实 验 目 录 实 验 一 显 微 镜 的 正 确 使 用 1 实 验 二 芽 孢 染 色 法 3 实 验 三 从 土 壤 中 分 离 纯 培 养 微 生 物 并 作 初 步 观 察 鉴 定 5 实 验 1 培 养 基 的 配 制 5 实 验 2 消 毒 和 灭 菌 8 实 验 3 土 壤 微 生

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1 漳 州 师 院 生 物 科 学 与 技 术 系 生 物 实 验 教 学 中 心

2 实 验 目 录 实 验 一 显 微 镜 的 正 确 使 用 1 实 验 二 芽 孢 染 色 法 3 实 验 三 从 土 壤 中 分 离 纯 培 养 微 生 物 并 作 初 步 观 察 鉴 定 5 实 验 1 培 养 基 的 配 制 5 实 验 2 消 毒 和 灭 菌 8 实 验 3 土 壤 微 生 物 的 稀 释 分 离 纯 化 无 菌 操 作 技 术 微 生 物 菌 落 的 观 察 及 初 步 鉴 定 11 实 验 四 九 龙 江 水 大 肠 菌 群 的 测 定 14 方 法 1 多 管 发 酵 法 14 方 法 2 滤 膜 法 测 定 水 中 大 肠 菌 群 19 方 法 3 革 兰 氏 染 色 法 21 实 验 五 大 肠 杆 菌 生 长 曲 线 的 测 定 23

3 实 验 一 显 微 镜 的 正 确 使 用 本 实 验 室 所 使 用 的 显 微 镜 为 Motic B1-220ALED 生 物 显 微 镜 当 你 从 未 使 用 过 此 显 微 镜 时, 应 该 先 进 行 如 下 操 作 : 1. 确 定 位 置 : 把 显 微 镜 摆 放 于 适 合 个 人 进 行 观 察 的 位 置 2. 灯 光 照 明 : 插 上 变 压 器, 打 开 电 源, 调 节 亮 度 控 制 手 轮, 直 到 获 得 所 需 亮 度 3. 瞳 距 筒 长 和 视 度 的 调 节 : (1) 安 放 标 本, 盖 玻 片 朝 上 (2) 用 10X 物 镜 对 焦 (3) 瞳 距 的 调 节 : 通 过 向 内 或 向 外 滑 动 目 镜 筒 盖 板, 使 左 右 镜 中 的 图 象 合 并 为 一 读 取 瞳 距 数 值 (4) 筒 长 和 视 度 的 调 节 : 旋 转 目 镜 视 度 调 节 圈, 使 调 节 圈 上 与 瞳 距 数 值 相 同 数 值 的 刻 线 于 目 镜 筒 上 的 刻 线 对 齐 ( 左 右 目 同 步 调 ), 此 时 是 标 准 筒 长 位 置 (5) 视 度 的 调 节 : 将 转 换 器 旋 至 40 物 镜, 调 节 调 焦 手 轮, 对 标 本 准 确 调 焦 再 转 换 至 4X 物 镜, 不 动 调 焦 手 轮, 旋 转 目 镜 调 节 圈, 使 每 个 目 镜 的 图 象 分 别 调 节 清 晰 视 度 的 调 节 的 目 的 是 补 偿 不 同 使 用 者 的 视 力 差 异 ** 请 记 录 你 的 瞳 距 和 筒 长 并 记 住 以 供 近 期 使 用 姓 名 瞳 距 左 眼 筒 长 右 眼 筒 长 4. 若 上 述 调 节 效 果 不 佳, 可 重 复 上 述 步 骤 5. 保 护 玻 璃 的 使 用 :Motic B1-220ALED 生 物 显 微 镜, 在 聚 光 镜 处 可 变 光 栏 的 滤 色 片 托 架 位 置 下 面, 有 一 磨 沙 保 护 玻 璃 使 用 低 倍 镜 观 察 时 (4 10 ), 需 使 用 此 保 护 玻 璃, 因 此 需 将 该 保 护 玻 璃 转 入 光 路 ; 而 使 用 高 倍 镜 观 察 时, 不 需 使 用 此 保 护 玻 璃, 因 此 需 将 该 保 护 玻 璃 转 出 光 路 6. 光 线 强 弱 的 调 节 : (1) 调 节 亮 度 控 制 手 轮 (2) 升 降 聚 光 镜 (3) 调 节 可 变 光 栏 如 果 你 已 经 掌 握 上 述 操 作, 对 待 检 标 本 即 可 进 行 如 下 程 序 观 察 : 7. 待 检 标 本 的 观 察 (1) 将 待 检 测 标 本 ( 玻 片 ) 置 于 载 物 台 上, 用 玻 片 夹 夹 住, 移 动 载 物 台 纵 向 横 向 调 节 手 轮, 使 观 察 标 本 处 于 物 镜 的 正 下 方 1

4 (2) 低 倍 镜 观 察 : 用 4 物 镜 观 察, 因 为 低 倍 镜 视 野 较 大, 易 发 现 目 标 和 确 定 检 查 位 置 通 过 调 焦 至 物 象 清 晰, 认 真 观 察 标 本 各 部 位, 找 到 目 的 物 并 将 其 移 到 视 野 的 中 心, 准 备 用 高 倍 镜 观 察 (3) 高 倍 镜 观 察 :10 40 (4) 油 镜 的 观 察 : A 将 油 镜 旋 至 载 物 台 的 正 上 方, 用 粗 调 焦 手 轮 将 油 镜 头 升 约 距 离 平 台 2cm B 手 持 玻 片 标 本, 在 镜 检 部 位 滴 上 一 滴 香 柏 油, 小 心 将 玻 片 放 入 载 物 台 上 C 小 心 下 降 镜 筒, 以 粗 调 手 轮 下 调 镜 头, 从 侧 面 注 视 油 镜 头 慢 慢 浸 在 香 柏 油 中, 几 乎 与 标 本 相 碰 特 别 注 意 : 不 能 将 油 镜 压 在 标 本 上, 更 不 能 用 力 过 猛, 否 则 不 仅 压 破 玻 片, 也 会 损 坏 镜 头 D 从 目 镜 观 察, 进 一 步 调 节 光 线, 使 视 野 达 最 高 程 度 E 用 粗 调 手 轮 将 镜 头 徐 徐 上 升, 直 到 视 野 出 现 模 糊 物 象 为 止, 然 后 再 用 细 调 手 轮 校 正 焦 急 距 如 果 油 镜 头 已 离 开 油 面 而 仍 未 见 物 象, 用 粗 调 焦 手 轮 将 油 镜 头 升 高 距 离 平 台 约 2cm 后, 必 须 再 从 侧 面 观 察, 将 油 镜 下 降, 重 复 上 述 操 作 到 物 象 看 清 为 主 F 观 察 完 毕, 上 旋 镜 筒, 取 出 玻 片 之 后, 先 用 擦 镜 纸 擦 去 镜 头 上 的 油, 然 后 沾 取 少 许 无 水 乙 醇 乙 醚 混 合 液 ( 配 比 =1:1.5), 擦 去 镜 头 上 残 留 油 迹 ; 再 用 擦 镜 纸 擦 净 镜 头 观 察 结 束 时, 你 还 得 做 以 下 事 情 : 8. 使 用 完 毕 后, 将 所 观 察 的 切 片 取 走, 转 低 倍 镜 对 准 光 路 9. 使 用 完 毕 要 先 将 照 明 强 度 调 至 最 小, 再 关 电 源, 拔 下 电 源 插 座, 最 后 把 防 尘 罩 盖 上 显 微 镜 操 作 注 意 事 项 : 1. 插 上 插 座 之 前 先 检 查 显 微 镜 电 源 开 关 是 否 关 上, 并 且 先 将 照 明 强 度 旋 至 最 小 ; 同 样, 使 用 完 毕 也 要 先 将 照 明 强 度 调 至 最 小 再 关 电 源, 拔 下 电 源 插 座 2. 转 换 镜 头 时 要 使 用 转 换 器, 手 不 要 直 接 接 触 镜 头 以 免 光 路 发 生 偏 移 3. 使 用 油 镜 后, 应 及 时 用 清 洗 液 将 100 倍 镜 头 擦 1-2 次 4. 使 用 完 毕 后, 将 所 观 察 的 切 片 取 走, 转 低 倍 镜 对 准 光 路 5. 显 微 镜 防 尘 罩 不 要 乱 放, 使 用 完 毕 后 归 于 原 位 待 任 课 教 师 检 查 并 签 字 方 可 离 开 2

