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1 广 西 植 物 Guihaia Mar.2014,34(2): htp://journal.gxzw.gxib.cn DOI: /j.isn.1000G 颜 小 捷, 刘 幼 娴, 郑 立 浪, 等. 胃 蛋 白 酶 和 木 瓜 蛋 白 酶 水 解 核 桃 蛋 白 工 艺 研 究 [J]. 广 西 植 物,2014,34(2): YanXJ,LiuYX,ZhengLL,etal.Studyonpreparationofwalnutpeptidesfromenzymatichydrolysisofpepsinandpapain[J].Guihaia,2014,34(2): 摘 胃 蛋 白 酶 和 木 瓜 蛋 白 酶 水 解 核 桃 蛋 白 工 艺 研 究 颜 小 捷 1, 刘 幼 娴 1,2, 郑 立 浪 1,3, 卢 凤 来 1, 李 典 鹏 1 (1. 广 西 植 物 功 能 物 质 研 究 与 利 用 重 点 实 验 室, 广 西 植 物 研 究 所, 广 西 桂 林 ; 2. 广 西 中 医 药 大 学, 南 宁 ;3. 广 西 师 范 大 学, 广 西 桂 林 ) 要 : 以 核 桃 粕 为 原 料, 以 水 解 度 为 考 察 指 标, 研 究 胃 蛋 白 酶 和 木 瓜 蛋 白 酶 对 核 桃 蛋 白 的 水 解 作 用. 结 果 表 明 : 木 瓜 蛋 白 酶 为 酶 解 核 桃 蛋 白 最 佳 酶, 其 最 佳 酶 解 条 件 为 底 物 浓 度 4% 酶 质 量 分 数 5% 酶 解 ph 值 为 7.0 酶 解 温 度 50 酶 解 时 间 4h; 在 该 条 件 下, 木 瓜 蛋 白 酶 酶 解 核 桃 蛋 白 水 解 度 可 高 于 25.76%. 关 键 词 : 核 桃 蛋 白 ; 胃 蛋 白 酶 ; 木 瓜 蛋 白 酶 ; 水 解 度 中 图 分 类 号 :Q946.5 文 献 标 识 码 :A 文 章 编 号 :1000G3142(2014)02G0183G06 Studyonpreparationofwalnutpeptidesfrom enzymatichydrolysisofpepsinandpapain YANXiaoGJie 1,LIU YouGXian 1,2,ZHENGLiGLang 1,3, LUFengGLai 1,LIDianGPeng 1 (1.GuangxiKeyLaboratoryofFunctionalPhytochemicalsResearchandUtilization,GuangxiInstituteofBotany, Guilin541006,China;2.GuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530001,China; 3.ColegeofLifeSciences,GuangxiNormalUniversity,Guilin541004,China) Abstract:Walnutpeptideswereobtainedthroughpepsinorpapainenzymolysiswithwalnutresidueasraw materials anddegreeofhydrolysisasindex.theresultsshowedthatpapainwastheoptimumproteinase.theoptimumhydrog lyticconditionswereasfolowed:substrateconcentrationwas4%,enzymeconcentrationwas5%,phwas7,temperag turewas50 andhydrolysistimewas4h.undertheseoptimumconditions,thedegreeofhydrolysiscanbehigher than25.76%. Keywords:walnutprotein;epsin;papain;degreeofhydrolysis 核 桃 (Juglansregial) 为 胡 桃 科 胡 桃 属 植 物, 因 其 营 养 丰 富, 有 补 肾 强 体 温 肺 定 喘 润 肠 通 便 强 身 健 脑 驻 颜 延 年 等 功 效, 又 称 长 寿 果 万 岁 子 益 智 果 美 容 果 ( 黄 黎 慧 等,2009; 李 萍 等,2011). 