 M, 刺 激 血 管 平 滑 肌 組 織 產 生 超 氧 陰 離 子 外, 隨 著 時 間 增 加 NADPH oxidase 和 uncoupled enos 產 生 的 超 氧 陰 離 子, 進 而 削 減 了 AVLE 內 皮 依 存 性 之 NO 舒 張 之 作 用 至 於 結 果 圖 13-C 中,AVLE 高 劑 量 恢 復 收 縮 至 前 置 收 縮 劑 PE 10-6 M 之 張 力 高 度, 此 恢 復 收 縮 作 用 為 一 短 暫 收 縮 (transient contraction) 之 現 象 此 短 暫 收 縮 之 現 象 : 根 據 推 測 有 可 能 是, 存 在 於 主 動 脈 血 管 平 滑 肌 中 的 肌 漿 質 網 的 NADPH oxidase 產 生 超 氧 陰 離 子, 經 由 調 控 ryanodine receptor 之 活 性, 釋 放 了 肌 漿 質 網 中 的 40

51 鈣 離 子, 造 成 了 短 暫 收 縮 之 現 象 (Yi et al., 2006) 第 七 節 研 究 限 制 此 研 究 為 離 體 大 鼠 主 動 脈 血 環 之 方 法, 單 一 觀 察 血 管 平 滑 肌 等 長 張 力 收 縮 與 藥 物 作 用 機 轉 ; 但 不 能 像 整 體 動 物 實 驗 一 樣, 觀 察 整 體 動 物 之 神 經 系 統 內 泌 系 統 和 心 血 管 系 統 之 整 體 互 相 作 用 41

52 第 五 章 結 論 與 建 議 第 一 節 結 論 低 劑 量 AVLE 10 μg/ml 有 長 效 性 舒 張 血 管 和 抗 氧 化 清 除 超 氧 陰 離 子 之 效 應 ; 但 高 劑 量 AVLE μg/ml 反 而 會 降 低 此 功 效 本 實 驗 結 果 推 測, 此 逆 轉 舒 張, 恢 復 收 縮 之 作 用 為 組 織 中 超 氧 陰 離 子 之 產 生 與 NO 競 爭 之 失 衡, 導 致 血 管 平 滑 肌 恢 復 前 置 收 縮 劑 之 收 縮 狀 態 因 此 本 實 驗 結 論 中, 建 議 使 用 AVLE, 當 適 量 即 可, 過 量 反 而 降 低 良 好 之 功 效, 並 且 會 有 血 管 組 織 損 傷 之 現 象 第 二 節 對 未 來 研 究 方 向 的 建 議 1 AVLE 之 長 效 效 應 ( Long-lastng effect ), 缺 乏 對 於 整 體 性 動 物 之 研 究, 建 議 未 來 整 體 性 之 動 物 研 究 中 可 作 長 效 之 作 用 AVLE 之 長 效 效 應 俱 有 臨 床 效 應, 表 示 長 效 效 應 對 未 臨 床 藥 物 之 使 用, 只 需 少 量 適 量 極 可 達 到 效 應, 不 需 高 劑 量 之 使 用 2 高 劑 量 之 AVLE, 缺 乏 整 體 性 動 物 之 血 管 組 織 損 傷 研 究, 建 議 未 來 可 作 整 體 性 動 物 和 細 胞 損 傷 之 研 究 探 討 整 體 性 動 物 之 損 傷 研 究 是 否 與 離 體 動 物 實 驗 吻 合 3 有 效 成 分 : 本 實 驗 使 用 之 AVLE 萃 取 物 為,Venetron: 含 有 金 絲 桃 苷 ( hyperoside ) 和 異 榭 皮 苷 ( isoquercitin), 經 前 學 者 之 研 究, 兩 項 植 物 化 合 物 互 相 結 合, 在 生 物 體 內 會 有 最 佳 之 代 謝 吸 收 時 間 但 單 項 之 藥 物 研 究 仍 究 缺 乏, 建 議 未 來 可 作 單 項 藥 物 之 整 體 性 動 物 與 細 胞 之 研 究 單 項 成 份 之 研 究, 具 有 藥 理 上 和 經 濟 上 之 價 值 42

53 參 考 文 獻 References Adeagbo, A. S., & Triggle, C. R. (1993). Varying extracellular [K+]: a functional approach to separating EDHF- and EDNO-related mechanisms in perfused rat mesenteric arterial bed. J Cardiovasc Pharmacol, 21(3), Beckman, J. S., Beckman, T. W., Chen, J., Marshall, P. A., & Freeman, B. A. (1990). Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite: implications for endothelial injury from nitric oxide and superoxide. Proc Natl Acad Sci U S A, 87(4), Butterweck, V., Nishibe, S., Sasaki, T., & Uchida, M. (2001). Antidepressant effects of apocynum venetum leaves in a forced swimming test. Biol Pharm Bull, 24(7), Chen, X. (1996). Cardiovascular protection by ginsenosides and their nitric oxide releasing action. Clin Exp Pharmacol Physiol, 23(8), China, T. P. C. o. t. H. M. o. t. P. s. R. o. (2000). Pharmacopeia of People s Republic of China, part 1. Chemical Technologic Publisher, Beijing. Correia, M. L., & Haynes, W. G. (2007). Arterial compliance and endothelial function. Curr Diab Rep, 7(4), Edgaras Stankevičius, E. K., Enrikas Vainorius2, Ulf Simonsen1 (2003). Role of nitric oxide and other endothelium-derived factors. MEDICINA (2003) Vol. 39, No.4. Feletou, M., & Vanhoutte, P. M. (2009). EDHF: an update. Clin Sci (Lond), 117(4), Forstermann, U. (2008). Oxidative stress in vascular disease: causes, defense mechanisms and potential therapies. Nat Clin Pract Cardiovasc Med, 5(6), Forstermann, U. (2010). Nitric oxide and oxidative stress in vascular disease. Pflugers Arch, 459(6), Forstermann, U., & Munzel, T. (2006). Endothelial nitric oxide synthase in vascular disease: from marvel to menace. Circulation, 113(13), Forstermann, U., Nakane, M., Tracey, W. R., & Pollock, J. S. (1993). Isoforms of nitric oxide synthase: functions in the cardiovascular system. Eur Heart J, 14 Suppl I, Frei, B. (1994). Natural antioxidants in human health and disease. Furchgott, R. F., & Zawadzki, J. V. (1980). The obligatory role of endothelial 43

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