2 研 究 论 文 肠 杆 菌 (Escherichia coli, E.coli) 响 应 热 激 的 研 究 中, 有 关 推 测 认 为 : 在 受 到 高 温 刺 激 时, 基 因 rpoe 由 抑 制 状 态 变 为 激 活 状 态, 编 码 出 的 σ 2 因 子 可 特 异 性 识 别

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1 : 中 国 细 胞 生 物 学 学 报 Chinese Journal of Cell Biology 23, 3(): rpoe 基 因 对 环 境 胁 迫 下 肠 炎 沙 门 氏 菌 生 长 能 力 的 影 响 乔 向 欣 曾 红 亮 杨 晋 刘 坤 曾 庆 梅 * ( 合 肥 工 业 大 学 农 产 品 生 物 化 工 教 育 部 工 程 研 究 中 心, 合 肥 239) 摘 要 rpoe 基 因 是 普 遍 存 在 于 细 菌 中 的 一 类 调 节 基 因, 对 细 菌 响 应 各 种 环 境 胁 迫 起 着 重 要 的 调 节 作 用 该 研 究 利 用 λ 噬 菌 体 的 Red 重 组 系 统 构 建 出 肠 炎 沙 门 氏 菌 (Salmonella enteritidis, S.E) 的 rpoe 基 因 缺 陷 株 ΔrpoE, 并 考 察 ΔrpoE 在 不 同 环 境 胁 迫 条 件 下 的 生 长 能 力 结 果 显 示, 在 37 C 时, ΔrpoE 的 生 长 能 力 无 显 著 变 化 ; 而 在 高 低 温 酸 氧 高 渗 培 养 条 件 下, ΔrpoE 的 生 长 能 力 显 著 弱 于 野 生 株 该 研 究 首 次 获 得 了 S.E 的 基 因 缺 陷 株 ΔrpoE, 并 初 步 探 索 了 rpoe 基 因 在 S.E 中 的 功 能, 有 助 于 进 一 步 研 究 rpoe 基 因 在 大 肠 杆 菌 沙 门 氏 菌 等 肠 杆 科 细 菌 在 响 应 环 境 胁 迫 过 程 中 表 现 出 的 生 物 学 功 能 关 键 词 肠 炎 沙 门 氏 菌 ; Red 重 组 ; ΔrpoE; 环 境 胁 迫 Influence of rpoe Gene on Growth Ability of Salmonella enteritidis under the Stress of Circumstance Qiao Xiangxin, Zeng Hongliang, Yang Jin, Liu Kun, Zeng Qingmei* (Engineering Research Center of Bio-process, Hefei University of Technology, Ministry of Education of PRC, Hefei 239, China) Abstract rpoe gene is one kind of regulatory genes which can be commonly found in bacteria and plays an important role to various environmental stress response. In this study, an rpoe gene mutant of Salmonella enteritidis (S.E) called ΔrpoE was constructed by λ-red recombinase system and the growth ability of ΔrpoE under different stress of circumstance was inspected. The results showed that there was no difference between wild and mutant strains at 37 C. However, the growth ability of mutant strains was significantly weaker than wild strains under the culture condition of high and low temperature, acidic, oxidative, high-osmotic. In summary, this is the first time to get the rpoe knock-out mutant in Salmonella enteritidis and the function of rpoe gene is preliminarily inspected, which can help to find out the further function and mechanism of the rpoe gene in Enterobacteriaceae such as E.coli