现 实 中, 人 们 仅 关 注 核 桃 油 的 营 养 价 值, 忽 略 了 对 核 桃 饼 粕 的 开 发 利 用. 核 桃 粕 中 蛋 白 质 含 量 达 52%, 其 中 谷 蛋 白 含 量 高 达 70.11%, 而 谷 蛋 白 中 疏 水 性 氨 基 酸 比 例 较 高, 导 致 核 桃 蛋 白 溶 解 性 较 差, 大 大 限 制 了 其 在 食 品 工 业 中 的 利 用 ( 毛 晓 英,2012; 丁 晓 雯 等, 2005). 核 桃 蛋 白 中 谷 氨 酸 和 精 氨 酸 分 别 占 氨 基 酸 总 量 的 19.5%~20.4% 和 15.4%~15.7%, 其 中 谷 氨 酸 在 人 体 内 能 促 进 γg 氨 基 丁 酸 的 生 成, 降 低 血 液 氨 基 酸 的 含 量, 促 进 脑 细 胞 的 呼 吸 ; 赖 氨 酸 与 精 氨 酸 的 比 值 低 至 0.16~0.19, 按 该 比 值 适 当 摄 入 可 降 低 冠 心 病 和 动 脉 粥 样 硬 化 发 生 的 概 率 (Kritchevsky,et al.,1982;carrol,etal.,1975). 因 此, 核 桃 粕 的 加 收 稿 日 期 :2013G11G20 修 回 日 期 :2014G03G07 基 金 项 目 : 广 西 科 技 攻 关 项 目 ( 桂 科 攻 G3G10); 广 西 植 物 研 究 所 基 本 业 务 费 项 目 ( ). 作 者 简 介 : 颜 小 捷 (1985G), 女, 广 西 玉 林 人, 硕 士, 助 理 研 究 员, 主 要 从 事 植 物 资 源 开 发 与 利 用 研 究,(EGmail)xiaojie128@126.com. 通 讯 作 者 : 李 典 鹏, 药 学 博 士, 研 究 员, 主 要 从 事 天 然 药 物 和 天 然 植 物 的 化 学 研 究,(EGmail)ldp@gxib.cn.

2 184 广 西 植 物 34 卷 工 利 用 和 有 效 开 发 是 延 长 核 桃 产 业 链 的 根 本 途 径, 而 核 桃 粕 蛋 白 的 深 加 工 将 是 核 桃 粕 精 深 加 工 中 最 具 潜 力 和 最 有 前 途 的 领 域. 生 产 生 物 活 性 肽 是 蛋 白 质 领 域 中 新 兴 的 朝 阳 产 业, 其 系 列 产 品 是 当 前 国 内 外 食 品 界 中 较 为 热 门 的 研 究 对 象. 至 今, 相 关 学 者 和 企 业 多 以 乳 制 品 大 豆 玉 米 等 为 原 料 研 究 和 生 产 低 分 子 肽, 如 市 场 上 较 为 常 见 的 有 阿 片 肽 抗 菌 肽 抗 癌 肽 减 肥 肽 降 糖 肽 玉 米 肽 等 ( 豆 康 宁 等,2007; 王 丽 华 等,2008; 林 燕 等,2009); 反 之, 以 核 桃 粕 为 原 料 制 备 的 低 分 子 肽 制 品 却 较 为 罕 见. 现 实 中, 要 想 得 到 核 桃 中 特 殊 的 活 性 水 解 肽 类 物 质, 须 有 足 够 的 核 桃 水 解 产 物 作 相 关 的 药 效 学 实 验. 本 文 主 要 以 胃 蛋 白 酶 和 木 瓜 蛋 白 酶 为 例, 研 究 其 水 解 核 桃 蛋 白 的 最 适 条 件. 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 与 仪 器 核 桃 饼 粕 ( 青 岛 十 相 自 在 食 品 有 限 公 司 ); 胃 蛋 白 酶 ( 郑 州 义 多 利 化 工 产 品 有 限 公 司 ); 木 瓜 蛋 白 酶 ( 南 宁 庞 博 生 物 工 程 有 限 公 司 ); 盐 酸 ( 西 陇 化 工 股 份 有 限 公 司 ); 氢 氧 化 钠 ( 西 陇 化 工 股 份 有 限 公 司 ); 磷 酸 氢 二 钾 ( 广 东 汕 头 市 西 陇 化 工 厂 ); 磷 酸 二 氢 钾 ( 广 东 汕 头 市 西 陇 化 工 厂 ); 甘 氨 酸 ( 国 药 集 团 化 学 试 剂 有 限 公 司 ); 茚 三 酮 ( 西 陇 化 工 股 份 有 限 公 司 ). 