5 实 验 二 芽 孢 染 色 法 一. 目 的 要 求 1. 学 习 并 掌 握 芽 孢 染 色 法 2. 了 解 芽 孢 杆 菌 的 形 态 特 征 二. 基 本 原 理 芽 孢 染 色 法 是 利 用 细 菌 的 芽 孢 和 菌 体 对 染 料 的 亲 合 力 不 同 的 原 理, 用 不 同 染 料 进 行 着 色, 使 芽 孢 和 菌 体 呈 不 同 的 颜 色 而 便 于 区 别 芽 孢 壁 厚 透 性 低, 着 色 脱 色 均 较 困 难, 因 此, 当 先 用 一 弱 碱 性 染 料, 如 孔 雀 绿 (malachite green) 或 碱 性 品 红 (basicfuchsin) 在 加 热 条 件 下 进 行 染 色 时, 此 染 料 不 仅 可 以 进 入 菌 体, 而 且 也 可 以 进 入 芽 孢, 进 入 菌 体 的 染 料 可 经 水 洗 脱 色, 而 进 入 芽 孢 的 染 料 则 难 以 透 出, 若 再 用 复 染 液 ( 如 番 红 液 ) 或 衬 托 溶 液 ( 如 黑 色 素 溶 液 ) 处 理, 则 菌 体 和 芽 孢 易 于 区 分 三. 器 材 1. 菌 种 蜡 样 芽 孢 杆 菌 约 2d 营 养 琼 脂 斜 面 培 养 物, 球 形 芽 孢 杆 菌 1~2d 营 养 琼 脂 斜 面 培 养 物 2. 染 色 剂 5% 孔 雀 绿 水 溶 液,0.5% 番 红 水 溶 液 3. 仪 器 或 其 他 用 具 小 试 管, 滴 管, 烧 杯, 试 管 架, 载 玻 片, 木 夹 子, 显 微 镜 灯 四. 操 作 步 骤 方 法 1: (1) 将 培 养 24 小 时 左 右 的 枯 草 芽 孢 杆 菌 或 其 他 芽 孢 杆 菌, 作 涂 片 干 燥 固 定 (2) 滴 加 3 5 滴 孔 雀 绿 染 液 于 已 固 定 的 涂 片 上 (3) 用 木 夹 夹 住 载 玻 片 在 火 焰 上 加 热, 使 染 液 冒 蒸 汽 但 勿 沸 腾, 切 忌 使 染 液 蒸 干, 必 要 时 可 添 加 少 许 染 液 加 热 时 间 从 染 液 冒 蒸 汽 时 开 始 计 算 约 4 5 分 钟 这 一 步 也 可 不 加 热, 改 用 饱 和 的 孔 雀 绿 水 溶 液 ( 约 7.6%) 染 10 分 钟 (4) 倾 去 染 液, 待 玻 片 冷 却 后 水 洗 至 孔 雀 绿 不 再 褪 色 为 止 (5) 用 番 红 水 溶 液 复 染 1 分 钟, 水 洗 (6) 待 干 燥 后, 置 油 镜 观 察, 芽 孢 呈 绿 色, 菌 体 呈 红 色 3

6 方 法 2: (1) 取 二 支 洁 净 的 小 试 管, 分 别 加 入 0.2mL 无 菌 水, 再 往 一 管 中 加 入 1 2 接 种 环 的 蜡 状 芽 孢 杆 菌 的 菌 苔, 另 一 管 中 加 入 1 2 接 种 环 的 生 孢 梭 菌 的 菌 苔, 两 管 各 自 充 分 混 合 成 浓 厚 的 菌 悬 液 (2) 在 菌 悬 液 中 分 别 加 入 0.2mL 苯 酚 品 红 溶 液, 充 分 混 合 后, 于 沸 水 浴 中 加 热 3 5 分 钟 (3) 用 接 种 环 分 别 取 上 述 混 合 液 2 3 环 于 两 片 载 玻 片 上, 涂 薄, 风 干 后, 将 载 玻 片 稍 倾 斜 于 烧 杯 上, 用 95% 乙 醇 冲 洗 至 无 红 色 液 流 出 (4) 再 用 自 来 水 冲 洗, 滤 纸 吸 干 (5) 取 1 2 接 种 环 黑 色 素 溶 液 于 涂 片 处, 立 即 展 开 涂 薄, 自 然 干 燥 后, 油 镜 观 察, 在 淡 紫 灰 色 背 景 的 衬 托 下, 菌 体 为 白 色, 菌 体 内 的 芽 孢 为 红 色 五. 实 验 报 告 1. 结 果 : 绘 图 表 示 两 种 芽 孢 杆 菌 的 形 态 特 征 ( 注 意 芽 孢 的 形 状 着 生 位 置 及 芽 孢 囊 的 形 状 特 征 ) 2. 思 考 题 : 说 明 芽 孢 染 色 法 的 原 理 用 简 单 染 色 法 能 否 观 察 到 细 菌 的 芽 孢? 4

7 实 验 三 ( 综 合 ): 从 土 壤 中 分 离 纯 培 养 微 生 物 并 作 初 步 观 察 鉴 定 实 验 1 培 养 基 的 配 制 一. 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 学 习 和 掌 握 配 制 培 养 基 的 一 般 方 法 和 步 骤 内 容 : 1. 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 的 配 制 2. 高 氏 一 号 培 养 基 的 配 制 3. 马 丁 氏 培 养 基 的 配 制 二. 实 验 材 料 和 用 具 牛 肉 膏 蛋 白 胨 琼 脂 可 溶 性 淀 粉 葡 萄 糖 孟 加 拉 红 链 霉 素 1mol/L NaOH 1mol/LHCl KNO3 NaCl K2HPO4 3H2O MgSO4 7H2O FeSO4 7H2O 试 管 三 角 瓶 烧 杯 量 筒 玻 璃 棒 天 平 牛 角 匙 ph 试 纸 棉 花 牛 皮 纸 记 号 笔 线 绳 纱 布 三. 操 作 步 骤 ( 一 ) 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 的 配 制 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 是 一 种 应 用 最 广 泛 和 最 普 通 的 细 菌 基 础 培 养 基 其 配 方 如 下 : 牛 肉 膏 3g 蛋 白 胨 10g NaCl 5g 琼 脂 15~20g 水 1000mL ph7.4~7.6 1 称 药 品 按 实 际 用 量 计 算 后, 按 配 方 称 取 各 种 药 品 放 入 大 烧 杯 中 牛 肉 膏 和 蛋 白 胨 可 分 别 放 在 小 烧 杯 或 表 面 皿 中 称 量, 用 热 水 溶 解 后 倒 入 大 烧 杯 蛋 白 胨 极 易 吸 潮, 故 称 量 时 要 迅 速 2 加 热 溶 解 在 烧 杯 中 加 入 少 于 所 需 要 的 水 量, 然 后 放 在 石 棉 网 上, 小 火 加 热, 并 用 玻 璃 棒 搅 拌, 待 药 品 完 全 溶 解 后 再 补 充 水 分 至 所 需 量 若 配 制 固 体 培 养 基, 则 将 称 好 的 琼 脂 放 入 已 溶 解 的 药 品 中, 再 加 热 融 化, 在 此 过 程 中, 需 不 断 搅 拌, 以 防 琼 脂 糊 底 或 溢 出, 最 后 补 充 所 失 水 分 3 调 ph 用 ph 试 纸 或 酸 度 计 检 测 培 养 基 的 ph 值, 若 ph 偏 酸, 可 滴 加 1mol/L NaOH, 边 加 边 搅 拌, 并 随 时 检 测, 直 至 达 到 所 需 ph 范 围 若 偏 碱, 则 用 1mol/LHCl 进 行 调 节 ph 调 节 通 常 放 在 加 琼 脂 之 前 注 意 ph 值 不 要 调 过 头, 以 免 回 调 而 影 响 培 养 基 内 各 离 子 的 浓 度 5