and S.E. Key words Salmonella enteritidis; Red recombination; ΔrpoE; environment stress 肠 炎 沙 门 氏 菌 (Salmonella enteritidis, S.E) 可 污 染 各 种 畜 奶 蛋 产 品, 能 引 发 人 畜 发 热 腹 泻 [] 呕 吐 等 症 状, 是 引 起 急 性 肠 胃 炎 的 主 要 原 因 当 受 到 高 低 温 酸 氧 渗 透 压 等 生 存 压 力 的 刺 激 时, 肠 炎 沙 门 氏 菌 需 要 及 时 有 效 地 调 节 某 些 基 因 的 表 达 和 蛋 白 的 活 性 来 适 应 新 的 环 境 rpoe 是 普 遍 存 在 于 细 菌 中 的 一 类 调 节 基 因, 在 细 菌 响 应 非 致 死 性 环 境 [2] 胁 迫 的 过 程 中 起 着 重 要 的 调 节 作 用 其 中, 在 对 大 收 稿 日 期 : 接 收 日 期 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 批 准 号 : ) 和 国 家 高 技 术 研 究 发 展 计 划 ( 批 准 号 : 2AA8) 资 助 的 课 题 * 通 讯 作 者 Tel/Fax: -2982, zengqingmei-@3.com Received: December 2, 22 Accepted: February 22, 23 This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No.37, ) and the National High Technology Research and Developmend Program of China (Grant No.2AA8) *Corresponding author. Tel/Fax: , zengqingmei-@3.com

2 2 研 究 论 文 肠 杆 菌 (Escherichia coli, E.coli) 响 应 热 激 的 研 究 中, 有 关 推 测 认 为 : 在 受 到 高 温 刺 激 时, 基 因 rpoe 由 抑 制 状 态 变 为 激 活 状 态, 编 码 出 的 σ 2 因 子 可 特 异 性 识 别 并 引 导 RNA 聚 合 酶 和 调 控 蛋 白 结 合 到 热 休 克 基 因 启 动 子 区 域 上, 诱 导 热 休 克 蛋 白 基 因 的 表 达 并 产 生 大 量 的 热 激 蛋 白 [3], 从 而 提 高 细 胞 对 热 的 应 激 能 力 和 菌 体 对 非 致 死 性 热 刺 激 的 存 活 率 大 肠 杆 菌 和 肠 炎 沙 门 氏 菌 中 rpoe 基 因 的 同 源 性 高 达 93% 左 右, 且 对 应 编 码 的 蛋 白 序 列 的 同 源 性 高 达 99% 左 右 此 类 反 应 机 制 在 大 肠 杆 菌 中 的 研 究 已 有 大 量 的 报 道 [2-3], 但 在 沙 门 氏 菌 中 尚 未 深 入 开 展 rpoe 基 因 调 节 功 能 的 相 关 研 究 因 此, 大 肠 杆 菌 中 rpoe 基 因 的 研 究 将 对 本 课 题 产 生 重 要 的 指 导 和 借 鉴 作 用 目 前 对 细 菌 基 因 功 能 的 阐 述, 常 需 要 使 该 基 因 缺 失, 然 后 比 较 野 生 菌 株 与 缺 陷 菌 株 之 间 的 差 异, 从 而 确 切 地 得 到 该 基 因 的 功 能 信 息 [] 在 微 生 物 基 因 工 程 研 究 中, λ 噬 菌 体 的 Red 重 组 系 统 是 近 些 年 来 发 展 起 来 的 可 使 机 体 特 定 的 基 因 失 活 或 缺 失 的 新 型 分 子 生 物 学 技 术, 可 产 生 精 确 的 基 因 突 变, 也 可 纠 正 机 体 的 基 因 突 变, 已 被 广 泛 应 用 于 研 究 特 定 基 因 功 能 构 建 特 定 突 变 工 程 菌 改 变 生 物 代 谢 途 径 等 方 面 与 传 统 的 基 因 敲 除 方 法 相 比, 该 技 术 以 其 较 短 的 同 源 臂 和 较 高 的 重 组 效 率 等 优 点 广 泛 用 于 大 肠 杆 菌 的 基 因 修 饰 中 [] 本 课 题 利 用 λ 噬 菌 体 的 Red 重 组 系 统 对 肠 炎 沙 门 氏 菌 的 rpoe 基 因 进 行 敲 除, 比 对 rpoe 基 因 缺 失 前 后 菌 体 在 高 低 温 酸 氧 高 渗 条 件 下 生 长 情 况 的 差 异, 初 步 探 求 rpoe 基 因 在 响 应 环 境 胁 迫 过 程 中 对 菌 体 活 性 的 影 响, 为 进 一 步 研 究 细 菌 基 因 功 能 提 供 了 理 论 基 础 和 数 据 支 撑 材 料 与 方 法. 材 料.. 