十 两 装 高 速 中 药 粉 碎 机 LGG500A( 浙 江 瑞 安 市 百 信 药 机 器 械 厂 ); 电 子 天 平 XS225AGSCS(PreciG sa);hhgs 型 水 浴 锅 ( 郑 州 长 城 科 工 贸 有 限 公 司 ); KQ3200DE 型 数 控 超 声 波 清 洗 器 ( 昆 山 市 仪 器 有 限 公 司 );ph 计 ( 深 圳 市 柯 迪 达 电 子 有 限 公 司 CTG 6023);T6 型 新 世 纪 紫 外 可 见 分 光 光 度 计 ( 北 京 普 析 通 用 仪 器 有 限 责 任 公 司 ). 1.2 方 法 核 桃 蛋 白 提 取 核 桃 饼 粕 经 粉 碎 过 40 目 筛, 核 桃 粉 浸 泡 于 去 离 子 水 中 (1 9,w/v), 用 3 mol L G1 氢 氧 化 钠 溶 液 调 ph 值 至 9.0, 超 声 波 浸 提 1h, 4000r min G1, 离 心 10 min, 取 上 清 液 加 6 mol L G1 盐 酸 调 ph 值 至 4.5, 蛋 白 质 酸 沉 淀,4000r min G1, 离 心 10 min, 沉 淀 水 洗 至 中 性, 真 空 冷 冻 干 燥, 得 核 桃 蛋 白 备 用 ( 丁 晓 雯 等,2005) 完 全 水 解 蛋 白 液 的 制 备 精 密 称 取 核 桃 蛋 白 50mg, 然 后 加 入 6mol L G1 盐 酸 50 ml, 置 沸 水 浴 中 冷 凝 回 流 水 解 4h, 冷 却, 过 滤, 滤 液 真 空 浓 缩 至 1mL 左 右, 加 蒸 馏 水 9 ml, 滴 加 1 滴 酚 酞 指 示 剂, 用 3 mol L G1 氢 氧 化 钠 溶 液 调 至 微 红, 定 量 转 移 至 25mL 容 量 瓶 中, 用 去 离 子 水 稀 释 至 刻 度, 摇 匀, 离 心, 所 得 上 清 液 备 用 ( 郭 兴 凤,2000; 颜 小 捷 等, 2012) 未 酶 解 蛋 白 液 的 制 备 称 取 核 桃 蛋 白 5g, 浸 泡 于 50mL 去 离 子 水 中, 超 声 波 浸 提 10 min 后 充 分 搅 拌 30min,4000r min G1, 离 心 10min, 取 上 清 液 备 用 标 准 曲 线 的 制 作 精 密 称 取 105 下 干 燥 至 恒 重 的 甘 氨 酸 25mg, 置 25 ml 容 量 瓶 中 加 去 离 子 水 溶 解 并 稀 释 至 刻 度, 摇 匀, 得 1mg ml G1 储 备 液, 移 取 2mL 上 述 储 备 液 于 10mL 容 量 瓶 中 定 容 至 刻 度, 得 0.2 mg ml G1 对 照 品 溶 液. 分 别 吸 取 ml 对 照 品 溶 液 于 试 管 中, 加 去 离 子 水 至 2 ml, 加 1 mlph8.2 的 磷 酸 缓 冲 液, 加 1 ml2% 的 茚 三 酮 显 色 剂, 摇 匀 密 封 后 置 于 沸 水 浴 加 热 15 min, 然 后 冷 水 冷 却, 加 入 5mL 去 离 子 水 混 匀, 放 置 15min 后 以 去 离 子 水 管 作 为 空 白 对 照,570nm 波 长 下 测 定 吸 光 度 ( 赵 新 淮 等,1994), 以 甘 氨 酸 含 量 为 横 坐 标, 以 其 吸 光 度 为 纵 坐 标, 得 甘 氨 酸 含 量 测 定 标 准 曲 线 y=14.5x (R 2 =0.9933) 酶 解 核 桃 蛋 白 的 单 因 素 实 验 称 取 一 定 质 量 的 核 桃 蛋 白, 用 50 ml 蒸 馏 水 配 制 成 核 桃 蛋 白 水 溶 液, 称 重, 超 声 5 min 后 置 于 沸 水 浴 中 加 热 10 min 进 行 预 处 理, 冷 却 后 补 重, 调 节 反 应 温 度 ( 水 浴 保 温 ) 和 ph 分 别 为 37 和 2, 然 后 加 入 不 同 剂 量 胃 蛋 白 酶, 水 解 后 在 沸 水 浴 条 件 下 灭 酶 10 min, 冷 却 后 4000r min G1, 离 心 10 min, 量 取 并 记 录 上 清 液 体 积, 上 清 液 进 行 水 解 度 的 测 定. 