8 4 过 滤 液 体 培 养 基 可 用 滤 纸 过 滤, 固 体 培 养 基 可 用 4 层 纱 布 趁 热 过 滤, 以 利 结 果 的 观 察 但 是 供 一 般 使 用 的 培 养 基, 这 步 可 省 略 5 分 装 按 实 验 要 求, 可 将 配 制 的 的 培 养 基 分 装 入 试 管 或 三 角 瓶 内 分 装 时 可 用 三 角 漏 斗 以 免 使 培 养 基 沾 在 管 口 或 瓶 口 上 而 造 成 污 染 分 装 量 : 固 体 培 养 基 约 为 试 管 高 度 的 1/5; 分 装 入 三 角 瓶 内 的 以 不 超 过 其 容 积 的 一 半 为 宜, 半 固 体 培 养 基 以 试 管 高 度 的 1/3 为 宜 6 加 棉 塞 试 管 口 和 三 角 瓶 口 塞 上 用 普 通 棉 花 ( 非 脱 脂 棉 ) 制 作 的 棉 塞 棉 塞 的 形 状 大 小 和 松 紧 度 要 合 适, 四 周 紧 贴 管 壁, 不 留 缝 隙, 才 能 起 到 防 止 杂 菌 侵 入 和 有 利 通 气 的 作 用 要 使 棉 塞 总 长 约 3/5 塞 入 试 管 口 或 瓶 口 内, 以 防 棉 塞 脱 落 有 些 微 生 物 需 要 更 好 的 通 气, 则 可 用 8 层 纱 布 制 成 通 气 塞 有 时 也 可 用 试 管 帽 或 塑 料 塞 代 替 棉 塞 7 包 扎 加 塞 后, 将 三 角 瓶 的 棉 塞 外 包 一 层 牛 皮 纸 或 双 层 报 纸, 以 防 灭 菌 时 冷 凝 水 沾 湿 棉 塞 若 培 养 基 分 装 于 试 管 中, 则 应 先 把 装 同 类 培 养 基 的 试 管 扎 成 捆 后, 再 于 棉 塞 外 包 一 层 牛 皮 纸 然 后 用 记 号 笔 注 明 培 养 基 名 称 组 别 日 期 8 灭 菌 将 上 述 培 养 基 于 o C 湿 热 灭 菌 20min 如 因 特 殊 情 况 不 能 及 时 灭 菌, 则 应 放 入 冰 箱 内 暂 存 9 摆 斜 面 灭 菌 后, 如 制 斜 面, 则 需 趁 热 将 试 管 口 端 搁 在 一 根 长 木 条 上, 并 调 整 斜 度, 使 斜 面 的 长 度 不 超 过 试 管 总 长 的 1/2; 待 其 凝 固 10 无 菌 检 查 将 灭 菌 的 培 养 基 放 入 37 o C 温 箱 中 培 养 24~48h, 无 菌 生 长 即 可 使 用 或 储 存 于 冰 箱 或 清 洁 的 橱 内, 备 用 ( 二 ) 高 氏 1 号 培 养 基 的 配 制 高 氏 1 号 培 养 基 是 用 于 分 离 和 培 养 放 线 菌 的 合 成 培 养 基 其 配 方 如 下 : 可 溶 性 淀 粉 20g,KNO3 1 g,nacl 0.5g,K2HPO4.3H2O 0.5g, FeSO4.7H2O 0.01g, 琼 脂 15~20g, 水 1000mL, ph7.4~7.6 1 称 量 和 溶 解 先 计 算 后 称 量, 按 用 量 先 称 取 可 溶 性 淀 粉, 放 入 小 烧 杯 中, 并 用 少 量 冷 水 将 其 调 成 糊 状, 再 加 至 少 于 所 需 水 量 的 沸 水 中, 继 续 加 热, 边 加 热 边 搅 拌, 至 其 完 全 溶 解 对 微 量 成 分 FeSO4.7H2O 可 先 配 成 高 浓 度 的 储 备 液 后 再 加 入, 方 法 是 先 在 100mL 水 中 加 入 1g 的 FeSO4.7H2O, 配 成 浓 度 为 0.01g/mL 的 储 备 液, 6

9 再 在 1000mL 培 养 基 中 加 入 以 上 储 备 液 1mL 即 可 待 所 有 药 品 完 全 溶 解 后, 补 充 水 分 到 所 需 的 总 体 积 如 要 配 制 固 体 培 养 基, 其 琼 脂 溶 解 过 程 同 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 配 制 2 ph 调 节 分 装 包 扎 灭 菌 及 无 菌 检 查 同 ( 一 ) ( 三 ) 马 丁 氏 培 养 基 的 配 制 马 丁 氏 培 养 基 是 用 于 分 离 真 菌 的 选 择 培 养 基 其 配 方 如 下 : K2HPO4 1g, MgSO4. 7H2O 0.5g, 蛋 白 胨 5g, 葡 萄 糖 10g, 琼 脂 15~20g, 水 1000mL, 自 然 ph 1 称 量 和 溶 解 先 计 算 后 称 量, 按 用 量 称 取 各 成 分, 并 将 其 溶 解 在 少 于 所 需 量 的 水 中 待 各 成 分 溶 解 后, 补 充 水 分 到 所 需 体 积 再 将 孟 加 拉 红 配 成 1% 的 水 溶 液, 在 1000mL 培 养 液 中 加 入 以 上 孟 加 拉 红 溶 液 3.3mL, 混 匀 后, 再 加 入 琼 脂 加 入 融 化, 方 法 同 ( 一 ). 2 同 ( 二 )2 3 链 霉 素 的 加 入 链 霉 素 受 热 容 易 分 解, 所 以 临 用 时, 将 培 养 基 融 化 待 温 度 降 至 45 o C 左 右 时 才 能 加 入 可 先 将 链 霉 素 配 成 1% 的 溶 液 ( 配 好 的 链 霉 素 溶 液 保 存 于 -20 o C), 在 100mL 培 养 基 中 加 入 1% 链 霉 素 0.3mL, 使 每 毫 升 培 养 基 中 含 链 霉 素 30μg 四 注 意 事 项 1 在 配 制 培 养 基 时, 不 可 用 铜 或 铁 锅 加 热 溶 化, 以 免 金 属 离 子 进 入 培 养 基 中, 影 响 细 菌 生 长 2 称 药 品 用 的 牛 角 匙 不 要 混 用 3 称 完 药 品 应 及 时 盖 紧 瓶 盖 五 实 验 报 告 写 出 本 实 验 培 养 基 的 名 称 数 量 配 制 过 程, 并 指 明 要 点 六 问 题 与 思 考 1 配 制 培 养 基 有 哪 几 个 步 骤? 在 操 作 过 程 中 应 注 意 些 什 么 问 题? 为 什 么? 2 培 养 基 配 制 完 成 后, 为 什 么 必 须 立 即 灭 菌? 若 不 能 及 时 灭 菌 应 如 何 处 理? 已 灭 菌 的 培 养 基 如 何 进 行 无 菌 检 查? 3 在 马 丁 氏 培 养 基 中 加 入 链 霉 素 的 目 的 是 什 么? 7

10 实 验 2 消 毒 和 灭 菌 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 了 解 消 毒 和 灭 菌 的 原 理, 并 掌 握 各 种 灭 菌 方 法 的 操 作 步 骤 内 容 : 1 高 压 蒸 汽 灭 菌 2 干 热 灭 菌 法 3 过 滤 除 菌 法 二 实 验 材 料 和 用 具 待 灭 菌 的 培 养 基 ( 实 验 1) 和 链 霉 素 溶 液 自 动 立 式 压 力 蒸 汽 灭 菌 器 移 液 管 手 提 式 高 压 蒸 汽 灭 菌 锅 干 热 消 毒 箱 培 养 皿 试 管 三 操 作 步 骤 ( 一 ) 高 压 蒸 汽 灭 菌 法 高 压 蒸 汽 灭 菌 法 适 用 于 培 养 基 无 菌 水 工 作 服 等 物 品 的 灭 菌 I 自 动 立 式 压 力 蒸 汽 灭 菌 器 的 操 作 步 骤 I-1 装 料 开 盖, 把 包 扎 好 的 灭 菌 物 品 放 在 灭 菌 桶 内 的 筛 板 上, 灭 菌 包 体 积 一 般 不 超 过 20cmX10cmX10cm 为 宜, 各 包 之 间 留 有 间 隙, 以 利 于 蒸 汽 穿 透 在 堆 放 灭 菌 包 时 应 注 意 安 全 阀 放 汽 阀 孔 位 置 必 须 留 出 空 位, 保 障 其 畅 通 放 汽, 否 则 因 安 全 阀 出 气 孔 堵 塞 不 能 工 作 造 成 事 故 I-2 开 机 I-2-1 加 水 : 接 上 本 机 标 牌 一 致 的 电 源, 将 控 制 面 板 上 电 源 开 关 按 至 ON 处, 此 时 断 水 灯 ( 黄 色 ) 亮, 显 示 电 源 已 正 常 输 入 低 水 位 灯 ( 红 色 ) 亮, 显 示 蒸 发 锅 内 处 断 水 状 态, 然 后 将 灭 菌 桶 盖 罩 住 灭 菌 桶, 把 生 活 用 水 从 灭 菌 桶 与 蒸 锅 夹 缝 内 加 入, 当 水 位 达 到 高 水 位 时, 以 上 两 灯 同 时 灭 此 时, 应 继 续 加 水 到 高 水 位 灯 ( 绿 色 ) 亮 时 停 止 I-2-2 设 定 温 度 : 数 显 窗 内, 红 色 数 显 为 灭 菌 桶 内 温 度, 绿 色 数 显 为 设 定 温 度 按 动 控 制 板 上 增 加 键 或 减 少 键, 可 在 绿 色 数 显 上 设 定 所 需 温 度, 按 动 位 移 键 可 将 闪 烁 的 绿 灯 数 显 进 位 移 位 设 定, 当 每 次 所 需 温 度 结 束 时, 须 按 一 下 确 认 键 进 行 确 认, 即 可 完 成 设 定 此 时, 红 色 数 显 随 着 蒸 发 锅 内 温 度 上 升 而 变 化 I-2-3 设 定 时 间 : 温 度 设 定 完 毕 并 按 确 认 键 后, 绿 色 数 显 切 换 成 定 时 状 态, 按 位 移 键 定 位, 然 后 再 按 增 加 键 和 减 少 键, 设 定 所 需 的 保 温 时 间, 设 定 完 毕 后, 须 按 一 下 确 认 键 进 行 确 认 保 温 时 间 采 用 倒 计 时, 当 灭 菌 锅 内 温 度 达 到 设 定 温 度 时, 定 时 器 才 开 始 计 时 如 在 运 行 过 程 中 要 查 看 时 间 数 和 设 定 温 度 数, 只 要 按 一 下 确 认 键, 便 可 切 到 所 需 的 数 显 进 行 阅 读 8