菌 株 与 质 粒 肠 炎 沙 门 氏 菌 (Salmonella enteritidis, S.E) 国 内 标 准 株 购 自 中 国 工 业 微 生 物 菌 种 保 藏 管 理 中 心 (CICC); 质 粒 pkd 质 粒 pkd 质 粒 pcp2 均 由 华 东 理 工 大 学 生 物 反 应 器 工 程 国 家 重 点 实 验 室 惠 赠 质 粒 pkd( 含 两 端 带 有 FRT 位 点 的 卡 那 霉 素 素 抗 性 基 因 kan, 用 作 抗 性 模 板 ) pkd( 含 氨 苄 青 霉 素 抗 性 基 因, 用 以 编 码 同 源 重 组 酶, 对 温 度 敏 感 ) pcp2( 含 氯 霉 素 抗 性 基 因, 用 以 去 除 抗 性 基 因 kan, 对 温 度 敏 感 ) 均 保 存 于 大 肠 杆 菌 DHα 中..2 主 要 试 剂 质 粒 抽 提 试 剂 盒 购 自 Qiagen 公 司 ; PCR 扩 增 试 剂 盒 PCR 产 物 纯 化 试 剂 盒 均 购 自 上 海 生 工 生 物 工 程 有 限 公 司 ; L- 阿 拉 伯 糖 氨 苄 青 霉 素 卡 那 霉 素 氯 霉 素 琼 脂 糖 CaCl 2 均 购 自 BBI 公 司.2 方 法.2. 引 物 的 设 计 敲 除 rpoe 基 因 共 需 条 引 物, 其 中 用 于 同 源 重 组 的 引 物 S S2 分 别 由 两 部 分 组 成, 端 加 下 划 线 的 序 列 与 rpoe 基 因 两 翼 序 列 同 源, 3' 端 未 加 下 划 线 的 序 列 与 质 粒 pkd 上 卡 那 霉 素 抗 性 基 因 kan 两 侧 序 列 互 补 用 于 鉴 定 缺 陷 株 的 引 物 S3 [-8] S 设 计 在 同 源 重 组 区 域 外 侧, 序 列 如 表 所 示 引 物 合 成 由 上 海 生 工 生 物 工 程 有 限 公 司 完 成.2.2 抗 性 重 组 片 段 pkd-kan 的 制 备 以 含 卡 那 霉 素 抗 性 基 因 kan 的 质 粒 pkd 为 模 板, S S2 为 引 物 进 行 PCR 扩 增 反 应, 得 到 能 替 换 rpoe 基 因 便 于 后 期 菌 株 抗 性 筛 选 的 重 组 基 因 片 段 为 防 止 残 留 质 [-7] 粒 模 板 影 响 后 续 实 验, 将 产 物 进 行 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 后 切 胶 回 收 纯 化, 并 进 行 浓 度 测 定 将 此 基 因 片 段 命 名 为 pkd-kan.2.3 Red 重 组 酶 的 诱 导 和 电 转 化 感 受 态 的 制 备 将 含 氨 苄 青 霉 素 抗 性 基 因 的 质 粒 pkd 按 常 规 化 学 [7] 法 (CaCl 2 法 ) 转 化 到 肠 炎 沙 门 氏 菌 中, 通 过 氨 苄 青 霉 素 抗 性 平 板 筛 选 阳 性 转 化 子 挑 选 单 菌 落 于 ml LB 液 体 培 养 基 中 3 C 过 夜 培 养, 按 : 的 比 例 转 接 到 含 氨 苄 青 霉 素 的 LB 液 体 培 养 基 中 3 C 培 养 至 D 约 为.2, 加 入 终 浓 度 为 3 mmol/l 的 L- 阿 拉 伯 糖 引 物 Primers S S2 S3 S 表 实 验 中 所 用 的 引 物 序 列 Table Primers and sequences used in this research 序 列 Sequences -GAA AGT TTT TCT TTC TGC ATG CCT AAT ACC TTT TCC AGT ATG GGA ATT AGC CAT GGT CC-3 -ATG AGC GAG CAG TTA ACG GAC CAG GTC CTG GTT GAA CGG GTG TAG GCT GGA GCT GCT TC-3 -GAA TCG CGG ATC AGG T-3 -TGC GGC TTA TGG AGT G-3

3 乔 向 欣 等 : rpoe 基 因 对 环 境 胁 迫 下 肠 炎 沙 门 氏 菌 生 长 能 力 的 影 响 3 继 续 培 养 9 min, 诱 导 质 粒 pkd 上 gam bet 和 exo [-8] 三 种 基 因 编 码 的 gam bet 和 exo 三 种 酶 并 充 分 表 达, 为 抗 性 重 组 片 段 pkd-kan 和 rpoe 基 因 的 同 源 重 组 做 准 备 然 后 按 常 规 方 法 制 备 肠 炎 沙 门 氏 菌 电 转 化 [-8] 感 受 态 细 胞, 用 于 下 一 步 转 化 实 验.2. 