固 定 其 他 条 件, 分 别 改 变 底 物 浓 度 酶 解 ph 值 酶 解 时 间 酶 解 温 度 等 单 一 条 件, 考 察 核 桃 蛋 白 水 解 度 的 变 化 情 况. 同 理, 调 节 反 应 温 度 ( 水 浴 保 温 ) 和 ph 分 别 为 50 和 7, 先 考 察 不 同 剂 量 木 瓜 蛋 白 酶 对 核 桃 蛋 白 水 解 影 响, 后 固 定 其 他 条 件, 分 别 改 变 底 物 浓 度 酶 解 ph 值 酶 解 时 间 酶 解 温 度 等 单 一 条 件, 考 察 核 桃 蛋 白 水 解 度 的 变 化 情 况 正 交 实 验 酶 质 量 分 数 核 桃 蛋 白 底 物 浓 度 酶 解 ph 值 酶 解 温 度 和 酶 解 时 间 对 整 个 酶 解 反 应 体 系 均 具 有 一 定 的 影 响. 本 实 验 根 据 单 因 素 结 果 选 取 了 核 桃 蛋 白 浓 度 酶 质 量 分 数 和 酶 解 ph 值 3 个 因 素, 设 计 L9(3 3 ) 正 交 实 验 优 化 胃 蛋 白 酶 酶 解 核 桃

3 2 期 颜 小 捷 等 : 胃 蛋 白 酶 和 木 瓜 蛋 白 酶 水 解 核 桃 蛋 白 工 艺 研 究 185 蛋 白 条 件, 实 验 设 计 见 表 1. 另 选 取 核 桃 蛋 白 浓 度 酶 质 量 分 数 和 酶 解 时 间 3 个 因 素, 设 计 L9(3 3 ) 正 交 实 验 优 化 木 瓜 蛋 白 酶 酶 解 核 桃 蛋 白 条 件, 实 验 设 计 见 表 2. Table1 水 平 Level Table2 表 1 胃 蛋 白 酶 正 交 实 验 因 素 水 平 表 MultiGfactorandmultiGlevelorthogonaltestonpepsin A 底 物 浓 度 Concentrationof substrate(%) 因 素 Factor B 酶 质 量 分 数 Massfraction ofenzyme(%) C 酶 解 ph 值 phofenzymatic hydrolysis 水 平 Level 表 2 木 瓜 蛋 白 酶 正 交 实 验 因 素 水 平 MultiGfactorandmultiGlevelorthogonaltestonpapain A 底 物 浓 度 Concentrationof substrate(%) 因 素 Factor B 酶 质 量 分 数 Massfraction ofenzyme(%) C 酶 解 时 间 Enzymatic hydrolysistime 水 解 度 的 测 定 方 法 DH = hs-ho ht-ho 100 式 中,DH 表 示 水 解 度,hs 代 表 每 克 核 桃 蛋 白 酶 解 后 游 离 氨 基 酸 浓 度,ho 代 表 每 克 核 桃 蛋 白 未 酶 解 的 游 离 氨 基 酸 浓 度 ;ht 代 表 每 克 核 桃 蛋 白 用 6 mol L G1 盐 酸 完 全 水 解 后 总 的 游 离 氨 基 酸 浓 度 (PeG naetal.,2001). 2 结 果 与 分 析 2.1 酶 质 量 分 数 对 酶 解 反 应 影 响 酶 与 底 物 浓 度 比 分 别 在 0.5% ~4% 和 1% ~ 6% 之 间 变 化, 以 水 解 度 作 指 标, 胃 蛋 白 酶 及 木 瓜 蛋 白 酶 的 酶 质 量 分 数 变 化 对 核 桃 蛋 白 酶 解 效 果 影 响 ( 图 1). 从 图 1 可 知, 胃 蛋 白 酶 酶 质 量 分 数 在 0.5%~ 2% 范 围 内, 胃 蛋 白 酶 对 核 桃 蛋 白 水 解 度 变 化 不 大 ; 在 2%~3% 范 围 内, 随 酶 质 量 分 数 的 升 高 水 解 度 快 速 增 大 ; 在 3% 时, 取 得 最 佳 水 解 度 为 3.85%, 酶 质 量 分 数 进 一 步 增 大 时 水 解 度 呈 现 波 动 趋 势. 