11 I-3 密 封 : 以 上 操 作 完 成 后, 将 压 板 完 全 推 入 固 定 柱 内, 将 手 轮 向 右 旋 紧, 使 盖 与 主 体 密 封 I-4 灭 菌 I-4-1 排 气 : 为 了 保 证 温 控 仪 与 灭 菌 室 温 度 的 一 致, 应 将 灭 菌 室 内 的 冷 空 气 排 除 干 净, 具 体 可 在 加 热 开 始 时 打 开 放 气 阀, 待 水 煮 沸 后, 水 蒸 气 和 空 气 一 起 从 排 气 阀 孔 排 出, 一 般 认 为, 当 排 出 的 气 流 很 强 并 有 嘘 声 时, 表 明 锅 内 空 气 已 排 净 ( 沸 后 约 5min), 然 后 关 上 排 气 阀 同 时 将 下 排 气 阀 稍 稍 的 打 开, 让 微 量 的 蒸 汽 通 过 下 排 气 阀 在 整 个 灭 菌 过 程 中 不 断 排 出, 这 样 有 利 于 灭 菌 室 上 下 部 温 度 保 持 同 步 I-4-2 当 设 定 时 间 结 束 时, 电 控 装 置 自 动 关 闭 加 热 电 源, 并 伴 有 蜂 鸣 提 醒 此 时, 应 将 电 源 关 闭 I-4-3 灭 菌 结 束 后, 待 其 冷 却, 直 至 压 力 表 指 针 回 复 至 0 位 后, 打 开 排 放 气 阀 再 待 数 分 钟 排 去 余 汽, 才 能 将 盖 打 开, 取 出 灭 菌 物 品, 排 掉 剩 水 II 手 提 式 高 压 蒸 汽 灭 菌 锅 ( 演 示 ) ( 二 ) 干 热 灭 菌 法 干 热 灭 菌 法 适 用 于 玻 璃 器 皿, 如 试 管 培 养 皿 三 角 瓶 过 滤 器 移 液 管 等 的 灭 菌 使 用 的 仪 器 为 干 热 消 毒 箱 1 装 入 待 灭 菌 物 品 预 先 将 各 种 器 皿 用 纸 包 好 或 装 入 金 属 制 的 培 养 皿 筒 移 液 管 筒 内, 然 后 放 入 消 毒 箱 中, 关 闭 箱 门 2 温 度 与 时 间 的 设 定 打 开 电 源 开 关, 在 控 制 面 板 上 对 温 度 和 时 间 进 行 设 定, 本 实 验 所 需 温 度 为 160~170 o C, 当 温 度 上 升 到 所 设 定 的 温 度 后, 计 时 开 始, 一 般 设 定 时 间 为 2h 3 灭 菌 过 程 当 温 度 上 升 到 设 定 的 温 度 后, 维 持 所 需 ( 设 定 ) 时 间, 设 定 时 间 一 结 束, 数 显 示 窗 显 示 End, 加 温 电 源 切 断, 并 有 声 音 提 醒, 关 闭 电 源 4 取 出 灭 菌 物 品 待 消 毒 箱 温 度 降 到 70 o C 以 下 后, 才 能 打 开 箱 门, 取 出 灭 菌 物 品 ( 三 ) 过 滤 除 菌 法 有 些 物 质, 如 抗 生 素 血 清 维 生 素 等 易 受 热 分 解, 因 而 要 采 用 过 滤 除 菌 法 目 前 常 采 用 的 过 滤 器 主 要 为 滤 膜 过 滤 器, 其 操 作 过 程 如 下 : 1 按 图 2-1 进 行 安 装, 为 阻 止 空 气 中 细 菌 进 入 过 滤 瓶 而 在 接 管 处 塞 入 棉 花, 外 用 纸 包 好 进 行 121 o C 湿 热 灭 菌 20min 2 在 洁 净 工 作 台 上, 把 过 滤 器 与 真 空 泵 连 接 ; 加 入 所 需 灭 菌 的 液 体, 开 动 真 空 泵 进 行 抽 滤 抽 滤 结 束 后, 切 断 真 空 泵 电 源 ; 打 开 过 滤 器, 取 出 过 滤 液 备 用 或 保 存 3 过 滤 器 拆 装 与 整 理 9

12 四 注 意 事 项 1 使 用 高 压 灭 菌 锅 应 严 格 按 照 操 作 程 序 ( 加 水 排 冷 空 气 降 零 ) 进 行, 避 免 发 生 事 故 ; 灭 菌 时 操 作 者 切 勿 擅 自 离 开 2 干 热 灭 菌 时 消 毒 箱 中 物 品 不 要 摆 得 太 拥 挤, 以 免 阻 碍 空 气 流 通 而 影 响 灭 菌 效 果 ; 灭 菌 物 品 不 要 与 消 毒 箱 内 壁 的 钢 板 接 触, 以 防 包 装 纸 烤 焦 起 火 3 过 滤 除 菌 时 应 检 查 过 滤 装 置 是 否 漏 气, 以 防 污 染 五 实 验 报 告 1 记 录 各 种 不 同 物 品 所 用 的 灭 菌 方 法 及 灭 菌 条 件 ( 温 度 压 力 等 ) 2 试 述 高 压 蒸 汽 灭 菌 的 操 作 过 程 及 注 意 事 项 六 问 题 和 思 考 1 比 较 各 种 灭 菌 方 法 的 原 理 及 适 用 范 围 2 高 压 蒸 汽 灭 菌 中 为 什 么 要 把 冷 空 气 排 净, 为 什 么 在 灭 菌 后 不 能 骤 然 快 速 降 压? 3 在 检 测 某 水 体 是 否 存 在 病 毒 的 实 验 中, 如 何 排 除 细 胞 型 生 物 的 干 扰? 试 设 计 一 实 验 10

13 实 验 3 土 壤 微 生 物 的 稀 释 分 离 纯 化 无 菌 操 作 技 术 微 生 物 菌 落 的 观 察 及 初 步 鉴 定 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 :1 学 习 从 土 壤 中 分 离 微 生 物 的 方 法, 学 习 无 菌 操 作 等 技 术 2 识 别 细 菌 酵 母 菌 放 线 菌 和 霉 菌 四 大 类 微 生 物 的 菌 落 特 征 内 容 :1 用 稀 释 法 分 离 细 菌 放 线 菌 霉 菌 和 酵 母 菌 2 用 平 板 划 线 方 法 分 离 微 生 物 3 学 习 接 种 操 作 技 术 4 根 据 菌 落 的 形 态 特 征 判 断 未 知 菌 的 类 别 二 实 验 材 料 和 用 具 已 灭 菌 的 牛 肉 膏 高 氏 1 号 马 丁 氏 固 体 培 养 基 各 1 瓶,49.5mL 无 菌 水 ( 带 玻 璃 珠 )1 瓶,4.5mL 无 菌 水 6 管 80% 乳 酸 10% 酚 液 95% 乙 醇 无 菌 培 养 皿 12 套 1mL 无 菌 移 液 管 10 支 土 壤 样 品 天 平 称 量 纸 药 匙 试 管 架 接 种 环 酒 精 灯 洁 净 工 作 台 三 操 作 步 骤 ( 一 ) 土 壤 稀 释 分 离 1 取 土 壤 取 表 层 以 下 5~10cm 处 的 土 壤 样 品, 放 入 灭 菌 的 袋 中 备 用, 或 放 在 4 o C 冰 箱 暂 存 2 制 备 稀 释 液 ( 要 无 菌 操 作 ) (1) 制 备 土 壤 悬 液 : 取 土 样 0.5g, 迅 速 倒 入 带 玻 璃 珠 的 无 菌 水 瓶 中 ( 玻 璃 珠 用 量 以 充 满 瓶 底 为 最 好 ), 振 荡 5~10min, 使 土 样 充 分 打 散, 即 成 10-2 的 土 壤 悬 液 (2) 稀 释 : 用 无 菌 移 液 管 吸 10-2 的 土 壤 悬 液 0.5mL, 放 入 4.5m 无 菌 水 中, 即 为 10-3 稀 释 液, 如 此 重 复, 可 依 次 制 成 10-3 ~10-8 的 稀 释 液 注 意 : 操 作 时 管 尖 不 能 接 触 液 面, 每 一 个 稀 释 度 换 一 支 移 液 管, 每 次 吸 土 液, 要 将 移 液 管 插 在 液 面, 吹 吸 3 次, 每 次 吸 上 的 液 面 要 高 于 前 一 次, 以 减 少 稀 释 中 的 误 差 3 混 菌 法 测 定 菌 落 述 的 方 法 (1) 细 菌 取 两 管 稀 释 液 各 1mL, 分 别 接 入 相 应 标 号 的 平 皿 中, 每 个 稀 释 度 接 两 个 平 皿 然 后 取 冷 却 至 50 o C 的 牛 肉 膏 琼 脂 培 养 基, 分 别 倒 入 以 上 培 养 皿 中 ( 装 量 以 铺 满 皿 底 的 2/3 为 宜 ), 迅 速 轻 轻 摇 动 平 皿, 使 菌 液 与 培 养 基 充 分 混 匀, 但 不 沾 湿 皿 的 边 缘, 待 琼 脂 凝 固 即 成 细 菌 平 板, 倒 平 板 时 要 注 意 11