片 段 pkd-kan 的 电 转 化 和 缺 陷 株 ΔrpoE-kan 的 鉴 定 于 冰 上 将 μl 的 pkd-kan 片 段 和 μl 制 备 好 的 感 受 态 细 胞 混 匀, 置 于.2 cm 电 击 杯 中 进 行 电 击 转 化 电 击 参 数 为 : 电 压 2. kv, 电 阻 2 Ω, 脉 冲 2 μf [-7] 电 击 完 成 后 立 即 加 入 37 C 预 热 的 无 抗 性 LB 液 体 培 养 基, 于 37 C 培 养 2 h [9], 使 接 入 抗 性 片 段 的 细 胞 充 分 复 苏 然 后 取 菌 液 涂 布 至 含 卡 那 霉 素 的 LB 平 板, 筛 选 出 含 抗 性 基 因 的 缺 陷 株 阳 性 克 隆 以 阳 性 单 克 隆 为 模 板, S3 S 为 引 物 进 行 PCR [,8] 扩 增 鉴 定, 查 看 抗 性 片 段 与 rpoe 基 因 的 重 组 情 况 将 重 组 成 功 的 菌 株 命 名 为 ΔrpoE-kan.2. 质 粒 抗 性 基 因 的 消 除 及 缺 陷 株 ΔrpoE 的 鉴 定 通 过 电 转 化 法 将 编 码 FLP 重 组 酶 的 质 粒 pcp2 转 化 [-7] 到 菌 株 ΔrpoE-kan 中, 3 C 培 养 后 涂 布 氯 霉 素 抗 性 平 板 并 筛 选 出 转 化 子, 然 后 转 接 到 不 含 抗 生 素 的 LB 液 体 培 养 基 中 2 C 过 夜 培 养 质 粒 pcp2 编 码 的 FLP 重 组 酶 能 够 识 别 kan 两 侧 的 FRT 位 点, 通 过 位 点 特 异 性 重 组 将 抗 性 基 因 去 除 在 消 除 kan 的 同 时, 对 温 度 敏 感 的 质 粒 pkd pcp2 在 高 温 下 会 逐 渐 [9-2] 丢 失 消 除 质 粒 的 菌 株 为 基 因 缺 陷 株 阳 性 克 隆, 以 阳 性 单 克 隆 为 模 版, S3 S 为 引 物 进 行 PCR 扩 增 鉴 定, 查 看 抗 性 基 因 kan 的 去 除 情 况 将 去 除 抗 性 基 因 成 功 的 菌 株 命 名 为 缺 陷 株 ΔrpoE.2. ΔrpoE 遗 传 稳 定 性 的 鉴 定 挑 取 ΔrpoE 单 克 隆 于 LB 液 体 培 养 基 中 37 C 培 养 至 对 数 后 期, 然 后 按 : 的 比 例 接 种 到 新 鲜 的 LB 液 体 培 养 基 中 如 此 连 续 传 代 培 养 次, 每 次 均 吸 取 μl 菌 液 涂 布 于 LB 平 板, 然 后 随 机 挑 取 长 出 的 个 单 菌 落 为 模 板, S3 S [,2] 为 引 物 进 行 PCR 扩 增 鉴 定, 查 看 基 因 缺 陷 株 是 否 存 在 回 复 突 变 情 况, 考 查 细 菌 基 因 敲 除 后 的 稳 定 性.2.7 ΔrpoE 的 生 长 特 性 及 数 据 的 统 计 学 分 析 挑 取 基 因 缺 陷 株 和 野 生 株 单 菌 体 分 别 于 ml LB 液 体 培 养 基 中 37 C 培 养 至 对 数 后 期, 按 : 的 比 例 接 种 到 新 鲜 的 LB 液 体 培 养 基 中, 测 定 接 种 浓 度, 调 节 二 者 的 D 值 相 等 然 后 模 拟 常 见 外 界 胁 迫 环 境, 设 置 几 种 不 同 的 培 养 条 件 : 高 低 温 条 件 (3 C 37 C 2 C); 酸 性 条 件 ( 培 养 基 ph 值 为.); 氧 激 条 件 ( 培 养 基 中 加 入 终 浓 度 为. mmol/l 的 H 2 O 2 ); 高 渗 条 件 ( 培 养 基 中 加 入 终 浓 度 为 mmol/l 的 NaCl) 每 隔 3 h 取 ml 菌 液, 稀 释 后 涂 布 至 营 养 琼 脂 平 板, 平 板 计 数 法 计 菌 落 数 [7] 为 减 小 实 验 误 差, 做 组 平 行 实 验 取 菌 落 数 的 平 均 值 以 不 同 培 养 条 件 下 的 培 养 时 间 为 横 坐 标, 细 菌 活 菌 数 的 对 数 为 纵 坐 标 绘 制 生 长 曲 线, 观 察 野 生 株 和 基 因 缺 陷 株 在 环 境 胁 迫 条 件 下 的 生 长 情 况 同 时 使 用 SPSS 统 计 学 分 析 软 件 对 几 种 培 养 条 件 下 二 者 的 数 据 进 行 分 析 比 较, 当 P<. 时 差 异 具 有 统 计 学 意 义 2 结 果 2. 