木 瓜 蛋 白 酶 酶 质 量 分 数 在 1%~6% 范 围 内, 对 核 桃 蛋 白 水 解 度 呈 上 升 趋 于 平 缓 的 趋 势. 综 合 考 虑 酶 水 解 度 及 酶 成 本 等 因 素, 故 选 择 胃 蛋 白 酶 和 木 瓜 蛋 白 酶 酶 质 量 分 数 分 别 为 3% 和 5% 作 为 下 一 步 实 验 参 考. 2.2 底 物 浓 度 对 酶 解 反 应 影 响 以 核 桃 蛋 白 为 底 物, 其 浓 度 分 别 在 1%~8% 和 2%~12% 之 间 变 化, 以 水 解 度 作 指 标, 底 物 浓 度 变 化 对 核 桃 蛋 白 酶 解 效 果 影 响 ( 图 2). 从 图 2 可 知, 在 一 定 范 围 内, 胃 蛋 白 酶 和 木 瓜 蛋 白 酶 对 核 桃 蛋 白 水 解 度 均 随 底 物 浓 度 的 升 高 呈 先 升 后 降 的 趋 势, 如 胃 蛋 白 酶 在 底 物 浓 度 不 超 过 2% 时, 随 着 底 物 浓 度 增 加, 水 解 度 逐 渐 增 大 ; 底 物 浓 度 超 过 2% 后, 水 解 度 呈 下 降 趋 势 ; 当 核 桃 蛋 白 浓 度 为 2% 时, 水 解 度 最 大 为 7.93%. 木 瓜 蛋 白 酶 在 底 物 浓 度 不 超 过 4% 时, 随 着 底 物 浓 度 增 加, 水 解 度 逐 渐 增 大 ; 底 物 浓 度 超 过 4% 后, 水 解 度 呈 下 降 趋 势 ; 当 核 桃 蛋 白 浓 度 为 4% 时, 水 解 度 最 大 为 31.69%. 2.3 酶 解 ph 值 对 酶 解 反 应 影 响 ph 值 分 别 在 0.5~4 和 4~9 之 间 变 化, 以 水 解 度 作 指 标,pH 变 化 对 酶 解 效 果 影 响 ( 图 3). 从 图 3 可 知,pH 值 为 3 是 胃 蛋 白 酶 酶 解 反 应 较 适 宜 ph 值, 其 水 解 度 为 7.44%;pH 值 为 7 是 木 瓜 蛋 白 酶 酶 解 反 应 较 适 宜 ph 值, 其 水 解 度 为 25.27%. 2.4 酶 解 温 度 对 酶 解 反 应 影 响 温 度 在 30~60 和 35~60 之 间 变 化, 以 水 解 度 作 指 标, 温 度 变 化 对 酶 解 效 果 影 响 ( 图 4). 从 图 4 可 知,35 为 胃 蛋 白 酶 酶 解 反 应 较 适 宜 温 度, 其 水 解 度 为 2.67%;50 为 木 瓜 蛋 白 酶 酶 解 反 应 较 适 宜 温 度, 其 水 解 度 为 23.90%. 2.5 酶 解 时 间 对 酶 解 反 应 影 响 以 水 解 度 作 指 标, 酶 解 时 间 在 1~6h 之 间 变 化 对 酶 解 效 果 影 响 ( 图 5). 从 图 5 可 知, 在 一 定 条 件 下, 胃 蛋 白 酶 对 核 桃 蛋 白 水 解 度 随 水 解 时 间 延 长 变 化 较 小, 而 木 瓜 蛋 白 酶 对 核 桃 蛋 白 水 解 度 随 水 解 时 间 增 加 呈 上 升 趋 于 平 缓 的 趋 势, 当 水 解 时 间 为 3h, 其 水 解 度 达 17.40%, 若 水 解 时 间 再 增 加, 其 水 解 度 增 加 很 缓 慢. 故 选 择 胃 蛋 白 酶 和 木 瓜 蛋 白 酶 酶 解 时 间 分 别 为 1h 和 3h. 2.6 胃 蛋 白 酶 正 交 试 验 由 表 3 可 见,RA>RC>RB, 核 桃 蛋 白 浓 度 (A) 酶 质 量 分 数 (B) 和 酶 解 ph 值 (C) 三 个 因 素 对 试 验 考 察 指 标 影 响 的 主 次 顺 序 是 ACB, 即 底 物 核 桃 蛋 白 浓 度 影 响 最 大, 酶 解 ph 值 次 之, 酶 质 量 分 数 的 影 响 最 小. 另 ka1 ka2 ka3, 说 明 A 因 素 的 水 平 变 动 对 试 验 结 果 有 影 响, 同 一 因 素 中 水 平 的 ka 值 越 大, 该 水 平 对 试 验 指 标 的 影 响 就 越 大, 所 以 可 断 定 A2 为 A 因 素 的 优 水 平 (ka2>ka3>ka1).