14 无 菌 操 作 (2) 放 线 菌 取 两 管 稀 释 液, 在 每 管 中 加 入 10% 酚 液 5~6 滴, 摇 匀, 静 置 片 刻, 然 后 分 别 从 两 管 吸 出 1mL 加 入 相 应 标 号 的 平 皿 中, 选 用 高 氏 1 号 培 养 基, 用 与 细 菌 相 同 的 方 法 倒 入 平 皿 中, 便 可 制 成 放 线 菌 平 板 (3) 霉 菌 取 两 管 稀 释 液 各 1mL, 分 别 接 入 相 应 标 号 的 平 皿 中, 每 个 稀 释 度 接 两 个 平 皿 在 熔 好 的 马 丁 氏 固 体 培 养 基 中, 每 100mL 加 入 灭 菌 的 乳 酸 1mL, 轻 轻 摇 匀, 然 后 用 与 细 菌 相 同 的 方 法 倒 入 平 皿 中, 便 可 制 成 霉 菌 平 板 (4) 酵 母 菌 * 若 土 样 取 自 果 园 或 菜 园 的 土 壤, 在 (3) 即 可 能 分 离 到 4 培 养 将 接 种 好 的 细 菌 放 线 菌 霉 菌 平 板 倒 置, 即 皿 盖 朝 下 放 置, 于 28~30 o C 恒 温 培 养, 细 菌 培 养 1~2d, 放 线 菌 培 养 5~7d, 霉 菌 3~5d 可 用 于 观 察 菌 落, 用 于 进 一 步 纯 化 分 离 或 直 接 转 接 斜 面 ( 二 ) 平 板 划 线 分 离 微 生 物 1 倒 平 板 按 无 菌 操 作 要 求, 在 洁 净 工 作 台 或 在 火 焰 旁 操 作, 取 融 化 并 冷 却 至 不 烫 手 的 固 体 培 养 基 ( 约 50 o C), 倒 入 无 菌 培 养 皿, 倒 量 以 铺 满 皿 底 为 限, 平 放 待 其 冷 却 凝 固, 备 用 2 划 线 分 离 使 用 接 种 环, 从 待 纯 化 的 菌 落 或 待 分 离 的 斜 面 菌 种 中 沾 取 少 量 菌 样, 在 相 应 培 养 基 平 板 划 线 分 离, 划 线 的 方 法 多 样, 目 的 是 获 得 单 个 菌 落 3 培 养 方 法 同 土 壤 稀 释 分 离 4 菌 落 观 察 从 培 养 好 的 未 知 平 板 中, 挑 选 8 个 不 同 的 单 菌 落, 逐 个 编 号, 根 据 菌 落 识 别 要 点 区 分 未 知 菌 落 类 群, 并 将 观 察 结 果 填 入 表 4-1 ( 三 ) 斜 面 接 种 1 取 新 鲜 固 体 斜 面 培 养 基, 分 别 做 好 标 记 ( 写 上 菌 名, 日 期 接 种 人 等 ), 然 后 用 无 菌 操 作 方 法, 把 待 接 菌 种 接 入 以 上 培 养 基 斜 面 中 2 接 种 方 法 用 接 种 环 沾 取 少 量 待 接 菌 种, 然 后 在 新 鲜 斜 面 上 之 字 形 划 线, 方 向 是 从 下 部 开 始, 一 直 划 至 上 部 注 意 划 线 要 轻, 不 可 把 培 养 基 划 破 3 接 种 后 恒 温 培 养 [ 同 ( 一 )4] 四 注 意 事 项 1 一 般 土 壤 中, 细 菌 最 多, 放 线 菌 及 霉 菌 次 之, 而 酵 母 菌 主 要 见 于 果 园 及 菜 园 土 壤 中, 故 从 土 壤 分 离 细 菌 时, 要 取 较 高 的 稀 释 度, 否 则 菌 落 连 成 一 片 不 能 计 数 12

15 2 在 土 壤 稀 释 分 离 操 作 中, 每 稀 释 10 倍, 最 好 更 换 一 次 移 液 管, 使 计 数 准 确 3 放 线 菌 的 培 养 时 间 较 长, 故 制 平 板 的 培 养 基 用 量 可 适 当 增 多 4 观 察 菌 落 特 点 时, 要 选 择 分 离 得 很 开 的 单 个 较 大 菌 落, 对 培 养 皿 和 试 管 要 编 好 号 码, 请 勿 随 意 移 动 开 盖, 以 免 搞 混 菌 号 五 实 验 报 告 1 记 录 土 壤 稀 释 分 离 结 果, 计 算 出 每 克 土 壤 中 的 细 菌 放 线 菌 和 霉 菌 或 放 线 菌 的 数 量 计 算 方 法 : 选 择 长 出 菌 落 数 20~300 之 间 的 培 养 皿 进 行 计 数, 按 以 下 公 式 : 总 菌 数 = 同 一 稀 释 度 几 次 重 复 的 菌 落 平 均 数 稀 释 倍 数 2 分 别 记 录 平 板 划 线 斜 面 接 种 的 结 果, 并 进 行 自 我 评 价 3 记 录 未 知 菌 落 的 辨 别 结 果 ( 填 表 ) 4 上 交 代 表 细 菌 放 线 菌 酵 母 菌 和 霉 菌 的 斜 面 试 管 种 各 一 支, 并 附 各 自 形 态 特 征 观 察 记 录 六 问 题 和 思 考 1 在 测 定 土 壤 微 生 物 含 量 中, 除 混 菌 法 还 有 什 么 方 法? 2 比 较 细 菌 放 线 菌 酵 母 菌 和 霉 菌 菌 落 形 态 的 差 异? 3 设 计 一 个 实 验, 检 测 实 验 室 空 气 环 境 中 的 微 生 物 类 别? 表 4-1 未 知 菌 落 的 形 态 观 察 记 录 表 湿 干 菌 落 描 述 菌 落 号 培 养 基 厚 薄 大 小 松 密 大 小 表 面 边 缘 隆 起 形 状 正 面 颜 色 反 面 水 溶 性 色 素 透 明 度 判 断 结 果