片 段 pkd-kan 的 制 备 结 果 以 质 粒 pkd 为 模 板, S S2 为 引 物 进 行 PCR 扩 增 反 应, 得 到 两 端 与 rpoe 基 因 上 下 游 序 列 同 源 中 间 为 卡 那 霉 素 抗 性 基 因 kan 的 DNA 片 段 经 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 初 步 鉴 定, 并 由 上 海 生 工 生 物 工 程 有 限 公 司 测 序, 结 果 如 图 所 示 PCR 产 物 的 长 度 为 88 bp, 与 理 论 值 一 致, 表 明 片 段 pkd-kan 扩 增 成 功 [,8] 2.2 缺 陷 株 ΔrpoE-kan 的 鉴 定 结 果 采 用 电 转 化 法 将 片 段 pkd-kan 转 化 到 含 质 粒 pkd 的 肠 炎 沙 门 氏 菌 中, 经 卡 那 霉 素 抗 性 LB 平 板 筛 选 出 阳 性 克 隆 分 别 以 阳 性 单 菌 落 和 野 生 单 菌 落 为 模 板, S3 S 为 引 物 进 行 PCR 扩 增 反 应, 对 pkd-kan 和 rpoe 基 因 的 重 组 情 况 进 行 鉴 定, 结 果 如 图 2 所 示 经 测 序, 阳 性 菌 落 PCR 产 物 长 度 为 77 bp, 而 对 照 野 生 菌 PCR 产 物 长 度 为 79 bp, 二 者 差 异 显 著 结 果 证 明 rpoe 基 因 被 替 换, 基 因 缺 陷 株 ΔrpoE-kan 构 建 成 功 88 bp 2 3 M -: pkd-kan 的 PCR 扩 增 产 物 ; M: DNA 标 准 2 bp bp bp 7 bp bp 2 bp -: products of pkd-kan amplified by PCR; M: DNA ladder. 图 片 段 pkd-kan 的 PCR 鉴 定 Fig. Identification of pkd-kan by PCR

4 研 究 论 文 2 M 2 M 77 bp 79 bp 2 bp bp bp 7 bp bp 2 bp 79 bp 327 bp 2 bp bp bp 7 bp bp 2 bp : ΔrpoE-kan 的 PCR 扩 增 产 物 ; 2: rpoe 的 PCR 扩 增 产 物 ; M: DNA 标 准 : products of ΔrpoE-kan amplified by PCR; 2: products of rpoe amplified by PCR; M: DNA ladder. 图 2 缺 陷 株 ΔrpoE-kan 的 PCR 鉴 定 Fig.2 Identification of ΔrpoE-kan by PCR : rpoe 的 PCR 扩 增 产 物 ; 2: ΔrpoE 的 PCR 扩 增 产 物 ; M: DNA 标 准 : products of rpoe amplified by PCR; 2: products of ΔrpoE amplified by PCR; M: DNA ladder. 图 3 抗 性 基 因 kan 去 除 的 PCR 鉴 定 Fig.3 Identification of elimination of the kan gene by PCR 图 缺 陷 株 的 ΔrpoE 的 部 分 DNA 序 列 分 析 Fig. Partial sequence analysis of ΔrpoE 2.3 缺 陷 株 ΔrpoE 的 鉴 定 结 果 采 用 电 转 化 法 将 质 粒 pcp2 转 入 菌 株 ΔrpoEkan 中, 最 终 取 菌 液 涂 布 LB 平 板 获 得 阳 性 克 隆 以 阳 性 单 菌 落 为 模 板, S3 S 为 引 物 进 行 PCR 扩 增 反 应, 对 抗 性 基 因 kan 的 去 除 结 果 进 行 鉴 定 并 测 序, 结 果 如 图 3 和 图 所 示 PCR 产 物 长 度 为 327 bp, 对 照 野 生 株 PCR 产 物 为 79 bp, 二 者 差 异 显 著 结 果 证 明 kan 基 因 已 被 消 除, 而 仅 在 原 来 的 抗 性 基 因 单 侧 留 下 [,] 一 个 FRT 位 点 和 一 些 残 余 序 列, 证 明 基 因 缺 陷 株 ΔrpoE 构 建 成 功 2. ΔrpoE 遗 传 稳 定 性 的 鉴 定 结 果 将 基 因 缺 陷 株 在 体 外 连 续 传 代 培 养 次 并 每 次 取 μl 涂 布 LB 平 板, 随 机 在 每 个 平 板 中 挑 取 个 单 克 隆 进 行 菌 落 PCR 扩 增 反 应, 结 果 如 图 所 示, 每 327 bp 2 M,2: ΔrpoE 的 PCR 扩 增 产 物 ; M: DNA 标 准. 2 bp bp bp 7 bp bp 2 bp,2: products of ΔrpoE amplified by PCR; M: DNA ladder. 图 ΔrpoE 稳 定 性 的 PCR 鉴 定 Fig. Identification of stability of the ΔrpoE by PCR