4 186 广 西 植 物 34 卷 图 1 酶 质 量 分 数 对 核 桃 蛋 白 水 解 度 的 影 响 Fig.1 Theinfluenceoftheenzymemassfractiononwalnutproteinhydrolysis 图 2 底 物 浓 度 对 核 桃 蛋 白 水 解 度 的 影 响 Fig.2 Theinfluenceofsubstrateconcentrationonhydrolysisdegreeofwalnutprotein 图 3 酶 解 ph 值 对 核 桃 蛋 白 水 解 度 的 影 响 Fig.3 TheefectionofenzymesolutionpHonhydrolysisdegreeofwalnutprotein 同 理 B3 和 C2 分 别 为 B C 两 因 素 的 优 水 平. 故 胃 蛋 白 酶 酶 解 核 桃 蛋 白 的 最 佳 工 艺 条 件 为 :A2B3C2, 即 底 物 浓 度 为 2%, 酶 质 量 分 数 为 5%, 酶 解 ph 值 为 木 瓜 蛋 白 酶 正 交 实 验 由 表 4 可 见,RA>RB>RC, 核 桃 蛋 白 浓 度 (A) 酶 质 量 分 数 (B) 和 酶 解 时 间 (C) 三 个 因 素 对 试 验 考 察 指 标 影 响 的 主 次 顺 序 是 ABC, 即 底 物 核 桃 蛋 白 浓 度 影 响 最 大, 酶 质 量 分 数 次 之, 酶 解 时 间 的 影 响 最 小.kA1 ka2 ka3, 说 明 A 因 素 的 水 平 变 动 对 试 验 结 果 有 影 响, 同 一 因 素 中 水 平 的 ka 值 越

5 2 期 颜 小 捷 等 : 胃 蛋 白 酶 和 木 瓜 蛋 白 酶 水 解 核 桃 蛋 白 工 艺 研 究 187 图 4 酶 解 温 度 对 核 桃 蛋 白 水 解 度 的 影 响 Fig.4 Theefectionofenzymesolutiontemperatureonthehydrolysisdegreeofwalnutprotein 图 5 酶 解 时 间 对 核 桃 蛋 白 水 解 度 的 影 响 Fig.5 Theefectofenzymesolutiontimeonthehydrolysisdegreeofwalnutprotein 表 3 胃 蛋 白 酶 正 交 实 验 结 果 与 分 析 Table3 Theresultsandanalysisoforthogonaltestonpepsin 编 号 No. A B C 水 解 度 Degreeofhydrolysis(%) k k k R 大, 该 水 平 对 试 验 指 标 的 影 响 就 越 大, 可 断 定 A2 为 A 因 素 的 优 水 平 (ka2>ka1>ka3). 同 理 B2 和 C3 分 别 为 B C 两 因 素 的 优 水 平. 故 木 瓜 蛋 白 酶 酶 解 核 桃 蛋 白 的 最 佳 工 艺 条 件 为 A2B2C3, 即 底 物 浓 度 为 4%, 酶 质 量 分 数 为 5%, 酶 解 时 间 为 4h. 表 4 木 瓜 蛋 白 酶 正 交 实 验 结 果 与 分 析 Table4 Theresultsandanalysisoforthogonaltestonpapain 编 号 No. A B C 水 解 度 Degreeofhydrolysis(%) K K K R 结 论 与 讨 论 酶 解 蛋 白 释 放 出 具 某 种 生 理 功 能 的 生 物 活 性 肽 与 蛋 白 质 的 水 解 程 度 密 切 相 关, 即 与 水 解 度 有 关 ( 周

6 188 广 西 植 物 34 卷 慧 江 等,2012). 目 前 报 道 测 定 蛋 白 质 水 解 度 的 方 法 有 phgslat 法 甲 醛 滴 定 法 三 硝 基 苯 磺 酸 法 (TNG BS) 茚 三 酮 比 色 法 等. 其 中,pHGslat 法 在 研 究 中 仅 适 用 于 中 性 及 碱 性 (ph>7) 或 ph<3 的 酸 性 溶 液 中 进 行 的 水 解, 并 且 需 要 特 别 的 仪 器 对 反 应 体 系 的 ph 值 进 行 在 线 控 制 ( 徐 英 操 等,2007); 之 所 以 测 定 核 桃 蛋 白 水 解 度 时 不 宜 采 用 甲 醛 滴 定 法, 是 因 为 核 桃 蛋 白 中 富 含 脯 氨 酸 (4.29%), 易 与 甲 醛 反 应 生 成 不 稳 定 化 合 物, 导 致 测 定 的 水 解 度 值 偏 低 ( 毛 晓 英,2012);TNBS 法 是 国 外 较 为 常 用 的 测 定 蛋 白 水 解 度 