16 实 验 四 九 龙 江 水 大 肠 菌 群 的 测 定 方 法 1 多 管 发 酵 法 一 目 的 要 求 学 习 测 定 水 源 水 大 肠 菌 群 数 量 的 多 管 发 酵 法 测 定, 了 解 大 肠 杆 菌 的 数 量 在 饮 水 中 的 重 要 性 二 基 本 原 理 多 管 发 酵 法 包 括 初 步 发 酵 试 验 平 板 分 离 和 复 发 酵 试 验 三 个 部 分 1. 初 步 发 酵 试 验 发 酵 管 内 装 有 乳 糖 胆 盐 蛋 白 胨 液 体 培 养 基, 并 倒 置 一 德 汉 氏 小 套 管 乳 糖 能 起 选 择 作 用, 因 为 很 多 细 菌 不 能 发 酵 乳 糖, 而 大 肠 菌 群 能 发 酵 乳 糖 而 产 生 酸 产 气 为 便 于 观 察 细 菌 的 产 酸 情 况, 培 养 基 内 加 有 溴 甲 酚 紫 作 为 ph 指 示 剂, 细 菌 产 酸 后, 培 养 基 即 由 原 来 的 紫 色 变 为 黄 色 溴 甲 酚 紫 还 有 抑 制 其 它 细 菌 如 芽 孢 菌 生 长 的 作 用 水 样 接 种 于 发 酵 管 内,37 下 培 养,24h 内 小 套 管 中 有 气 泡 形 成, 并 且 培 养 基 浑 浊, 颜 色 改 变, 说 明 水 中 存 在 大 肠 杆 菌, 为 阳 性 结 果, 但 也 有 个 别 其 他 类 型 的 细 菌 在 此 条 件 下 也 可 能 产 气 ; 此 外 产 酸 不 产 气 的 也 不 能 完 全 说 明 是 阴 性 结 果, 在 量 少 的 情 况 下, 也 可 能 延 迟 48h 后 才 产 气, 此 时 应 视 为 可 疑 结 果, 因 此, 以 上 两 种 结 果 均 需 继 续 做 下 面 两 部 分 实 验, 才 能 确 定 是 否 是 大 肠 菌 群 48h 后 仍 不 产 气 的 为 阴 性 结 果 2. 平 板 分 离 平 板 培 养 基 一 般 使 用 复 红 亚 硫 酸 钠 琼 脂 ( 远 藤 氏 培 养 基 ) 或 伊 红 美 蓝 琼 脂 (EMB agar), 前 者 含 有 碱 性 复 红 染 料, 在 此 作 为 指 示 剂, 它 可 被 培 养 基 中 的 亚 硫 酸 钠 脱 色, 使 培 养 基 呈 淡 粉 红 色, 大 肠 菌 群 发 酵 乳 糖 后 产 生 的 酸 和 乙 醛 即 和 复 红 反 应, 形 成 深 红 色 复 合 物, 使 大 肠 菌 群 落 变 成 为 带 金 属 光 泽 的 深 红 色 亚 硫 酸 钠 还 可 以 抑 制 其 他 杂 菌 的 生 长 伊 红 美 蓝 琼 脂 平 板 含 有 伊 红 美 蓝 染 料, 在 此 作 为 指 示 剂, 大 肠 菌 群 发 酵 乳 糖 造 成 酸 性 环 境 时, 该 两 种 染 料 即 结 合 复 合 物, 使 大 肠 菌 群 产 生 与 远 藤 氏 培 养 基 上 相 似 的 带 核 心 的 有 金 属 光 泽 的 铜 绿 色 深 紫 色 ( 龙 胆 紫 的 紫 色 ) 菌 落 初 发 酵 管 24h 内 产 生 酸 产 气 和 48h 产 酸 产 气 的 均 需 在 以 上 平 板 上 划 线 分 离 菌 落 3. 复 发 酵 试 验 以 上 大 肠 菌 群 阳 性 菌 落, 经 涂 片 染 色 为 革 兰 氏 阴 性 芽 孢 杆 菌 者, 通 过 此 试 验 再 进 一 步 证 实 原 理 与 初 发 酵 试 验 相 同, 经 24h 培 养 产 酸 又 产 气 的, 最 后 确 定 为 大 肠 菌 群 阳 性 结 果 14

17 三 实 验 材 料 和 设 备 1 器 材 试 管 吸 头 (1mL 5mL) 冰 箱 量 筒 玻 棒 烧 杯 PH 计 培 养 皿 水 浴 锅 ( 箱 ) 培 养 箱 试 剂 瓶 电 磁 炉 显 微 镜 锥 形 瓶 接 种 环 干 燥 箱 汉 德 氏 管 高 压 灭 菌 器 单 道 移 液 器 电 子 分 析 天 平 2 培 养 基 乳 糖 胆 盐 蛋 白 胨, 伊 红 美 蓝 琼 脂 (EMB) 四 操 作 步 骤 ( 一 ) 多 管 发 酵 ( 大 肠 菌 群 的 测 定 ) 1 水 样 的 采 集 : 用 高 温 灭 菌 过 的 试 剂 瓶 到 九 龙 江 取 水, 将 瓶 子 连 瓶 盖 一 起 伸 到 厘 米 的 深 处 打 开 瓶 塞, 等 水 满 后 盖 上 盖 子 后 从 水 中 取 出 运 送 水 样 时 应 避 免 玻 璃 瓶 摇 动, 水 样 溢 出 后 又 流 回 瓶 中, 从 而 增 加 污 染 2 水 样 的 稀 释 : 将 灭 菌 的 三 根 试 管 各 装 9mL 的 无 菌 水 标 上 的 记 号 充 分 振 荡 水 样, 从 中 吸 取 1mL 于 1 号 试 管 中, 充 分 振 荡 即 得 1:1 0 的 稀 释 液 同 理 配 制 1:100 及 1:1000 稀 释 液 3 水 源 水 的 检 查 (1) 初 步 发 酵 试 验 在 1 个 含 有 50mL 三 倍 浓 缩 的 乳 糖 胆 盐 蛋 白 胨 发 酵 烧 瓶 中, 加 入 100mL 水 样 ( 轻 度 污 染 水 的 测 定 ) 在 2 支 含 有 5mL 三 倍 浓 缩 乳 糖 胆 盐 蛋 白 胨 发 酵 管 中, 各 加 入 10mL 水 样 ( 中 轻 度 污 染 水 的 测 定 各 一 支 ) (2) 从 原 水 样 1:10 1:100 的 稀 释 液 各 吸 取 1mL 于 4 支 经 过 灭 菌 的 装 有 10mL 普 通 浓 度 乳 糖 蛋 白 胨 中 ( 每 吸 取 一 次, 吸 头 都 要 换 一 次 ) 原 水 样,1:10 重 复 一 次 ( 中 轻 度 污 染 水 的 测 定 各 一 支 ) (3) 将 上 述 溶 液 混 匀 后, 于 36 摄 氏 度 培 养 24h,24h 未 产 气 的 继 续 培 养 至 48h 记 录 其 稀 释 液 的 产 气 管 数, 进 行 复 发 酵 试 验 (4) 平 板 分 离 经 24h 培 养 后, 将 产 酸 产 气 及 48h 产 酸 产 气 的 发 酵 管 ( 瓶 ), 分 别 划 线 接 种 于 伊 红 美 蓝 琼 脂 平 板 上, 再 于 37 下 培 养 18-24h, 将 符 合 下 列 特 征 的 菌 落 的 一 小 部 分, 进 行 涂 片, 革 兰 氏 染 色, 镜 检 (5) 复 发 酵 试 验 经 涂 片 染 色 镜 检, 如 为 革 兰 氏 阴 性 无 芽 孢 杆 菌, 则 挑 取 该 菌 落 的 另 一 部 分, 重 新 接 种 于 普 通 浓 度 的 乳 糖 胆 盐 蛋 白 胨 发 酵 管 中, 每 管 可 接 种 来 自 同 一 初 发 酵 管 的 同 类 型 菌 落 1-3 个,37 培 养 24h, 结 果 若 产 酸 又 产 气, 即 证 实 有 大 肠 菌 群 存 在 证 实 有 大 肠 菌 群 存 在 后, 再 根 据 初 发 酵 试 验 的 阳 性 管 ( 瓶 ) 15

18 数 查 表, 即 得 大 肠 菌 群 数 大 肠 菌 群 检 数 表 ( 严 重 污 染 水 ) 接 种 水 样 量 /ml 每 升 水 样 中 大 肠 菌 群 数 备 注 < 接 种 水 样 量 为 1.111(1,0.1,0.01, 个 一 份 ) >

19 大 肠 菌 群 检 数 表 ( 中 度 污 染 水 ) 接 种 水 样 量 /ml 每 升 水 样 中 大 肠 菌 群 数 备 注 < 接 种 水 样 量 为 11.11(10,1,0.1,0.01 个 一 份 )

20 大 肠 菌 群 检 数 表 ( 轻 度 污 染 水 ) 接 种 水 样 量 /ml 每 升 水 样 中 大 肠 菌 群 数 备 注 < 接 种 水 样 量 为 11.11(10,1,0.1,0.01 个 一 份 ) 实 验 四 附 录 1. 乳 糖 胆 盐 蛋 白 胨 液 体 培 养 基 乳 糖 蛋 白 胨 10g 20g 0.04% 溴 甲 酚 紫 水 溶 液 25mL 胆 盐 蒸 馏 水 5g 1000mL 将 上 述 培 养 基 成 分 加 热 溶 解 于 1000mL 蒸 馏 水 中 后, 调 ph7.2~7.4, 加 入 0.04% 溴 甲 酚 紫 水 溶 液 25mL, 充 分 混 匀, 分 装 于 置 有 杜 汉 氏 小 管 的 试 管 内 115 灭 菌 15min 2 3 倍 浓 缩 乳 糖 胆 盐 蛋 白 胨 液 体 培 养 基 ( 多 管 发 酵 法 检 测 大 肠 菌 群 ) 体 积 不 变 (100), 其 各 成 分 量 为 1 配 方 中 的 3 倍 18