5 乔 向 欣 等 : rpoe 基 因 对 环 境 胁 迫 下 肠 炎 沙 门 氏 菌 生 长 能 力 的 影 响 (A) (D) Wild strains Mutant strains Wild strains Mutant strains 2 98 * * * 8 * 7 * (B) (C) Wild strains Mutant strains Wild strains Mutant strains 9 8 * 7 * * * 3 3 * (E) (F) Wild strains Mutant strains Wild strains Mutant strains 8 7 * * A: 野 生 株 和 缺 陷 株 在 3 C 的 生 长 曲 线 ; B: 野 生 株 和 缺 陷 株 在 37 C 的 生 长 曲 线 ; C: 野 生 株 和 缺 陷 株 在 2 C 的 生 长 曲 线 ; D: 野 生 株 和 缺 陷 株 在 酸 性 条 件 下 的 生 长 曲 线 ; E: 野 生 株 和 缺 陷 株 在 氧 激 条 件 下 的 生 长 曲 线 ; F: 野 生 株 和 缺 陷 株 在 高 渗 条 件 下 的 生 长 曲 线 *P<., P<. A: the growth curve of wild strains and mutant strains at 3 C; B: the growth curve of wild strains and mutant strains at 37 C; C: the growth curve of wild strains and mutant strains at 2 C; D: the growth curve of wild strains and mutant strains in acidic condition; E: the growth curve of wild strains and mutant strains in oxidative condition; F: the growth curve of wild strains and mutant strains in high-osmotic condition. *P<., P<.. 图 野 生 株 和 缺 陷 株 在 不 同 环 境 胁 迫 条 件 下 的 生 长 曲 线 Fig. The growth curve of wild strains and mutant strains in different environmental stress conditions 次 PCR 产 物 长 度 依 然 为 327 bp, 证 明 传 代 培 养 过 程 中 没 有 出 现 回 复 突 变, 构 建 的 缺 陷 株 ΔrpoE 非 常 稳 定 2. ΔrpoE 的 生 长 特 性 及 数 据 的 统 计 学 分 析 在 高 低 温 条 件 (3 C 37 C 2 C) 酸 性 条 件 ( 培 养 基 ph 值 为.) 氧 激 条 件 ( 培 养 基 中 加 入 终 浓 度 为. mmol/l 的 H 2 O 2 ) 高 渗 条 件 ( 培 养 基 中 加 入 终 浓 度 为 mmol/l 的 NaCl) 下, 分 别 以 培 养 时 间 为 横 坐 标, 细 菌 活 菌 数 的 对 数 为 纵 坐 标 绘 制 野 生 株 和 缺 陷 株 的 生 长 曲 线, 结 果 如 图 所 示 经 SPSS 统 计 学 分 析 软 件 对 组 数 据 进 行 差 异 分 析 处 理 并 进 行 误 差 分 析, 结 果 显 示 在 37 C 最 适 温 度 条 件 下, 野 生 株 和 缺 陷 株 的 生 长 数 据 无 显 著 差 异 (P>.), 二 者 生 长 情 况 几 乎 无 差 别 ; 而 在 3 C 低 温 2 C 高 温 酸 性 氧 激 高 渗 条 件 下, 缺 陷 株 和 野 生 株 数 据 间 的 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P<.), 二 者 生 长 情 况 具 有 显 著 差 异 以 上 结 果 表 明, 在 最 适 温 度 条 件 下, rpoe 基 因 对 细 菌 活 性 几 乎 无 影 响 ; 而 在 其 他 几 种 培 养 条 件 下, rpoe 基 因 会 显 著 影 响 细 菌 的 活 性, 基 因 的 缺 失 会 导 致 细 菌 对 环 境 胁 迫 ( 低 温 高 温 酸 氧 高 渗 ) 的 耐 受 能 力 显 著 降 低 3 讨 论 在 利 用 Red 重 组 系 统 对 肠 炎 沙 门 氏 菌 的 rpoe 基 因 进 行 敲 除 的 过 程 中, 设 计 引 物 制 备 抗 性 重 组 片 段