的 方 法, 该 法 非 常 灵 敏, 且 不 受 酶 特 异 性 影 响, 但 由 于 所 用 试 剂 较 为 昂 贵 且 反 应 中 需 要 较 长 时 间, 不 能 实 时 反 应 水 解 过 程 的 水 解 度 ( 周 慧 江 等,2012); 由 于 用 水 合 茚 三 酮 显 色 法 无 法 判 断 水 解 后 的 游 离 氨 基 是 原 样 品 中 本 来 就 含 有 的 还 是 经 水 解 产 生 的, 且 采 用 的 是 单 一 氨 基 酸 做 标 准, 而 不 同 的 氨 基 酸 对 茚 三 酮 的 呈 色 度 不 同, 因 此 采 用 茚 三 酮 比 色 法 结 果 也 有 偏 差. 郭 兴 凤 (2000) 采 用 待 水 解 蛋 白 质 的 完 全 水 解 液 作 为 标 准 溶 液, 消 除 了 由 于 蛋 白 质 水 解 液 中 不 同 的 氨 基 酸 对 反 应 试 剂 的 响 应 不 同 所 带 来 的 误 差, 但 我 们 试 验 中 发 现 该 完 全 水 解 液 在 中 性 条 件 下 难 于 保 存, 标 准 曲 线 制 作 过 程 中 难 于 保 持 稳 定 性 及 重 复 性, 故 选 择 甘 氨 酸 作 为 标 准, 待 水 解 原 料 的 完 全 水 解 液 中 总 的 游 离 氨 基 酸 浓 度 减 去 其 未 酶 解 的 游 离 氨 基 酸 浓 度 作 为 基 准, 虽 然 消 除 了 原 样 品 中 含 有 的 游 离 氨 基 酸 对 测 定 结 果 造 成 的 误 差, 但 不 同 的 氨 基 酸 对 反 应 试 剂 的 响 应 所 带 来 的 误 差 还 有 待 进 一 步 消 除. 酶 解 方 式 对 核 桃 蛋 白 酶 解 产 物 的 水 解 度 影 响 较 大, 在 一 定 条 件 下, 木 瓜 蛋 白 酶 酶 解 产 物 的 水 解 度 显 著 高 于 胃 蛋 白 酶 酶 解 产 物. 而 相 关 学 者 根 据 AS 中 性 蛋 白 酶 等 五 种 酶 的 最 佳 反 应 条 件 对 核 桃 蛋 白 进 行 水 解 能 力 比 较, 结 果 表 明 水 解 能 力 大 小 顺 序 为 AS.1398 中 性 蛋 白 酶 > 胃 蛋 白 酶 > 2709 碱 性 蛋 白 酶 > 胰 蛋 白 酶 > 木 瓜 蛋 白 酶 ( 丁 晓 雯 等,2005). 推 其 原 因 为 酶 的 最 佳 反 应 条 件 并 不 一 定 是 其 水 解 核 桃 蛋 白 的 最 佳 反 应 条 件, 水 解 蛋 白 质 中 各 单 因 素 对 整 个 酶 解 反 应 体 系 均 具 有 一 定 的 影 响, 同 一 型 号 蛋 白 酶 在 水 解 不 同 蛋 白 中 其 最 佳 参 数 有 所 改 变. 本 实 验 通 过 单 因 素 及 正 交 试 验 优 化 胃 蛋 白 酶 及 木 瓜 蛋 白 酶 水 解 核 桃 蛋 白 工 艺 参 数, 研 究 得 出 最 优 酶 解 工 艺 为 木 瓜 蛋 白 酶 为 酶 制 剂, 底 物 浓 度 为 4%, 酶 质 量 分 数 为 5%, 酶 解 ph 为 7 酶 解 温 度 为 50 酶 解 时 间 为 4h, 下 一 步 将 对 水 解 后 核 桃 多 肽 的 药 理 药 效 及 其 功 能 性 食 品 的 开 发 进 行 深 入 系 统 地 研 究. 参 考 文 献 : CarolKK,HamiltonRMG.1975.Efectsofdietaryproteinand carbohydrateonplasmgcholesterollevelsinrelationtoatherog sclerosis[j].foodsci,40:18-23 DouKN( 豆 康 宁 ),DongB( 董 彬 ),WangYM( 王 银 满 ) Thebiologicfunctionandtheapplicationprospectsofsoybean proteinactivepeptides( 大 豆 蛋 白 活 性 肽 的 生 物 功 能 与 应 用 前 景 )[J].FoodProces( 粮 食 加 工 ),32(2):52-54 DingXW( 丁 晓 雯 ),Zhang QZ( 张 庆 祝 ),Qiao HO( 乔 海 鸥 ) Studyonoptimumconditionofenzymatichydrolysison walnutprotein( 核 桃 蛋 白 最 佳 酶 解 条 件 研 究 )[J].Cereals& Oils( 粮 食 与 油 脂 ),10(23):23-25 GuoXF( 郭 兴 凤 ).2000.Determinationofhydrolysisdegreeof