21 方 法 2 滤 膜 法 测 定 水 中 大 肠 菌 群 一 目 的 要 求 学 习 使 用 滤 膜 法 测 定 水 中 大 肠 菌 群 二 基 本 原 理 滤 膜 法 是 采 用 滤 膜 过 滤 器 过 滤 水 样, 使 其 中 的 细 菌 截 留 在 滤 膜 上, 然 后 将 滤 膜 放 在 适 当 培 养 基 上 进 行 培 养, 大 肠 菌 群 可 直 接 在 膜 上 生 长, 从 而 可 直 接 计 数, 所 用 滤 膜 是 一 种 多 孔 硝 化 纤 维 膜 或 乙 酸 纤 维 膜, 其 孔 径 0.45μm 伊 红 美 蓝 琼 脂 (EMB agar) 含 有 伊 红 美 蓝 染 料, 在 此 作 为 指 示 剂, 大 肠 菌 群 发 酵 乳 糖 造 成 酸 性 环 境 时, 该 两 种 染 料 即 结 合 复 合 物, 使 大 肠 菌 群 产 生 与 远 藤 氏 培 养 基 上 相 似 的 带 核 心 的 有 金 属 光 泽 的 深 紫 色 ( 龙 胆 紫 的 紫 色 ) 菌 落 三 药 品 和 用 具 1) 培 养 基 伊 红 美 蓝 琼 脂 培 养 基 ( 简 称 EMB), 灭 菌 水 2) 仪 器 和 其 他 用 具 SW-CJ-2FD 超 净 工 作 台,LDZX-40B1 不 锈 钢 立 式 灭 菌 消 毒 器 天 平 M-50 砂 芯 过 滤 器 真 空 泵 0.45μm 的 滤 膜 烧 杯 镊 子 四 水 样 取 校 内 自 来 水 100mL 五 操 作 步 骤 1 EMB 平 板 的 制 作 称 取 37g 的 EMB 加 1000mL 的 蒸 馏 水, 加 热 溶 解 后 分 装 于 三 角 锥 形 瓶 中, 于 LDZX-40B1 不 锈 钢 立 式 灭 菌 消 毒 器 控 制 116 灭 菌 20min 然 后 倒 平 板 2 滤 膜 灭 菌 将 滤 膜 放 入 装 有 蒸 馏 水 的 烧 杯 中, 加 热 煮 沸 15min, 共 煮 沸 三 次 3 滤 膜 过 滤 器 装 置 把 已 灭 菌 的 过 滤 器 基 座, 滤 膜 漏 斗 和 抽 滤 瓶 按 下 图 1 装 配 好, 其 中 滤 膜 用 灭 菌 镊 子 移 至 过 滤 器 基 座 上 其 他 可 直 接 用 手 或 夹 钳 操 作 19

22 4 将 抽 滤 瓶 接 上 真 空 泵 5 加 水 样 过 滤 6 开 动 真 空 泵 进 行 抽 滤 7 抽 完 后, 加 入 等 量 的 灭 菌 水 继 续 抽 滤, 目 的 是 冲 洗 漏 斗 壁 8 过 滤 完 毕, 关 上 真 空 泵, 用 镊 子 夹 住 滤 膜 边 缘, 将 没 有 细 菌 的 一 面 紧 帖 在 伊 红 美 蓝 琼 脂 培 养 基 平 板 上 滤 膜 与 培 养 基 之 间 不 得 有 气 泡 9 平 板 倒 置 于 37 下 培 养 22-24h 10 选 择 符 合 大 肠 菌 群 菌 落 特 征 的 菌 落, 进 行 计 数 大 肠 菌 群 菌 落 特 征 : (1) 深 紫 黑 色 有 金 属 光 泽 (2) 紫 黑 色 不 带 或 略 带 金 属 光 泽 (3) 淡 紫 红 色 中 心 颜 色 较 深 11 初 步 计 算 1L 水 样 的 大 肠 菌 群 数 = 滤 膜 上 的 大 肠 菌 群 菌 落 数 10 六 实 验 报 告 1. 根 据 你 所 做 的 实 验 结 果, 描 写 滤 膜 上 的 大 肠 菌 群 菌 落 的 外 观 2. 滤 膜 上 的 大 肠 菌 群 菌 落 数 3. 1L 水 样 的 大 肠 菌 群 数 20

23 方 法 3 革 兰 氏 染 色 法 一 目 的 要 求 1. 学 习 并 初 步 掌 握 革 兰 氏 染 色 法 2. 了 解 革 兰 氏 染 色 的 原 理 及 其 在 细 菌 分 类 鉴 定 中 的 重 要 性 二 基 本 原 理 革 兰 氏 染 色 法 (Gram's staining method) 是 细 菌 学 中 广 泛 使 用 的 一 种 鉴 别 染 色 法,1884 年 由 丹 麦 医 师 Gram 创 立 革 兰 氏 染 色 法 不 仅 用 来 观 察 细 菌 的 形 态, 而 且 它 还 是 细 菌 鉴 定 的 重 要 方 法, 可 将 所 有 的 细 菌 区 分 为 革 兰 氏 阳 性 菌 (G+) 和 革 兰 氏 阴 性 菌 (G-) 两 大 类, 是 细 菌 学 上 最 常 用 的 鉴 别 性 染 色 法 革 兰 氏 染 色 法 的 主 要 步 骤 是 先 用 结 晶 紫 进 行 初 染 ; 再 加 媒 染 剂 -- 碘 液, 以 增 加 染 料 与 细 胞 间 的 亲 和 力, 使 结 晶 紫 和 碘 在 细 胞 膜 上 形 成 分 子 量 较 大 的 复 合 物 ; 然 后 用 脱 色 剂 ( 乙 醇 或 丙 酮 ) 脱 色 ; 最 后 用 蕃 红 复 染 凡 细 菌 不 被 脱 色 而 保 留 初 染 剂 的 颜 色 ( 紫 色 ) 者 为 革 兰 氏 阳 性 菌 G+, 如 被 脱 色 后 又 染 上 复 染 剂 的 颜 色 ( 红 色 ) 者 为 革 兰 氏 阴 性 菌 G- 有 芽 胞 的 杆 菌 和 绝 大 多 数 和 球 菌, 以 及 所 有 的 放 线 菌 和 真 菌 都 呈 革 兰 氏 正 反 应 ; 弧 菌, 螺 旋 体 和 大 多 数 致 病 性 的 无 芽 胞 杆 菌 都 呈 现 负 反 应 该 染 色 法 所 以 能 将 细 菌 分 为 G+ 菌 和 G- 菌, 是 由 这 两 类 菌 的 细 胞 壁 结 构 和 成 分 的 不 同 所 决 定 的 G- 菌 的 细 胞 壁 中 含 有 较 多 易 被 乙 醇 溶 解 的 类 脂 质, 而 且 肽 聚 糖 层 较 薄 交 联 度 低, 故 用 乙 醇 或 丙 酮 脱 色 时 溶 解 了 类 脂 质, 增 加 了 细 胞 壁 的 通 透 性, 使 结 晶 紫 和 碘 的 复 合 物 易 于 渗 出, 结 果 细 菌 就 被 脱 色, 再 经 蕃 红 复 染 后 就 成 红 色 G+ 菌 细 胞 壁 中 肽 聚 糖 层 厚 且 交 联 度 高, 类 脂 质 含 量 少, 经 脱 色 剂 处 理 后 反 而 使 肽 聚 糖 层 的 孔 径 缩 小, 通 透 性 降 低, 因 此 细 菌 仍 保 留 初 染 时 的 颜 色 三 器 材 1. 菌 种 大 肠 杆 菌 约 24h 营 养 琼 脂 斜 面 培 养 物, 金 黄 色 葡 萄 球 菌 约 24h 营 养 琼 脂 斜 面 培 养 物, 蜡 样 芽 孢 杆 菌 (B.cereus)12~24h 营 养 琼 脂 斜 面 培 养 物 2. 染 色 剂 : 革 兰 氏 染 色 液 3. 仪 器 及 其 他 用 具 : 显 微 镜 酒 精 灯 载 玻 片 接 种 环 双 层 瓶 ( 内 装 香 柏 油 和 二 甲 苯 ), 擦 镜 纸 生 理 盐 水 等 四 操 作 步 骤 1. 制 片 (1) 涂 片 : 取 干 净 载 玻 片 一 块, 在 载 玻 片 中 间 加 一 滴 蒸 馏 水, 按 无 菌 操 作 法 取 菌 涂 片, 制 成 很 薄 的 涂 面, 注 意 取 菌 不 要 太 多 (2) 晾 干 : 让 涂 片 在 酒 精 灯 火 焰 上 方 文 火 烘 干 (3) 固 定 : 手 执 玻 片 一 端, 让 菌 膜 朝 上, 通 过 火 焰 2-3 次 固 定 ( 以 不 烫 手 为 宜 ) 21