6 研 究 论 文 时, 两 侧 同 源 序 列 的 长 度 是 影 响 重 组 效 率 的 关 键 点 目 前, 国 内 外 通 过 Red 重 组 进 行 基 因 修 饰 所 使 用 的 引 物 同 源 臂 长 度 主 要 在 - bp 之 间, 过 短 的 同 源 臂 容 [,8,3] 易 被 降 解, 导 致 重 组 效 率 偏 低 经 过 本 实 验 验 证, 发 现 当 同 源 臂 长 度 为 39 bp 时, 重 组 片 段 的 重 组 效 率 较 高 在 进 行 重 组 酶 的 诱 导 时, L- 阿 拉 伯 糖 的 浓 度 和 诱 导 时 间 也 直 接 影 响 了 重 组 效 率 发 现 选 择 L- 阿 拉 伯 糖 的 浓 度 为 3 mmol/l 诱 导 时 间 为 9 min 时 比 诱 导 时 间 为 比 min 效 率 高 通 过 连 续 传 代 培 养 观 察 缺 陷 株 的 基 因 稳 定 性, 发 现 基 因 敲 除 后 菌 体 非 常 稳 定, 不 存 在 基 因 回 复 突 变 的 情 况 在 测 定 野 生 株 和 缺 陷 株 的 生 长 曲 线 时, 由 于 多 次 在 同 一 种 培 养 基 中 取 样, 增 大 了 污 染 杂 菌 的 可 能 性 ; 且 取 样 量 较 少, 样 品 中 菌 量 可 能 不 足 以 代 表 整 个 培 养 基 中 的 活 菌 数, 因 此 做 了 组 平 行 实 验, 取 样 品 中 菌 量 的 平 均 值 来 绘 制 生 长 曲 线 通 过 对 比 野 生 株 和 缺 陷 株 在 几 种 不 同 环 境 胁 迫 下 的 生 长 情 况, 推 测 rpoe 基 因 对 肠 炎 沙 门 氏 菌 活 性 的 影 响 可 能 是 : 在 适 宜 生 长 条 件 时, rpoe 基 因 活 性 受 到 抑 制, 不 参 与 应 激 反 应, 不 影 响 菌 体 的 正 常 生 理 活 性 在 受 到 低 温 高 温 酸 氧 高 渗 等 环 境 胁 迫 影 响 时, rpoe 基 因 抑 制 被 解 除, 活 性 得 以 发 挥, 从 而 使 菌 体 对 环 境 胁 迫 的 耐 受 能 力 显 著 提 高 在 大 肠 杆 菌 的 研 究 中, 目 前 细 菌 响 应 热 激 的 机 制 认 为 : 在 热 应 激 后, 细 胞 外 膜 错 折 叠 不 能 正 确 装 配, 从 而 促 使 内 膜 蛋 白 水 解 酶 degs rsep 激 活, 水 解 rsea, 解 除 对 rpoe 的 抑 制 使 rpoe 活 化 释 放 到 细 胞 质, 激 活 8 余 种 基 因 的 表 达, 包 括 热 休 克 蛋 白 rpoh grea 其 他 分 子 伴 侣 折 叠 催 化 剂 的 启 动 和 促 进 脂 多 糖 修 复, [-7] 并 最 终 能 指 导 外 膜 应 激 受 损 蛋 白 重 新 正 确 装 配 rpoe 启 动 的 这 些 基 因 中, rpoh 已 被 证 实 是 可 以 直 接 被 rpoe 诱 导 表 达 从 而 启 动 其 下 游 相 关 基 因 的 表 达 的, [,8-9] 使 细 菌 响 应 热 激 得 以 生 存 本 课 题 利 用 Red 重 组 系 统 成 功 构 建 了 rpoe 基 因 缺 陷 株, 并 优 化 了 实 验 条 件, 初 步 考 察 了 rpoe 基 因 在 肠 炎 沙 门 氏 菌 响 应 环 境 胁 迫 过 程 中 的 调 节 作 用, 为 该 技 术 在 其 他 菌 种 中 的 应 用 提 供 了 借 鉴, 并 为 进 一 步 研 究 rpoe 基 因 在 原 核 生 物 中 的 调 节 功 能 奠 定 了 基 础 参 考 文 献 (References) 杨 保 伟, 张 秀 丽, 曲 东, 席 美 丽, 崔 生 辉, 申 进 玲, 等 陕 西 部 分 零 售 畜 禽 肉 沙 门 氏 菌 血 清 型 和 基 因 型. 微 生 物 学 报 (Yang Baowei, Zhang Xiuli, Qu Dong, Xi Meili, Cui Shenghui, Shen Jinling, et al. Serotypic and genotypic characterization of Salmonella Serovars from retails meat in Shaanxi province (27-28). Acta Microbiologica Sinica) 2; (): -. 2 Kazmierczak MJ, Wiedmann M, Boor KJ. Alternative sigma factors and their roles in bacterial virulence. Microbiol Mol Biol Rev 2; 9(): Kanehara K, Ito K, Akiyama Y. YaeL proteolysis of RseA is controlled by the PDZ domain of YaeL and a Gln-rich region of RseA. EMBO J 23; 22(23): 李 樊, 刘 义, 何 钢. 基 因 敲 除 技 术 研 究 进 展. 生 物 技 术 通 报 (Li Fan, Liu Yi, He Gang. Status of gene knockout. Biotechnol Bull) 28; 9(2): 8-2. 张 雪, 温 廷 益. Red 重 组 系 统 用 于 大 肠 杆 菌 基 因 修 饰 研 究 进 展. 