protein( 蛋 白 质 水 解 度 的 测 定 )[J].ChinOil( 中 国 油 脂 ),25 (6): HuangLH( 黄 黎 慧 ),Huang Q( 黄 群 ),SunSG( 孙 术 国 ), 等 StudiesonthenutritionhealthprotectionfunctionofwalG nutanditsexploitations( 核 桃 的 营 养 保 健 功 能 与 开 发 利 用 ) [J].FoodSci( 食 品 科 学 ),4:48-50 KritchevskyD,TepperSA,CzarneckiSK,etal.1982.AtherogeG nicityofanimalandvegetableprotein.influenceofthelysineto arginineratio[j].atheroslerosis,41: LiP( 李 萍 ),LuJM( 卢 健 鸣 ).2011.Studiesontheprocessingof walnutanditscomprehensireutilization( 核 桃 的 加 工 及 其 综 合 利 用 )[J].ApplPromotion( 应 用 推 广 ),5 LinY( 林 燕 ),ChenJL( 陈 计 峦 ),WuJH( 吴 继 红 ).2009.ReG searchadvanceonpreparationofwalnutpeptidebyenzymatic way( 酶 法 制 备 核 桃 多 肽 研 究 进 展 )[J].Cereals& Oils( 粮 食 与 油 脂 ),1:46-48 MaoXY( 毛 晓 英 ).2012.Studiesonthestructurecharacterization andproductsmodificationofwalnutprotein( 核 桃 蛋 白 质 的 结 构 表 征 及 其 制 品 的 改 性 研 究 )[D].JiangnanUniv( 江 南 大 学 ) PenaEA Ramos,XiongYL.2001.Antioxidativeactivityofwhey proteinhydrolysatesinaliposomalsystem[j].dairysci,84 (12): WangLH( 王 丽 华 ),HuangMF( 黄 明 发 ).2008.Researchadvance onbioactivepeptidesfromsoybeanprotein( 大 豆 源 生 物 活 性 肽 研 究 进 展 )[J].Cereals& Oils( 粮 食 与 油 脂 ),1:42-45 XuYC( 徐 英 操 ),LiuCH( 刘 春 红 ).2007.Introductionofmethod fordeterminationofdegreeofhydrolysisofproteinhydrolysates ( 蛋 白 质 水 解 度 测 定 方 法 综 述 )[J].FoodRes& Devel( 食 品 研 究 与 开 发 ),28(7): YanXJ( 颜 小 捷 ),LuFL( 卢 凤 来 ),Chen HY( 陈 换 莹 ),etal Studiesonisolation,purification,structuralidentification anditsantitumoractivityofpolysaccharidesfrom Momordica grosvenoriswingle sroot( 罗 汉 果 根 多 糖 的 分 离 纯 化 结 构 鉴 定 及 抗 肿 瘤 活 性 研 究 )[J].Guihaia( 广 西 植 物 ),32(1): ZhaoXH( 赵 新 淮 ),FengZB( 冯 志 彪 ).1994.Thedeteminationof proteinhydrolysatehydrolyzeddegree( 蛋 白 质 水 解 物 水 解 度 的 测 定 )[J].FoodSci( 食 品 科 学 ),179(11):65-67 ZhouHJ( 周 慧 江 ),ZhuZB( 朱 振 宝 ),YiJH( 易 建 华 ).2012.VaG riousmethodsavailablefordeterminationofhydrolyzeddegreeof walnutprotein( 核 桃 蛋 白 水 解 物 水 解 度 测 定 方 法 比 较 )[J]. Cereals& Oils( 粮 食 与 油 脂 ),2:28-30

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