24 注 意 : 1 要 用 活 跃 生 产 期 的 幼 培 养 物 做 革 兰 氏 染 色 ; 2 涂 片 用 的 载 玻 片 要 洁 净 无 油 污 迹, 否 则 影 响 涂 片 3 挑 菌 量 应 少 些, 涂 片 宜 薄, 过 厚 重 叠 的 菌 体 则 不 易 观 察 清 楚 2. 初 染 (1) 结 晶 紫 色 染 色 : 将 玻 片 置 于 干 净 的 培 养 皿 上, 加 适 量 ( 以 盖 满 细 菌 涂 面 ) 的 结 晶 紫 染 色 液 染 色 1-2 分 钟 (2) 水 洗 : 倾 去 染 色 液, 用 水 小 心 地 冲 洗 3. 媒 染 (1) 用 碘 液 冲 去 残 水, 并 用 碘 液 覆 盖 约 1 分 钟 (2) 水 洗 : 用 水 洗 去 碘 液 4. 脱 色 用 滤 纸 吸 去 玻 片 上 的 残 水, 将 玻 片 倾 斜, 在 白 色 背 景 下, 用 滴 管 流 加 95% 的 乙 醇 脱 色, 直 至 流 出 的 乙 醇 无 紫 色 时, 立 即 水 洗 革 兰 氏 染 色 成 败 的 关 键 是 脱 色 时 间, 如 脱 色 过 度, 革 兰 氏 阳 性 细 菌 也 可 被 脱 色 而 被 误 认 为 是 革 兰 氏 阴 性 细 菌 而 脱 色 时 间 过 短, 革 兰 氏 阴 性 细 菌 则 会 被 误 认 为 是 革 兰 氏 阳 性 细 菌 脱 色 时 间 的 长 短 还 受 涂 片 的 厚 薄 脱 色 时 玻 片 晃 动 的 程 度 等 因 素 的 影 响 脱 色 时 间 一 般 约 20-30s 5. 复 染 (1) 用 番 红 复 染 约 2 分 钟 (2) 水 洗 : 用 水 洗 去 涂 片 上 的 番 红 染 色 液 (3) 晾 干 : 将 染 好 的 涂 片 用 吸 水 纸 吸 干 6. 镜 检 镜 检 时 先 用 低 倍, 再 用 高 倍, 最 后 用 油 镜 观 察, 并 判 断 菌 体 的 革 兰 氏 染 色 反 应 性 被 染 成 蓝 紫 色 的 是 革 兰 氏 阳 性 菌, 被 染 成 红 色 的 是 革 兰 氏 阴 性 菌 五 实 验 报 告 1. 结 果 根 据 观 察 结 果, 绘 出 两 种 细 菌 的 形 态 图 2. 思 考 题 (1) 你 认 为 制 备 细 菌 染 色 标 本 时, 尤 其 应 该 注 意 哪 些 环 节? (2) 为 什 么 要 求 制 片 完 全 干 燥 后 才 能 用 油 镜 观 察? (3) 如 果 你 的 涂 片 未 经 热 固 定, 将 会 出 现 什 么 问 题? 如 果 热 温 度 过 高, 时 间 太 长, 又 会 怎 么 样? 22

25 实 验 五 大 肠 杆 菌 生 长 曲 线 的 测 定 一 目 的 要 求 1. 通 过 细 菌 数 量 的 测 量 了 解 大 肠 杆 菌 的 生 物 特 征 和 规 律, 绘 制 生 长 线 2. 复 习 光 电 比 浊 法 测 量 细 菌 数 量 的 方 法 二 基 本 原 理 大 多 数 细 菌 的 繁 殖 速 率 很 快, 在 合 适 的 条 件 下, 一 定 时 期 的 大 肠 杆 菌 细 胞 每 20min 分 裂 一 次 将 一 定 量 的 细 菌 转 入 新 鲜 液 体 培 养 基 中, 在 适 宜 的 条 件 下 培 养 细 胞 要 经 历 延 迟 期 对 数 期 稳 定 期 和 衰 亡 期 四 个 阶 段 以 培 养 时 间 为 横 坐 标, 以 细 菌 数 目 的 对 数 或 生 长 速 率 为 纵 坐 标 作 图 所 绘 制 的 曲 线 称 为 该 细 菌 的 生 长 曲 线 不 同 的 细 菌 在 相 同 的 培 养 条 件 下 其 生 长 曲 线 不 同, 同 样 的 细 菌 在 不 同 的 培 养 条 件 下 所 绘 制 的 生 长 曲 线 也 不 相 同 测 定 细 菌 的 生 长 曲 线, 了 解 其 生 长 繁 殖 规 律, 这 对 人 们 根 据 不 同 的 需 要, 有 效 地 利 用 和 控 制 细 菌 的 生 长 具 有 重 要 意 义 本 实 验 用 分 光 光 度 计 (spectrophotometer) 进 行 光 电 比 浊 测 定 不 同 培 养 时 间 细 菌 悬 浮 液 的 OD 值, 绘 制 生 长 曲 线 也 可 以 直 接 用 试 管 或 带 有 测 定 管 的 三 角 瓶 ( 图 VIII-5) 测 定 klett units 值 的 光 度 计 只 要 接 种 1 支 试 管 或 1 个 带 测 定 管 的 三 角 瓶, 在 不 同 的 培 养 时 间 ( 横 坐 标 ) 取 样 测 定, 以 测 得 的 klett units 为 纵 坐 标, 便 可 很 方 便 的 绘 制 出 细 菌 的 生 长 曲 线 如 果 需 要, 可 根 据 公 式 1klett units=od/0.002 换 算 出 所 侧 菌 悬 液 的 OD 值 三 器 材 1. 菌 种 大 肠 杆 菌 2. 培 养 基 LB 液 体 培 养 基 70mL, 分 装 2 支 大 试 管 (5mL/ 支 ), 剩 余 60mL 装 入 250mL 的 三 角 瓶 3. 仪 器 和 其 他 用 具 722 型 分 光 光 度 计, 水 浴 振 荡 摇 床, 无 菌 试 管, 无 菌 吸 管 等 四 操 作 步 骤 1. 标 记 取 11 支 无 菌 大 试 管, 用 记 号 笔 分 别 标 明 培 养 时 间, 即 和 20h 2. 接 种 分 别 用 5mL 无 菌 吸 管 吸 取 2.5mL 大 肠 杆 菌 过 夜 培 养 液 ( 培 养 10~12h) 转 入 盛 有 50mLLB 液 的 三 角 瓶 内, 混 合 均 匀 后 分 别 取 5mL 混 合 液 放 入 上 述 标 记 的 11 支 无 菌 大 试 管 中 23

26 3. 培 养 将 已 接 种 的 试 管 置 摇 床 37 振 荡 培 养 ( 振 荡 频 率 250r/min), 分 别 培 养 和 20h, 将 标 有 相 应 时 间 的 试 管 取 出, 立 即 放 冰 箱 中 贮 存, 最 后 一 同 比 浊 测 定 其 光 度 值 4. 比 色 测 定 用 未 接 种 的 LB 液 体 培 养 基 作 空 白 对 照, 选 用 600nm 波 长 进 行 光 电 比 色 测 定 从 早 取 出 的 培 养 液 依 次 测 定, 对 细 胞 密 度 大 的 培 养 液 用 LB 液 体 培 养 基 适 当 稀 释 后 测 定, 使 其 光 密 度 值 在 0.1~0.65 之 内 ( 测 定 OD 值 前, 将 待 测 定 的 培 养 液 振 荡, 使 细 胞 均 匀 分 布 ) 本 操 作 步 骤 也 可 用 简 便 的 方 法 代 替 1. 用 1mL 无 菌 吸 管 吸 取 0.25mL 大 肠 杆 菌 过 夜 培 养 液 转 入 盛 有 3~5mL LB 液 的 试 管 中 混 匀 后 将 试 管 直 接 插 入 分 光 光 度 计 的 比 色 糟 中, 比 色 糟 上 方 用 自 制 地 暗 盒 将 试 管 及 比 色 暗 室 全 部 罩 上, 形 成 一 个 大 的 暗 环 境, 另 以 1 支 盛 有 LB 液 但 没 有 接 种 的 试 管 调 零 点, 测 定 样 品 中 培 养 0h 的 OD 值 测 定 完 毕 后, 取 出 试 管 置 37 继 续 振 荡 培 养 2. 分 别 在 培 养 和 20h, 取 出 培 养 物 试 管 按 上 述 方 法 测 定 OD 值 该 方 法 准 确 度 高 操 作 简 便 但 必 须 注 意 的 是 使 用 的 2 支 试 管 要 很 干 净, 其 透 光 程 度 愈 接 近, 测 定 的 准 确 度 愈 高 五 实 验 报 告 1 结 果 (1) 将 测 定 的 OD600 值 填 入 下 表 : 培 养 时 间 (h) 对 照 光 密 度 值 OD600 (2) 绘 制 大 肠 杆 菌 的 生 长 曲 线 2 思 考 题 : (1) 如 果 用 活 菌 计 数 法 制 作 生 长 曲 线, 你 认 为 汇 有 什 么 不 同? 两 者 各 有 什 么 有 缺 点? (2) 细 菌 生 长 繁 殖 所 经 历 的 四 个 时 期 中, 哪 个 时 期 其 时 代 最 短? 若 细 胞 密 度 为 10 3 /ml, 培 养 4.5h 后, 其 密 度 高 达 /ml, 请 计 算 出 其 代 时 (3) 次 生 代 谢 产 物 的 大 量 积 累 在 哪 个 时 期? 根 据 细 菌 生 长 繁 殖 的 规 律, 采 用 哪 些 措 施 可 使 次 生 代 谢 产 物 累 积 更 多? 24