中 国 生 物 工 程 杂 志 (Zhang Xue, Wen Tingyi. Advances of Red recombination system in Escherichia coil gene modification. China Biotechnology) 28; 28(2): Datsenko KA, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-2 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA 2; 97(2): -. 7 张 维 铭. 现 代 分 子 生 物 学 实 验 手 册. 第 二 版. 北 京 : 科 学 出 版 社 (Zhang Weiming. Beijing: Science Press), 27,. 8 Yu D, Ellis HM, Lee EC. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 2; 97(): Murphy KC. Use of bacteriophage recombination functions to promote gene replacement in Escherichia coli. J Bacteriol 998; 8: Serra-Moreno R, Aeosta S, Hernalsteens JP. Use of the lambda Red recombinase system to produce recombinant prophages carrying antibiotic resistance genes. BMC Mol Biol 2; 7: 3. Poteete AR. What makes the bacteriophage lambda Red system useful for genetic engineering: Molecular mechanism and biological function. FEMS Micro-biol Lett 2; 2(): Muyrers JP, Zhang Y, Stewart AF. ET-cloning: Think recombination frist. Genet Eng(NY) 2; 22(): Liu PT, Jenkins NA, Copeland NG. A highly efficient recombineering-based method for generating conditional knockout mutations. Genome Res 23; 3(3): 7-8. 杜 鸿, 邹 昕, 夏 秋 风, 高 宇 琳, 黄 新 祥. 伤 寒 沙 门 菌 rpoe 基 因 缺 陷 变 异 株 的 制 备 及 其 生 存 能 力. 苏 州 大 学 学 报 ( 医 学 版 )(Du Hong, Zou Xin, Xia Qiufeng, Gao Yulin, Huang Xinxiang. Construction of a rpoe gene-deleted mutant in Salmonella Enterica Serovar typhi and its survival ability. Suzhou University Journal of Medical Science) 29; 29(2): Arsène F, Tomoyasu T, Bukau B. The heat shock response of Escherichia coli. Int J Food Microbiol 2; : 3-9. Raivio TL, Silhavy TJ. Periplasmic stress and ECF sigma factors. Annu Rev Microbiol 2; : Ra RG, Raivio TL. A third envelope stress signal transduaion pathway in Escherichia coli. Mol Microbiol 22; : Rhodius VA, Suh WC, Nonaka G. Conserved and variable functions of the σ E stress response in related genomes. PLoS Biol 2; (): e2. 9 Mecsas J, Rouviere PE, Erickson JW. The activity of sigma E, an Escherichia coli heat-inducible sigma-factor, is modulated by expression of outer membrane proteins. Genes Dev 993; 7:

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